CN108410881B

CN108410881B - Lec2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用

Info

Publication number: CN108410881B
Application number: CN201810083252.3A
Authority: CN
Inventors: 薛金曼; 陈钰佩; 牛蕾蕾; 雷洁; 郑志富
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: CN108410881A

Abstract

本发明涉及LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用，属于基因工程领域，在此基础上进一步提供一种提高植物低氮胁迫耐受性的方法，即首先构建含有LEC2转录因子的重组植物表达载体；然后将构建的重组植物表达载体转化到植物组织或细胞中异位表达；培育筛选出低氮胁迫耐受性增强的转基因植株。本发明首次揭示了LEC2转录因子在提高植物低氮胁迫耐受性方面的新应用，对于提高植物氮肥利用效率，发展节约型农业模式具有重要意义。

Description

LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地，涉及LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用。

背景技术

氮素不仅是核酸及蛋白质的重要组分，还参与构成叶绿素、各种代谢相关酶等重要物质，是维持植物正常生长发育所必须的“生命元素”。氮素的丰缺、形态差异对于作物的产量与品质有着重要的影响。其中氮素的缺乏会导致植株水分吸收利用率及光合速率下降，生长受抑制，植株矮小，根茎细，分蘖少，花、果实等发育迟缓。充足的氮肥可以保证农作物的产量及品质，但是目前氮肥的滥用不仅造成了大量资源的浪费，还可能会降低作物的产量。只有合理调控作物正常生长发育所需的氮肥，提高氮素的吸收、转运和同化效率以培育耐低氮胁迫的植物，才能保证作物的高产、高效和优质。

植物激素是植物体内产生的能够调控植物生长发育的微量有机物质，已有研究表明生长素与低氮胁迫耐受性存在着内在联系。低氮胁迫会促进生长素响应基因的表达，而施加外源生长素可提高植物的低氮胁迫耐受性。此外，生长素还可改善植物体内的氮素分配。Siobhan A等发现LEC2的异位表达可以促进植物体内生长素的合成。当LEC2被激活，生长素响应基因受诱导表达，相关酶(YUC2和YUC4)合成，其中YUC4可能是LEC2的直接转录靶点，蛋白和油体随之开始积累。然而，目前关于LEC2转录因子的异位表达能否提高植物对低氮胁迫的耐受性尚不清楚。

烟草是常见的模式植物之一，对氮素营养需求大，一旦缺乏将导致其生长受抑制，烟叶产量下降，而过量又会延长其生育期，降低烟叶品质。研究低氮条件下烟草的胁迫响应机制，不仅为提高作物营养利用效率提供理论指导，还对发展节约型农业模式具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于研究如何提高植物的低氮胁迫耐受性，进而揭示了LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用；再此基础上利用基因工程技术提供一种提高植物低氮胁迫耐受性的方法，该方法是通过将LEC2基因在植物体内异位表达，从而使转基因植株与野生型相比叶片衰老缓慢，且叶绿素含量高于野生型，表现出低氮胁迫耐受性。

本研究构建了35S启动子驱动的AtLEC2过表达载体，遗传转化烟草幼苗，通过分析T₁代植株在缺氮培养条件下的表型变化，结果表明过表达AtLEC2转基因烟草植株并未出现类似野生型的叶片黄化现象，显示出一定的缺氮胁迫耐受性。

本发明请求保护LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用，所述LEC2基因包括与SEQ ID NO：01的核苷酸序列同源性达到90％以上的基因，或与SEQ ID NO：02的氨基酸序列同源性达到95％以上的基因。

进一步的，所述应用是通过在植物体内异位或异源表达LEC2基因以提高植物的低氮胁迫耐受性。

更进一步的，所述植物为烟草。

更进一步的，所述LEC2基因来自拟南芥。

本发明还提供一种提高植物低氮胁迫耐受性的方法，包括：(1)构建含有LEC2基因的重组植物表达载体；(2)将构建的重组植物表达载体转化到植物组织或细胞中；(3)培育筛选得到低氮胁迫耐受性增强的转基因植株。

进一步的，所述重组植物表达载体的构建方法为：首先提取拟南芥种子RNA，反转录形成cDNA，以cDNA为模板，扩增LEC2基因片段；然后将LEC2基因片段插入到双元载体pBI121中，构建重组植物表达载体pBI121-LEC2。

本发明的有益效果：

本发明首次开发了含有LEC2基因的转录基因在提高植物低氮胁迫耐受性方面的应用，通过在植物组织或细胞内异位表达，增加了植物对于低氮胁迫的耐受性，通过转基因方法将该基因转入到植物体内，培育筛选出具有高低氮胁迫耐受性的转基因植株，从而降低氮素肥料的施用量，不但节约资源，还能减少土壤中过量氮素残留对环境产生的危害，符合国家政策需求，是民之所向。尤其是获取高低氮胁迫耐受性的烟草，提高烟株营养利用效率，也对发展节约型农业模式具有重要意义。

附图说明

图1是pBI121-35S MCS的载体示意图；

图2是pBI121-35S-LEC2载体示意图；

图3是用BamHI和XhoI酶切pBI121-35S-LEC2；其中，1、2：BamHI和XhoI酶切；

图4是用SacI和XbaI酶切pBI121-35S-LEC2；其中，1、2：SacI和XbaI酶切；M：1kbDNA ladder；

图5是转基因烟草的获得过程示意图；

图6是转基因烟草T₀阳性植株的筛选结果，1-7表示转基因烟草的不同株系；

图7是转基因烟草T₁阳性植株的筛选结果；

图8是缺氮21天时野生型与T₁代含有LEC2基因的转基因烟草的表型观察；其中，左侧是野生型烟草；右侧是T₁代含有LEC2基因的转基因烟草；

图9是低氮处理不同时期时黄色叶片百分比对比图；

图10是T₁转基因烟草低氮条件下叶绿素含量的分析图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

1、植物材料与菌种

本试验所用的植物材料是烟草K326，是一种大田栽培品种，由河南农业大学烟草学院提供。

拟南芥为哥伦比亚型。

农杆菌菌株为改造后的GV3101。

2、试剂配置

各试剂母液浓度：Ca(NO₃)₂·4H₂O 142.8mM，MgSO₄·7H₂O 1M，CaCl₂ 608mM，K₂HPO₄400mM，FeNa₂EDTA 17.85mM，K₂CO₃ 806Mm，H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L，CuSO₄·5H₂O 0.051g/L，H₂MoO₄ 0.081g/L。

3、载体pBI121-35S MCS的构建

在pBI121-GUS中插入启动子35S和多克隆位点，构建重组载体pBI121-35S MCS。具体步骤为：以质粒pBI121-GUS为模板，用引物ZZF47和ZZF48进行PCR扩增，获得35Spromoter。然后以35S promoter为模板，分别用3对引物ZZF47和ZZF49，ZZF47和ZZF50，ZZF47和ZZF51依次对其纯化回收产物进行PCR扩增，最终获得DNA片段35S-MCS。其中多克隆位点包括BamHI，XmaI，SmaI，XhoI和SacI。通过酶切位点HindIII和SacI将DNA片段35S MCS克隆到载体pBI121-GUS，从而获得新的双元载体pBI121-35SMCS，如图1所示。相关引物序列如下表1所示。

分别用ClaI和EcoRI，HindIII和SacI对pBI121-35S MCS载体进行双酶切，将酶切产物进行凝胶电泳，酶切的片段分别为1595bp和11313bp，915bp和11993bp，正确。且经测序验证，序列正确。

4、35S-AtLEC2过表达载体构建

用植物总RNA试剂盒(产品编号：5111050，杭州新景)，提取拟南芥种子RNA。用反转录试剂盒(产品编号：6210A，TaKaRa)反转录形成cDNA。以cDNA为模板，用LEC2特异性引物(FP：AAATGGATAACTTCTTACCCTTTC；RP：TCACCACCACTCAAAGTCGTTAAAG)进行PCR扩增，获得LEC2片段，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。然后以纯化回收产物为模板，分别用引物(LEC2FP-XbaI)和(LEC2RP-SacI)进行PCR扩增，分别在5’末端和3’末端加上单酶切位点，最终获得带有酶切位点的目的基因的XbaI-LEC2-SacI。通过双酶切位点XbaI和SacI将目的基因XbaI-LEC2-SacI插入双元载体pBI121-35S MCS，构成单基因表达载体pBI121-35S-AtLEC2，即pBI121-LEC2，如图2所示。然后转化感受态DH5α大肠杆菌，并进行酶切验证，LEC2目的片段带有BamHI和XhoI酶切位点，因此，用BamHI和XhoI酶切载体pBI121--LEC2后出现646bp和13316bp两个片段，如图3所示。用SacI和XbaI酶切载体pBI121-LEC2会将LEC2目的片段切下来，因此将酶切产物进行凝胶电泳后会出现1104bp的LEC2目的片段和12858bp的载体骨架片段，如图4所示，且LEC2目的片段经测序验证正确。将pBI121-LEC2表达载体进行根癌农杆菌的转化。

5、烟草幼苗的遗传转化

5.1烟草材料的获得

将野生型烟草种子放在铺有滤纸的小培养皿中，加入少许ddH₂O至刚好浸没种子，置于4℃冰箱春化2天。然后将种子播在有基质培养基的发芽盆中，待种子发芽至长有2片子叶后移栽至有基质培养基的盆栽盆中。经正常的浇水、施肥管理约2个月后，可得到实验所用的烟草材料。

5.2叶片表面消毒

1、从温室中取生长约2个月的烟草幼嫩叶片；

2、超净工作台中，用无菌水洗去叶片表面的杂质；

3、用75％的酒精浸泡叶片30s，同时缓慢摇晃；

4、将叶片置于无菌水中浸泡，除去叶片表面的酒精；

5、10％的次氯酸钠(0.05％的吐温-20)浸泡材料10min，边浸泡边轻轻振荡；

6、最后用无菌水洗4遍，完成叶片的表面消毒。

5.3叶盘法转化烟草

1、把经过表面消毒后的叶片切成大小为0.5-1.0cm²的正方形小块，将这些正方形小块平铺在T1培养基上，并用镊子轻柔的压叶片，保证叶片底面与培养基充分接触，每个培养皿放10个小叶片，用封口膜将培养皿封好，放于暗处，25±1℃的条件下预培养2-3天；

2、将含有植物表达载体的农杆菌在LB固体培养基中划线，28℃培养；

3、用牙签挑取含植物表达载体的农杆菌单菌落并接种到10mL含庆大霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，220rpm，28℃，24h；

4、将菌液转接到50mL含庆大霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，使其OD₆₀₀为0.015；

5、12h后测菌液约为OD₆₀₀＝0.8-1.0，离心3000rpm，5min，4℃，弃上清，然后用等体积的MS液体重悬；

6、用镊子将预培养的烟草叶片打若干孔后，使之在菌液中浸泡6min，边浸泡边轻轻摇晃，过程中要保证叶片完全浸在菌液中。取出叶片，用无菌滤纸吸干后，继续在T1培养基上25±1℃暗培养2-3天；

7、将共培养后的叶片转移到T2筛选培养基上，25±1℃，16h光照，8h黑暗，光照强度为30μmolm^-2.s^-1的条件下培养，15-20天即可观察到叶片边缘长出愈伤或丛生再生芽，约10天芽可长至2-3cm；

8、将2-3cm长的芽切下转入培养瓶(T2筛选培养基)中继续生长15天，然后转入T3生根培养基中开始生根，转入生根培养基之前必须将茎部多余的愈伤组织切除干净，25±1℃，16h光照，8h黑暗，光照强度为30μmol m^-2·s^-1的条件下培养；

9、约一周后，再生苗开始生根，根系长出；15天后待根系发达，打开组培瓶盖，将经过Kan筛选的烟草组培苗炼苗3-5天后，移栽至温室中；将组培苗根部所带有的生根培养基用清水冲洗干净，移栽至营养土(泥炭土:蛭石:珍珠岩＝6:3:1，v/v/v)中，浇足水，罩上保鲜袋约一周，放于温室中，存活率达100％，生长条件为27±1℃，自然光。在后期的生长过程中注意病虫害等防治工作。

其中，烟草的组织培养过程如图5所示。

烟草遗传转化过程中所使用的培养基：

预培养培养基(T1)：4.4g/L MS基本培养基、30g/L Sucrose、3.5g/L Phytagel^TM、1mg/L6-BA和0.1mg/LNAA，pH 5.8；

发芽培养基(T2)：4.4g/L MS基本培养基、30g/L Sucrose、3.5g/L Phytagel^TM、1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、300mg/L Timentin和75mg/L Kan，pH 5.8；

生根培养基(T3)：2.2g/L MS基本培养基、15g/L Sucrose、4.0g/L Phytagel^TM、0.1mg/LNAA、300mg/Ltimentin和75mg/L Kan，pH 5.8。

6、阳性转基因植株筛选和温室培养

待移栽至温室的烟草长至大约一个星期后对其进行分子鉴定：CTAB法提取转基因烟草的基因组DNA，经PCR验证AtLEC2。反应体系：rtaqmix:10ul,FP:0.5μl,RP:0.5ul,ddH₂O:8ul，基因组DNA 1ul。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸70s，35个循环，72℃保持10min，4℃保存。经过PCR分子鉴定和筛选得到7棵阳性转基因烟草，鉴定结果如图6所示。对T₁代转基因烟草进行分子鉴定共得到7棵阳性转基因烟草，鉴定结果如图6所示。将经过筛选的阳性转基因烟草组培苗炼苗3-5天后，移栽至温室温度26℃，自然光照下培养。

7、氮素缺失水培条件的设置

将含有LEC2基因的T₁代转基因烟草种子播种在含有卡那霉素的MS培养基上培养，选取阳性植株为实验材料，用优化后的Hoagland营养液培养，用Ca(NO₃)₂·4H₂O供给氮元素。实验设置正常氮素营养对照组与缺氮组，其中，正常氮素营养对照组氮素浓度为52.5ppm，缺氮组氮素浓度为1.25ppm。选取生长状况一致的转基因烟草先在1/8全素营养液中培养；隔三天后更换营养液，其中的Ca(NO₃)₂·4H₂O为全素条件下浓度的1/4，其他元素为全素条件下浓度的1/2；培养三天后再更换营养液，其中的Ca(NO₃)₂·4H₂O为全素条件下的1/4，其他元素为全素条件；在上述条件下进行培养，最后将用于做缺氮组的转基因烟草转入缺氮营养液中进行培养。之后按照下表2所示配方每隔三天换一次营养液。培养条件为温度20℃-30℃，光照16h黑暗8h。培养时应避免营养液暴漏在光照下。

表2：营养液配方(1L体系)

8、转基因烟草农艺性状的分析

分别记录野生型和含有LEC2基因的转基因烟草在缺氮水培条件下的叶绿素含量、叶片黄化程度及植株的表型变化，分析异位表达LEC2对转基因烟草低氮胁迫耐受性的影响，结果如图8-10所示。

图8为缺氮21天处理野生型与T₁代含有LEC2基因的转基因烟草的表型观察，图9为低氮处理不同时期时黄色叶片百分比，通过图可以看出当野生型烟草出现黄色叶片时，含有LEC2基因的T₁转基因烟草叶片仍为绿色，且随着低氮处理时间的增加含有LEC2基因的T₁转基因烟草叶片虽然开始变黄但是黄色叶片百分比依然低于野生型烟草。图10为含有LEC2基因的T₁转基因烟草低氮条件下叶绿素含量的分析，可以看出含有LEC2基因的T1转基因烟草低氮条件下叶绿素含量高于野生型。

低氮胁迫时，植物会在生理等水平上发生一系列反应从而提高植物的低氮胁迫耐受性。研究发现异位表达LEC2的转基因烟草与野生型相比叶片衰老缓慢，且叶绿素含量高于野生型，表现出低氮胁迫耐受性。因此LEC2的异位表达可以提高植物的低氮胁迫耐受性。

需要说明的是，上述实施例为发明性的，并不以此限制本发明的保护范围。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰，这种变化和修饰均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江农林大学

<120> LEC2基因在提高植物低氮胁迫耐受性上的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1092

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 1

atggataact tcttaccctt tccctcttct aacgcaaact ctgtccaaga actctctatg 60

gatcctaaca acaatcgctc gcacttcaca acagtcccta cttatgatca tcatcaggct 120

cagcctcatc acttcttgcc tccgttttca tacccggtgg agcagatggc ggcggtgatg 180

aatcctcagc cggtttactt atcggagtgt tatcctcaga tcccggttac gcaaaccgga 240

agtgaattcg gttctctggt tggtaatcct tgtttgtggc aagagagagg tggttttctt 300

gatccgcgta tgacgaagat ggcaaggatc aacaggaaaa acgccatgat gagatcaaga 360

aacaactcta gccctaattc tagtccaagt gagttggttg attcaaagag acagctgatg 420

atgcttaact tgaaaaataa cgtgcagatc tccgacaaga aagatagcta ccaacagtcc 480

acatttgata acaagaagct tagggttttg tgtgagaagg aattgaagaa cagcgatgtt 540

gggtcactcg ggaggatagt tctaccaaag agagatgcag aagcaaatct tccgaagcta 600

tctgataaag aaggaatcgt tgtacagatg agagatgttt tctctatgca gtcttggtct 660

ttcaaataca agttttggtc caataacaag agcagaatgt atgtcctcga gaacacagga 720

gaatttgtga agcaaaatgg agctgagata ggagactttt taacaatata cgaggacgaa 780

agcaagaatc tctacttcgc catgaatgga aattcgggaa aacaaaatga aggaagagaa 840

aatgagtcga gggaaaggaa ccactacgaa gaggcaatgc ttgattacat accaagagac 900

gaagaggaag cttccattgc aatgctcatc ggaaatctaa acgatcacta tcccatccct 960

aacgatctca tggacctcac cactgacctt cagcaccatc aagccacgtc ctcatcaatg 1020

ccacctgagg atcacgcgta cgtgggttca tccgatgatc aggtgagctt taacgacttt 1080

gagtggtggt ga 1092

<210> 2

<211> 363

<212> PRT

<213> 拟南芥

<400> 2

Met Asp Asn Phe Leu Pro Phe Pro Ser Ser Asn Ala Asn Ser Val Gln

1 5 10 15

Glu Leu Ser Met Asp Pro Asn Asn Asn Arg Ser His Phe Thr Thr Val

20 25 30

Pro Thr Tyr Asp His His Gln Ala Gln Pro His His Phe Leu Pro Pro

35 40 45

Phe Ser Tyr Pro Val Glu Gln Met Ala Ala Val Met Asn Pro Gln Pro

50 55 60

Val Tyr Leu Ser Glu Cys Tyr Pro Gln Ile Pro Val Thr Gln Thr Gly

65 70 75 80

Ser Glu Phe Gly Ser Leu Val Gly Asn Pro Cys Leu Trp Gln Glu Arg

85 90 95

Gly Gly Phe Leu Asp Pro Arg Met Thr Lys Met Ala Arg Ile Asn Arg

100 105 110

Lys Asn Ala Met Met Arg Ser Arg Asn Asn Ser Ser Pro Asn Ser Ser

115 120 125

Pro Ser Glu Leu Val Asp Ser Lys Arg Gln Leu Met Met Leu Asn Leu

130 135 140

Lys Asn Asn Val Gln Ile Ser Asp Lys Lys Asp Ser Tyr Gln Gln Ser

145 150 155 160

Thr Phe Asp Asn Lys Lys Leu Arg Val Leu Cys Glu Lys Glu Leu Lys

165 170 175

Asn Ser Asp Val Gly Ser Leu Gly Arg Ile Val Leu Pro Lys Arg Asp

180 185 190

Ala Glu Ala Asn Leu Pro Lys Leu Ser Asp Lys Glu Gly Ile Val Val

195 200 205

Gln Met Arg Asp Val Phe Ser Met Gln Ser Trp Ser Phe Lys Tyr Lys

210 215 220

Phe Trp Ser Asn Asn Lys Ser Arg Met Tyr Val Leu Glu Asn Thr Gly

225 230 235 240

Glu Phe Val Lys Gln Asn Gly Ala Glu Ile Gly Asp Phe Leu Thr Ile

245 250 255

Tyr Glu Asp Glu Ser Lys Asn Leu Tyr Phe Ala Met Asn Gly Asn Ser

260 265 270

Gly Lys Gln Asn Glu Gly Arg Glu Asn Glu Ser Arg Glu Arg Asn His

275 280 285

Tyr Glu Glu Ala Met Leu Asp Tyr Ile Pro Arg Asp Glu Glu Glu Ala

290 295 300

Ser Ile Ala Met Leu Ile Gly Asn Leu Asn Asp His Tyr Pro Ile Pro

305 310 315 320

Asn Asp Leu Met Asp Leu Thr Thr Asp Leu Gln His His Gln Ala Thr

325 330 335

Ser Ser Ser Met Pro Pro Glu Asp His Ala Tyr Val Gly Ser Ser Asp

340 345 350

Asp Gln Val Ser Phe Asn Asp Phe Glu Trp Trp

355 360

Claims

1.LEC2基因在提高烟草低氮胁迫耐受性上的应用，其特征在于：所述LEC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：02所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：通过在植物体内异位或异源表达LEC2基因以提高植物的低氮胁迫耐受性。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述LEC2基因来自拟南芥。

4.一种提高烟草低氮胁迫耐受性的方法，其特征在于：包括：（1）构建含有LEC2基因的重组植物表达载体，所述LEC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示、氨基酸序列如SEQID NO：02所示；（2）将构建的重组植物表达载体转化到植物组织或细胞中；（3）培育筛选得到低氮胁迫耐受性增强的转基因植株。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组植物表达载体的构建方法为：首先提取拟南芥种子RNA，反转录形成cDNA，以cDNA为模板，扩增LEC2基因片段；然后将LEC2基因片段插入到双元载体pBI121中，构建重组植物表达载体pBI121-LEC2。