CN107827964A

CN107827964A - 一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用

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Publication number: CN107827964A
Application number: CN201711306272.4A
Authority: CN
Inventors: 张凌云; 张鹤华
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN107827964B

Abstract

本发明公开了与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。本发明发现新基因PwNAC2，将其导入拟南芥中得到转PwNAC2拟南芥植株，通过实验证明，转PwNAC2拟南芥植株的耐旱性和耐盐性显著提高，表明PwNAC2或其编码的蛋白具备耐逆性。

Description

一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用。

背景技术

干旱、盐碱等非生物逆境胁迫严重影响植物的正常生长发育，而植物在长期进化过程中会形成一系列有效的作用机制，其中包括调控胁迫相关基因的表达以应对外界不良环境。逆境胁迫诱导表达基因可大致分为两大类：即功能蛋白编码基因和参与逆境胁迫信号转导过程的转录调控蛋白编码基因。

NAC转录因子是具有多种生物学功能的植物特异转录调控因子，在植物生长发育、形态建成、激素调节和逆境胁迫应答过程中发挥着重要作用。目前在模式植物如拟南芥和水稻中的NAC基因与植物抗逆性相关研究已经取得了重要进展，但木本植物中NAC基因的功能研究报道较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关蛋白。

本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白的名称为PwNAC2，来源于青杄(Piceawilsonii Mast.)，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由387个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白质PwNAC2，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质PwNAC2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质PwNAC2的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与PwNAC2蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与PwNAC2蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码PwNAC2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PwNAC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码PwNAC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由1164个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PwNAC2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PwNAC2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PwNAC2且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码PwNAC2的核酸分子的表达盒(PwNAC2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PwNAC2的DNA，该DNA不但可包括启动PwNAC2转录的启动子，还可包括终止PwNAC2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述PwNAC2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。使用PwNAC2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素、氯霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增上述PwNAC2基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的实施例中，所述重组载体具体可为在pCAMBIA1205载体的BamHI和SmaI位点间插入上述PwNAC2基因(序列1)得到的重组表达载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌为GV3101。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供PwNAC2蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了PwNAC2蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了PwNAC2蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了PwNAC2蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

上述应用中，所述调控为提高。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中PwNAC2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中PwNAC2蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达PwNAC2蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将PwNAC2蛋白质的编码基因导入受体植物；所述PwNAC2蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，PwNAC2蛋白的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有PwNAC2蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA1205-PwNAC2导入农杆菌GV3101中。所述重组载体pCAMBIA1205-PwNAC2为将序列表中序列1所示的PwNAC2插入表达载体pCAMBIA1205的BamHI和SmaI酶切位点间，且保持pCAMBIA1205载体的其他序列不变后得到的载体。所述重组载体pCAMBIA1205-PwNAC2表达PwNAC2蛋白。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中任一种：(1)转基因植物的种子萌发率高于受体植物；(2)转基因植物的根长长于受体植物；(3)转基因植物的存活率高于受体植物。所述所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物具体通过如下体现：所述转基因植物在高浓度盐或高浓度甘露醇的胁迫下种子萌发率和/或幼苗根长和/或存活率大于所述所述受体植物。上述高盐环境具体可以是100mM、200mM的NaCl水溶液引起的环境；上述干旱环境具体可以是200mM、400mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境，也可以是停止浇水11天的干旱处理环境。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述PwNAC2基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)。

本发明首先发现了新基因PwNAC2，然后将其导入拟南芥中得到转PwNAC2拟南芥，并发现转PwNAC2拟南芥耐旱和耐盐，具体为转PwNAC2拟南芥的种子在NaCl浓度为100mM培养基中的萌发率显著高于野生型对照的种子萌发率，在NaCl浓度为100mM培养基中的幼苗根长显著长于野生型对照的幼苗根长，在NaCl浓度为200mM培养基质中处理11天后的幼苗存活率显著高于野生型对照的存活率；并且本发明获得的转PwNAC2拟南芥的种子在甘露醇浓度为200mM的培养基中的萌发率显著高于野生型对照的种子萌发率，在甘露醇浓度为200mM的培养基中的幼苗根长显著长于野生型对照的幼苗根长，在培养基质中的幼苗停止浇水11天，复水3天后的存活率显著高于野生型对照的存活率。上述结果表明，PwNAC2或其编码的蛋白具备提高植物耐旱性和耐盐性的功能。

附图说明

图1为PwNAC2基因在青杄各组织中的表达情况。

图2为转PwNAC2拟南芥分子检测结果。

图3为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥种子在100mM的NaCl处理下萌发8天的观测结果。

图4为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥种子在100mM的NaCl处理下萌发率测定结果。

图5为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥种子在200mM的甘露醇处理下萌发8天的观测结果。

图6为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥种子在200mM的甘露醇处理下萌发率测定结果。

图7为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和甘露醇的平板生长8天的根长观察结果。

图8为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和甘露醇的平板生长8天的根长的数值统计。

图9为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥幼苗在200mM的NaCl处理11天后的观测结果。

图10为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥幼苗在干旱处理11天，复水3天后的观测结果。

图11为转PwNAC2拟南芥和野生型拟南芥幼苗在盐处理和干旱处理后存活率测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pCAMBIA1205载体记载于文献“ZhangTong，LiYanfang，ZhouYanni，ZhangLingyun，Cloning and Expression Analysis of a HomologousExpansin Gene EXP2in Picea wilsonii.Journal of Forestry Research.2016,27(2):247–255.”中，公众可从申请人(北京林业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、转录因子PwNAC2及其编码基因的获得

一、转录因子PwNAC2及其编码基因的获得

采用Gateway方法构建青杄cDNA文库，由英潍捷基(上海)公司完成。以青杄PwNAC2的EST序列为模板，采用5’-CCCAATCATCCAACCTTAGGCT-3’和5’-CAACTGGGCCTCTGCATTC-3’引物进行PCR扩增，得到5’RACE-PCR；采用5’-TAGCCAGCCTCACAGTTCCAA-3’和5’-CTGCCAGGAAACAGCTATGAC-3’引物进行PCR扩增，得到3’RACE-PCR，将RACE-PCR产物与EST序列拼接，得到cDNA全长序列，并对其进行测序。

测序结果表明：cDNA核苷酸序列为序列表中序列1，由1164个核苷酸组成，与Genbank中的序列进行比较，确定它属于青杄NAC类转录因子，并将其所示的基因命名为PwNAC2，PwNAC2编码的蛋白命名为PwNAC2，其氨基酸序列为序列表中序列2，由387个氨基酸组成。上述cDNA可以通过人工合成获得。

二、通过荧光定量PCR分析PwNAC2基因的组织表达情况

分别提取青杄花粉、根、茎、针叶、种子和球果组织的RNA，反转录合成cDNA；然后分别以上述各组织的cDNA为模板，以5’-CAACATGGGGAGACCGAATGC-3’和5’-TCAATCCCTCTAATAAGAA-3’为引物进行PCR扩增，检测PwNAC2基因在青杄不同组织中的表达情况。同时以EF1-α基因作为内参，扩增EF1-α基因的5’引物为：5’–AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3’，3’引物为：5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。RT-qPCR反应条件：先95℃预变性15min；然后95℃20sec，56℃28sec，72℃50sec，共33个循环；再72℃延伸5min。

PwNAC2基因在各组织中的表达情况如图1所示。结果表明，PwNAC2在所有组织中均有表达，茎中表达量较低，球果中表达量最高。

实施例2、PwNAC2基因在提高植物耐逆性中的应用

一、转PwNAC2拟南芥的构建

1、PwNAC2基因的获得

制备下述引物对：

引物1：5’-CAACATGGGGAGACCGAATGC-3’；

引物2：5’-TCAATCCCTCTAATAAGAA-3’。

以青杄的cDNA为模板，用上述引物1和2进行PCR扩增，得到大小为1164bp的PCR产物，并对其进行测序。

测序结果表明：PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列1，可编码序列表中序列2所示的蛋白PwNAC2。

2、重组表达载体的获得

将上述PCR产物与pEASY-T1载体相连接，得到的连接产物用限制性内切酶BamHI和SmaI进行双酶切，得到酶切产物(含有上述PwNAC2基因的DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示)。酶切产物与经相同酶切的pCAMBIA1205载体相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷、X-gal和50ug/ml硫酸卡那霉素的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定。

测序结果表明，质粒为将序列表中序列1所示的PwNAC2插入表达载体pCAMBIA1205的BamHI和SmaI酶切位点间得到的重组载体，将其命名为pCAMBIA1205-PwNAC2。

3、转PwNAC2拟南芥的获得

1)转PwNAC2拟南芥的获得

将上述步骤2制备的重组载体pCAMBIA1205-PwNAC2转化农杆菌GV3101的感受态细胞(购置于上海唯地生物技术公司)，得到重组菌GV3101/pCAMBIA1205-PwNAC2(提取质粒送去测序，为重组载体pCAMBIA1205-PwNAC2)。

将重组菌GV3101/pCAMBIA1205-PwNAC2单克隆接种于含25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养两天。将培养液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％SilwetL-77的侵染液悬浮。

采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)(购自ABRC)，收获当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代)，在含有40μg/ml潮霉素(Hygromycin B)和40μg/ml羧苄青霉素(Carbenicllin)的MS培养基筛选萌发的种子。将在上述培养基上萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的转PwNAC2拟南芥植株(T4代)种子。最后将转PwNAC2拟南芥植株(T4代)种子直接播种到培养土中，长出的转PwNAC2拟南芥植株(T4代)在长日照条件下生长两周左右开花。

2)转PwNAC2拟南芥的分子检测

提取转PwNAC2拟南芥植株(T4代)的RNA，反转录得到cDNA，以其为模板，采用引物3和引物4进行PCR扩增。并以野生型拟南芥为对照。

引物3：5‘-CAACATGGGGAGACCGAATGC-3’；

引物4：5‘-TCAATCCCTCTAATAAGAA-3’。

结果如图2所示，转PwNAC2拟南芥植株(T4代)(T)PwNAC2的表达量显著高于野生型拟南芥(WT)，表明PwNAC2在转PwNAC2拟南芥植株(T4代)中表达。

采用同样的方法，将空载体pCAMBIA1205转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，播种、传代，得到空载体过表达拟南芥植株(T4代)。

二、转PwNAC2拟南芥功能研究

1、种子萌发试验

1)耐盐性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC2拟南芥植株(T4代)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，培养基中含100mM的NaCl，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

在第8天统计种子萌发率，结果如图3和图4所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC2拟南芥植株(T4代)，图3为萌发8天的表型图，图4为统计图)，转PwNAC2拟南芥植株(T4代)的种子在培养基中NaCl浓度为100mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥的种子萌发率。

野生型拟南芥(WT)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的结果无显著差异。

2)耐旱性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC2拟南芥植株(T4代)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含200mM的甘露醇，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

在第8天统计种子萌发率，结果如图5和图6所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC2拟南芥植株(T4代)，图5为萌发8天的表型图，图6为统计图)，转PwNAC2拟南芥植株(T4代)的种子在甘露醇浓度为200mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥的种子萌发率。

2、根长测量耐盐性和耐旱性试验

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC2拟南芥植株(T4代)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，萌发后的拟南芥幼苗，用镊子移到垂直平铺在MS培养基上，其中培养基中分别含100mM的NaCl和200mM的甘露醇。实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100株，实验重复3次，结果取平均值。

在第8天测量统计两个株系的根长，结果如图7和图8所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC2拟南芥植株(T4代)，图7为生长8天的表型图，图8为统计图)，转PwNAC2拟南芥植株(T4代)的种子在NaCl浓度为100mM、甘露醇浓度为200mM时的根长显著高于野生型拟南芥的幼苗根长。

野生型拟南芥(WT)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)结果无显著差异。

上述结果表明，PwNAC2或其编码的蛋白具备耐旱性和耐盐性。

3、幼苗耐逆实验

1)耐盐性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC2拟南芥植株(T4代)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的种子播种在MS培养基上，7天后，将幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在培养基质中生长12天后，浇以200mM NaCl溶液，每两天浇一次，11天后统计存活率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图9和图11所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC2拟南芥植株(T4代)，图9为200mM的NaCl处理11天后的表型图，图11为统计图)，转PwNAC2拟南芥植株(T4代)的幼苗在200mM NaCl处理后的存活率显著高于野生型拟南芥的幼苗的存活率。

2)耐旱性研究

取野生型拟南芥(WT)、转PwNAC2拟南芥植株(T4代)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的种子播种在MS培养基上，7天后，将幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。在培养基质中生长12天后，停止浇水11天，复水3天后统计存活率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

结果如图10和图11所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwNAC2拟南芥植株(T4代)，图10为干旱处理11天，复水3天后的表型图，图11为统计图)，转PwNAC2拟南芥植株(T4代)的幼苗在干旱处理11天，复水3天后的存活率显著高于野生型拟南芥的幼苗的存活率。

序列表

<110>北京林业大学

<120>一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1164

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggggagac cgaatgcaga ggcccagttg aatttaccgc ccggattcag atttttccct 60

accgatgacg agcttgttgt gcactacttg tgcaggaagg ctgcatcaca ggccattgct 120

gttcctatta ttgcagaggt ggacttgtac aaattcgatc cgtggcagct cccagaaaag 180

gcactgtttg gagaaaagga gtggtatttc ttcactccga gggacaggaa gtatccaaat 240

ggttctcgcc cgaacagggc tgccggctca gggtactgga aagccacagg tgcagataaa 300

cccatcactg ctaagggcag taacaagcgc gttggcatca agaaggctct ggttttctat 360

gtgggaaaag cacctaaagg aaacaagact aattggatta tgcatgaata ccgccttgct 420

gatgtcaaca ggtctgcaaa gaagaagggc agcctaaggt tggatgattg ggtactttgt 480

cgaatataca acaagaagag cagtgcggag aagttagcta aggagcagaa ggagtggtcc 540

tcggaagaag caatggaaca attccatgaa gaaattgatg aaaaggtgcc aggaatactg 600

ctcactggga atactataat gaactcgagc attgagaatt cagaaagaac ttcacaagat 660

tcaaccatat ctgccccttc tcccaattgt agaacggcct ctaaccatga ttcacgagct 720

tctgccatta cttccttgag ctacaactca aatcccattt ttgagcagaa tttgaacctt 780

tcaaatgcca gtagtgctcc aatggagatt ccagaacttg tccctttttt cagctctatg 840

aataatcgca ggacaaatta tgattcagca gatttaattc ctcctattct actcaccgat 900

tcaagttgtt ccatgcaatc atcgcatgat cttaaatccg agaaagaaga agtgcagagc 960

agctttaggt tggaagagtt gatgcagcag cagcagcagg agaatgccgg tttgaatcaa 1020

caaatgttca gctttggctt cgagagtctg caaaatccat ttccatcatt agaccaaata 1080

cagcctccta ccaacaatga tcctttccaa gattacttag ccagcctcac agttccaagt 1140

tacttacaaa ggtcttctta ttag 1164

<210>2

<211>387

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Gly Arg Pro Asn Ala Glu Ala Gln Leu Asn Leu Pro Pro Gly Phe

1 5 10 15

Arg Phe Phe Pro Thr Asp Asp Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg

20 25 30

Lys Ala Ala Ser Gln Ala Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Val Asp

35 40 45

Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Gln Leu Pro Glu Lys Ala Leu Phe Gly

50 55 60

Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn

65 70 75 80

Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr

85 90 95

Gly Ala Asp Lys Pro Ile Thr Ala Lys Gly Ser Asn Lys Arg Val Gly

100 105 110

Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Val Gly Lys Ala Pro Lys Gly Asn

115 120 125

Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asn Arg

130 135 140

Ser Ala Lys Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys

145 150 155 160

Arg Ile Tyr Asn Lys Lys Ser Ser Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Gln

165 170 175

Lys Glu Trp Ser Ser Glu Glu Ala Met Glu Gln Phe His Glu Glu Ile

180 185 190

Asp Glu Lys Val Pro Gly Ile Leu Leu Thr Gly Asn Thr Ile Met Asn

195 200 205

Ser Ser Ile Glu Asn Ser Glu Arg Thr Ser Gln Asp Ser Thr Ile Ser

210 215 220

Ala Pro Ser Pro Asn Cys Arg Thr Ala Ser Asn His Asp Ser Arg Ala

225 230 235 240

Ser Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Asn Pro Ile Phe Glu Gln

245 250 255

Asn Leu Asn Leu Ser Asn Ala Ser Ser Ala Pro Met Glu Ile Pro Glu

260 265 270

Leu Val Pro Phe Phe Ser Ser Met Asn Asn Arg Arg Thr Asn Tyr Asp

275 280 285

Ser Ala Asp Leu Ile Pro Pro Ile Leu Leu Thr Asp Ser Ser Cys Ser

290 295 300

Met Gln Ser Ser His Asp Leu Lys Ser Glu Lys Glu Glu Val Gln Ser

305 310 315 320

Ser Phe Arg Leu Glu Glu Leu Met Gln Gln Gln Gln Gln Glu Asn Ala

325 330 335

Gly Leu Asn Gln Gln Met Phe Ser Phe Gly Phe Glu Ser Leu Gln Asn

340 345 350

Pro Phe Pro Ser Leu Asp Gln Ile Gln Pro Pro Thr Asn Asn Asp Pro

355 360 365

Phe Gln Asp Tyr Leu Ala Ser Leu Thr Val Pro Ser Tyr Leu Gln Arg

370 375 380

Ser Ser Tyr

385

<210>3

<211>1170

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

tccatgggga gaccgaatgc agaggcccag ttgaatttac cgcccggatt cagatttttc 60

cctaccgatg acgagcttgt tgtgcactac ttgtgcagga aggctgcatc acaggccatt 120

gctgttccta ttattgcaga ggtggacttg tacaaattcg atccgtggca gctcccagaa 180

aaggcactgt ttggagaaaa ggagtggtat ttcttcactc cgagggacag gaagtatcca 240

aatggttctc gcccgaacag ggctgccggc tcagggtact ggaaagccac aggtgcagat 300

aaacccatca ctgctaaggg cagtaacaag cgcgttggca tcaagaaggc tctggttttc 360

tatgtgggaa aagcacctaa aggaaacaag actaattgga ttatgcatga ataccgcctt 420

gctgatgtca acaggtctgc aaagaagaag ggcagcctaa ggttggatga ttgggtactt 480

tgtcgaatat acaacaagaa gagcagtgcg gagaagttag ctaaggagca gaaggagtgg 540

tcctcggaag aagcaatgga acaattccat gaagaaattg atgaaaaggt gccaggaata 600

ctgctcactg ggaatactat aatgaactcg agcattgaga attcagaaag aacttcacaa 660

gattcaacca tatctgcccc ttctcccaat tgtagaacgg cctctaacca tgattcacga 720

gcttctgcca ttacttcctt gagctacaac tcaaatccca tttttgagca gaatttgaac 780

ctttcaaatg ccagtagtgc tccaatggag attccagaac ttgtcccttt tttcagctct 840

atgaataatc gcaggacaaa ttatgattca gcagatttaa ttcctcctat tctactcacc 900

gattcaagtt gttccatgca atcatcgcat gatcttaaat ccgagaaaga agaagtgcag 960

agcagcttta ggttggaaga gttgatgcag cagcagcagc aggagaatgc cggtttgaat 1020

caacaaatgt tcagctttgg cttcgagagt ctgcaaaatc catttccatc attagaccaa 1080

atacagcctc ctaccaacaa tgatcctttc caagattact tagccagcct cacagttcca 1140

agttacttac aaaggtcttc ttattaggtc 1170

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

6.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中任一种：

(1)转基因植物的种子萌发率高于受体植物；

(2)转基因植物的根长长于受体植物；

(3)转基因植物的存活率高于受体植物。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1所述的蛋白质；

或，所述过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

10.根据权利要求4或5所述的应用或根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。