CN105541981B - Myb37蛋白及其编码基因在调控植物种子产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子产量中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(即MYB37蛋白)在如下a1)‑a4)任一中的应用：a1)提高植物的种子产量；a2)增高植物的株高；a3)选育种子产量提高的植物品种；a4)选育株高增高的植物品种。MYB37基因与植物种子产量相关，将MYB37基因在植物体内过表达后，能够显著提高植株种子产量。因而，该基因在培育高产植物品种中具有新的功能，从而为培育新的高产作物新品种提供了重要的可能性，对农业生产具有重大意义。

Description

MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子产量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子产量中的应用。
背景技术
在耕地面积逐渐减少的情况下，为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高作物单位产量具有极其重要意义。株高是植株形态建成的重要基础，是影响作物高产稳产的重要因素。传统杂交育种和转基因技术育种的本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。传统的杂交育种操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对某个基因进行选择和操作，对后代的表现预见性较差。比如杂交品种后代既继承了一些人们希望得到的优良性状，但同时也继承了一些不好的性状；因此，传统的杂交育种需要通过长期的育种筛选，进而将这些不好的性状筛掉，这使得杂交育种的成功率降低并且年限增长。而转基因技术所转入的一般是经过功能验证且后代表现可准确预期的基因。因此，可以高效、准确、快速的将提高品质的基因导入到高产的作物中，也可以把高产的基因导入到品质提高的品种里。因此，转基因技术是对传统杂交育种技术的发展和补充，将两者紧密结合，可以大大地提高植物品种改良的效率。近年来，随着研究人员对植物高产分子机制的深入研究，采用转基因等基因工程手段向植物导入外源基因提高产量已成为培育高产植物品种的新途径之一，对农业生产具有重大意义。
MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子，MYB结构域通常含有1-4个不完全重复的氨基酸序列(R)，每一个重复序列R中大约有52个氨基酸，形成3个α螺旋，每隔约18个氨基酸规则间隔的色氨酸(W)残基，所以每一个重复中共有3个规则间隔色氨酸。MYB转录因子在动植物中都存在，MYB转录因子家族是拟南芥中最大的一类转录因子家族；目前为止，拟南芥中已经鉴定出超过200个基因编码MYB转录因子，其中含有两个R的R2R3-MYB成员最多，大约有126个成员左右；MYB37属于R2R3-MYB中第14亚组，在拟南芥tair网站上的基因号为AT5G23000(https://www.arabidopsis.org/)。随着对MYB转录因子家族成员的研究，越来越多的MYB转录因子被人们所认知。MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、细胞形态决定、胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等。
发明内容
本发明的目的是提供一种MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子产量中的应用。
本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)-a4)任一中的应用：
a1)提高植物的种子产量；
a2)增高植物的株高；
a3)选育种子产量提高的植物品种；
a4)选育株高增高的植物品种。
B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)-a4)任一中的应用：
a1)提高植物的种子产量；
a2)增高植物的株高；
a3)选育种子产量提高的植物品种；
a4)选育株高增高的植物品种。
在本发明中，以上a3)中的所述选育种子产量提高的植物品种的方法，具体可包括将所述MYB37蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。以上a4)中的所述选育株高增高的植物品种的方法，具体可包括将所述MYB37蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，为如下(A)或(B)：
(A)培育种子产量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子产量提高；
(B)培育株高增高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比株高增高。
在本发明中，所述种子产量具体体现为单株果荚数目和/或单株种子干重。相应的，所述种子产量提高具体体现为单株果荚数目增多和/或单株种子干重增加。
在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即MYB37基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第100至1089位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列1由1793个核苷酸组成，为所述MYB37基因在拟南芥基因组中序列，其中第236-327及458-854位均为内含子序列；序列2由1304个核苷酸组成，为所述MYB37基因的cDNA序列，其中第100-1089位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由329个氨基酸残基组成。
在所述(A)和所述(B)中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为将所述MYB37基因插入pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点Xba I与Kpn I之间后得到的重组质粒。
在上述方法中，将携带有所述MYB37基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。
在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之间插入序列2的第100-1086位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。
实验证明，相比野生型对照植株，MYB37基因过表达株系种子的产量显著提高。本发明对植物高产分子机制的研究具有重要意义；另外，该基因在培育高产植物品种中具有新的功能，从而为培育高产作物新品种提供了重要的可能性，对农业生产具有重大意义。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测过表达材料中MYB37 mRNA的表达情况。
图2为MYB37过表达株系种子产量相关统计结果。**表示与Col-0组相比，差异极显著(P<0.01)。其中，A为株高形态图片；B为株高统计结果；C为单株果荚数目统计结果；D为单个果荚种子数统计结果；E为单株种子干重统计结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供(记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination byagroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)的产品。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6bgene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。
实施例1、MYB37转基因植物的获得及鉴定
本实施例中所涉及的MYB37基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由1793个核苷酸组成，为所述MYB37基因在拟南芥基因组中序列，其中第236-327及458-854位均为内含子序列；所述MYB37基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由1304个核苷酸组成，为所述MYB37基因的cDNA序列，其中第100-1089位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由329个氨基酸残基组成。
一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37的构建
提取拟南芥野生型(Col生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1000bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第100-1086位核苷酸序列。
引物1：5’-CTAGTCTAGAATGGGAAGAGCTCCGTGTT-3’(下划线部分为Xba I的识别位点，该序列的第11-29位为序列2的第100-118位)；
引物2：5’-CGGGGTACCGGAGTAGAAATAGGGCAAGC-3’(下划线部分为Kpn I的识别位点，该序列的第10-29位为序列2的第1067-1086位的反向互补序列)。
用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之间插入序列2的第100-1086位所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-MYB37。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37中，启动所述MYB37基因转录的启动子为35S启动子。
在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的MYB37基因为模板。
二、MYB37转基因拟南芥的获得及鉴定
1、MYB37转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得
将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37及pCAMBIA-1300-221空载体通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有MYB37基因(PCR目的条带大小为1000bp左右)的农杆菌GV3101命名为pCAMBIA-1300-221-MYB37；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。
采用用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.ThePlant Journal,1998,16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌pCAMBIA-1300-221-MYB37(或空-GFP/pCAMBIA-1300-221)转化拟南芥野生型(Col生态型)。
转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素的MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-MYB37的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株(T1代)。
2、MYB37转基因拟南芥鉴定
(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝MYB37转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。
(2)转基因拟南芥OE1和OE6纯合系的筛选
经上述鉴定分析后，选择其中二个具有代表性的单拷贝MYB37转基因拟南芥株系，分别记为OE1和OE6(T1代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE1和OE6的纯合系植株，作为实验材料进行以下种子产量相关统计。
三、转基因拟南芥OE1和OE6纯合系中MYB37基因表达量分析
提取拟南芥野生型(Col-0生态型)和过表达植株(OE1和OE6)的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中MYB37基因在转录水平上表达情况。具体如下：
1、转录水平分析(RNA表达量)
以上述获得的转基因拟南芥植株(OE1和OE6)及拟南芥野生型(Col-0生态型)为实验材料。各实验材料在平皿中生长12天后进行收样，提取各实验材料的总RNA，反转录成单链cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析MYB37基因在各实验材料中的表达情况。
其中，扩增MYB37基因的引物序列为：
MYB37RT-F1：5’-CGACAAGACAAAAGTGAAGCGA-3’(序列2的第120-141位)；
MYB37RT-R1：5’-TGGCAGCGAAGAGACTAAAAATG-3’(序列2的第333-355位的反向互补序列)。
以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
上述引物的反应条件如下:
(1)反应体系的建立
实时荧光定量PCR反应体系
(2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
(3)反应程序的设定：
实时荧光定量PCR反应程序
(4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各株系中MYB37基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
MYB37相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，MYB37基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)中MYB37基因的表达为1。从图中可以看出，相比拟南芥野生型(Col-0)，步骤二获得的转基因拟南芥OE1和OE6中MYB37 mRNA表达量均显著高于野生型(Col-0)中。
实施例2、MYB37转基因植物种子产量相关统计
一、株高
测量同时期拟南芥野生型(Col-0生态型)、实施例1得到的两个T3代纯合体MYB37转基因株系(OE1和OE6)以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体植株[Col-0(35SGFP)]的株高。一次实验中每种实验材料统计48棵植株，实验重复3次，结果取平均值，t检验用于分析差异显著性(**P<0.01)。
结果发现：MYB37转基因株系(OE1和OE6)的株高显著高于拟南芥野生型Col-0(**P<0.01)。而转入pCAMBIA-1300-221空载体的植株[Col-0(35S GFP)]株高与野生型基本一致，无统计学差异。具体参见图2中A和B。
二、单株果荚数目
由于MYB37转基因株系(OE1和OE6)的株高较高；因此，很有可能转基因株系单株的总果荚数比野生型多，因此发明人统计了果实成熟期的野生型Col-0、实施例1得到的两个T3代纯合体MYB37转基因株系(OE1和OE6)以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体植株[Col-0(35S GFP)]的单株总果荚数。一次实验中每种实验材料统计48棵植株，实验重复3次，结果取平均值，t检验用于分析差异显著性(**P<0.01)。
结果发现：MYB37转基因株系(OE1和OE6)单株总果荚数比野生型Col-0单株总果荚数显著增多(**P<0.01)。而转入pCAMBIA-1300-221空载体的植株单株果荚数目与野生型一致，无统计学差异。具体参见图2中C。
三、单个果荚种子数
比较野生型Col-0、实施例1得到的两个T3代纯合体MYB37转基因株系(OE1和OE6)以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体植株[Col-0(35S GFP)]中长短大体相同的果荚内含有的种子数目。每次实验中，一个基因型植株统计60个果荚；实验重复3次，结果取平均值，t检验用于分析差异显著性(*P<0.05)。
结果发现：野生型Col-0和MYB37转基因株系(OE1和OE6)中长短大体相同的果荚内种子数目基本相同，无统计学差异。而转入pCAMBIA-1300-221空载体植株[Col-0(35SGFP)]和野生型中长短大体相同的果荚内种子数目也基本相同，无统计学差异。具体参见图2中D。
四、单株种子干重
由于MYB37转基因株系(OE1和OE6)单株总果荚数比野生型Col-0显著增多(图2中C)，并且野生型Col-0和MYB37转基因株系(OE1和OE6)中长短大体相同的果荚内含有的种子数目基本相同(图2中D)；所以，MYB37转基因株系(OE1和OE6)单株种子的总干重也有可能高于野生型Col-0。因此，本发明的发明人统计了野生型Col-0、实施例1得到的两个T3代纯合体MYB37转基因株系(OE1和OE6)以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体植株[Col-0(35S GFP)]单株种子的总干重。一次实验中每种实验材料统计48棵植株，实验重复3次，结果取平均值，t检验用于分析差异显著性(**P<0.01)。
结果发现：MYB37转基因株系(OE1和OE6)单株种子的总干重显著高于野生型Col-0(**P<0.01)。而转入pCAMBIA-1300-221空载体植株单株种子的总干重与野生型基本相同，无统计学差异。具体参见图2中E。
综合以上结果，得出结论：由于MYB37转基因株系(OE1和OE6)株高较高，进而产生更多的果荚数，从而使MYB37转基因株系(OE1和OE6)单株种子的总干重显著高于野生型Col-0。

Claims (10)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)-a4)任一中的应用：
a1)提高植物的种子产量；
a2)增高植物的株高；
a3)选育种子产量提高的植物品种；
a4)选育株高增高的植物品种；
所述植物为拟南芥。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)-a4)任一中的应用：
a1)提高植物的种子产量；
a2)增高植物的株高；
a3)选育种子产量提高的植物品种；
a4)选育株高增高的植物品种；
所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述种子产量体现为单株果荚数目和/或单株种子干重。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第100至1089位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子。
5.培育种子产量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子产量提高；
所述植物为拟南芥。
6.培育株高增高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比株高增高；
所述植物为拟南芥。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述种子产量体现为单株果荚数目和/或单株种子干重。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第100至1089位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
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