CN112708632B

CN112708632B - 一种非编码rna分子在小麦高产分子育种中的应用

Info

Publication number: CN112708632B
Application number: CN202110131704.2A
Authority: CN
Inventors: 李永春; 孟凡荣; 王瀑童; 张莉
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-01-30
Filing date: 2021-01-30
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2041-01-30
Also published as: CN112708632A

Abstract

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体涉及一种非编码RNA分子在小麦高产分子育种中的应用。本发明非编码RNA参与的基因调控网络与小麦籽粒发育分子调控过程密切相关，过表达该非编码RNA分子可实现小麦穗粒数增加和千粒重提高，在小麦高产分子育种方面具有潜在应用价值，具有很好的应用前景。在具体应用中，该非编码RNA过表达后小麦种子的粒长、粒宽均增加5%左右，小麦穗粒数增加7%～15%。

Description

一种非编码RNA分子在小麦高产分子育种中的应用

技术领域

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体涉及一种非编码RNA分子在小麦高产分子育种中的应用。

背景技术

小麦作为全球大约三分一人口主要的食物来源，是最重要粮食作物之一，开展小麦高产优质分子育种一直是农业研究领域的重要方向。

千粒重是决定小麦产量的关键性状，探讨小麦籽粒发育调控的分子机制及其在粒重调控方面的应用是开展小麦高产分子育种的重要基础。研究表明，在转录基因中只有1～2%编码蛋白质，大多数转录为非编码RNA(ncRNA)，在ncRNA中调控型ncRNA通常在基因表达调控中发挥重要作用，调控型ncRNA可进一步划分为microRNA(miRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)等。非编码RNA功能方面的研究主要集中在miRNA和siRNA，这两类小RNA都是通过碱基互补配对的原则识别特异靶位点，在有关蛋白因子的参与下形成沉默复合体(RISC)，并对靶基因的mRNA进行剪切或翻译抑制，最终实现对靶基因的转录后调控。

研究表明，在小麦生长发育和逆境胁迫响应过程中，依赖于非编码RNA的基因表达调控途径发挥着重要的调控功能。种子发育过程是小麦生长发育和产量形成的重要阶段，种子发育进程的调控直接影响到小麦的产量和品质，因此探讨非编码RNA在小麦种子发育调控过程中的生物学功能具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种小麦非编码RNA分子在调控小麦穗粒数和千粒重方面的应用。通过表达该非编码RNA分子，可实现小麦穗粒数和千粒重的增加，在小麦高产分子育种方面具有潜在应用价值。

本发明的技术方案是：

第一方面，

SEQ ID NO:1所示的非编码RNA分子的基因序列在调控小麦穗粒数中的应用。

SEQ ID NO:1所示的非编码RNA分子的基因序列在小麦高产育种中的应用。

第二方面，

SEQ ID NO:2所示的非编码RNA分子在调控小麦穗粒数中的应用。

SEQ ID NO:2所示的非编码RNA分子在小麦高产育种中的应用。

采用非编码RNA调控小麦穗粒数的过程具体如下：

1. 过表达载体构建：

将种子发育相关非编码RNA（graindevelopmental related non-conding RNA，GDRNR1）的基因序列插入到双元表达载体的多克隆位点（如图1）。在克隆GDRNR1基因时，可用引物GDRNR1-F（5’-CTACTACTGGGGAAGACGAAGAGG-3’）和GDRNR1-R（5‘-AGCTCCTCTTCTCCGCTTCATG-3’），以小麦种子基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后连接到通用克隆载体中，并通过测序分析验证克隆片段的正确性。

根据表达载体多克隆位点的特征，在上述引物GDRNR1-F和GDRNR1-R的上游引入适当的酶切位点或用于infusion连接的接头序列。

2. 遗传转化：

采用人工气候箱培养遗传转化材料，适宜条件为24℃，16h光照，光照强度为240umol•m^-2•s^-1，8h黑暗；利用基于幼胚培养的胚性愈伤组织进行遗传转化，可通过农杆菌或基因枪进行遗传转化。

3. 分子鉴定：

对GDRNR1过表达的植物材料进行DNA水平和RNA水平鉴定，提取GDRNR1过表达的植物基因组DNA和mRNA，并利用PCR和RT-PCR技术进行特异性检测分析。

鉴定该过表达植物材料时，上游引物采用启动子特异引物，如Ubiquitin启动子（包含5’UTR区域和第一内含子），具体可以采用特异引物YP2009（5’-GGAGCGCACACACACACAAC-3’），下游引物用GDRNR1基因特异引物GDRNR1-R（5’-AGCTCCTCTTCTCCGCTTCATG-3’），利用基因组DNA和cDNA为模板的扩增产物分别为1357bp和347bp。

4. 农艺性状鉴定及评价：

对于小麦材料的籽粒发育特性及表型鉴定分析可通过室内盆栽进行，具体种植方式可参照常规小麦盆栽技术进行。为了保证农艺性状鉴定的准确性，一般采用每平方米300株的种植密度，培养温度为24℃，每天光照16小时；开花后挂牌并标记日期，在花后40天测量株高，并单穗收获，测定穗长、穗粒数、粒长和粒宽等指标。与同等条件下种植的对照小麦材料相比较，分析该非编码RNA基因过表达后对籽粒发育及千粒重的影响。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供的与籽粒发育调控密切相关的非编码RNA编码基因在小麦高产分子育种方面具有潜在应用价值。

本发明非编码RNA参与的基因调控网络与小麦籽粒发育分子调控过程密切相关，过表达该编码基因可实现小麦穗粒数和千粒重明显增加，提高了小麦产量，在小麦高产分子育种方面具有潜在的应用价值，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为过表达非编码RNA基因GDRNR1的表达盒信息；

图2为利用该非编码RNA基因GDRNR1过表达后对小麦籽粒发育调控的效应。图2中上图为对照小麦材料和T₂代小麦转基因材料的穗型对比图，左为对照小麦材料，右为T₂代小麦转基因材料；图2中下图为对照小麦材料和T₂代小麦转基因材料小穗基部籽粒对比图，左为粒长对比图，右为粒宽对比图，图中第1列种子为对照，第2～4列为T₂代小麦转基因材料。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

下述实施例中的实验，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的方法；所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中所用小麦样本均获自国家种质库（http://icgr.cass.net.cn/cgris国家种质库.html）。

采用非编码RNA调控小麦千粒重的过程如下：

步骤1：过表达载体的构建：

采用常规方法提取小麦叶片基因组DNA，然后采用引物GDRNR1-F（5’-CTACTACT

GGGGAAGACGAAGAGG-3’）和GDRNR1-R（5’- AGCTCCTCTTCTCCGCTTCATG-3’）以小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR运行程序为：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃ 5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，将目标DNA片段（223bp）回收，并与pMD19-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨卞青霉素（100mg•L^-1）的LB培养基平板上筛选重组克隆，挑选单菌落，在1.5mL离心管中用1mL的LB培养基（含有氨卞青霉素100mg•L^-1）培养（180rpm•min^-1）过夜；取菌液1uL作为模板，利用T-载体通用引物YP0085（5‘-ATCGGTGCGGGCCTCTT-3’）和YP0086（5‘-GGCACCCCAGGCTTTACAC-3’）进行PCR扩增鉴定，PCR程序（95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min），扩增产物大小应为508bp；对鉴定正确的重组菌液扩摇培养，提取质粒并通过T-载体通用引物测序分析验证其序列的正确性。

测序验证正确的重组载体用于后续构建过表达载体的模板，采用引物GDRNR1-Fu（5’-GGAGCTCGGGTACCCCTACTACTGGGGAAGACGAAGAGG-3’）和GDRNR1-Ru（5’-GAAAGCTCGATCCCCAGCTCCTCTTCTCCGCTTCATG -3’）进行扩增，PCR程序（95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃ 5min。），目的片段为253 bp。将扩增的目的片段经琼脂糖凝胶电泳和回收（方法同上）后，采用infusion的方法将GDRNR1 基因插入到植物表达载体的多克隆位点，从而获得重组载体（如图1）。

步骤2：遗传转化和阳性植株的鉴定：

取小麦开花后15天的麦穗，剥出幼嫩种子，灭菌后在超净工作台上用解剖镊剥取幼胚，盾片朝上接种在诱导培养基上，25℃，暗培养。诱导培养14天后选取生长状态良好的颗粒状胚性愈伤组织为转化受体材料，利用基因枪法进行遗传转化，具体方法参照Zhang等(Biolistic genetic transformation of a wide range of Chinese elite wheat(Triticum aestivum L.) varieties. Journal of Genetics and Genomics, 2015, 42,39-42) 。

获得遗传转化的再生植株，利用PCR技术进行转基因材料鉴定，提取遗传转化获得的小麦材料的基因组DNA和mRNA，然后利用PCR和RT-PCR技术进行DNA水平和RNA水平的鉴定分析，扩增产物大小分别为1357bp和347bp。上游引物采用Ubiquitin启动子（包含5’UTR区域和第一内含子）特异引物YP2009（5’-GGAGCGCACACACACACAAC-3’），下游引物采用基因特异引物GDRNR1-R（5’-ACTTCGGTCATTAGAGGCCACG-3’），鉴定获得DNA水平阳性植株11株；进一步利用半定量RT-PCR技术对转基因材料中外源基因的表达水平进行了鉴定，最后确定了3个高表达的植株，用于表型鉴定。

步骤3：籽粒性状的鉴定：

选取T₂代小麦转基因材料和对照小麦材料（非转基因小麦材料）种植在气候箱，为了保证转基因材料和对照的生长条件一致性，选择长方形花盆，种植时每个花盆种2行，每列10株，其中第1行为转基因材料，第2行为对照，气候箱光照强度为240 mmol·m-2·s^-1，光照时间为16h，温度为24°C，苗期时3～4天浇一次水，抽穗灌浆时期每天观察，一般1～2天浇一次水，待成熟后，单穗收获，然后测定穗长、穗粒数、粒长和粒宽，并与同等条件下种植的对照小麦材料相比较，开展籽粒发育特性及表型的鉴定。

结果如图2所示，GDRNR1基因过表达后小麦材料种子的粒长、粒宽都增加了5%左右；穗粒数提高了7%～15%。由此可见，该非编码RNA参与了小麦籽粒发育的分子调控过程，通过该非编码RNA基因过表达可实现对小麦穗粒数和千粒重的调控，并应用于小麦高产分子育种。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一种非编码RNA分子在小麦高产分子育种中的应用

<130> 无

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 223

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

ctactactgg ggaagacgaa gaggaggaag agacgcaaag gtgccattga gtgcagcgtt 60

gatgaaccgt ccggcctcct ccgaggccgg agcggttcac cggcgctgca cacaatgacg 120

cctctgcttt ctctggcgaa acaatcacca ttggcacagg cattcatcag ctacctgtgt 180

acgctcatgt gccgacggag gcatgaagcg gagaagagga gct 223

<210> 2

<211> 223

<212> RNA

<213> Triticum aestivum

<400> 2

cuacuacugg ggaagacgaa gaggaggaag agacgcaaag gugccauuga gugcagcguu 60

gaugaaccgu ccggccuccu ccgaggccgg agcgguucac cggcgcugca cacaaugacg 120

ccucugcuuu cucuggcgaa acaaucacca uuggcacagg cauucaucag cuaccugugu 180

acgcucaugu gccgacggag gcaugaagcg gagaagagga gcu 223

Claims

1.过表达SEQ ID NO:1所示的非编码RNA分子的基因在增加小麦穗粒数和千粒重中的应用。

2.过表达SEQ ID NO:2所示的非编码RNA分子在增加小麦穗粒数和千粒重中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，操作过程如下：

步骤1：过表达载体构建：

将SEQ ID NO:1所示的非编码RNA分子的基因序列插入到双元表达载体的多克隆位点；

步骤2：遗传转化：

利用小麦的胚性愈伤组织进行遗传转化；

步骤3：分子鉴定：

对所述非编码RNA分子的基因过表达的植物材料进行DNA水平和RNA水平鉴定，确定为高表达阳性材料后再进行栽培；

步骤4：栽培获得小麦穗粒数和千粒重提高的材料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1中SEQ ID NO:1所示的非编码RNA分子的基因序列插入到双元表达载体前，需要先对该基因序列扩增，扩增所用引物为GDRNR1-Fu：5’-GGAGCTCGGGTACCCCTACTACTGGGGAAGACGAAGAGG-3’和GDRNR1-Ru：5’-GAAAGCTCGATCCCCAGCTCCTCTTCTCCGCTTCATG-3’。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3中分子鉴定过表达的植物材料时，上游引物为YP2009：5’-GGAGCGCACACACACACAAC-3’，下游引物为GDRNR1-R：5’-ACTTCGGTCATTAGAGGCCACG-3’。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，胚性愈伤组织的培养条件为24℃，16h光照，光照强度为240 umol•m^-2•s^-1，8h黑暗。