CN115948423A - Snac1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的SNAC1基因在水稻植株中过表达，可以显著提高水稻对褐飞虱的抗性，以及促进水稻在褐飞虱胁迫下抗虫物质类黄酮的积累。本发明为水稻抗褐飞虱的关键分子遗传机理提供了依据，对培育抗性水稻品种、提高水稻质量和品质具有重要指导意义。

Description

SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用

技术领域

本发明属于植物病虫害防治技术领域，更具体为水稻SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。

背景技术

水稻(OryzasativaL.)是我国主要粮食作物，褐飞虱(Nilaparvatalugens)是当前水稻生产上的最具毁灭性的害虫之一，被我国农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》。由于褐飞虱致害性变异造成水稻品种抗虫性衰退以及抗虫品种资源的匮乏等原因，在农业生产中对褐飞虱的防治主要依赖于化学农药，然而化学农药的过多施用不仅会威胁食品安全和生态环境，而且容易导致褐飞虱的高抗药性。目前认为，培育和应用抗虫水稻品种是农业防治褐飞虱最有效和最环保的策略。因此，鉴定抗褐飞虱基因和解析抗褐飞虱机制是水稻抗虫育种成功的关键。

目前，通过正向遗传学图位克隆的方法已经成功分离到的抗褐飞虱基因已经超过15个。第一个被克隆的抗褐飞虱基因BPH14编码一个典型的CC-NB-LRR类NLR蛋白，该蛋白通过与转录因子WRKY46和WRKY72互作调控胼胝质合成酶基因的表达，从而诱导胼胝质在筛管细胞的沉积以阻止褐飞虱吸取水稻韧皮部的汁液，进而提高水稻对褐飞虱的抗性。包括Bph9在内的多个抗褐飞虱基因集聚于水稻第12染色体长臂上，且主要编码NLR类蛋白。抗褐飞虱基因Bph3和Bph15编码一类定位于细胞膜的凝集素受体激酶(LecRKs)，可能作为植物免疫受体感知植食性昆虫相关模式分子(HAMPs)或者植物损伤模式分子(DAMPs)并激活水稻免疫反应，从而提高水稻植株对稻飞虱(褐飞虱和白背飞虱)的广谱和持久抗性。此外，抗褐飞虱基因BPH6编码一个新型非典型的LRR类蛋白，该蛋白通过与胞泌复合体亚基蛋白OsEXO70E1互作调控水稻细胞蛋白的外泌，同时通过整合多种植物激素信号，从而保持韧皮部细胞细胞壁成分和结构的稳定以阻碍褐飞虱取食，最终实现对稻飞虱的广谱抗性。而另一个最新克隆的抗褐飞虱基因Bph30则是编码一个含有两个LRR结构域的新蛋白，该基因在水稻叶鞘厚壁组织细胞中高度表达，通过促进纤维素和半纤维素在厚壁组织细胞中的积累以强化厚壁组织，从而形成坚固的物理屏障阻止褐飞虱口器穿刺到达韧皮部取食汁液。总体而言，目前克隆的褐飞虱基因主要编码NLR受体蛋白或LecRKs，其可能通过介导植物抗病类似的PTI或ETI反应来提高水稻植株对褐飞虱的抗性；这些水稻抗褐飞虱基因的鉴定，为保障水稻产量和品质提供了很好的认知。

目前在水稻-褐飞虱互作方面的研究显示，水稻响应褐飞虱胁迫的分子机制非常复杂，多种分子参与调控该过程，包括MAPK级联反应途径，植物激素和次生代谢产物等。在MAPK途径中，OsMKK3蛋白正调控水稻对褐飞虱抗性，而OsMAPK20-5则会削弱水稻植株对褐飞虱的抗性；OsERF3通过在抗虫反应早期抑制MAPK途径的抑制子进而负调控水稻对褐飞虱的抗性；OsMPK3/OsMPK6蛋白能够能够激活转录因子OsWRKY70，进而降低水稻植株对褐飞虱的抗性。在植物激素中，水杨酸(SA)途径参与Bph9-、Bph14-、和Bph29-介导的褐飞虱抗性反应，而转录因子OsMYB30能够通过调控SA合成的上游主要途径-苯丙氨酸裂解酶途径关键基因OsPALs表达，促进SA和木质素的合成和积累，进而提高水稻植株对褐飞虱的抗性；另一种重要的抗虫激素茉莉素(JA)被证明也能够正调控水稻对褐飞虱抗性；而其他的生长相关激素(赤霉素GA、油菜素内酯BR、乙烯etheylene)则被发现负调控水稻对褐飞虱抗性。在次生抗性代谢物调控水稻对褐飞虱抗性方面，目前发现黄酮类物质是一类重要的水稻抗虫物质，miR396/OsGRF8分子模块能够通过调控类黄酮合成途径关键酶基因OsF3H的表达，从而提高水稻植株对褐飞虱的抗性。

综上所述，目前关于水稻响应褐飞虱胁迫的分子机制还有待进一步解析，同时由于含有抗褐飞虱基因的水稻品种的抗虫性容易丢失，因此不断深入挖掘水稻响应褐飞虱过程的重要基因在农业防治褐飞虱中至关重要。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是克服目前水稻抗褐飞虱基因资源的不足，提供了SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，为通过分子育种手段培育水稻抗虫新品系提供了依据。

本发明的第一个目的是提供SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，所述SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在NCBI中的Genesymbol为LOC4334553。

具体地，所述的SNAC1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

具体地，所述提高水稻对褐飞虱抗性，是通过在水稻中过表达SNAC1基因，提高水稻对褐飞虱的抗性。

本发明的第二个目的是提供SNAC1基因在提高水稻在褐飞虱胁迫下的类黄酮含量的应用，所述的SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，所述的提高水稻在褐飞虱胁迫下的类黄酮含量，是通过在水稻植株中过表达SNAC1基因，促进褐飞虱取食后抗虫物质类黄酮含量的积累。

具体地，所述的类黄酮含量的积累，是SNAC1通过特异性结合类黄酮合成关键酶基因的启动子并激活其转录，促进类黄酮合成关键酶合成。

具体地，所述的类黄酮合成关键酶基因为OsF3H，其在NCBI中的Genesymbol为LOC4331443。

本发明的第三个目的是提供一种提高水稻对褐飞虱抗性的方法，其特征在于，是在水稻中过表达SNAC1基因，优选是将含SNAC1基因的过表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将SNAC1基因导入水稻外植体，再将被转化的外植体培育成植株，使所述的SNAC1基因在水稻植株中过表达。

本发明的第四个目的是提供一种提高水稻在褐飞虱胁迫下的类黄酮含量的方法，其特征在于，是在水稻中过表达SNAC1基因，优选是将含SNAC1基因的过表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将SNAC1基因导入水稻外植体，再将被转化的外植体培育成植株，使所述的SNAC1基因在水稻植株中过表达。

优选地，所述的SNAC1高表达载体为pBWA(V)HS-SNAC1。

优选地，所述的水稻为中花11。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了水稻SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，高表达水平的SNAC1基因可以显著提高水稻对褐飞虱的抗性。本发明还提供了褐飞虱胁迫下提高水稻抗虫物质类黄酮含量的方法，高表达水平的SNAC1基因可显著提高水稻类黄酮的含量。本发明为水稻抗褐飞虱的关键分子遗传机理提供了依据，对培育抗性水稻品种、提高水稻质量和品质具有重要指导意义。

附图说明

图1是SNAC1基因过表达和突变体材料构建和鉴定结果图；其中图a是SNAC1基因的CRISPR-Cas9打靶位点设计示意图和snac1-cas9植物鉴定结果图；图b是SNAC1基因过表达载体示意图；图c是SNAC1-OE植物鉴定结果图。

图2是SNAC1-OE和snac1-cas9水稻相对野生型水稻在褐飞虱处理前后的表型结果图；其中图a-c分别是4周左右的野生型、snac1-cas9和SNAC1-OE水稻植株在褐飞虱处理5天后的表型分析(a)、植物鲜重(b)和植株死亡率(c)统计分析结果。

图3是SNAC1调控OsF3H表达促进褐飞虱取食后类黄酮含量积累的结果图。图a是定量PCR检测褐飞虱取食24h后野生型、SNAC1-OE和snac1-cas9植株中OsF3H基因表达结果；图b是ChIP-qPCR分析SNAC1结合OsF3H基因启动子区域含NACSR元件结果；图c是褐飞虱取食24h后野生型和SNAC1-OE水稻植株中类黄酮含量结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：水稻SNAC1基因过表达和突变体材料对褐飞虱抗性表型分析

一、SNAC1基因过表达和CRISPR-cas9敲除的载体构建以及相关遗传转化材料鉴定，具体实验方法及结果如下：

1、实验方法

(1)在SNAC1基因第一个外显子上设计CRISPR-Cas9打靶序列(CCACCCCACGGACGACGAGCTGG)，利用单子叶植物CRISPR-Cas9系统(由华南农业大学刘耀光院士团队提供)按照参考文献(DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007)的方法将打靶序列克隆到pYLCRISPR/Cas9双原载体，打靶设计如图1a所示。

(2)克隆SNAC1基因的编码区全长(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并将其插入到花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的pBWA(V)HS载体的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间，通过无缝克隆(In-FusionCloning)技术，构建pBWA(V)HS-SNAC1过表达载体，过表达载体构建如图1b所示。

(3)将所得载体转化至农杆菌EHA105后，遗传转化得到稳定植株，即获得敲除突变体材料snac1-cas9和过表达材料SNAC1-OE植株(此步骤为公司代为构建)。

(4)运用CTAB法提取敲除突变体材料snac1-cas9植株的叶片总DNA，通过普通PCR扩增SNAC1靶点区域，并将PCR产物进行碱基测序鉴定。PCR引物序列为F：ATCTCCTCTTCTTCCCGCAG和R：TCCAATCAGTCTTGACCCCT。

(5)运用Trizol法提取过表达材料SNAC1-OE植株的叶片总RNA，并反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)在mRNA水平检测SNAC1基因的表达水平，以中花11野生型水稻植株作为对照。

SNAC1的定量PCR引物序列为：

F：ATCGCCGAGGTGGATCTCTA；

R：AATCAGTCTTGACCCCTCGC。

内参基因为OsActin1，基因号为LOC_Os03g50885，其定量PCR引物序列为：

F：CATTGGTGCTGAGCGTTTCC；

R：CCCGCAGCTTCCATTCCTAT。

2、实验结果

如图1c所示，五个过表达株系中SNAC1基因的表达量相比野生型水稻植株均大幅上调，我们从中选择了OE#8和OE#11两个表达上调最高的株系进行后续褐飞虱抗性分析；如图1a所示，通过CRISPR-Cas9技术获得了对SNAC1基因具有两种不同打靶敲除效果的snac1-cas9植株snac1-cas9#2和snac1-cas9#6。

二、SNAC1-OE和snac1-cas9植株的对褐飞虱耐受性表型分析，具体实验方法及结果如下：

1、实验方法

(1)水稻种子(SNAC1-OE、snac1-cas9和中花11野生型水稻)播种于包含1/2MS培养基平皿上，培养皿放置于14h光照/10h黑暗、80％相对湿度、温度为28℃的培养间中培养。将10天左右的水稻幼苗移栽到塑料盆钵(直径14cm，高15cm)内，每盆20株，置于温室(14h光照/10h黑暗、70％相对湿度、温度为28℃)生长到4-5叶期进行褐飞虱胁迫处理。

(2)褐飞虱供试种群为在敏感种群TN1饲养多年种群，选取长势良好的4周大小水稻植株，按每株5只的比例接入3-4龄若虫，以不接虫为对照，设置三个重复，观察水稻生长状况并统计水稻植株死亡率和鲜重。

2、实验结果

SNAC1-OE和snac1-cas9水稻植株相比野生型水稻在褐飞虱处理后的表型结果如图2所示，可以看出相比野生型水稻植株，SNAC1-OE过表达植株(SNAC1-OE#8和#11)对褐飞虱的抗性显著增强，而snac1-cas9植株(snac1-cas9#2和#6)则对褐飞虱取食更为敏感(图2a)，同时植株鲜重(图2b)以及植株死亡率(图2c)统计数据也支持该表型结果。这些结果说明，SNAC1正调控水稻响应褐飞虱胁迫过程，过表达SNAC1基因能够可显著提高水稻对褐飞虱的抗性。

实施例2：SNAC1直接调节OsF3H的表达促进褐飞虱诱导的类黄酮含量积累

一、褐飞虱处理前后SNAC1-OE和snac1-cas9植株中OsF3H的基因表达分析，具体实验方法及结果如下：

1、实验方法

(1)野生型水稻、SNAC1-OE和snac1-cas9植株的种植方法同实施例1；

(2)在步骤(1)所得水稻植株上接种3龄期褐飞虱(每株10只)为接种组，不接种褐飞虱为对照组(CK)，在接种褐飞虱24h后同时进行对照组和接种组的茎部取样；

(3)运用Trizol法提取步骤(2)所得材料的总RNA，并反转录为cDNA，利用qRT-PCR检测OsF3H基因的表达水平。

OsF3H的定量PCR引物序列为：

F：CGCTACCTCCCTGATTGG；

R：ACCTTCTTGATGTAGTCCTGTTC。

内参基因为OsActin1，基因号同上，其定量PCR引物序列为：

F：CATTGGTGCTGAGCGTTTCC；

R：CCCGCAGCTTCCATTCCTAT。

2、实验结果

结果如图3a所示，在褐飞虱取食24h后，相比野生型水稻植株，SNAC1-OE植株中OsF3H的表达量显著增高，而snac1-cas9植株中OsF3H的表达量均显著降低。说明，SNAC1影响水稻响应褐飞虱胁迫过程中OsF3H的基因表达，过表达SNAC1基因能够显著提高水稻植株中褐飞虱诱导的OsF3H基因表达水平。

二、ChIP-qPCR分析SNAC1对OsF3H基因启动子的结合，具体实验方法及结果如下：

1、实验方法

(1)带Flag标签的SNAC1-OE植株水稻种子播种于包含1/2MS培养瓶中，培养瓶放置于14h光照/10h黑暗、80％相对湿度、温度为28℃的培养间中培养至14天左右；

(2)收取步骤(1)所得水稻植株的茎部材料2g，加入含1％甲醛的30mLPBS缓冲液，真空交联30min。利用液氮将交联后的样品研磨成粉，加入30mL提取液(0.4M蔗糖；10mMTris-HCl，pH8.0；5mMβ-巯基乙醇)，接着通过超声波细胞破碎仪打断染色质，超声波破碎功率设置为40Hz，超声破碎时间设置为超声30秒，停顿30秒，总时间为25分钟，将染色质打断至200bp左右。然后加入80μLProteinG磁珠和5μgFlag抗体在4℃条件下孵育过夜，最后将获得蛋白-DNA复合物在65℃孵育过夜进行解交联。

(3)利用DNA纯化试剂盒回收纯化解交联后的DNA，利用qRT-PCR检测OsF3H基因启动子P1和P2的相对定量水平。

2、实验结果

染色质免疫共沉淀ChIP-qPCR分析结果如图3b所示，SNAC1能够富集OsF3H基因启动子上含NACSR元件的P1和P2片段，说明SNAC1通过直接结合OsF3H基因的启动子调控OsF3H的表达从而介导水稻响应褐飞虱胁迫过程。

三、褐飞虱处理前后SNAC1-OE植株中类黄酮含量分析，具体实验方法及结果如下：

1、实验方法

(1)野生型水稻和SNAC1-OE植株的种植方法同实施例1；

(2)在步骤(1)所得水稻植株上接种3龄期褐飞虱(每株10只)为接种组，不接种褐飞虱为对照组(CK)，在接种褐飞虱24h后同时进行对照组和接种组的茎部取样；

(3)收取步骤(2)所得水稻植株的茎部材料100g，利用液氮磨碎，加入5mL50％乙醇4℃过夜萃取，离心后保留上清液；取0.1mL上清液用30％乙醇定容至1mL，然后加入60uLNaNO₂(0.5M)和60uLAlCl₃(0.3M)混匀进行反应，再加入0.4mLNaOH终止反应，最终用去离子水定容至2mL；

(4)通过酶标仪将步骤(3)所得样品在510nm处读取吸光度，并根据芦丁标准品曲线，进行类黄酮含量的分析。

2、实验结果

类黄酮含量分析结果如图3c所示，褐飞虱取食前，SNAC1-OE水稻植株中相比野生型水稻类黄酮含量没有显著差别；褐飞虱取食24h后，野生型水稻植株中类黄酮含量相比褐飞虱取食前显著增加，而SNAC1-OE植株相比野生型水稻类黄酮积累量更高。结合实施例2中的OsF3H基因表达和ChIP-qPCR结果，说明SNAC1通过直接调节OsF3H的表达促进褐飞虱诱导的类黄酮物质的积累，过表达SNAC1基因能够显著增加褐飞虱取食后水稻植株中类黄酮的含量。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQ ID NO.1(SNAC1的核苷酸序列)

ATGGGGATGGGGATGAGGAGGGAGAGGGACGCGGAGGCGGAGCTGAACCTGCCGCCG

GGGTTCAGGTTCCACCCCACGGACGACGAGCTGGTGGAGCACTACCTGTGCAGGAAGG

CGGCGGGGCAGCGCCTGCCGGTGCCGATCATCGCCGAGGTGGATCTCTACAAGTTCGAC

CCGTGGGATCTGCCCGAGCGCGCGCTGTTCGGCGCCAGGGAGTGGTACTTCTTCACCCC

GCGGGATCGCAAGTATCCTAATGGGTCACGCCCCAACCGCGCCGCCGGCAACGGGTACT

GGAAGGCCACCGGCGCCGACAAGCCCGTCGCGCCGCGGGGGCGCACGCTTGGGATCA

AGAAGGCGCTCGTGTTCTACGCCGGCAAGGCGCCGCGAGGGGTCAAGACTGATTGGAT

CATGCATGAGTACCGGCTCGCCGATGCTGGCCGCGCCGCCGCGGGCGCCAAGAAGGGA

TCTCTCAGGTTGGATGATTGGGTGCTGTGTCGGCTGTACAACAAGAAGAACGAGTGGGA

GAAGATGCAGCAGGGGAAGGAGGTGAAGGAGGAGGCGTCCGACATGGTTACGTCGCA

GTCGCACTCGCACACCCACTCGTGGGGCGAGACGCGCACGCCGGAGTCGGAGATCGTG

GACAACGACCCCTTCCCGGAGCTGGACTCGTTCCCGGCGTTCCAGCCTGCGCCGCCGCC

GGCGACGGCGATGATGGTGCCCAAGAAAGAATCGATGGACGACGCCACCGCGGCCGCC

GCCGCCGCCGCCACCATCCCCAGGAACAACAGCAGCCTGTTCGTGGACCTGAGCTACG

ACGATATCCAGGGCATGTACAGCGGCCTCGACATGCTGCCGCCGGGCGACGACTTCTAC

TCGTCGCTCTTCGCGTCGCCGCGGGTGAAGGGGACGACGCCACGCGCCGGCGCCGGCA

TGGGCATGGTCCCGTTCTGASEQ ID NO.2(SNAC1的氨基酸序列)

MGMGMRRERDAEAELNLPPGFRFHPTDDELVEHYLCRKAAGQRLPVPIIAEVDLYKFDPW

DLPERALFGAREWYFFTPRDRKYPNGSRPNRAAGNGYWKATGADKPVAPRGRTLGIKKAL

VFYAGKAPRGVKTDWIMHEYRLADAGRAAAGAKKGSLRLDDWVLCRLYNKKNEWEKM

QQGKEVKEEASDMVTSQSHSHTHSWGETRTPESEIVDNDPFPELDSFPAFQPAPPPATAMMV

PKKESMDDATAAAAAAATIPRNNSSLFVDLSYDDIQGMYSGLDMLPPGDDFYSSLFASPRV

KGTTPRAGAGMGMVPF。

Claims (10)

1.SNAC1基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，其特征在于，所述的SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的SNAC1基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高水稻对褐飞虱抗性，是通过在水稻中过表达SNAC1基因，提高水稻对褐飞虱的抗性。

4.SNAC1基因在提高水稻在褐飞虱胁迫下的类黄酮含量的应用，所述的SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的提高水稻在褐飞虱胁迫下的类黄酮含量，是通过在水稻植株中过表达SNAC1基因，促进褐飞虱取食后抗虫物质类黄酮含量的积累。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的类黄酮含量的积累，是SNAC1通过特异性结合类黄酮合成关键酶基因的启动子并激活其转录，促进类黄酮合成关键酶合成，所述的类黄酮合成关键酶基因为OsF3H，其在NCBI中的Gene symbol为LOC4331443。

7.一种提高水稻对褐飞虱抗性的方法，其特征在于，是在水稻中过表达SNAC1基因，所述的SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将含SNAC1基因的过表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将SNAC1基因导入水稻外植体，再将被转化的外植体培育成植株，使所述的SNAC1基因在水稻植株中过表达。

9.一种提高水稻在褐飞虱胁迫下的类黄酮含量的方法，其特征在于，是在水稻中过表达SNAC1基因，所述的SNAC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将含SNAC1基因的过表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将SNAC1基因导入水稻外植体，再将被转化的外植体培育成植株，使所述的SNAC1基因在水稻植株中过表达。

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