JPWO2006057306A1 - ストレス耐性及び/又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物及びその子孫。
17. 項1に記載のイネ科植物及びその子孫から得られる有用物質。
18. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
20. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
33. 以下の工程:
(1)植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
(2)該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された生産性ないし形質を有する植物体を再生し、
(3)該植物体から受粉により種子を採取し、および
(4)該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子
本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素(ADC)遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素(ODC)遺伝子、スペルミジンについてはS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素(SAMDC)遺伝子とスペルミジン合成酵素(SPDS)遺伝子、スペルミンについてはS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素(SAMDC)遺伝子とスペルミン合成酵素(SPMS)遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。
・配列番号1に示される塩基配列中塩基番号77〜1060で示される塩基配列を有するDNA、
・配列番号3に示される塩基配列中塩基番号456〜1547で示される塩基配列を有するDNA、
・配列番号5に示される塩基配列中塩基番号541〜2661で示される塩基配列を有するDNA、
が挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。更に、
・該上記いずれかの配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。
ストレス耐性が改良されたイネ科植物及びその子孫
本発明において、「ストレス」としては、上述のごとく、高温、低温、低pH、低酸素、酸化、塩、浸透圧、乾燥、水、冠水、カドミウム、銅、オゾン、大気汚染、紫外線、強光、弱光、病原体、病原菌、害虫、除草剤などの環境から受けるストレスが例示される。この中で「高温ストレス」とは、植物の生育適温度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、高温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「低温ストレス」とは、植物の生育適温度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、低温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「塩ストレス」とは、植物の生育適塩濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、塩ストレスを受けた植物は過剰な塩が細胞内に流入して徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「乾燥ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、乾燥ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「水ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、水ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「弱光ストレス」とは、植物の生育適光強度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、弱光ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「病原菌ストレス」とは、植物が病原菌に遭遇または感染することによって植物が受けるストレスであり、病原菌ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「害虫ストレス」とは、植物が害虫に遭遇することによって植物が受けるストレスであり、害虫ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。
生産性が改良された植物及びその子孫
本発明において、「生産性」としては、上述のごとく、イネ科植物のあらゆる器官(組織)、例えば、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果、小穂などを包含し、該器官(組織)の形質として数量、生育期間、形、着色、性質、特性が例示される。
実施例1:植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローニング
WO02/23974の実施例2の記載に従い、完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子(FSPD1;配列番号1,2)、S−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子(FSAM24;配列番号3,4)、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を(FADC76;配列番号5,6)を得た。
実施例2:トランスジェニックイネの作製と解析
(1)発現コンストラクトの作製
配列番号1に示したポリアミン代謝関連遺伝子FSPD1の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、XhoIで切断し、グラスミルク法で精製した。次にpGEM−7Zf(Promega社製)をXhoI切断して、FSPD1断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。pGEM−7Zfのマルチクローニングサイトの制限酵素XbaIとKpnIで再度FSPD1断片を切り出して、35Sプロモーターが連結しているバイナリーベクターpBI101−Hm2にサブクローニングした。これらのプラスミドをpBI35S−FSPD1+/−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図1に示した。なお、形質転換された大腸菌JM109を、Escherichia coli JM109/pBI35S−FSPD1+/−と命名した。
(2)プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
(1)で得られた大腸菌pBI35S−FSPD1+/−、大腸菌pBI35S−FSAM24+/−、大腸菌pBI35S−FADC76+/−とヘルパープラスミドpRK2013を持つ大腸菌HB101株を、それぞれ50mg/lのカナマイシンを含むLB培地で37℃で1晩、アグロバクテリウムEHA101株を50mg/lのカナマイシンを含むLB培地で37℃で2晩培養した。各培養液1.5mlをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、LB培地で洗浄した。これらの菌体を1mlのLB培地に懸濁後、3種の菌を100μlずつ混合し、LB培地寒天培地にまき、28℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達(三者接合法)させた。1から2日後に一部を白金耳でかきとり、50mg/lカナマイシン、20mg/lハイグロマイシン、25mg/lクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に塗布した。28℃で2日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をEHA101/pBI35S−FSPD1+/−、EHA101/pBI35S−FSAM24+/−、EHA101/pBI35S−FADC76+/−と命名した。
(3)イネの形質転換
イネの形質転換はHiei Y.らの方法(Plant J.,6,271−282,1994)を参考にした。イネ品種‘ゆきひかり’(以下「ゆきひかり」又は「野生株」という)の完熟種子を籾を取り除いた後、70%エタノールで5分浸漬の後、同様に滅菌したビーカーに入れた滅菌液(5%次亜塩素酸ナトリウム、0.02%Triton X−100)に20分浸漬して滅菌を行った。滅菌した種子は、滅菌ビーカーに入れた滅菌水で3回洗浄を行った。洗浄後、カルス誘導培地〔N6Clプレート:N6無機塩、N6ビタミン、2mg/l 2,4−D、30g/l シュクロース、2g/l ゲルライト、pH5.8〕上に置床し、植物インキュベーター(サンヨー社製、MLR−350HT)中で25℃、明所(60μmol・m−2・s−1、16時間明期/8時間暗期、以下この光条件を明所とする)条件下にて培養した。約1ヶ月後、増殖した組織より植物体への再分化能を持つ胚性カルスを選抜した。選抜した胚性カルスは以後、1ヶ月毎に新しいN6Clプレートに移植し、増殖させた。アグロバクテリウムの感染は形質転換アグロバクテリウム株EHA101/pBI35S−FSPD1+/−、EHA101/pBIC2−FSPD1+/−(CaMV35Sプロモーターを西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼプロモーターに置き換えたもの)、EHA101/pBI35S−FSAM24+/−、EHA101/pBI35S−FADC76+/−を50mg/lカナマイシン及び50mg/lハイグロマイシンを含むLB寒天培地にて27℃、2晩培養後、菌体を飯粒2粒程度掻き取り、感染培地(AA:AA無機塩、アミノ酸、B5ビタミン、20g/l シュクロース、2mg/l 2,4−D、0.2mg/l カイネチン、10mg/l アセトシリンゴン、pH5.8)に懸濁した。この菌体懸濁液を、滅菌したステンレスネット製バスケットを入れた300ml滅菌ビーカーに移した。ビーカーに前培養した胚性カルスをこのビーカーのバスケットに入れて2分間浸したのち、2枚重ねた滅菌濾紙上にバスケットごと乗せて余分な水分を除き、共存培養培地(N6COプレート:N6無機塩、N6ビタミン、30g/l シュクロース、10g/l グルコース、2mg/l 2,4−D、10mg/l アセトシリンゴン、2g/l ゲルライト、pH5.8)に移して、28℃、暗黒条件下にて3日間共存培養した。3日間共存培養した胚性カルスを、除菌液(滅菌水にカルベニシリンを終濃度500mg/lとなるように加えたもの)50mlを入れた滅菌したステンレスバスケット入り300mlビーカーのバスケットに移し、ピンセットでバスケットをつまみ、数分間良く洗浄した。次に胚性カルスを、バスケットごと除菌液を入れた300ml滅菌ビーカーに移し、再び洗浄を行った。同じ操作を再度繰り返した後、滅菌濾紙上で余分な水分を除き、選抜培地(N6SEプレート:N6無機塩、N6ビタミン、30g/l シュクロース、2mg/l 2,4−D、50mg/l ハイグロマイシン、500mg/l カルベニシリン、2g/l ゲルライト、pH5.8)に並べて25℃、暗黒条件下にて約3〜4週間培養した。ほぼ全てのカルスを再分化培地(MSREプレート:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、30g/l ソルビトール、2g/l casamino酸、1mg/l NAA、2mg/l BAP 250mg/l カルベニシリン、50mg/l ハイグロマイシン、4g/l ゲルライト、pH5.8)に移植して25℃、暗黒条件下にて再分化するまで培養した。得られた形質転換体について導入遺伝子の確認と発現解析を行った。具体的には導入遺伝子の確認については、ゲノムDNAを調整した後に、PCR法とサザンハイブリダーゼーションを行った。導入遺伝子の発現解析は、ノーザン解析とウエスタン解析を行った。ウエスタン解析は4系統の形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2,RSP−CS−3−1,RSP−CS−3−2,RSP−CS−3−3,RSP−CS−3−4)から葉をサンプリングしてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を常法に従ってSDS−PAGEした後にエレクトロブロット法でメンブレンに転写した。FSPD1のペプチド抗体(SPDS−SP3:LCSTEGPPLDFKHP)を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果を図2に示した。図2の結果から明らかなように形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2,RSP−CS−3−1,RSP−CS−3−2,RSP−CS−3−3,RSP−CS−3−4)はFSPD1ペプチド抗体と免疫反応を示すバンドが検出され、目的遺伝子が転写、翻訳されていることが示された。以上のことから、目的遺伝子が導入されている形質転換イネを得ることができた。
(4)ポリアミンの解析
(3)で作製した形質転換イネについて、PCR(またはサザン解析)、ノーザン解析、ウエスタン解析の結果からセルラインの選抜を行った。確実にポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ該遺伝子を安定的に発現している系統についてポリアミン分析を行った。FSPD1がセンス方向(+)で導入されているセルライン、RSP−SS−1−1、RSP−SS−1−2、RSP−CS−3−1、RSP−CS−3−2、RSP−CS−3−3、RSP−CS−3−4を選抜し、RSP−SS−1−1、RSP−SS−1−2はプロモーターとしてCaMV35Sプロモーターが導入されている系統、RSP−CS−3−1、RSP−CS―3−2、RSP−CS−3−3、RSP−CS−3−4は西洋わさび由来のペルオキシダーゼプロモーター(C2プロモーター)が導入されている系統である。FSPD1がアンチセンス方向(−)で導入されているセルライン、RSP−SA−1、RSP−SA−2を選抜し、いずれもCaMV 35Sプロモーターが導入されている系統である。FSAM24がセンス方向(+)で導入されているセルライン、RSP−SM−1−1、TSP−SM−1−2を選抜し、RSP−SM−1−1、RSP−SM−1−2はプロモーターとしてCaMV35Sプロモーターが導入されている系統である。同時に栽培を行った野生株(WT)と形質転換体(TSP)から約0.3〜1.0gの若葉をサンプリングして凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液(1,6−hexanediamine、内部標準量=7.5又は12nmol)と5%過塩素酸水溶液(試料生体重1.0g当たり5〜10ml)を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、
4℃・35,000×gで20分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに400μlの遊離型ポリアミン溶液、200μlの飽和炭酸ナトリウム水溶液、200μlのダンシルクロライド/アセトン溶液(10mg/ml)を加えて軽く混和した。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、60℃のウォーターバスで1時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液(100mg/ml)を200μl加えて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで30分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、600μlのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して2相に分かれた後に、上層のトルエン層を300μlマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに200μlのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器(励起波長:365nm・発光波長:510nm)を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。HPLCカラムはμBondapak C18(Waters社製:027324、3.9×300mm、粒子径10μm)を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のHPLCチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をセンス方向に導入したセルラインは、プトレシン含量、スペルミジン含量、スペルミン含量が野生株(WT)より有意に増加し、総ポリアミン含量も野生株(WT)より有意に増大していることが明らかとなった。特にスペルミジンとスペルミン含量の増加が顕著であった。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルラインは、プトレシン含量は増加したが、特にスペルミジン含量とスペルミン含量が野生株(WT)より有意に減少し、総ポリアミン含量も野生株(WT)より有意に減少していることが明らかとなった。以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をイネにセンス方向又はアンチセンス方向で遺伝子導入することで、内性のポリアミン含量を増加又は減少させることが可能であることが明らかとなった。これらのことから、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが示された。
実施例3:生産性の評価
野生株(WT)と形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2,RSP−CS−3−1,RSP−CS−3−2,RSP−CS−3−3,RSP−CS−3−4)の種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子に5mlの種子滅菌液(2.5% アンチホルミン、Tween20)を加えて、150rpmで30分間振とうした。種子滅菌液を捨てて、10mlの滅菌水を加えて、150rpm、10分間振とうしてこの操作を4回繰り返した。野生株(WT)の種子は生育培地(RGM:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、8g/l ファイトアガー、pH5.8)、形質転換イネの種子は選抜生育培地(RGM:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、8g/l ファイトアガー、50mg/l カナマイシン、20mg/l ハイグロマイシン、pH5.8)にそれぞれ播種した。26℃、弱光条件(4000ルクス)、16時間日長(16時間明期/8時間暗期)に設定したグロースチャンバーで生育させた。播種7〜10日目に野生株と形質転換イネについて生育がそろった個体を選抜し、市販の培養土を詰めたプラスチック製の鉢に定植した。多湿順化させた後に閉鎖系ガラス室(設定気温昼/夜:23〜24℃/21〜22℃、湿度55%、自然日長)で栽培試験を始めた。生育状況として穂ばらみ期、出穂期、開花期、成熟期などを調べた。その結果、穂ばらみ期、出穂期、開花期は野生株と形質転換イネで違いは見られなかった。成熟期については形質転換イネで野生株に比べて4〜7日程遅くなる傾向が見られた。播種日から4ヶ月後に収量構成要素を調べた。その結果を表1に示した。表1の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した形質転換イネでは野生株に比べて生産性ないし形質が改良できることが確認された。
(1)塩ストレス耐性の評価
野生株(WT)と形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2)の種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子に5mlの種子滅菌液(2.5% アンチホルミン、Tween20)を加えて、150rpmで30分間振とうした。種子滅菌液を捨てて、10mlの滅菌水を加えて、150rpm、10分間振とうしてこの操作を4回繰り返した。野生株(WT)の種子はNaClを含む(75mM NaCl,100mM NaCl)か含まない生育培地(RGM:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、8g/l ファイトアガー、pH5.8)、形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2)の種子はNaClを含む(75mM NaCl,100mM NaCl)か含まない選抜生育培地(RGM:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、8g/l ファイトアガー、50mg/l カナマイシン、20mg/l ハイグロマイシン、pH5.8)にそれぞれ播種した。26℃、弱光条件(4000ルクス)、16時間日長(16時間明期/8時間暗期)に設定したグロースチャンバーで生育試験を行った。播種10日目に生体重(全体)とシュート長を調査した。
(2)低温ストレス耐性の評価
野生株(WT)と形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2)の種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子に5mlの種子滅菌液(2.5% アンチホルミン、Tween20)を加えて、150rpmで30分間振とうした。種子滅菌液を捨てて、10mlの滅菌水を加えて、150rpm、10分間振とうしてこの操作を4回繰り返した。野生株(WT)の種子は生育培地(RGM:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、8g/l ファイトアガー、pH5.8)、形質転換イネ(RSP−SS−1−1,RSP−SS−1−2)の種子は選抜生育培地(RGM:MS無機塩、MSビタミン、30g/l シュクロース、8g/l ファイトアガー、50mg/l カナマイシン、20mg/l ハイグロマイシン、pH5.8)にそれぞれ播種した。26℃、弱光条件(4000ルクス)、16時間日長(16時間明期/8時間暗期)に設定したグロースチャンバーで3日間育成して、同じように発芽させた。その後、野生株と形質転換イネの半分の個体を低温ストレス条件(18℃・4000ルクス)に設定したグロースチャンバー移し、残りの半分の個体は26℃に設定したグロースチャンバーでそのまま生育を続けた。播種10日目に生体重(全体)とシュート長を調査した。
実施例5:通常栽培条件下または塩ストレス条件下でのコメ収量の評価
実施例2記載のRSP-SS-1-1、RSP-SS-1-2の形質転換イネからホモ系統としてRSP-SS-1-1-2とRSP-SS-1-2-3を選抜した。
Claims (33)
- 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物及びその子孫。
- ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子である請求項1記載のイネ科植物及びその子孫。
- 該生産性ないし形質、あるいは、該ストレス耐性が改良された植物が、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物を形質転換して得られる形質転換植物である、請求項1記載のイネ科植物及びその子孫。
- 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素(ADC)をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素(ODC)をコードする遺伝子、S−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素(SAMDC)をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素(SPDS)をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素(SPMS)をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種である請求項2に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、スペルミジン合成酵素をコードする遺伝子である請求項4記載のイネ科植物及びその子孫。
- 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の(a)または(b)または(c)の塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項2記載のイネ科植物及びその子孫。
(a)配列番号1(SPDS、1328)に示される塩基配列中塩基番号77〜1060で示される塩基配列、
(b)上記(a)の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(c)(a)または(b)の塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の(a)または(b)または(c)の塩基配列を有するS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項2記載のイネ科植物及びその子孫。
(a)配列番号3(SAMDC、1814)に示される塩基配列中塩基番号456〜1547で示される塩基配列、
(b)上記(a)の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(c)(a)または(b)の塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の(a)または(b)または(c)の塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項2記載のイネ科植物及びその子孫。
(a)配列番号5(ADC、3037)に示される塩基配列中塩基番号541〜2661で示される塩基配列、
(b)上記(a)の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(c)(a)または(b)の塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物である請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 低温ストレス耐性が改良されたイネ科植物である請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 病原菌ストレス耐性及び/又は害虫ストレス耐性が改良されたイネ科植物である請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 生産性ないし形質が改良される器官が、穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつおよび小穂からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 生産性ないし形質が分げつ期、穂ばらみ期、幼穂形成期において顕著に改良される請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- イネ科植物がイネである請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつまたは小穂の形態である請求項1に記載のイネ科植物及びその子孫。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のイネ科植物及びその子孫から得られる穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつまたは小穂。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のイネ科植物及びその子孫から得られる有用物質。
- 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
- ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子である請求項18記載の方法。
- 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
- ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子である請求項20記載の方法。
- 該形質転換細胞からイネ科植物を再生する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
- 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素(ADC)をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素(ODC)をコードする遺伝子、S−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素(SAMDC)をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素(SPDS)をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素(SPMS)をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種である請求項21に記載の方法。
- 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の(a)または(b)または(c)の塩基を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項21記載の方法。
(a)配列番号1に示される塩基配列中塩基番号77〜1060で示される塩基配列、
(b)上記(a)の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(c)(a)または(b)の塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の(a)または(b)または(c)の塩基を有するS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項21記載の方法。
(a)配列番号3に示される塩基配列中塩基番号456〜1547で示される塩基配列、
(b)上記(a)の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(c)(a)または(b)の塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つS−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の(a)または(b)または(c)の塩基を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項21記載の方法。
(a)配列番号5に示される塩基配列中塩基番号541〜2661で示される塩基配列、
(b)上記(a)の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(c)(a)または(b)の塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 器官が、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果および小穂からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項20に記載の方法。
- 改良されたストレス耐性を有するイネ科植物が、塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物である、請求項20に記載の方法。
- 改良されたストレス耐性を有するイネ科植物が、低温ストレス耐性が改良されたイネ科植物である、請求項20に記載の方法。
- 改良された病原菌ストレス耐性及び/又は害虫ストレス耐性を有するイネ科植物が、塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物である、請求項20に記載の方法。
- イネ科植物がイネである請求項20に記載の方法。
- 生産性ないし形質が分げつ期、穂ばらみ期、幼穂形成期において顕著に改良される請求項20に記載の方法。
- 以下の工程:
(1)植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
(2)該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された生産性ないし形質を有する植物体を再生し、
(3)該植物体から受粉により種子を採取し、および
(4)該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び/又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
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