CN108795973B

CN108795973B - 拟南芥糖基转移酶基因ugt79b8在提高植物光合效率中的应用

Info

Publication number: CN108795973B
Application number: CN201810667524.4A
Authority: CN
Inventors: 侯丙凯; 刘倩; 李燕洁
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2038-06-26
Also published as: CN108795973A

Abstract

本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用，其中所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通过RT‑PCR技术从拟南芥中克隆的。本发明利用基因UGT79B8构建植物过表达载体进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因过表达植物的光合效率显著提高，鲜重干重增加。预示本发明实施后将提高作物的生物量或产量，对我国农业生产具有重大意义。

Description

拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用

技术领域

本发明涉及一个糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体(通常是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水溶性、在细胞内和整体植株的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还能降低或消除内源和外源物质的毒性(Lim and Bowles,2004；Bowles et al.,2006；Wangand Hou,2009)。因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长发育等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物次生代谢物合成以及植物信号转导、植物防御反应等(Wang and Hou,2009；Lin et al 2016；Li andLi et al 2016；Huang et al 2017)。但是目前为止有关拟南芥糖基转移酶基因在提高光合效率方面的应用未见报道。

生物界存在的糖基转移酶按照所催化的底物性质和序列相关性分属94个不同的家族。其中家族1包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。在家族1中大多数基因C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列，即PSPG盒(plant secondary productglycosyltransferase box)。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana)全基因组测序的完成，通过对PSPG盒的序列分析发现拟南芥中共有119个可能的糖基转移酶，这些糖基转移酶中大部分的功能还不清楚。

拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8是拟南芥糖基转移酶家族1中的一个成员，目前它的基因序列已公开于核酸序列数据库中。但是经过检索，有关拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8具有促进光合作用并提高生物量的积累这一应用却未见报道。

发明内容

(1)本发明的目的

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用。

(2)本发明的技术方案

本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用。

本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高叶绿素含量中的应用。

其中：所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述拟南芥糖基转移酶UGT79B8的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。

本发明利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆糖基转移酶基因UGT79B8，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明该转基因植物的光合效率得到显著提高，叶绿素含量也明显提高，相应的植株鲜重干重提高，生物量增加。

(3)本发明实施后可能带来的有益效果

本发明首次证明拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8能够通过提高光合效率进而增加生物量。实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物的光合效率(见图1、图2、图3、图4和图5)。预示本发明实施后将会大大提高作物产量，对我国农业生产具有重大意义。

附图说明

图1.RT-PCR检测UGT79B8过表达株系实验。

将获得的UGT79B8T3代纯合株系和WT种子，灭菌后铺到含MS培养基的培养皿中，4度春化3天后，置于22℃中培养14天。分别提取RNA，反转录成cDNA后，用RT-PCR检验UGT79B8的过表达株系。实验结果显示，在OE-9/12株系中UGT79B8表达量明显上调，以后的实验均采用这两个株系作为材料。

图2.正常生长条件下UGT79B8过表达株系的生长优于对照。

其中以WT为拟南芥对照植物，79B8OE-9/12为两个过表达株系。

将MS培养基里长至14天的幼苗移到营养土，在正常生长条件下生长至四周大小，发现里79B8OE-9/12株系的生长明显优于对照株系。

图3.正常生长条件下UGT79B8过表达株系的叶绿素含量高于对照。

分别称取0.2g莲座叶并剪碎置于含有1mL二甲基亚砜的试管里(每一株系6个重复)，60℃烘2-4h后，加入4mL 80％丙酮，摇匀后利用分光光计测定OD₆₆₃和OD₆₄₅并计算叶绿素的含量，结果显示过表达株系的叶绿素含量明显高于WT。试验结果表明UGT79B8可以提高叶绿素含量。

图4.正常生长条件下UGT79B8过表达株系提高光合效率实验。

在营养土里生长至四周的苗子，经过半小时黑暗处理后，利用荧光仪测定UGT79B8过表达株系和WT的光合性能指标。实验结果发现，该基因过表达以后，荧光信号显著上升(Fo、Fm)，光能的吸收(ABS/CS)、捕获(Tro/CS)、电子传递(Eto/CS)效率和热耗散比率(Dio/CS)均有所提高，反应中心的数量(RC)和质体醌库(Sm)增加，光合性能提高(PI)。尤其是OE-12光合性能的提高最明显，说明该基因主要影响植物的光合效率。

图5.正常生长条件下UGT79B8过表达株系的鲜重干重测定实验。

在营养土里长至4周大小的苗子，这时未抽薹。用剪刀剪下苗子的地上部，确定没有杂质污染后立即利用分析天平称取重量即为鲜重，置于纸袋里并放于50℃烘箱一周，再次称重即为干重。(每一株系测定15棵苗子，重复三次)。实验结果发现，与WT拟南芥相比，过表达株系OE-9和OE-12均可以提高植株鲜重，并且OE-12在增加植株干重更加显著。该结果表明UGT79B8可以提高植株鲜重干重，增加了生物量。

具体实施方式

实施例1拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8的克隆

1.基因UGT79B8的克隆

通过公开网站http://www.cazy.org获得UGT79B8基因的cDNA序列。根据cDNA序列设计引物，正向引物为79B8-F:5’-GGATCCATGGAGCCAACGTTCCATGC-3’，反向引物为79B8-R:5’-GAGCTCTCAAATCAAATACTCTTGCA-3’。利用TRIzol试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增UGT79B8基因的全长cDNA序列。连入Blunt simple载体中，构建成测序中间载体，经过测序验证后，利用BamHI和SacI酶切后连入同样酶切位点消化后的pBI121表达载体。

2.基因UGT79B8的序列信息与特性分析

UGT79B8基因的编码区CDS为1329bp(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，编码442个氨基酸的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，C端具有44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。

实施例2拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8的转基因应用

1.含有UGT79B8编码区CDS表达载体的构建

pK79B8中间测序载体经过BamHI和SacⅠ双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全长cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，命名为pB79B8。

2.农杆菌介导植物转化

农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT79B8植物表达载体(pB79B8)转入农杆菌，然后进行PCR验证验证。利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集T1代种子并在筛选培养基上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮筛选，挑选出绿苗:白苗为3:1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。

3.过表达转基因植株分子鉴定

对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。UGT79B8在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGT79B8表达量高的株系，即79B8OE-9、79B8-12，来进行后续的工作。

4.UGT79B8基因的提高光合效率的功能验证

A.正常生长条件下UGT79B8过表达株系的生长优于对照。其中以WT为拟南芥对照植物，79B8OE-9/12为两个过表达株系。将MS培养基里长至14天的幼苗移到营养土，在正常生长条件下生长至四周大小，发现里79B8OE-9/12株系的生长明显优于对照株系。

B.正常生长条件下UGT79B8过表达株系的叶绿素含量高于对照。分别称取0.2g莲座叶并剪碎置于含有1mL二甲基亚砜的试管里(每一株系6个重复)，60℃烘2-4h后，加入4mL80％丙酮，摇匀后利用分光光计测定OD₆₆₃和OD₆₄₅并计算叶绿素的含量，结果显示过表达株系的叶绿素含量明显高于WT。试验结果表明UGT79B8可以提高叶绿素含量。

C.正常生长条件下UGT79B8过表达株系提高光合效率实验。在营养土里生长至四周的苗子，经过半小时黑暗处理后，利用荧光仪测定UGT79B8过表达株系和WT的光合性能指标。实验结果发现，该基因过表达以后，荧光信号显著上升(Fo、Fm)，光能的吸收(ABS/CS)、捕获(Tro/CS)、电子传递(Eto/CS)效率和热耗散比率(Dio/CS)均有所提高，反应中心的数量(RC)和质体醌库(Sm)增加，光合性能提高(PI)。尤其是OE-12光合性能的提高最明显，说明该基因主要影响植物的光合效率。

D.正常生长条件下UGT79B8过表达株系的鲜重干重测定实验。在营养土里长至4周大小的苗子，这时未抽薹。用剪刀剪下苗子的地上部，确定没有杂质污染后立即利用分析天平称取重量即为鲜重，置于纸袋里并放于50℃烘箱一周，再次称重即为干重。(每一株系测定15棵苗子，重复三次)。实验结果发现，与WT拟南芥相比，过表达株系OE-9和OE-12均可以提高植株鲜重，并且OE-12在增加植株干重更加显著。该结果表明UGT79B8可以提高植株鲜重干重，增加了生物量。

上述实验结果及数据见图1、图2、图3、图4和图5。显示本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中具有广泛的应用；在提高叶绿素含量、增加生物量中的应用前景良好。

序列表

<110>山东大学

<120>拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用

<141> 2018-6-10

<160>4

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213>人工序列

<221>拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8

<222>（1）…（1329）

<400> 1

atggagccaa cgttccatgc ttttatgttt ccctggtttg cttttggtca tatgattcct 60

tttctacatc ttgcaaacaa actagctgag aaaggtcatc aaatcacttt cttgctacct 120

aagaaagccc aaaaacagtt ggaacatcac aatctgttcc cagacagtat tgtctttcac 180

cctctcacaa tccctcatgt caatggcctc cctgctggtg ctgagacaac ctcggatatc 240

tcaatctcga tggacaactt actgtcggaa gccttggatc tcactcgcga tcaggttgaa 300

gctgcggttc gtgctctgag accggacttg atcttttttg attttgctca ttggattcca 360

gaaattgcca aagagcatat gatcaagagt gtgagttaca tgatagtatc tgcaacaaca 420

atagcttata catttgcccc tggtggtgta ttaggtgttc ccccaccagg ttatccttca 480

tcaaaggtgt tgtaccgtga aaacgatgct catgccttag caaccttatc tatcttctac 540

aagagacttt atcatcagat cactacaggt tttaagagct gtgacatcat tgcattgagg 600

acatgtaatg aaatcgaagg taaattctgc gactatatat caagtcaata ccataagaag 660

gttctcttga ctggtccaat gctccctgag caagacacaa gtaaaccact agaagaacag 720

ttgagtcatt ttctgagcag gttcccaccg aggtcagtgg tgttttgtgc acttggtagc 780

cagatcgttc ttgaaaagga tcaattccaa gaactctgct tagggatgga gctgacaggt 840

ttaccgtttc ttatagcggt aaagccaccg agaggatcat cgacggtcga agaagggtta 900

ccagaagggt tccaggagcg ggtgaaaggg cgtggtgtgg tttggggagg atgggtgcaa 960

caaccattga tattggatca tccgtcaata ggctgctttg tgaaccattg tggtccggga 1020

acaatatggg agtgtcttat gactgattgt caaatggttt tgcttccatt tttaggtgat 1080

caagttctct tcacaagatt gatgaccgag gaattcaagg tgtctgtaga agtgtcgaga 1140

gaaaaaacag gatggttttc aaaggagagc ttgagcgatg cgatcaagtc tgtgatggat 1200

aaagatagcg acctcggaaa gctagtgagg agtaaccacg ccaaattgaa ggagactctt 1260

ggtagtcatg gattattaac tggttacgtg gataaatttg tagaggaatt gcaagagtat 1320

ttgatttga 1329

<210> 2

<211> 442

<212> PRT

<213>人工序列

<221> 拟南芥糖基转移酶UGT79B8的氨基酸序列

<222>（1）…（442）

<400> 2

MEPTFHAFMF PWFAFGHMIP FLHLANKLAE KGHQITFLLP KKAQKQLEHH NLFPDSIVFH 60

PLTIPHVNGL PAGAETTSDI SISMDNLLSE ALDLTRDQVE AAVRALRPDL IFFDFAHWIP 120

EIAKEHMIKS VSYMIVSATT IAYTFAPGGV LGVPPPGYPS SKVLYRENDA HALATLSIFY 180

KRLYHQITTG FKSCDIIALR TCNEIEGKFC DYISSQYHKK VLLTGPMLPE QDTSKPLEEQ 240

LSHFLSRFPP RSVVFCALGS QIVLEKDQFQ ELCLGMELTG LPFLIAVKPP RGSSTVEEGL 300

PEGFQERVKG RGVVWGGWVQ QPLILDHPSI GCFVNHCGPG TIWECLMTDC QMVLLPFLGD 360

QVLFTRLMTE EFKVSVEVSR EKTGWFSKES LSDAIKSVMD KDSDLGKLVR SNHAKLKETL 420

GSHGLLTGYV DKFVEELQEY LI 442

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 正向引物79B8-F

<222>（1）…（26）

<400> 3

ggatccatgg agccaacgtt ccatgc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 反向引物79B8-R

<222>（1）…（26）

<400> 4

gagctctcaa atcaaatact cttgca 26

Claims

1.拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物光合效率中的应用；其中所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，所述植物是拟南芥。

2.拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8在提高植物叶绿素含量中的应用；其中所述拟南芥糖基转移酶基因UGT79B8的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，所述植物是拟南芥。