CN105713078B - 抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用。本发明公开的应用中，抗旱相关蛋白为如下A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，ZmDRRP及其编码基因可以提高植物的抗旱性，还可以促进植物根的生长，可以利用ZmDRRP及其编码基因调控植物的抗旱性。

Description

抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱是我国农业生产中主要的非生物逆境胁迫，随着气候恶劣变化，严重影响着作物的正常生长和产量稳定增长。玉米植株高大，需水量高，是干旱敏感性作物，一生需水量在420毫米以上，而我国广大的干旱半干旱地区年降雨量平均都在250毫米以下，部分地区甚至达到50毫米以下，农业水资源严重不足。据联合国粮农组织报告，玉米由于干旱每年会损失15-20％的产量。因此，通过抗旱基因发掘、种质创新与互相利用，培育和推广抗旱玉米新品种培育具有重要的实践意义。

干旱对植物的伤害主要有膜结构受到破坏、细胞器独立性破坏、蒸腾作用和呼吸作用减弱或停止、新陈代谢紊乱、生长发育停止等。抗旱植物通过一系列形态学和生理生化方面的响应对干旱伤害做出适应性或防御反应。依据不同的反应策略，植物的抗旱机制可以分为三种不同的类型：避旱，耐旱及御旱。避旱性是指在土壤和植物发生严重的水分亏缺之前，植物就已经完成其生活史或在干旱敏感期避开缺水，是通过改变生育期来躲避干旱胁迫的一种重要的耐旱机制；御旱性是指植物在干旱逆境下保持植株内部组织较高水势的能力，维持植株生长。叶片属性，冠层温度，气孔开度以及根系特性是玉米重要的御旱性指标，其中，发达的根系有利于植物对水分的吸收，根系扎的越深越能从土壤中吸收更多的水分。根长，根密度和根系生物量是决定玉米御旱性的主要性状；植物在干旱胁迫下维持正常生长发育的潜力被称为耐旱性。耐旱性是一个复杂的机制，涉及多种生理生化和分子层面上的变化。植物耐旱调控包括渗透调节，抗氧化剂清除防御系统，水通道蛋白，压力响应蛋白，转录因子以及信号转导途径等，植物生长发育，物候期，籽粒灌浆以及光合产物的运输都是与玉米耐旱性相关的性状。

随着现代生物技术的发展，对植物抗旱性的分子机制研究在不断深入，发掘了一系列抗旱相关基因，这些干旱响应基因编码蛋白主要分为三类：(1)参与细胞的信号转导和转录调控的蛋白(如蛋白激酶、蛋白磷酸化酶和转录因子)；(2)保护膜结构和其他蛋白的功能性蛋白(如LEA蛋白、抗氧化剂和渗透蛋白)；(3)水和离子吸收或运输相关的蛋白(如水通道蛋白和糖转运蛋白)。这些基因或蛋白的发掘对了解植物的抗旱机制，以及培育抗旱作物新品种有重要的实践意义。

但作物抗旱性是一个非常复杂的数量性状，其遗传代谢网络与作物的生长发育和环境变化息息相关。目前发掘的与干旱响应的基因远远没有达到系统地解析作物抗旱机制的要求，迫切需要通过各种新的技术和手段寻找新的抗旱基因，其决定的表型特征，并对其进行功能验证和遗传解析。

发明内容

本发明所要解决的问题是如何提高植物的抗旱性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用；所述抗旱相关蛋白名称为ZmDRRP，是如下A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；

A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，序列2由143个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的ZmDRRP蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的ZmDRRP蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的ZmDRRP蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与ZmDRRP相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；

所述生物材料，为下述B1)至B14)中的任一种：

B1)编码ZmDRRP的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B12)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)、b2)或b3)所示的基因：

b1)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)或限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ZmDRRP的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmDRRP的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由432个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmDRRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ZmDRRP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmDRRP且具有ZmDRRP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码ZmDRRP的核酸分子的表达盒(ZmDRRP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ZmDRRP的DNA，该DNA不但可包括启动ZmDRRP基因转录的启动子，还可包括终止ZmDRRP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述ZmDRRP基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为载体pCHF3。

B3)所述重组载体可含有序列1所示的用于编码ZmDRRP的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pCHF3-ZmDRRP。所述pCHF3-ZmDRRP为在载体pCHF3的Sma I识别序列处插入序列2所示的DNA分子得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101-pMP。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了ZmDRRP或所述生物材料在培育抗旱性增强植物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗旱性增强的转基因植物的方法，所述方法包括向受体植物中导入ZmDRRP的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性增强。

上述方法中，所述ZmDRRP的编码基因为上述B1)所述核酸分子。

在本发明的实施例中，所述ZmDRRP的编码基因(即序列1的第250-795位核苷酸所示的DNA分子)通过含有ZmDRRP基因表达盒的ZmDRRP基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述ZmDRRP基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述ZmDRRP基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述ZmDRRP基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述方法还包括从导入序列2所示的ZmDRRP的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株。

为解决上述技术问题，本发明还提供了调控植物抗旱性的产品，所述产品含有ZmDRRP或所述生物材料。

上述产品可以以ZmDRRP作为活性成分，还可以将ZmDRRP和其它可以调控植物抗旱性的物质进行组合得到的组合物作为活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述调控植物抗旱性的产品在调控植物抗旱性中的应用。

本发明中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmDRRP基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明中，所述抗旱性具体通过所述植物的花青苷含量和/或根长来衡量，抗旱性强的植物的花青苷含量较抗旱性弱的植物的低。所述抗旱性可体现在所述植物在甘露醇模拟的干旱环境或PEG模拟的干旱环境中的抗旱性上。

实验证明，ZmDRRP及其编码基因可以提高植物的抗旱性：与野生型植物相比，三个转ZmDRRP基因的株系DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10在干旱胁迫处理前的花青苷含量基本无变化，在干旱胁迫处理后，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的花青苷平均含量分别为10.24μg/g，16.34μg/g和15.71μg/g，仅为野生型的40-60％。ZmDRRP及其编码基因可以提高植物对甘露醇模拟的干旱环境的抗旱性：在不含甘露醇的培养基中，各中植物的根长基本无差异；在含有300mg/mL甘露醇的培养基中，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的根长分别为1.94cm、2.03cm和2.26cm，分别为野生型的1.1倍、1.2倍和1.3倍。ZmDRRP及其编码基因可以促进植物根的生长，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的下胚轴平均长度分别为0.48cm、0.51cm和0.52cm，分别为野生型的1.21倍、1.31倍和1.33倍。ZmDRRP基因在PEG模拟的干旱环境中表达量升高。表明，干旱环境可以诱导ZmDRRP基因的表达，来提高植物的抗旱性。

附图说明

图1为干旱胁迫前后转ZmDRRP基因植株的生长状况及存活率。其中，A为植株的生长状况，B为存活率。

图2为干旱胁迫前后转ZmDRRP基因植株花青苷含量的变化情况。

图3为野生型和过表达ZmDRRP转基因植株在甘露醇竖板上的根长统计。

图4为不同干旱时间处理下ZmDRRP基因的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的玉米齐319(Hao et al.A proposed selection criterion fordrought resistance across multiple environments in maize.BreedingScience.2011.61:101–108)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pCHF3(王爱萍，景蕊莲，杨武德，董琦.小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化.应用与环境生物学报.2008.14:750–752.)经中国农业科学院作物科学研究所景蕊莲老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌GV3101-pMP为北京博迈德基因技术有限公司产品，产品目录号为BC304-01。

下述实施例中的玉米自交系铁7922(Hao et al.A proposed selectioncriterion for drought resistance across multiple environments inmaize.Breeding Science.2011.61:101–108)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、利用ZmDRRP基因抗旱转基因拟南芥

本实施例提供了来源于玉米齐319的ZmDRRP基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码序列1所示的蛋白质，该蛋白质的名称为ZmDRRP。

一、转ZmDRRP基因拟南芥的构建

1、重组载体和重组农杆菌的构建

通过载体pCHF3的SmaI识别序列在载体pCHF3的SmaI识别序列处的插入序列2所示的DNA分子(即ZmDRRP基因)得到重组载体，将该重组载体命名为pCHF3-ZmDRRP，pCHF3-ZmDRRP与载体pCHF3的差别仅在于：pCHF3-ZmDRRP为在载体pCHF3的Sma I识别序列处插入序列2所示的DNA分子得到的重组载体。pCHF3-ZmDRRP表达序列1所示的ZmDRRP。

分别将载体pCHF3与pCHF3-ZmDRRP导入农杆菌GV3101-pMP中，分别得到含有载体pCHF3的重组农杆菌与含有pCHF3-ZmDRRP的重组农杆菌，将其分别命名为GV3101-pCHF3与GV3101-pCHF3-ZmDRRP。

2、重组农杆菌侵染转化拟南芥

1)用接种针沾取经步骤1的pCHF3-ZmDRRP，在含有抗生素的固体培养基(该培养基为向YEB培养基中加入利福平、庆大霉素和卡那霉素得到的固体培养基，其中，利福平的浓度为30μg/mL，庆大霉素的浓度为30μg/mL，卡那霉素的浓度为50μg/mL)划线，28℃暗培养2-4天；

2)挑取1)的单菌落接种于2-3mL含有抗生素的液体培养基(该培养基为向YEB培养基中加入利福平、庆大霉素和卡那霉素得到的液体培养基，其中，利福平的浓度为30μg/mL，庆大霉素的浓度为30μg/mL，卡那霉素的浓度为50μg/mL)，28℃210rpm/min培养过夜；

3)取1mL步骤2)得到的菌液接种于200mL步骤2)所述的含有抗生素的液体培养基中，28℃210rpm/min培养过夜至菌液呈现橘黄色；

4)将步骤3)得到的菌液倒入灭菌的离心杯中，室温，5000rpm，15min离心收集菌体；

5)将步骤4)得到的菌体悬浮于100mL的转化渗透液(转化渗透液为向1/2MS中加入蔗糖和siLwet得到的液体，转化渗透液中蔗糖的浓度为5g/100mL，siLwet的浓度为0.02％(体积百分比浓度)中，得到农杆菌悬浮液；

6)将野生型哥伦比亚生态型拟南芥(大部分的拟南芥的花蕾处于即将开花状态)整个花序进入步骤5)得到的农杆菌悬浮液中30s后放于托盘中，黑暗保湿培养24h，然后放于正常培养条件下培养(拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状态可再次侵染以提高转化效率)，得到T0代转基因拟南芥，将该T0代转基因拟南芥命名为T0代转ZmDRRP基因拟南芥。收获T1代转ZmDRRP基因种子。将T1代转ZmDRRP基因种子在含有卡那霉素的培养基上进行筛选，将具有卡那霉素抗性的植株在正常培养条件下培养，收获T2代转ZmDRRP基因种子。将T2代转ZmDRRP基因种子在含有卡那霉素的培养基上进行筛选，将具有卡那霉素抗性的植株在正常培养条件下培养，得到T2代转ZmDRRP基因植株，收获T3代转ZmDRRP基因种子。

按照步骤1)-6)的方法，将pCHF3-ZmDRRP替换为载体pCHF3，其他步骤均不变，将得到的转基因拟南芥命名为转空载体拟南芥，按照步骤6)的方法进行筛选得到T3代转空载体植株。

3、转基因拟南芥的鉴定

3.1基因组水平上的鉴定

提取T3代转ZmDRRP基因植株的基因组DNA，用引物DRRP-CDS(DRRPcdsF：5'-ATGGCGATGGCGTACAAG-3'；DRRPcdsR：5'-CGCAGCGGGGGCCTCATT-3')进行PCR扩增，得到三个PCR产物中含有目的条带的株系，分别命名为DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10。

3.2RNA水平的鉴定

提取步骤2的T3代转空载体植株、DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的RNA，进行定量PCR检测植株体内ZmDRRP基因的表达情况，用到的引物为DRRP-RT(DREBrtF:5'-TGCTCAGTAGTCAGTAGTC-3'；DREBrtR：5'-ACCCATCAACATCAACAC-3')，内参为GAPDH基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)，内参的引物为GAPDHF：5'-CATCACCACGGACTACAT-3'；GAPDHR：5'-GACTCCACGACATACTCA-3')，结果显示，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10中均有ZmDRRP基因的表达，T3代转空载体植株中无ZmDRRP基因的表达。

二、转基因拟南芥的抗旱性分析

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1、干旱胁迫处理

将处于两叶期的野生型拟南芥、步骤一的T3代转空载体植株以及DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10分别移栽至蛭石与营养土为3:1的混合土中，每个株系81株。每个株系移栽前浇足水，移栽1周后停止浇水，在16h光/8h暗(长日照)，22℃下干旱胁迫3周，3周后复水3天。

野生型拟南芥(WT)、DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10干旱胁迫前后的结果如图1所示，在干旱胁迫后，野生型拟南芥与T3代转空载体植株的叶片均枯萎卷曲，而DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的叶片仍硬挺；复水三天后，野生型拟南芥与T3代转空载体植株均全部死亡，而DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的死亡率均低于20％(存活率均超80％)。

花青苷是植物体在逆境胁迫条件下自身积累的一种色素，常被用于表征植物对胁迫的耐受性。在干旱处理10天后，对于正常和干旱条件下的各株系，测定其体内的花青苷含量。花青苷含量的测定方法如下：取植株的地上部分，每两棵一个样本，三个过表达株系和野生型株系干旱和正常条件下的植株各设置3个样本，称重并记录。提取液配置：甲醇：HCl＝99:1(v/v)。每个样本中加入5ml提取液，在4℃冰箱中抽提2天，用紫外分光光度计测定530nm和657nm处的吸光值。计算样本的花青苷含量，花青苷含量(μg/g)＝(OD530﹣0.25×OD657)×提取液体积(ml)×1/样鲜重(g)，对正常和干旱条件下的花青苷含量进行t测验。

野生型拟南芥(WT)、DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的结果如图2所示。结果显示，野生型拟南芥与T3代转空载体植株的花青苷含量在干旱胁迫前后基本无差异；与野生型拟南芥相比，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10在干旱胁迫处理前的花青苷含量基本无变化，在干旱胁迫处理后，野生型拟南芥的花青苷平均含量为26.92μg/g，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的花青苷平均含量分别为10.24μg/g，16.34μg/g和15.71μg/g，仅为野生型拟南芥的40-60％。

表明，ZmDRRP及其编码基因可以提高拟南芥的抗旱性。

2、甘露醇模拟的干旱环境处理

将野生型拟南芥(WT)、步骤一的T3代转空载体植株以及DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的种子消毒后播种至1/2MS培养基中，16h光/8h暗(长日照)，22℃下竖直培养3～5d后，挑选大小和根长一致不同株系植株移至0mg/mL甘露醇-1/2MS培养基(即1/2MS培养基)、300mg/mL甘露醇-1/2MS培养基(该培养基为向1/2MS培养基中添加甘露醇得到的甘露醇浓度为300mg/mL的固体培养基)中，观察并统计根长情况。每一竖板含三个纯合系和野生型，实验设置三个重复，取平均值。

结果显示(图3)，在0mg/mL甘露醇-1/2MS培养基中，各拟南芥的根长基本无差异；在300mg/mL甘露醇-1/2MS培养基中，野生型拟南芥与T3代转空载体植株的根长基本无差异，野生型拟南芥的根长为1.74cm，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的根长分别为1.94cm、2.03cm和2.26cm，分别为野生型拟南芥的1.1倍、1.2倍和1.3倍。表明，ZmDRRP及其编码基因可以提高拟南芥对甘露醇模拟的干旱环境的抗旱性。

3、黑暗处理

下胚轴是高等植物胚后期的幼苗茎，是连接根系与茎叶的重要结构，也是物质运输的重要通道，高等植物下胚轴是研究植物细胞伸长分子机理的经典材料。将春化后的野生型拟南芥、步骤一的T3代转空载体植株以及DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10分别种子点播在1/2MS固体培养基上，用锡箔纸将培养皿包住，竖直培养1周左右，观察并统计下胚轴情况。

结果显示，野生型拟南芥与T3代转空载体植株的下胚轴长度基本无差异，野生型拟南芥的下胚轴平均长度为0.39，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的下胚轴平均长度分别为0.48cm、0.51cm和0.52cm，分别为野生型拟南芥的1.21倍、1.31倍和1.33倍。表明，ZmDRRP及其编码基因可以促进拟南芥的生长。

实施例2、干旱胁迫下玉米的ZmDRRP基因表达量升高

从玉米自交系铁7922中挑选饱满整齐的种子100粒，用1％的NaClO浸泡消毒10分钟，用蒸馏水漂洗干净；滤纸吸干后，放入有湿润滤纸的发芽盒中26℃-28℃萌发4-5天,每日向发芽盒中加入适量水湿润滤纸，并且清洗种子以防发霉；挑选发芽一致的种子种在用无菌蒸馏水冲洗的无菌沙中，放入在保温箱中，在光周期为(光照16h/黑暗8h)、温度为24/21℃(光/暗)下培养至两叶一心期。

将两叶一心期的玉米苗在改良的Hoagland's(霍格兰氏)营养液(表2)中进行培养，培养至三叶一心期。

表2、改良的Hoagland's(霍格兰氏)营养液

注：营养液要现用现配，使用前用稀酸或稀碱将pH调至6.0左右，2天换一次营养液。

将三叶一心期的玉米幼苗在PEG培养液(PEG培养液为向改良的Hoagland's(霍格兰氏)营养液中加入PEG-6000得到的PEG-6000的质量百分比浓度为20％的液体)中进行干旱胁迫处理，在干旱胁迫处理0小时、1小时、3小时、6小时和12小时分别提取根、茎和叶的总RNA，检测ZmDRRP基因的表达情况。

结果(图4)显示，玉米ZmDRRP基因在PEG模拟的干旱环境中表达量升高。

Claims (6)

1.抗旱相关蛋白在调控植物抗旱性中的应用；所述抗旱相关蛋白的氨基酸序列如序列2的所示；所述植物为拟南芥或玉米。

2.与权利要求1所述抗旱相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；

所述生物材料，为下述B1）至B14）中的任一种：

B1）编码权利要求1所述抗旱相关蛋白的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B9）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10）含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织；

B12）含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B13）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官；

B14）含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

所述植物为拟南芥或玉米。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.权利要求1中所述的抗旱相关蛋白或权利要求2或3中所述的生物材料在培育抗旱性增强植物中的应用；所述植物为拟南芥或玉米。

5.一种培育抗旱性增强的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1中所述的抗旱相关蛋白的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性增强；所述植物为拟南芥或玉米。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求1中所述的抗旱相关蛋白的编码基因为权利要求3中B1）所述核酸分子。