CN104711287B - 一种提高植物根毛生成能力的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高植物根毛生成能力的蛋白及其编码基因与应用。本发明公开一种促进植物根毛生长和/或发育的方法，包括在植物中表达突变的乙烯受体，以促进植物根毛生长和/或发育。本发明为利用基因工程手段培育高效吸收土壤养分的农作物新品种提供基因资源，可用于培育高效吸收土壤养分的农作物新品种。

Description

一种提高植物根毛生成能力的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种提高植物根毛生成能力的蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

根系是植物从外界吸收水分、养分的主要器官。环境条件和栽培措施大多是首先通过影响根系进而影响到植株地上部分。根主要由根冠区、分生区、伸长区、根毛区(成熟区)组成。根毛作为植物根系的重要组成部分，是靠近根尖特异表皮细胞外伸形成的单细胞、管状突出物。成熟根毛的平均直径一般为7-10μm，长度可生长到1mm以上。根毛作为植物根与土壤的直接接触细胞，增大了植物根表皮细胞与土壤的接触面积，有助于提高根在土壤中的稳定性、根与微生物的互作及根对土壤营养的吸收。根毛的表面积约占植物根系总表面积的70％，是根系吸收水分和养分最活跃的组织，并且是植物根系感受外界信号的重要组成部分。研究表明，具有较长和较密根毛的植物能更有效地吸收水分和养分，从而增加作物的产量。

近年来，国内外学者从各个角度对根毛的生长和发育的生理机制和分子机制进行了深入的研究，已经筛选和积累了大量与根毛生长和发育相关的突变体。与根毛的极性延伸有关的突变体有lrx1，rhs11和rhd2等，表现为根毛长度的变短(Diet et al.,2006；Wonet al.,2009)；与根毛细胞命运决定有关的突变体有cpc，ttg，gl2，wer和rhd6等。这些突变体表现为根毛密度的增大或者根毛数目的明显减少(Tominaga et al.,2007；Won et al.,2009；Song et al.,2011)。这些突变体为研究根毛生长和发育的分子机制提供了很好的材料，并为构建调控根毛形成的信号网络提供了重要的信息(Bruex et al.,2012)。阐明调控根毛生长和发育的分子机制不仅有助于我们深入了解植物细胞发育分化的规律，而且能更好的服务于生产实践。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何培育具有较长和较密根毛的植物，进而提高植物吸收土壤养分的能力。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种促进植物根毛生长和/或发育的方法，包括在植物中表达突变的乙烯受体，以促进植物根毛生长和/或发育；

所述促进植物根毛生长和/或发育体现为植物的根毛长度增长和/或根毛密度提高。

上述方法中，所述突变的乙烯受体为如下a)或b)所示的蛋白质：

a)SEQ ID No.5所示的蛋白质；

b)将SEQ ID No.5所示的蛋白的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的促进植物根毛生长和/或发育的蛋白质。

上述任一所述的方法中，所述在植物中表达突变的乙烯受体的方法为在所述植物中导入所述突变的乙烯受体的基因；

所述突变的乙烯受体的基因具体是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述突变的乙烯受体的基因替换出发载体pZH01的多克隆位点间序列，pZH01的其余序列保持不变得到的，再具体为将所述突变的乙烯受体的基因替换pZH01的CaMV35S启动子后的BamHI和SacI识别位点间序列，pZH01的其余序列保持不变得到的；

所述CaMV 35S启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。

上述任一所述的方法中，所述突变的乙烯受体的基因的序列如SEQ ID No.4所示；

所述突变的乙烯受体的编码序列如SEQ ID No.11所示。

上述任一所述的方法中，所述在植物中表达突变的乙烯受体的方法为将所述植物的乙烯受体的基因进行突变。

上述方法中，所述乙烯受体为SEQ ID No.2所示的蛋白；

所述乙烯受体的编码序列如SEQ ID No.10所示；

所述乙烯受体的基因的序列如SEQ ID No.1中第2033位至第4925位所示。

上述任一所述的方法中，所述将所述植物的乙烯受体的基因进行突变得到所述突变的乙烯受体的基因，所述突变的乙烯受体为如下a)或b)的蛋白质：

a)SEQ ID No.5所示的蛋白质；

b)将SEQ ID No.5所示的蛋白的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的促进植物根毛生长和/或发育的蛋白质；

所述乙烯受体具体为SEQ ID No.2所示的蛋白；

所述乙烯受体的基因的序列具体如SEQ ID No.1中第2033位至第4925位所示；

所述突变的乙烯受体的基因的序列具体如SEQ ID No.4所示。

为了解决以上技术问题，本发明还提供一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：

a)SEQ ID No.5所示的蛋白质；

b)将SEQ ID No.5所示的蛋白的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的促进植物根毛生长和/或发育的蛋白质。

为了解决以上技术问题，本发明还提供与所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；

B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。

所述核酸分子具体为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)SEQ ID No.4所示的DNA分子或cDNA分子；

2)SEQ ID No.11所示的DNA分子或cDNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子或cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。

为了解决以上技术问题，本发明还提供上述蛋白质和/或上述生物材料在调控植物根毛生长和/或发育中的应用；

所述调控植物根毛生长和/或发育具体为促进植物根毛生长和/或发育，体现为植物的根毛长度增长和/或根毛密度提高；

上述任一所述的方法、蛋白质、生物材料或应用中，所述植物或目的植物可为双子叶植物或单子叶植物，具体可为十字花科植物，如拟南芥。

本发明证明将突变的植物激素乙烯的受体基因进行过表达，可以显著提高植物根毛长度和密度，同时并未改变植物的其他农艺性状。另外，由于植物激素乙烯的受体基因直接来源于植物，因而在生物安全方面具有较小的风险性。最后，由于植物激素乙烯的受体基因在其他各种重要农作物如水稻，玉米，小麦，大豆等中都有同源基因，因而在进行转基因植物构建时具有更多的选择余地。本发明为利用基因工程手段培育高效吸收土壤养分的农作物新品种提供基因资源，可用于培育高效吸收土壤养分的农作物新品种。

附图说明

图1为Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和突变体erh的根毛形态和根毛长度、密度的测量。

图2为Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和突变体erh植株表型。

图3为AtERS1基因的突变位点和不同物种中ERS1蛋白序列的比对结果。

图4为遗传互补实验中转基因拟南芥的幼苗形态结果和主根根尖的根毛形态。

图5为35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥的主根根尖的根毛形态和根毛长度、密度的测量。

以上各图中，野生型代表Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)，erh代表突变体erh。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

根癌农杆菌GV3101为Clontech公司产品。

Columbia-0(Col-0)生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)产品。

pBI101为Biovector产品，产品目录号为BiovectorpBI101，pBI101带有卡那霉素抗性基因。

pZH01的构建方法如下：将pCAMBIA1301载体的GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因(SEQ IDNo.12)替换为LUC(荧光素酶)基因(SEQ ID No.13)，pCAMBIA1301的其余序列保持不变得到。其中pCAMBIA1301为Biovector产品，产品目录号为BiovectorpCambia1301，pZH01带有潮霉素抗性基因。

实施例1、突变体的筛选

一、为了鉴定参与调控植物根毛发育的重要基因，以Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)为材料，在正常条件下对根发育发生改变的突变体进行大规模筛选。筛选的方法是将Columbia-0生态型拟南芥的种子直接在MS培养基上萌发，生长8天后，观察根的形态，用这种方法获得了一个过量产生根毛的突变体，将其命名为erh(enhanced root hairproduction)。

二、将消毒的Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh的种子铺于9cm的MS固体培养基(配方为MS盐4.46g/l(PhytoTechnology Laboratories产品，货号为M519)，MES1g/l，蔗糖10g/l，pH 5.8，琼脂浓度为1.2g/100ml)平板上，每种拟南芥铺8粒种子，4℃春化3天后，放入温室竖直培养，温室竖直培养的条件温度为23℃，光强为100μmol^-2s^-1，16小时光照8小时黑暗，植物生长8天后，得到Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh幼苗，观察根毛性状。

Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh的根毛性状如图1中A和B所示。

图1中，A为7天大小的Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh幼苗的形态；B为Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh的主根根尖的根毛形态。

三、根毛长度和密度的测量

首先，将步骤二培养得到的Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh幼苗在DIC显微镜(Olympus,BAX51,Japan)下观察其根毛并用对应连接的数码相机拍照。然后将拍摄好的照片用软件Digimizer打开，以标尺的实际刻度设置内参，然后每个根选取固定区域和长度计量根毛数目并测量该区域每根根毛的长度，得到每个根的根毛密度和平均根毛长度，每种拟南芥选取20到30个根，每个根量20到30个根毛，试验重复3次，结果取平均值。

Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh的根毛长度和密度的测量结果如图1中C和D所示。

图1中，C为Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh的根毛长度的统计图；D为Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh的根毛密度的统计图。

图1中，C的结果表明，Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的平均根毛长度为0.32±0.01mm，突变体erh的平均根毛长度为0.46±0.02mm。

图1中，D的结果表明，Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的根毛密度(每mm根里的根毛数量)为21.9±0.8个，突变体erh的根毛密度(每mm根里的根毛数量)为26.2±1.5个。

结果表明，相对于Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)，erh的根毛长度显著增长，根毛密度显著提高。

四、突变体erh的表型

将步骤二培养得到的Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh幼苗移入土中，继续生长，在20天和30天左右得到Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh植株，观察，拍照，Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和erh植株表型如图2所示。

图2中，A为20天大小的植株在土里的表型，B为30天大小的植株表型。

图2表明，突变体erh的地上部分与Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的表型无差别。

实施例2、基因的发现和遗传互补实验

一、基因的发现

运用图位克隆方法发现造成erh根毛突变性状是由于拟南芥基因组中一个植物激素乙烯受体基因AtERS1(ETHYLENE RESPONSE SENSOR 1)突变造成的。在erh突变体中，AtERS1蛋白的编码序列中自5’末端起第329位的核苷酸C变成T，从而使该基因编码的AtERS1蛋白自N端起第110位的脯氨酸(密码子CCT)突变成了亮氨酸(密码子CTT)。在其他植物如水稻，高粱，玉米，小麦等中都有AtERS1的同源基因。AtERS1基因的突变位点和不同物种中ERS1蛋白序列的比对结果如图3所示。

图3中，A为AtERS1基因的结构和突变位点。深色框：外显子；浅色框：UTR非编码区；细线：内含子；粗线：基因间序列。

图3中，B为不同物种中ERS1蛋白序列(自N端起第61至120位氨基酸区段)的比对结果。At,Arabidopsis thaliana拟南芥；Bn,Brassica napus油菜；Gm，Glycine max大豆；Sb,Sorghum bicolor高粱；Zm,Zea mays玉米；Os,Oryza sativa水稻；Hv,Hordeumvulgare大麦；Ta,Triticumaestivum小麦。方框显示为AtERS1蛋白的自N端起第110位氨基酸的比对结果。

图3中，B表明，通过序列比对发现，AtERS1蛋白自N端起第110位发生突变的脯氨酸在不同物种间是保守的。

erh突变体也可以通过基因工程的方法将Columbia-0生态型拟南芥的植物激素乙烯受体基因AtERS1基因组DNA序列(SEQ ID No.1中第2033位至第4925位所示的序列)自5’末端起第758位的核苷酸C突变为T得到。

二、遗传互补实验

为了验证所发现的AtERS1基因突变确实是造成根毛性状突变的原因，进行如下AtERS1基因的遗传互补实验：

(一)AtERS1::AtERS1 gDNA的构建

将SEQ ID No.1所示的序列替换pBI101的XbaI和XmaI酶切识别位点间序列，pBI101的其余序列保持不变，得到AtERS1::AtERS1 gDNA重组质粒，该质粒表达SEQ IDNo.2所示的蛋白，即AtERS1蛋白。AtERS1蛋白的编码序列如SEQ ID No.10所示。

SEQ ID No.1中第1位至第2032位为AtERS1基因启动子序列，第2033位至第4925位为AtERS1基因的基因组序列。

在突变体erh中，SEQ ID No.1中第2790位的C突变为T，使得SEQ ID No.2第110位的蛋白脯氨酸(P)突变为亮氨酸(L)，其余均不变。

(二)转基因植物的获得

将AtERS1::AtERS1 gDNA重组质粒导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。通过花序浸泡法(参考文献Clough SJ and Bent AF,1998)将重组农杆菌转染突变体erh，得到转AtERS1基因拟南芥，将其命名为AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。

具体方法如下：

挑选重组农杆菌单克隆于2-3ml的液体LB培养基中，28℃，250rpm培养16小时；取0.2ml菌液加到100ml液体LB培养基中，28℃，250rpm培养18-24小时；将菌液倒入250ml的离心管中，配平；室温，5500rpm离心10min；弃上清，将菌体重悬于floral dip溶液(1/2MSsalts with B5vitamin(Sigma salts 0404)2.2g/l；蔗糖50g/l；MES 0.5g/l；0.44mM 6BA10μl/l；Silwet L-77200μl/l；用NaOH调pH至5.7)中，调至OD600nm为0.8。将处于开花状态的erh倒置，使花完全浸没在菌体悬液中，维持2min；取出erh，侧放于湿润的托盘内，避光放置24小时后，将erh竖直，同普通植物一样培养。

(三)转基因植物的筛选及验证

从农杆菌浸泡后的植物上，收获种子(称之为AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T1代种子)。种子经消毒后，将其铺在琼脂浓度为0.55g/100ml的MS(含有50ug/ml卡那霉素)平板上，4℃春化2天；将平板放入温室，平放生长12天后，筛选抗性植株移入土中。单株收获抗性植株的种子(即AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T2代种子)。由于从AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T2代种子长出的T2代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥对导入的转基因载体可能为杂合子，从每一株单独的转基因株系选择种植10-20株T2代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。从T2代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥中，分别收取AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T3代种子，将其铺在琼脂浓度为1.2g/100ml，含卡那霉素的MS平板上，观察T3代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥代幼苗的抗性分离比例。若所有幼苗均显示为卡那霉素抗性表型，则被认为其T2代亲本植株所带的转基因载体已是纯合子。AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T3代种子在培养基上萌发后，被用以表型的分析。以相同生长天数的Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和突变体erh为对照，7天大小的拟南芥幼苗形态结果和主根根尖的根毛形态如图4所示。

图4中，A为7天大小的拟南芥幼苗形态；B为7天大小的拟南芥幼苗主根根尖的根毛形态。AtERS1::AtERS1代表T3代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。

图4表明，与突变体erh相比，T3代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥的根毛长度显著变短，根毛密度显著降低，恢复到与Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的根毛一样的表型，表明将AtERS1基因导入到突变体erh中可使突变体erh的性状恢复到Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的水平。

并提取T3代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥的基因组DNA，以其为模板，以引物F(AtERS1基因中的序列，5’-CAGGTGAAGGACACAGGG-3’)和引物R(pBI101载体上GUS基因中的序列，5’-GGCGTGGTGTAGAGCATT-3’)为引物，进行PCR鉴定，结果表明PCR产物大小约为1200bp，并将该PCR产物进行序列测定，与预期序列一致，因此T3代AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥确定为阳性AtERS1::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。

三、为了进一步验证所发现的AtERS1基因突变确实是造成根毛性状突变的原因，进行如下遗传互补实验：

(一)35S::AtERS1gDNA的构建

将SEQ ID No.3所示的序列替换pZH01载体CaMV 35S启动子后的BamHI和SacI酶切识别位点间的序列，pZH01的其余序列保持不变，得到35S::AtERS1gDNA重组质粒，该质粒表达SEQ ID No.2所示的蛋白。

(二)按照步骤二中(二)的方法得到35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。

(三)转基因植物的筛选及验证

从农杆菌浸泡后的植物上，收获种子(称之为35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T1代种子)。种子经消毒后，铺在琼脂浓度为0.55g/100ml的MS(含有50ug/ml卡那霉素)平板上，4℃春化2天；将平板放入温室，平放生长12天后，筛选抗性植株移入土中。单株收获抗性植株的种子(即35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T2代种子)。由于从T2代种子长出的T2代植株对导入的转基因载体可能为杂合子，从每一株单独的转基因株系选择种植10-20株T2代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。从这些T2代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥中，分别收取35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥T3代种子，将其铺在琼脂浓度为1.2g/100ml，含卡那霉素的MS平板上，观察T3代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥幼苗的抗性分离比例。若所有幼苗均显示为卡那霉素抗性表型，则被认为其T2代亲本植株所带的转基因载体已是纯合子。35S::AtERS1gDNA转基因拟南芥T3代种子在培养基上萌发后，被用以表型的分析。

图4中，35S::AtERS1代表T3代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。

图4表明，与突变体erh相比，T3代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥的根毛长度显著变短，根毛密度显著降低，恢复到与Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的根毛一样的表型，进一步表明将AtERS1基因导入到突变体erh中去，可使突变体erh的性状恢复到Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的水平。

并提取T3代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥的基因组DNA，以其为模板，以引物F’(位于35S启动子中的序列，5’-AACAGAACTCGCCGTAAAGA-3’)和引物R’(位于AtERS1基因中的序列,5’-CATAAGCACCCATTTGTAAGG-3’)为引物，进行PCR鉴定，结果表明PCR产物大小约为11OO bp，并将该PCR产物进行序列测定，与预期序列一致，因此T3代35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥确定为阳性35S::AtERS1 gDNA转基因拟南芥。

实施例3、过表达突变的AtERS1基因提高植物的根毛生成能力

一、35S::mAtERS1 gDNA的构建

将SEQ ID No.4所示的序列替换pZH01载体CaMV 35S启动子后的BamHI和SacI识别位点间序列，pZH01的其余序列保持不变，得到35S::mAtERS1 gDNA重组质粒，该质粒表达SEQ ID No.5所示的蛋白，即mAtERS1蛋白。

SEQ ID No.4所示的序列为突变的AtERS1基因(将其命名为mAtERS1基因)的基因组序列。mAtERS1蛋白的编码序列如SEQ ID No.11所示。

mAtERS1基因的基因组序列(SEQ ID No.4所示的序列)与AtERS1基因的基因组序列(SEQ ID No.1中第2033位至第4925位所示的序列)相比，仅存在基因组序列第758位的一个核苷酸的差异，AtERS1基因的该位点的核苷酸为C，mAtERS1基因的该位点的核苷酸为T。

mAtERS1蛋白的编码序列(SEQ ID No.11所示的序列)与AtERS1蛋白的编码序列(SEQ ID No.10所示的序列)仅存在第329位的一个核苷酸的差异，AtERS1蛋白的编码序列在该位点的核苷酸为C，mAtERS1蛋白的编码序列在该位点的核苷酸为T。

相应地，mAtERS1蛋白(SEQ ID No.5所示的蛋白)和AtERS1蛋白(SEQ ID No.2所示的蛋白)相比，仅存在蛋白序列第110位的一个氨基酸的差异，AtERS1蛋白的该位点的氨基酸为脯氨酸(P)，mAtERS1蛋白的该位点的氨基酸为为亮氨酸(L)。

二、将35S::mAtERS1 gDNA重组质粒导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。通过花序浸泡法(参考文献Clough SJ and Bent AF,1998)将重组农杆菌转染Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)，得到转AtERS1基因拟南芥，将其命名为的35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥。

三、转基因植物的筛选及验证

(一)将消毒的35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥的T1代种子铺在琼脂浓度为0.55g/100ml的MS(含有30ug/ml潮霉素)平板上，4℃春化2天后，将平板放入温室，平放生长12天后，筛选抗性植株移入土中。单株收获土中抗性植株种子(即35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥的T2代种子)。将其再次铺在含潮霉素的筛选培养基(琼脂浓度为0.55g/100ml的MS(含有30ug/ml潮霉素)平板)上，挑选抗潮霉素的植株(即T2代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥)。再在T2代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥株系中挑选10株抗性苗，移到土中，成熟后单株收获种子(即35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥的T3代种子)。将种子再次铺到含潮霉素的筛选培养基(琼脂浓度为0.55g/100ml的MS(含有30ug/ml潮霉素))上，检验抗潮霉素性状的分离情况。如无分离，则表明产生该种子的T3代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥植株为转基因纯合株系，可用于表型的分析，将其命名为T3代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥纯合株系。

提取T3代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥植物的基因组DNA，以其为模板，以引物F’(位于35S启动子中的序列，5’-AACAGAACTCGCCGTAAAGA-3’(SEQ ID No.8))和引物R’(位于AtERS1基因中的序列,5’-CATAAGCACCCATTTGTAAGG-3’(SEQ ID No.9))为引物进行PCR鉴定，结果表明PCR产物大小约为11OO bp，并将该PCR产物进行序列测定，与预期序列一致，因此T3代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥PCR鉴定为阳性35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥。

(二)提取步骤(一)筛选及鉴定得到的T3代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥纯合株系的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以mAtERS1F和mAtERS1R为引物进行real-time PCR，同时以Actin为内参基因，其引物为Actin F和Actin R进行上述实验，检测mAtERS1基因的mRNA的相对表达量。

并提取Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的总RNA进行上述实验作为对照。

mAtERS1F：5’-CTGATTCTGTCTGCAGA-3’；(SEQ ID No.6)

mAtERS1R：5’-TGTGTGAATTCCACACCCTGTG-3’。(SEQ ID No.7)

Actin F：5’-GACCTTGCTGGACGTGACCTTAC-3’

Actin R：5’-GTAGTCAACAGCAACAAAGGAGAGC-3’。

结果表明，与Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)相比，T3代35S::mAtERS1gDNA转基因拟南芥纯合株系中的mAtERS1基因超量表达。

四、转基因植物的表型分析

经过步骤三共获得6个T3代35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥纯合株系(分别为2-3、4-5、8-1、10-1、11-7、5-3)，对Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)，突变体erh和2-3、4-5、8-1、10-1、11-7、5-3进行根毛表型分析。

方法如下：将Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)，erh和2-3、4-5、8-1、10-1、11-7、5-3的种子分别在琼脂浓度为1.2g/100ml的MS培养基上萌发，8天后，在显微镜下观察各拟南芥的根毛性状，并测量各拟南芥的根毛长度和根毛密度，根毛长度和根毛密度的测量的方法同实施例1中步骤三。实验设三次重复，每次重复每个株系16株。

各拟南芥的主根根尖的根毛形态如图5中A所示。

各拟南芥的根毛长度和密度如图5中B所示。

图5中，B的结果表明，Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的平均根毛长度为0.32±0.01mm，突变体erh的平均根毛长度为0.46±0.02mm，35S::mAtERS1gDNA转基因拟南芥纯合株系2-3、4-5、8-1、10-1、11-7、5-3的平均根毛长度分别为0.65±0.03mm、0.68±0.03mm、0.69±0.03mm、0.81±0.06mm、0.74±0.05mm、0.70±0.03mm。Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的根毛密度(每mm根里的根毛数量)为21.9±0.8个，突变体erh的根毛密度(每mm根里的根毛数量)为26.2±1.5个，35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥纯合株系2-3、4-5、8-1、10-1、11-7、5-3的根毛密度(每mm根里的根毛数量)分别为56.3±1.7个、57.0±1.6个、63.2±1.2个、54.4±1.8个、59.0±1.6个、62.7±1.9个。

以上结果表明，35S::mAtERS1 gDNA转基因拟南芥的根毛长度和密度显著高于Columbia-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和突变体erh。

因此，在植物中过表达mAtERS1基因可以显著提高植物生成根毛的能力。

Claims (8)

1.一种促进植物根毛生长和/或发育的方法，包括在植物中表达突变的乙烯受体，以促进植物根毛生长和/或发育；

所述突变的乙烯受体为SEQ ID No.5所示的蛋白质；

所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述在植物中表达突变的乙烯受体的方法为在所述植物中导入所述突变的乙烯受体的基因；

所述突变的乙烯受体的基因具体是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述突变的乙烯受体的基因替换出发载体pZH01的多克隆位点间序列，pZH01的其余序列保持不变得到的，再具体为将所述突变的乙烯受体的基因替换pZH01的CaMV 35S 启动子后的BamHI和SacI识别位点间序列，pZH01的其余序列保持不变得到的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述突变的乙烯受体的基因的序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述在植物中表达突变的乙烯受体的方法为将所述植物的乙烯受体的基因进行突变。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述乙烯受体为SEQ ID No.2所示的蛋白。

所述乙烯受体的基因的序列如SEQ ID No.1中第2033位至第4925位所示。

6.蛋白质，是SEQ ID No.5所示的蛋白质。

7.与权利要求6所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B8）中的任一种：

B1）编码权利要求6所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

所述核酸分子为如下1）或2）所示的基因：

1）SEQ ID No.4所示的DNA分子或cDNA分子；

2）SEQ ID No.11所示的DNA分子或cDNA分子。

8.权利要求6所述的蛋白质和/或权利要求7所述的生物材料在调控植物根毛生长和/或发育中的应用；所述植物为拟南芥。