CN105802931A - Crk4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRK4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(即CRK4蛋白)在如下a1)或a2)中的应用：a1)抑制植物茎叶徒长；a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。CRK4基因过表达植株，相比野生型对照植株，在ABA抑制的茎叶徒长方面表现更加敏感。本发明通过调节CRK4的表达水平来抑制植物茎叶徒长具有重要意义，通过基因工程手段获得CRK4基因高表达、茎叶徒长受到抑制的转基因作物。本发明符合农业可持续发展的目的，可以节约养分、减少化肥和农药的喷施，对于培育绿色无公害新品种提供了可能性，具有广阔的应用前景。

Description

CRK4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种CRK4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用。

背景技术

种植农作物、果树或者花卉园艺植物的时候经常出现茎叶徒长的现象，结果造成养分的大量消耗、花器官数量减少、产量降低以及在灌浆期不能保证正常结果。造成植物茎叶徒长的因素有很多，其中既有外界自然环境引起的，如短日照、光照弱和雨水过多等，也有因为作物或者果树品种自身因素引起的。因此，通过改良作物、果树和花卉品种来抑制茎叶徒长具有重大的实际意义。随着分子生物学以及植物激素信号转导机制研究的不断深入，通过基因工程的手段向植物中导入外源基因来影响植物细胞信号转导或者激素的合成来调节茎叶徒长已经变得日趋成熟。

脱落酸(AbscisicAcid，ABA)在植物体内具有广泛生理效应，它广泛参与调控植物的生长发育和响应外界环境胁迫。在植物体内，ABA主要是在根尖、种子、果实和花器官中合成。ABA可以抑制种子萌发、幼苗生长、抑制主根发育以及促进叶片衰老和脱落等。植物体内ABA信号转导网络是极其复杂的，但是ABA信号转导起始于ABA受体对ABA信号的感知。除了ABA受体，还有许多其他的跟ABA信号转导有关的ABA响应基因被鉴定出来。这些ABA响应基因既包括正调节子也包括负调节子，它们定位于细胞的质膜、叶绿体、线粒体和细胞核等部位，并且广泛参与到植物对逆境胁迫的响应。这些ABA响应基因的发现加深了人们对ABA作用机制的认识，并且进一步丰富了人们对细胞内各种组分功能的深入理解。

类受体蛋白激酶RLKs(Receptor-likekinases)广泛参与到植物的生长发育和植物对逆境胁迫的响应过程，包括调控植物花器官和胚胎的发育、参与植物抗病反应、参与植物激素油菜素内酯信号转导以及参与ABA信号转导等过程，此外RLKs广泛参与到了MAPK、活性氧以及钙离子信号传递途径并且能够引起一系列的分子和细胞学反应。富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶CRKs(Cysteine-richreceptor-likeproteinkinases)是RLKs的一个亚家族，它在拟南芥中共有46个成员。CRKs基因主要分布在染色体IV上，并且染色体IV含有一个由19个CRKs基因首尾相连组成的基因簇，这也使得获得crks多突变体变的异常困难。CRKs家族的成员如RPK1、CRK36以及ARCK1已经被报道参与到ABA信号转导过程并且响应环境胁迫。此外，过表达CRK5或者CRK13的转基因拟南芥对病原菌P.syringae的抗性明显增强。因此，CRKs的功能是及其复杂和多样的，它在植物生长发育过程中各个方面的功能也逐步得到阐释。CRK4基因在拟南芥tair网站上的基因号为AT3G45860(https://www.arabidopsis.org/)。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRK4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用。所述茎叶徒长即农作物、果树或者花卉园艺植物茎叶发育过旺并且导致土壤养分过度浪费以及产量降低的现象。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CRK4蛋白)在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)抑制植物茎叶徒长；

a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。

B.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CRK4蛋白)的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)抑制植物茎叶徒长；

a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。

在本发明中，以上a2)中的所述选育茎叶徒长受到抑制的植物品种的方法，具体可包括将所述CRK4蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育茎叶徒长受到抑制的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育茎叶徒长受到抑制的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CRK4蛋白)的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比茎叶徒长受到抑制。

在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即CRK4基因)是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1由2641个核苷酸组成，为所述CRK4基因在拟南芥基因组中序列，其中第845-934、1070-1151、1274-1446、1658-1747、1986-2061及2219-2317位均为内含子序列；序列2由2031个核苷酸组成，为所述CRK4基因的cDNA序列，其中第1-2031位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由676个氨基酸残基组成。

在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述CRK4基因插入pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点SmaI与KpnI之间后得到的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述CRK4基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明的再一个目的是提供一种抑制植物茎叶徒长的方法。

本发明所提供的抑制植物茎叶徒长的方法，具体可包括如下步骤：

(1)向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；

(2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中或者向所述转基因植物喷施外源ABA。

在步骤(2)中，所述ABA在所述基质中的含量为0.5μM。所述基质具体可为培养基(如MS培养基)或土壤。

在所述方法中，所述抑制植物茎叶徒长具体体现为：在0.5μMABA条件下，与所述受体植物相比，所述转基因植物的子叶转绿受到抑制(所述转基因植物的子叶转绿率显著低于所述受体植物)。

另外，由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或所述蛋白质的编码基因在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

b1)降低植物对ABA的耐受性；

b2)选育对ABA耐受性降低的植物品种。

在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。

进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。

在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点SmaI和KpnI之间插入序列2的第1-2028位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。

本发明研究结果表明CRK4蛋白正调节ABA信号转导。实验证明，相比野生型对照植株，CRK4基因过表达植株的茎叶以及根系生长受到明显抑制，因此，可以通过基因工程的方法获得CRK4基因高表达、茎叶徒长受到抑制的转基因作物。本发明符合农业可持续发展的目的，可以节约养分、减少化肥和农药的喷施，对于培育绿色无公害新品种提供了可能性，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测CRK4过表达材料中CRK4mRNA的表达情况。

图2为ABA对CRK4过表达植株幼苗生长的影响分析结果。A表示野生型Col-0以及CRK4基因高表达株系C4OE-1和C4OE-2在MS平板上培养10天后的子叶转绿情况。B表示野生型Col-0以及CRK4基因高表达株系C4OE-1和C4OE-2在含有0.5μMABA的MS平板上培养10天后的子叶转绿情况。C是对A和B的统计结果。D表示野生型Col-0和转空载体株系GFP-OE在MS平板(左图)和含有0.5μMABA的MS平板(右图)上培养10天后的子叶转绿情况。E是对D的统计结果。误差线表示标准误差(SE)，不同字母代表同一ABA浓度下各处理之间差异显著(P<005)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供(记载文献：LijingLiu,YiyueZhang,SanyuanTang,etal.AnefficientsystemtodetectproteinubiquitinationbyagroinfiltrationinNicotianabenthamiana.ThePlantJournal,2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。

拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsisthaliana,ecotypeColumbia-0)，为拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)的产品。

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinlandetal.TransformationofvitistissuebydifferentstrainsofAgrobacteriumtumefacienscontainingtheT_6bgene.PlantCellReports,1992(11):192-195.)。

大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。

实施例1、CRK4转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的CRK4基因来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2641个核苷酸组成，为所述CRK4基因在拟南芥基因组中序列，其中第845-934、1070-1151、1274-1446、1658-1747、1986-2061及2219-2317位均为内含子序列；序列2由2031个核苷酸组成，为所述CRK4基因的cDNA序列，其中第1-2031位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由676个氨基酸残基组成。

一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK4的构建

提取拟南芥野生型(Col生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约2000bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第1-2028位核苷酸序列。

引物1：5’-TCCCCCGGGATGTCTTTCTTCTGGCTTTTTC-3’(下划线部分为SmaI的识别位点，该序列的第10-31位为序列2的第1-22位)；

引物2：5’-GGGGTACCACGAGGAGTTACATTAGTAAT-3’(下划线部分为KpnI的识别位点，该序列的第9-29位为序列2的第2008-2028位的反向互补序列)。

用限制性内切酶SmaI和KpnI双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点SmaI和KpnI之间插入序列2的第1-2028位所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-CRK4。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK4中，启动所述CRK4基因转录的启动子为35S启动子。

在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK4的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的CRK4基因为模板。

二、CRK4转基因拟南芥的获得及鉴定

1、CRK4转基因拟南芥植株的获得

将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK4导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2(同上)组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有CRK4基因(PCR目的条带大小为2000bp左右)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221-CRK4。

采用用农杆菌花序侵染的方法(SJClough,AFBent.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal,1998,16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-CRK4转化拟南芥野生型(Col生态型)。

转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素的MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-CRK4的拟南芥植株(T₁代)。

实验同时设置向拟南芥野生型(Col生态型)中转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照。

2、CRK4转基因拟南芥鉴定

(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝CRK4转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。

(2)转基因拟南芥C4OE-1和C4OE-2纯合系的筛选

经上述鉴定分析后，从中随机选择二个单拷贝CRK4转基因拟南芥株系，分别记为C4OE-1和C4OE-2(T₁代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T₃代转基因拟南芥C4OE-1和C4OE-2的纯合系植株，作为实验材料进行后续实验分析。

三、转基因拟南芥C4OE-1和C4OE-2纯合系中CRK4基因表达量分析

提取拟南芥野生型(Col-0生态型)和过表达植株(C4OE-1和C4OE-2)的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中CRK4基因在转录水平上表达情况。具体如下：

1、转录水平分析(RNA表达量)

以上述获得的转基因拟南芥植株(C4OE-1和C4OE-2)及拟南芥野生型(Col-0生态型)为实验材料。取生长4周左右的拟南芥幼苗，提取RNA并且反转录cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析CRK4基因在各实验材料中的表达情况。

其中，扩增CRK4基因的引物序列为：

CRK4RT-F1：5’-TCTACAATGAAACCGCCACT-3’(序列2的第737-756位)；

CRK4RT-R1：5’-CCCGGAGACTAAAGAAAGCT-3’(序列2的第915-934位的反向互补序列)。

以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：

Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

上述引物的反应条件如下:

(1)反应体系的建立

实时荧光定量PCR反应体系

(2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪进行实验。

(3)反应程序的设定：

实时荧光定量PCR反应程序

(4)数值分析，以2^-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各株系中CRK4基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。

CRK4相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，CRK4基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)中CRK4基因的表达为1。从图中可以看出，转基因拟南芥C4OE-1和C4OE-2中CRK4mRNA表达量均显著高于野生型(Col-0)中CRK4mRNA表达量(P<0.05)。

实施例2、CRK4转基因植物幼苗生长试验分析

ABA是植物抵抗外界逆境胁迫的重要信号分子，具有广泛生理效应。ABA可以促进种子成熟和休眠过程以及种子成熟过程中贮藏蛋白的积累、抑制种子萌发和幼苗生长、抑制主根发育、促进侧根发育以及促进叶片衰老和脱落等。因此当有外源ABA存在的条件下，植物的根长和茎叶的生长受到明显抑制，根据野生型与CRK4转基因植物对ABA的敏感性可以检测CRK4是否参与到ABA抑制的茎叶徒长过程。

将野生型拟南芥(Col-0生态型)、实施例1得到的单拷贝插入的T₃代纯合体C4OE-1和C4OE-2的种子直接播种在无ABA和含有0.5μMABA的MS板子上(每种实验材料播种80-100粒)，4℃层积3天，然后放在光照培养箱中正常培养5天后拍照记录实验结果，统计各种CRK4相关遗传材料的子叶转绿率。实验重复3次，误差线表示标准误差(SE)，不同字母代表同一ABA浓度下各处理之间差异显著(P<0.05)。

实验同时设置向拟南芥野生型(Col生态型)中转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照(空载对照)，即GFP-OE株系。

结果如图2所示，在无ABA的条件下，CRK4高表达株系C4OE-1和C4OE-2以及野生型拟南芥(Col-0生态型)的子叶均转绿，它们之间的子叶转绿率没有显著差异(P>0.05)。当有ABA(0.5μM)存在时，各种基因型的子叶转绿率均受到抑制，但是实施例1得到的单拷贝插入的T₃代纯合体CRK4转基因株系C4OE-1和C4OE-2相对于野生型拟南芥(Col-0生态型)受到抑制的程度更高(P<0.05)。而对于空载对照植株GFP-OE，无论是在无ABA的条件下，还是在有ABA(0.5μM)存在的条件下，其子叶转绿率与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异(P>0.05)。

综合以上结果可见，相对于野生型Col-0，实施例1得到的T₃代纯合体CRK4转基因株系(C4OE-1和C4OE-2)在ABA抑制的子叶转绿方面更加敏感，表现出ABA超敏表型，由于子叶转绿变慢会直接导致茎叶生长受到抑制，因此这在农业生产上可应用于抑制作物的茎叶徒长，也可以抑制园艺植物和果树的徒长，从而起到保持养分的作用。

Claims (10)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)抑制植物茎叶徒长；

a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。

2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)抑制植物茎叶徒长；

a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。

3.培育茎叶徒长受到抑制的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比茎叶徒长受到抑制。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

7.一种抑制植物茎叶徒长的方法，包括如下步骤：

(1)向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；

(2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中或者向所述转基因植物喷施外源ABA。

8.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或所述蛋白质的编码基因在如下任一中的应用：

b1)降低植物对ABA的耐受性；

b2)选育对ABA耐受性降低的植物品种。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物。