CN104513831B - 一种促进植物生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进植物生长的方法，其包含步骤：构建含有FTO或者其它同源去甲基蛋白酶基因的植物表达载体；植物表达载体转化受体菌；受体菌转化到目标植物中；培养所述目标植物，收集并培养T0代种子，从其幼苗中筛选阳性植株；培养筛选的阳性植株，待幼苗长大后收集T1代种子；培养T1代种子，从其幼苗中筛选阳性植株；培养筛选的阳性植株，待幼苗长大后收集T2代种子；培养T2代种子，从其幼苗中筛选纯合株系；将T2代纯合株系植株的T1代种子用于目标植物的培养。本发明通过将具有调控位于内部的RNA甲基化修饰m⁶A的外源基因，通过转基因技术引入植物中，通过调控植物的RNA上的m⁶A，进而达到促进植物生长加快的目的。

Description

一种促进植物生长的方法

技术领域

本发明涉及RNA表观遗传学和RNA甲基化修饰领域，尤其涉及通过调控植物中mRNA，和其它核RNA或者非编码RNA上甲基化的修饰，进而调节植物的生长。

背景技术

目前已经发现超过100多种化学修饰碱基分布于各种RNA中，包括核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和小核RNA(snRNA)等，以帮助完成各种RNA功能。在生命体中，主要的一类修饰是甲基化修饰。其中在真核生物的mRNA上的甲基化修饰主要为：位于5’端cap上的N7-甲基鸟嘌呤(m⁷G)，位于5’端头两个碱基或中间部位的2’-O-甲基化碱基(N_m)，位于中间部位的5-甲基胞嘧啶(m⁵C)和N6-甲基腺嘌呤(m⁶A)。

在真核细胞mRNA中分布最广的为m⁶A，由甲基转移酶复合物在腺嘌呤的N6位加甲基而来，目前只鉴定出SAM结合蛋白-METTL3(也称MT-A70)。在人体癌细胞HeLa中降低METTL3的表达量，细胞会凋亡。m⁶A存在于特定的系列RRACH中(R为腺嘌呤或鸟嘌呤，A为m⁶A，H为除鸟嘌呤外的其它碱基)，且为非化学计量修饰，在哺乳细胞中每个位点的含量约为20％左右。2011年发明人首次发现肥胖蛋白FTO可以去除mRNA中m⁶A的甲基，为首个RNA的去修饰酶(Nature Chemical Biology，2011，7：885；Nature Communications，2013，4：1798)。其原理如下：

具体FTO去甲基的化学机理如下述反应式所示：

FTO为主要的肥胖和二型糖尿病相关基因，通过全基因组关联研究发现FTO还与多种疾病相关，如癌症、老年痴呆、心血管、神经机能障碍等疾病。此发现意味着RNA修饰可以如同DNA、组蛋白修饰一样可逆性动态调控，有可能存在RNA水平的表观遗传学。

2012年在Nature和Cell先后发表了老鼠和人体中m⁶A的全转录组测序文章，通过m⁶A抗体免疫共沉淀技术与高通量测序联用，发现m⁶A广泛存在于mRNA和lncRNA中，且主要富集于终止密码子和3’非翻译区，进一步证实了广泛存在的m⁶A在转录组RNA水平具有重要功能，同时也意味着FTO对m⁶A的去甲基功能的发现对RNA功能的研究具有里程碑的意义。

m⁶A也广泛存在于植物中，在模式植物拟南芥中它的含量约1.5％(m⁶A/A)，且含量分布在各组织中有差异，在花中的含量要高于根和叶子。m⁶A主要富集在3’UTR且距离poly(A)约100-150个碱基。在拟南芥中m⁶A的甲基转移蛋白为MTA(At4g10760，为人体METTL3的同源蛋白)。敲除MTA，mRNA中总m⁶A含量降低，植物正常发育受到抑制，胚芽不能通过球形状态继续发育。降低MTA的表达量，mRNA中总m⁶A含量同样降低，拟南芥生长受到干扰，顶端优势减弱，器官分裂不明晰，毛丝状分支增加。m⁶A也同时存在于其它核RNA和非编码RNA中。上述研究结果表明RNA甲基化修饰m⁶A与植物的组织分裂相关。目前，通过转基因技术人为调控植物中RNA甲基化修饰m⁶A进而调控植物生长还完全是空白。

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。常用的植物转基因的方法有介导转化法，即农杆菌介导法，基因枪介导转化法和花粉管通道法。植物转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。如抗虫基因工程将Bt基因导入棉花、玉米、水稻、烟草、马铃薯等作物，毒杀害虫；或将胶蛋白酶抑制剂基因导入作物，干扰害虫消化作用，而导致害虫死亡。在作物种类方面，大多集中在大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、南瓜、木瓜、西葫芦、水稻等。

利用转基因技术导入外源基因来改变植物性状的研究已经比较久远，但是到目前为止所研究、报道或专利保护的外源基因中从未有涉及改变RNA甲基化修饰m⁶A的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过转基因技术人为调控植物中RNA甲基化修饰m⁶A进而调控植物生长的方法。

本发明通过将具有调控RNA甲基化修饰m⁶A的外源基因，通过转基因技术引入植物中，通过调控植物的RNA上的m⁶A，进而达到促进植物生长加快、变大和根系更长的目的。

本发明通过下述技术方案实现上述的发明目的：

本发明提供一种促进植物生长的方法，其主要包含步骤：

1)构建含有人FTO基因(NCBI Reference Sequence：NM_001080432.2；NP_001073901.1)的植物表达载体pCAMBIA1307-hFTO；

2)将步骤1)构建的植物表达载体转化受体菌；

3)将步骤2)转化的受体菌转化到目标植物中；

4)培养所述目标植物，收集T0代种子；

5)培养步骤4)收集到的T0代种子，从其幼苗中筛选阳性植株；

6)培养步骤5)筛选的阳性植株，待幼苗长大后收集T1代种子；

7)培养步骤6)收集到的T1代种子，从其幼苗中筛选阳性植株；

8)培养步骤7)筛选的阳性植株，待幼苗长大后收集T2代种子；

9)培养步骤8)收集到的T2代种子，从其幼苗中鉴定纯合株系；

10)将鉴定为T2代纯合株系植株的T2代种子用于目标植物的培养。

优选地，步骤1)包含将人FTO基因与载体pCAMBIA1307连接后形成植物表达载体pCAMBIA1307-hFTO。所述载体pCAMBIA1307含有CaMV35S启动子、卡那霉素和潮霉素抗性基因。

优选地，所述植物载体包括适用于各种目标植物的相应载体和启动子。

优选地，所述构建入植物载体的外源基因主要包括各物种的m⁶A的去甲基酶，进一步地，所述各物种的m⁶A的去甲基酶为所有FTO的同源基因。

优选地，所述目标植物为拟南芥。步骤2)所述受体菌为农杆菌。

优选地，步骤5)包含：将收集到的T0代种子用次氯酸钠消毒后种在带有潮霉素抗性的MS培养基平板上，静春化后于正常条件下培养，2周左右可看到大多数幼苗发生黄化现象，只有少数幼苗没有发生黄化，没发生黄化的幼苗筛选为阳性植株。

优选地，步骤7)包含：将收集到的T1代种子用次氯酸钠消毒后种在带有潮霉素抗性的MS培养基平板上，静春化后于正常条件下培养，2周左右可看到绝大多数幼苗没有发生黄化现象，只有少数幼苗发生黄化，没发生黄化的幼苗筛选为阳性植株。

优选地，步骤9)包含：将T2代幼苗移栽到花盆中，正常条件下生长，待长大后收集种子，再将种子种在同一培养基上进行T2代纯合株系的鉴定；若平板中所有幼苗都为绿色，均未出现黄化现象，则表明为纯合株系；若平板中有幼苗出现黄化现象，则表明为非纯合株系。

本发明提供的上述植物表达载体，包含人或者其它物种的FTO基因。

进一步地，本发明提供了FTO及其它同源RNA去甲基蛋白酶。

进一步地，本发明提供了通过引入RNA去甲基蛋白酶调控mRNA的去甲基进而调控植物的生长的方法。

目前尚未见报道将本发明所述的外源基因-人(或者其它物种的)FTO基因导入植物中；本发明通过试验验证，人FTO(hFTO)基因具有促进植物生长的作用。其通过本发明所提供的转基因方法，将具有调控RNA甲基化修饰m⁶A的外源基因引入植物中，通过人为地调控植物中RNA上的m⁶A，从而促进植物生长变快、根系更长、植物长得更大。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是将T2代纯合株系的拟南芥种子种在正常MS培养基上第10天观察根系生长的试验结果(培养皿斜放)。

图2是将T2代纯合株系的拟南芥种子种在培养基上10天后，移至土壤，植物生长总第28天的试验结果(从顶端拍摄)。

图3是将T2代纯合株系的拟南芥种子种在培养基上10天后，移至土壤，植物生长总第28天的试验结果(从侧面拍摄)。

具体实施方式

实施例1利用转基因技术将hFTO基因介导入拟南芥(哥伦比亚生态型)

本发明采用的转基因技术为实验室使用的常规农杆菌介导法，简要实验流程如下：

1.含有人体FTO(hFTO)基因的植物表达载体的构建

利用亚克隆技术，将hFTO基因构建入植物表达载体(pCAMBIA1307，含有CaMV35S启动子，卡那霉素和潮霉素抗性)。

植物表达载体pCAMBIA1307为CaMV35S启动子，卡那霉素和潮霉素抗性，采用亚克隆技术，将hFTO基因插入BamHI和SalI中。

a)利用PCR技术将hFTO基因复制成带有BamHI和SalI限制性内切酶的插入片段

所用的PCR引物分别为下述序列(如SEQ ID NO：1-2所示)：

hFTO-p1(含BamHI酶切)含：5’-AATTGGATCCATGAAGCGCACCCCGA-3’

hFTO-p2(含SalI酶切)：5’-ATCTGTCGACTAGGGTTTTGCTTCCAGAAG-3’

PCR扩增反应体系为25μL，其中15ng模板hFTO的DNA，10X缓冲液2.5μL，20μmol/L引物各1μL，taq DNA聚合酶1μL。扩增条件：94℃预变性5min；94℃30s，56℃40s，72℃2.5min，共30个循环；72℃10min，4℃保存。

1％琼脂糖凝胶电泳检测，用Qiagen公司的PCR产物纯化试剂盒回收。

b)利用BamHI和SalI限制性内切酶分别对上述PCR扩增的插入片段和植物表达载体pCAMBIA1307进行双酶切

双酶切反应体系为20μL，其中NEB4#缓冲液2μL，BamHI和SalI各1μL，DNA各500ng；在37℃酶切3小时。之后用1％琼脂糖凝胶电泳和Qiagen公司的切胶纯化试剂盒进行纯化。

c)利用T4 ligase将hFTO与植物表达载体pCAMBIA1307连接，构建pCAMBIA1307-hFTO质粒

将双酶切过的hFTO片段和pCAMBIA1307以3：1质量比加入，T4ligase为1μL，缓冲液2μL，总反应体系为20μL，在16℃放置18小时。之后取10μL连接产物转化到200μL的感受态细胞DH5α中。取适量菌液涂布于LB平板上(含卡那霉素抗性)，37℃恒温培养箱中倒置培养16小时。然后挑取单菌落经PCR或BamHI和SalI双酶切验证，由上海美吉生物医药科技有限公司测序。

2.pCAMBIA1307-hFTO和pCAMBIA1307植物表达载体转化农杆菌pCAMBIA1307空载体作为对照，分别将pCAMBIA1307和pCAMBIA1307-hFTO的植物表达载体通过电击法转化到农杆菌(EHA105，利福平抗性)中，将转化后的菌液涂于带有潮霉素和利福平抗性的LB平板上，28度孵育2天，之后挑选单菌落利用PCR和酶切技术进行阳性克隆的鉴定，挑选出带有阳性克隆的农杆菌菌株。具体为：

a)首先用75％乙醇擦拭电转化仪，再用灭菌水洗电转化杯3-5遍，再用灭过菌的滤纸擦干后置于冰上；

b)将稀释的连接产物和农杆菌感受态细胞均放置在冰上融化；

c)将2μL的连接产物加入到40μL农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上30min；

d)打开开关，调至Manual，并调节电压至2.1KV，然后将混合物加入到已预冷的电转化杯中，为使混合物均匀进入杯底需轻轻敲击电转化杯或用枪头轻轻吸打几次；

e)将电转化杯推入电转化仪中，按下pluse键并听到蜂鸣声后，立即向转化杯中加SOC培养基1mL，用枪头轻微吸打重悬细胞后转移到1.5mL离心管中，28℃220r/min振荡培养2-3h将转化后的菌液涂于带有潮霉素和利福平抗性的LB平板上，28度孵育2天，之后挑选单菌落利用PCR和酶切技术进行阳性克隆的鉴定，挑选出带有阳性克隆的农杆菌菌株；

f)取适量菌液涂布于LB平板上(含潮霉素100mg/L，利福平50mg/L)，28℃恒温培养箱中倒置培养2d；

g)挑选单菌落利用PCR和酶切技术进行阳性克隆的鉴定，挑选出带有阳性克隆的农杆菌菌株，保存于-80度冰箱。

3.农杆菌介导的拟南芥的遗传转化

首先培养拟南芥的无菌苗，在20天左右待株高5cm左右时，剪掉顶生花序以刺激更多花序产生，当有大量花苞时采用花序侵染法转化拟南芥。将农杆菌侵染过的拟南芥用保鲜袋套好保持湿度，暗培养1天，然后去掉保鲜袋，置于正常光照条件下培养，待结荚后收集T₀代种子。

实施例2转基因拟南芥的筛选及纯合株系的鉴定

1.转基因拟南芥T0代的筛选

将收集到的T0代种子用次氯酸钠消毒后种在带有潮霉素抗性的MS培养基平板上，静春化后于正常条件下培养，2周左右可看到大多数幼苗发生黄化现象，只有少数幼苗没有发生黄化，没发生黄化的幼苗则可能为阳性植株。

2.阳性植株T1代的筛选

将上述少数幼苗移栽到花盆中，正常条件下生长，待幼苗长大结荚后收集种子，进行T2代的筛选，如上一步骤。

3.纯合株系T2代的鉴定

将T2代幼苗移栽到花盆中，正常条件下生长，待长大后收集种子为T2代种子，再将种子种在上述培养基上进行T₂代纯合株系的鉴定。若平板中所有幼苗都为绿色，均未出现黄化现象，则表明为纯合株系；若平板中有幼苗出现黄化现象，则表明为非纯合株系。经筛选鉴定后，将T2代纯合株系的种子用于后续实验。

实施例3 hFTO促进拟南芥的生长

实施例2中鉴定的T2代纯合株系的种子种在正常MS培养基上，经鉴定和观察，与pCAMBIA1307空载体对照组相比，hFTO转基因拟南芥生长加快、根系更长、长得更大，具体请参照附图：图1是根系生长第10天的试验结果(实验过程中培养基板斜放)，转基因组的幼苗根长是对照组的2-3倍。图2和图3分别为从植物顶端和侧面拍摄，是第28天的试验结果(种子在MS培养基上生长10天后，移栽入土壤中)。从图2的顶端拍摄可以明显看出转基因植株的莲座叶要远比对照组的大。图3的侧面拍摄可以明显看出转基因组的花茎要比对照组的长，而且转基因组的植株都已结荚。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (9)

1.一种促进拟南芥生长的方法，其特征在于，包含步骤：

1)构建含有人的FTO基因的植物表达载体；

2)将步骤1)构建的植物表达载体转化受体菌；

3)将步骤2)转化的受体菌转化到所述拟南芥中；

4)培养所述拟南芥，收集T0代种子；

5)培养步骤4)收集到的T0代种子，从其幼苗中筛选阳性植株；

6)培养步骤5)筛选的阳性植株，待幼苗长大后收集T1代种子；

7)培养步骤6)收集到的T1代种子，从其幼苗中筛选纯合植株；

8)培养步骤7)筛选的纯合植株，待幼苗长大后收集T2代种子，为纯合株系种子，用于所述拟南芥的培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包含将人FTO基因与载体pCAMBIA1307连接后形成植物表达载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体pCAMBIA1307含有CaMV35S启动子、卡那霉素和潮霉素抗性基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述受体菌为农杆菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)包含：将收集到的T0代种子用次氯酸钠消毒后种在带有潮霉素抗性的MS培养基平板上，静春化后于正常条件下培养，2周左右可看到大多数幼苗发生黄化现象，只有少数幼苗没有发生黄化，没发生黄化的幼苗筛选为阳性植株。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)包含：将收集到的T1代种子用次氯酸钠消毒后种在带有潮霉素抗性的MS培养基平板上，静春化后于正常条件下培养，2周左右可看到绝大多数幼苗没有发生黄化现象，只有少数幼苗发生黄化，没发生黄化的幼苗筛选为阳性植株。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤9)包含：将T2代幼苗移栽到花盆中，正常条件下生长，待长大后收集种子，再将种子种在同一培养基上进行T2代纯合株系的鉴定；若平板中所有幼苗都为绿色，均未出现黄化现象，则表明为纯合株系；若平板中有幼苗出现黄化现象，则表明为非纯合株系。

8.人的FTO基因在促进拟南芥生长中的应用。

9.通过引入RNA去甲基蛋白酶调控mRNA的去甲基进而调控拟南芥的生长的方法。

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