KR20010042772A

KR20010042772A - 폴리누클레오티드 서열 및 이들을 기공의 수가 증가된식물을 생산하는데 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20010042772A
Application number: KR1020007011507A
Authority: KR
Inventors: 프레데릭 마리앤 반더리; 피터 크리스티안 시즈몬스; 앨리스테어 매컬로크 헤더링튼; 조프리 헤이즈 홀로이드; 줄리 엘리자베스 그레이
Original assignee: 돈 리사 로얄; 신젠타 리미티드
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1999-04-19
Publication date: 2001-05-25
Also published as: BR9909765A; EP1080196A1; CN1376198A; CA2324442A1; JP2002512035A; AU3615199A; WO1999054471A1; GB9808304D0

Abstract

본 발명은

(i) 식물 재료 내에서 분류 14-3-3의 전사 인자의 합성을 자극하는 지방산이 생산되는 것을 억제하거나 그렇지 않으면 지방산이 상기 인자의 합성을 자극하지 못하도록 막는 단계;

(ii) 이렇게 억제된 물질을 선택하는 단계;

(iii) 이렇게 선택된 물질을 식물 내에서 재생시키는 ; 단계로 구성된, 비교 대조용 식물과 비교해 보았을 때 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 서열을 포함하는 내생 유전자를 코-서프레션 또는 안티-센스 인히비션법을 이용하여 억제한다.

Description

폴리누클레오티드 서열 및 이들을 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는데 사용하는 방법{POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES AND THEIR USE IN A METHOD OF PRODUCING PLANTS WITH AN INCREASED NUMBER OF STOMATA}

본 발명은 유전적으로 조작된 식물에 관한 것이다. 본 발명은 특히 폴리누클레오티드 서열 및 이들을 형질 전환되지 않은 (선행 기술의) 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는 데 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 식물은 적당한 조건 하 에서는 선행 업계의 식물과 비교해 수확량이 증대될 수 있다.

영국에서, 대량 생산하는 많은 재배자들은 온실에서의 이산화탄소의 양을 증가시키기 위해 천연 가스, 등유 버너, 또는 액화 이산화탄소 등을 이용한다. 온실 작물의 잇점이란 겨울철 외부 일조량이 적어도 작물의 품질과 수율을 증대시키고 성장을 최대화시킨다는 점이다. 그러나 재배 기간이 더 길어지면 이러한 방법으로는 수확량에 있어서 가능한 모든 잇점들을 이룰 수가 없다. 광합성 순화 작용을 포함하는 수많은 생리적이고 생화학적인 인자들이 이러한 현상에 기여하는 것으로 생각된다. 그러나, 비교적 관심이 적었던 한 가지 중요한 인자는 증가된 이산화탄소가 기공의 공변 세포에 미치는 영향이다. 기공의 직경이 줄어들 뿐만 아니라 이산화탄소가 또한 공변 세포의 성장에 영향을 미치며 특히 이산화탄소의 농도가 높은 상태에서 성장하는 잎 위에서의 기공의 수를 줄게 만든다. 이러한 인자들은 확산 저항을 증대시키며 이산화탄소의 흡수를 감소시키는 결과를 가져오게 될 것이다. 온실에서 재배되는 상추, 가지, 피망, 오이 및 토마토의 경우가 특히 그러하다. 이산화탄소의 흡수가 감소된다는 것은 수확량이 감소되었다는 것 그 자체로서 증명될 수 있다. 온실 재배자들에게 있어서, 또 다른 중요한 문제점은 현대식 에너지 절약 장치를 이용하므로서 보통 발생되는 높은 습도 때문에 또는 이산화탄소의 수준이 높게 유지되는 환경 때문에 작물에 손실을 가져온다는 점이다. 이러한 문제점의 심각성을 보여주는 것으로서, 높은 습도에서 성장한 토마토는 과실의 수확량이 10 - 15% 까지 감소하며 높은 습도를 계속적으로 유지시키면 수확량의 35%가 감소하는 것으로 보고되었다. 다습한 상태에서 재배된 오이 및 long season 토마토의 경우, 증발이 억제되므로서 영양분(특히, 칼슘)의 흡수가 감소되어 잎 마름병의 원인이 되고 잎의 유효한 면적이 줄어들게 된다. 칼슘이 부족한 경우, 이와 관련하여 조직이 괴사하면 작물이 병원체의 공격에 특히 약해지고 결과적으로 가능한 작황이 더 감소하게 된다. 토마토 재배의 경우, 다습하면 과실의 수확량과 품질이 떨어지게 된다. 습도가 평균 습도보다 더 높으면 작물의 품질에 영향을 미칠 수 있는 어떤 해충을 길러내게 되는 환경이 만들어지기도 한다. 따라서 이산화탄소의 농도가 높아서 생기는 유해한 효과 뿐만 아니라 이러한 해충들을 방제하는 것이 이롭다. 물론, 이산화탄소의 농도를 높게 하여 재배하면 이에 수반하여 기공의 저항도 증가되기 때문에 상기 언급된 모든 문제점들이 악화 될 것이다.

본 발명은 잎 표면 위의 기공의 수를 증가시키므로 서 높아진 이산화탄소의 농도에 특이적으로 감응하는 식물을 제공 하므로서 상기한 문제점들을 경감시킨다. 다른 제한적 요소들이 없다면, 광합성을 위한 이산화탄소의 흡수를 증대시키고 또 물 손실에 대한 유효 표면적을 증가시켜 증발이 증대되므로서 칼슘 부족을 억제하는 것을 기대할 수 있다. 밀, 보리, 쌀 및 phaseolus vulgaris 에 관한 탄소 동위 원소 구별법 연구에 관한 데이터는 기공 저항이 적은 유전자형이 수확량이 더 크다는 것을 나타낸다.

본 발명은 또는 특히 기공의 공변 세포 내에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 폴리누클레오티드 서열 및 이의 변이체에 관한 것이다.

식물에서의 유전자 발현은 핵산과 단백질 요소들을 포함하는 여러 가지 조절 성분들에 의해 조절된다. 식물 유전자가 이중 가닥 DNA로서 존재하는 경우, 발현의 기본 단계에는 중합 효소에 의해 메신저 RNA를 생산하는 것이 포함된다. 발현 과정의 이 부분은 보통 "프로모터"라고 불리는 영역에 의해 개시가 된다. 이 프로모터는 단백질 암호화(protein encoding) 영역의 (5`)상단부에 놓여 있으며 구조적 또는 조직에 특이적인, 또는 발생학적으로-조절 및/또는 유도될 수 있다.

프로모터 영역 안에는, 프로모터의 완전한 기능을 하는데 필요한, 여러 가지 도메인이 들어있다. 이들 도메인의 첫 번째는 구조 유전자의 바로 가까운 상부에 놓여지며 일치 서열, 보통 유전자의 바로 가까운 상부에 70쌍의 염기를 함유하는 "코어 프로모터 영역"을 형성한다. 이 코어 프로모터 영역에는 특성화된 CAAT 와 TATA 배열(box), 이를 둘러 싼 서열이 함유되며 구조 유전자에 대한 전사 (Transcription)시발점을 규정하는 전사 개시 서열을 나타낸다. 코어 프로모터 영역의 정확한 길이는 불명확하지만 보통은 구별할 수 있다. 이러한 영역은 보통 약간 변화는 있지만 모든 프로모터안에 존재한다. 다양한 잘 특성화된 배열들 사이에 놓여있는 서열들은 그 중요성이 덜 하다.

코어 프로모터 영역의 존재가 이 서열을 프로모터로서 정의하는데 : 만일 이 영역이 없다면 프로모터는 그 기능을 하지 않는다. 더욱이, 이 코어 프로모터 영역은 프로모터의 활성을 완전히 제공하는데는 불충분하다. 보통 코어의 상부인 일련의 조절 서열들이 프로모터의 나머지를 구성한다. 조절 서열들은 발현의 수준, 발현의 공간적 패턴과 시간적 패턴을 결정하며, 중요한 프로모터 부분 집합의 경우에는 도입된 조건 하 에서(빛, 온도, 약품, 호르몬 등과 같은 외부 인자들에 의해 조절된)의 발현을 결정한다.

표현형 특성(생산성 품질, 또는 수확량 같은)을 조절 및/또는 향상시키기 위해 재배 식물을 다루는데 식물 조직내의 이종 유전자들을 발현시키는 것이 필요하다. 따라서, 이렇게 유전적 조작을 하는 것은 필요로하는 유전자 발현을 유도하고 조절하기 위한 수단들의 이용 가능성에 의존하는데 예를 들면 식물에 유효하고 유전자 이식된(transgenic) 식물에 원하는 효과들을 갖도록 유전자 발현을 조절하는 적당한 프로모터들의 이용 가능성 및 이들을 이용하는 것에 의존한다. 여러 가지 다양한 다른 프로모터들을 선택하므로서 특별한 유전자, 구조, 세포, 조직, 식물 또는 환경에 관해 가장 적당한 프로모터를 선택할 수 있도록 하는 것이 이롭다.

박테리아, 비루스, 진균류(fungi), 및 식물들로부터 얻은 프로모터들(및 기타 조절 성분들)이 식물 세포 내에서의 유전자 발현을 조절하는데 사용되어 왔다. 다양한 외부 유전자(예를 들어 박테리아성 마커 유전자)에 집중된 여러 가지 프로모터 서열들로 구성된 DNA 구조를 이용한 수많은 식물 형질 전환 실험으로 유용한 프로모터 서열을 확인할 수 있게 되었다. 대부분의 경우, 500 - 1000개의 염기로 된 서열이면 외부 유전자의 발현을 조절할 수 있기에 충분하다는 것이 입증되었다. 그러나, 서열의 길이가 1 kb 보다 더 길면 유전자 이식된 식물 내에서의 유전자 발현의 수준을 높게 만든다는 장점을 가질 수 있다는 것 또한 알려져 있다. 일정 범위의 자연적으로 발생된 프로모터들이 식물 내에서 작용하는 것으로 알려져 있으며 식물 내에서의 이종(외부 및 내생의) 유전자들의 발현을 유도하는데 사용되어 왔는데 : 예를 들면 constitive 35S 컬리플라우어 모자이크 바이러스 프로모터, 완숙된 토마토 폴리갈락투로나아제 프로모터(Bird et al. 1988, Plant Molecular Biology, 11:651-662), E8 프로모터(Diekman ＆ Fisher, 1988,EMBO,7:3315-3320), 및 과실에 특이적인 2A11 프로모터(Pear et al, 1989, Plant Molecular Biology, 13:639-651) 및 다수가 있다.

본 발명은

(i) 식물 재료(Plant material) 내에서 분류 14-3-3의 전사 인자의 합성을 자극하는 지방산이 생산되는 것을 억제하거나 그렇지 않으면 지방산이 상기 인자의 합성을 자극하지 못하도록 막는 단계;

(ii) 이렇게 억제된 물질을 선택하는 단계;

(iii) 이렇게 선택된 물질을 식물 내에서 재생시키고 비교 대조용 식물과 비교해 보았을 때 기공의 수가 증가된 이들 식물을 재생물 집단에서 부터 선택해 내는 ; 단계로 구성된, 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한

(i) SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 폴리누클레오티드 서열로 구성된 내생 유전자의 기능을 억제하거나 또는 그렇지 않으면 이것의 활성을 없애는 단계;

(ii) 이렇게 억제된 물질을 선택하는 단계 ;

(iii) 이렇게 선택된 물질을 식물 안에서 재생시키고 재생된 집단에서부터 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물들을 선택해 내는 단계;로 구성된 비교용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물의 생산방법을 제공한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 방법을 실행하는데 있어서, 내생 유전자는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액(citrate buffersd saline) 안에서 인큐베이션 시키고 이어서 같은 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 SEQ ID No.1, 또는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 서열로 여전히 잡종화되는 것에 상보적인 폴리누클레오티드 서열로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한

(i) SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 서열로 구성된 폴리누클레오티드로 식물 재료를 형질 전환시키고;

(ii) 이렇게 형질 전환된 재료를 선택하고;

(iii)이렇게 선택된 재료를 식물 안에서 재생시키고 재생된 집단에서부터 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 선택하는 단계로 구성된; 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는 방법을 제공한다.

상기한 방법에 사용되는 폴리누클레오티드는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시키고 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 것으로 구성될 수 있다. 이방법에 사용되는 폴리누클레오티드가 안티-센스 오리엔테이션(anti-sense orientation)된 것이 특히 바람직하다. 기공의 수가 증가한 식물들은 형질 전환되지 않은 비교용 식물들과 형질 전환된 식물 모두를 발아 후에 다음과 같은 (i) 이산화탄소가 증가된 조건; (ii) 칼슘이 증가된 조건; (iii) 극심한 온도 및 압력 조건; (iv) 물 이용 가능성이 줄어든 조건; (v) 오존, 질소 또는 황 산화물과 같은 오염물 가스가 증가된 환경 조건; 및(vi) 빛이 강화된 조건; 중 최소한 한가지 조건에 노출시켰을 때 이 둘 사이의 차이점을 기준으로 선택된 것 일수 있다. 이산화탄소의 농도가 약 450 ppm 보다 큰 것이 바람직하다. 이산화탄소의 농도가 약 550 ppm 이상인 것이 더 바람직하며 650ppm 이상이면 더욱 바람직하다.

본 발명은 또한 상술한 바와 같은 재료에서부터 재생되었으며 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가한, 형태학적으로 정상인 생식 능력이 있는 완전한 식물, 종자 및 이의 자손(progency)을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 형질 전환된 식물에는 : 간장콩, 목화, 담배, 사탕무, 씨에서 기름을 짜는 평지, 캐놀라, 아마, 해바라기, 감자, 토마토, 알파파, 상추, 옥수수, 밀, sorghum(수수 속(屬) 식물), 호밀, 바나나, 보리(대맥),귀리, 잔디풀, 마초(forage grass), 사탕수수, 완두콩, 야생콩(field bean), 쌀, 파인, 포플러, 사과, 포도, 덩굴 식물, 오이, 고추, 귤 및 견과류 나무가 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가한 식물을 생산하는 방법에 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사된 서열로 구성된 폴리누클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법에 사용할 수 있는 다른 폴리누클레오티드는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 것으로 구성될 수 있다. 이 방법에 사용하기 위한 폴리누클레오티드는 식물을 조작할 수 있는 프로모터의 발현 제어하에 있는 것일 수 있으며 상기 폴리누클레오티드의 단백질 암호화 영역의 하부인 전사 종결 영역으로 더 이루어질 수 있다. 특히, CaMV35S ; FMV35S ; NOS ; OCS ; 및 E9 같은 프로모터들이 사용될 수 있다. 이 프로모터는 기공의 공변 세포에 특이적인 프로모터인 것이 더 바람직하다. 이 프로모터는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 폴리누클레오티드 서열로 구성된 것이 더욱 바람직하다.

SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 서열로 구성된 분리된(isolated) 폴리누클레오티드가 또한 제공된다.

본 발명은 또한 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로서 묘사되는 서열로 구성된 발현 조절 서열을 제공한다. 놀랍게도, 이 서열은 기공의 공변 세포내에서 이종 유전자들을 발현시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명에 마련된 조절 서열들은 상기한 바와 같은 방법 및 폴리누클레오티드와 함께 연합하여 사용할 수 있다. 그러나, 업계의 숙련자들은 기공의 공변 세포에 전사를 특히 필요로 하는 모든 방법에 이들 조절 서열들을 다른 기타 폴리누클레오티드와 함께 사용할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명에 따라서, 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1로 묘사된 서열로 잡종화될 수 있는, 그러나 상기 온도가 65 - 70℃ 사이 일때는 잡종화 되지 않는 것에 상보적인 서열로 구성되는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이 폴리누클레오티드는 식물의 기공 지수(이후에 기술되는 바와 같은)가 이산화탄소의 농도가 높은 조건에 노출될 때 감소하기 보다는 증가하는 식물을 생산하는데 이용될 수 있다.

폴리누클레오티드는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 서열로 구성될 수 있다. 폴리누클레오티드로 구성된 단백질 암호화 영역은 식물에 사용 가능한 프로모터와 터미네이터에 의해 결합된 것일 수 있다. 그 자체로는 본 발명에 직접적인 관계가 없는 이러한 프로모터와 터미네이터는 업계의 숙련자들에게는 잘 알려져 있는 것이며 여기에는 예를 들면 CaMV35S ; FMV35S ; NOS ; OCS ; 및 E9 (RUBISCO의 작은 소단위에서부터 유도된)등이 있다. 그러나, 본 발명에 따르는 폴리누클레오티드의 단백질 암호화 영역은 기공의 공변 세포에 특이적인 프로모터의 발현 조절하에 있는 것이 바람직하다. 숙련자라면 "특이적"이란 용어를 "오로지 제한적"이라는 의미로 이해하지 않을 것이며 따라서 상기 영역을 구성하기 위해 형질 전환된 물질에서부터 재생된 식물 내의 다른 어느 곳에서도 상기한 서열의 발현을 발견할 수 없을 것이란 것을 이해할 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 식물 형질 전환 벡터를 포함한다.

벡터 내에서, 단백질 암호화 영역(또는 이것의 실질적인 부분)이 SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사된 서열과 비교해 보았을 때 안티-센스 오리엔테이션 상태이어서 이 영역의 RNA 생성물이 이것을 포함하는 식물 재료 안에서 단백질 암호화 영역이 거의 동일하게 나타나는 내생 유전자가 억제 되도록 만들 수 있다. "실질적"이라는 의미는 서열에 관련하여 최소한 70%가 동일하다는 뜻이다.

본 발명은 특히, 지방산 엘롱가아제(elongase)의 활성을 갖는 경우에 본 발명의 폴리누클레오티드에의해 암호화된 번역 생성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 본 발명의 벡터로 형질 전환된 식물 재료, 또는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 폴리누클레오티드로 구성된 폴리누클레오티드를 제공한다.

식물 재료는 식물이 제초제, 해충, 건조 및/또는 진균, 박테리아 또는 바이러스 감염에 견디거나 또는 저항하게 만들 수 있는 단백질을 암호화하는 영역으로 구성된 폴리누클레오티드로 형질 전환된 것이거나 또는 이후에 더 형질 전환된 것일 수 있다.

제초제에 대한 내성을 제공할 수 있는 단백질은 글리포세이트 옥시도-리덕타아제(GOX), 5-에놀-피루빌-3-포스포신키메이트 신테타아제(EPSPS) 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(PAT), 하이드록시 페닐 피루베이트 디옥시게나아제 (HPPD), 글루타티온 S 트랜스퍼라아제(GST), 사이토크롬 P450, 아세틸-COA 카복실라아제(ACCase), 아세토락테이트 신타아제(ALS), 프로토포피리노겐 옥시다아제 (PROTOX), 디하이드롭테로에이트 신타아제, 폴리아민 트랜스포트 프로테인, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 브로목시닐 니트릴라아제, 피토엔 디쎄추라아제(PDS), Alcaligenes eutrophus에서 얻을 수 있는 tfdA 유전자 생성물, 및 상기 단백질의 돌연변이 또는 변형된 변이체로 구성된 그룹에서부터 선택된 것 일 수 있다.

식물 재료를 형질 전환시키는 폴리누클레오티드는 (i) 암호와 영역의 번역 생성물을 엽록체, 미토콘드리아, 기타 세포 소기관 또는 식물의 세포벽 같은 색소체에 맞출 수 있는 펩티드; 및/또는 (ii) 번역되지 않은 번역증진용 서열을 : 암호화하는 단백질 암호화 영역 5`로 구성된다.

이 폴리누클레오티드는 코돈에 적합하도록 된 것이거나 또는 일단 식물 재료 안으로 함침되면 최소한 전사를 증진시키도록 조절된 것 일수 있다. 따라서 재료를 형질 전환시키기 위해 사용되는 폴리누클레오티드는 mRNA 불안정 암호화 특성 및/또는 뜻 밖의 재접합(splice) 영역이 제거될 수 있다는 점에서 변형된 것일 수 있으며, 또는 제초제에 대한 내성을 부여하는 영역에 있어서 만일 이렇게 변형된 폴리누클레오티드가 변형된 폴리누클레오티드안에 있는 단백질 암호화 영역과 상기 식물 안에 내생적으로 존재하면서 거의 동일한 단백질을 암호화하는 유사 단백질 암호화 영역 사이의 동일한 정도가 약 70% 미만인 식물에 바람직한 코돈으로 구성되는 조건을 만족한다면 이렇게 변형된 폴리누클레오티드가 식물 안에 발현되어 변형되지 않은 폴리누클레오티드의 단백질 암호화 영역이 내생성인 유기체 내에서 변형되지 않은 폴리누클레오티드가 발현 되므로서 얻어진 것과 거의 유사한 활성/기능을 가지고 있는 거의 유사한 단백질을 생산할 수 있도록 식물에 바람직한 코돈을 이용할 수 있다.

형질 전환 기술은 잘 알려져 있으며, 여기에는 미립자를 이용한 biolistic 형질 전환법, Agrobacterium을 이용한 형질 전환법, 원형질 형질 전환법(임의에 따라 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에서), 폴리누클레오티드 또는 벡터를 포함하는 매질 내에서 식물 조직, 세포 또는 원형질을 소니케이션하는 방법, 분화 가능한 (totipotent) 식물 재료 안으로 폴리누클레오티드 또는 벡터를 미량 주입하는 방법(임의에 따라 공지된 탄화규소"위스커"기법을 이용하는), 일렉트로포레이션 (eletroporation)등이 포함된다.

본 발명은 또한 바로 앞서의 문단에서 언급한 재료에서부터 재생된 형태학적으로 정상인 번식력이 있는 완전한 식물 및 이의 자손, 이러한 식물 및 그 자손의 종자, 이러한 식물 및 그 자손의 일부분을 제공한다. 형질 전환된 본 발명의 식물에는 낟알이 작은 곡물, 씨에서 기름을 짜는 작물, 섬유 식물, 열매, 채소, 재배 작물, 및 나무가 포함된다. 특히 바람직한 이러한 식물에는 간장콩, 목화, 담배, 사탕무, 씨에서 기름을 짜는 평지, 카놀라, 아마, 해바라기, 감자, 토마토, 알파파, 상추, 옥수수, 밀, sorghum(수수 속(屬) 식물), 호밀, 바나나, 보리(대맥),귀리, 잔디풀, 마초(forage grass), 사탕수수, 완두콩, 야생콩(field bean), 쌀, 파인, 포플러, 사과, 포도, 오이, 고추, 귤 및 견과류 나무가 포함될 수 있다. 가장 바람직한 부분에는 꺽꽂이용 꽃(cut flowers)이 포함된다.

본 발명은

(ii) 이렇게 억제된 물질을 선택하는 단계;

(iii) 이렇게 선택된 물질을 식물 내에서 재생시키고 비교 대조용 식물과 비교해 보았을 때 기공의 수가 증가된 이들 식물을 재생물 집단에서 부터 선택해 내는 단계; 로구성된, 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하기 위한 방법을 제공한다.

이 방법의 바람직한 구체예로, 지방산의 생합성 경로안에 포함된 단백질을 암호화는 식물 내생 유전자의 감지를 억제시키거나 또는 동일한 유전자의 발현을 안티-센스 인히비션(anti-sense inhibition)을 이용하므로서 전사 인자의 합성을 자극하거나 그렇지 않으면 전사 인자의 합성을 증대 시키는 지방산을 억제시킨다. 안티-센스 인히비션법은 잘 알려져 있으며 업계의 숙련자들은 일상적으로 개발, 사용한다. 일반적으로, 내생 유전자에 의해 생성된 감지 mRNA에 상보적이고 이것과 잡종될 수 있는 안티-센스 mRNA의 생산을 통해 식물 내에서 이 인히비션(억제) 기법이 실행된다.

본 발명의 방법은

(i) 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션 시키고 이어서 같은 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 SEQ ID No.1로 묘사되는 서열로 여전히 잡종화되는 것에 상보적인 서열로 구성된 식물의 내생 유전자의 기능을 억제하거나 그렇지 않으면 이것의 활성을 방해하고;

(ii) 이렇게 억제된 재료를 선택하고;

(iii) 이렇게 선택된 재료를 식물 내로 재생시키는; 단계로 구성된다.

본 발명의 식물은 보통 선행 기술의 유사한 식물의 경우 최소한 10%의 기공을 더 함유한다. 이들이 최소한 15%, 이보다는 최소한 20%, 이보다는 최소한 25%의 기공을 더 포함하는 것이 바람직하며 최소한 30%의 기공을 더 포함하는 것이 더 바람직하다.

업계의 숙련자들은 유전자의 기능을 억제하거나 붕괴시키는 여러 가지 수 많은 방법들을 알고 있을 것이다. 센스-코서프레션법(sense-cosupression)및 안티-센스 인히비션법이 특히 바람직하지만 그 자체가 내생 유전자의 돌연 변이 유발인 소위 키메로플라스티(Chimeroplasty) 기법을 이용할 수도 있다. 이 기법은 본질적으로 본 발명과 직접적인 관계는 없으나 대략적으로 여기에는 상보적인 영역 안에서 DNA 회복 및 레플리케이션 효소의 작용을 통해 내생 유전자 내에서 "부정합"이 나타나게 된다는 조건을 만족한다면 내생 유전자 내에 있는 목적 서열에 상보적인 영역(보통 길이가 100 누클레오티드 미만인)을 포함하는 혼합된 리보-데옥시 리보핵산을 식물 재료 안에 삽입시키는 것이 포함된다. 이 부정합은 일반적으로 효소의 활성 부위를 암호화하는 유전자 영역 안에서 일어나는데 이 활성은 결과적으로 없어지거나 또는 거의 생략된다. 요약하면 일단 잠재화될 내생 유전자가 확인이 되면 모든 유전자 억제 기술을 사용할 수 있다. 이외에도 업계의 숙련자라면 원하는 유전자의 억제 효율을 증대시키기 위해 업계에서 이용 가능한 기법들을 자유롭게 이용할 수 있다. 이러한 방법에는 역위 - 반복 서열을 이용하는 것이 포함되며 이는 본문의 참고 문헌으로 포함된 국제 출원 PCT 공고 제 WO 98/53083호에 기술되어있다.

그러나 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 숙련자들은 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션 시키고 이어서 같은 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 SEQ ID No.1로 묘사되는 서열로 여전히 잡종화되는 것에 상보적인 서열로 구성된 폴리누클레오티드로 형질 전환된 식물 재료를 선호할 것이다. 다른 한편으로, 이 식물 재료는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1로 묘사된 서열로 잡종화될 수 있는, 그러나 상기 온도가 65 - 70℃ 사이 일 때는 잡종화되지 않는 것에 상보적인 서열로 구성되는 폴리누클레오티드로 형질 전환된 것일 수 있다. 이 방법에 사용하기에 특히 적합한 폴리누클레오티드는 SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.8로 묘사되는 서열로 구성되는 것이다.

형질 전환되지 않은 비교 대조용 식물과 형질 전환된 식물을 발아 후 다음과 같은 최소한 한 가지 조건에 노출시켰을 때 이 두 식물의 차이를 기준으로하여 기공의 수가 증가된 식물을 선택할 수 있는데 그 조건이란; (i) 높아진 이산화탄소의 농도;(ii) 증가된 칼슘; (iii) 극심한 온도 및 압력 조건;(iv) 줄어든 물의 이용 가능성; (v) 예를 들면 질소 또는 황 산화물, 오존 같은 증가된 주변의 오염 가스; (vi) 증대된 빛 조건 등이다. 상기한 차이란 (i) 꽃이 늦게 피는 것; (ii) 성장 특성이 바뀌는 것; 및(iii) 기공 지수가 증대되는 것으로 구성된 그룹에서부터 선택된 것일 수 있다. 다른 한편으로, 항생 물질에 대한 저항성을 기준으로 식물의 선택할 수 있는데, 이 저항성이란 기공의 수를 증가시킬 수 있는 유전자와 함께 식물 재료 안으로 동시 삽입된 항생 물질 저항성을 주는 유전자에 의해 만들어진다. 업계의 숙련자들은 잎의 특정 부위 안에 들어있는 세포의 총 수의퍼센트로서 나타냈을 때 기공의 수인 "기공 지수"(stomatal index)라는 용어를 알고있을 것이다. 기공 지수의 정의는 다음과 같다 :

SI = 기공 도수(frequency)/표피 세포 도수 + 기공 도수 ×100

본 발명은 또한 본 발명의 식물을 형질 전환되지 않은 수정 가능한 비교용 식물과 교배시켜 만든 식물 및 이의 자손을 포함한다. 이 식물 또는 이의 자손은 유전자 이식에 대해 동형 접합될 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 방법으로 얻은 식물, 이의 자손, 이 식물과 자손의 종자, 이 식물과 자손의 일 부분을 모두 포함한다. 특히 바람직한 부분은 열매, 꽃 및 종자이다.

본 발명은 또한 형질 전환되지 않은 비교용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하기 위한 방법에 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 이용하는 방법을 포함한다.

본 발명은 부록된 도면 및 서열 목록과 함께 다음의 기술된 내용을 보면 더욱 명확해 질 것이다.

SEQ ID No.1은 종자 내에서 발현된 FAE - 1으로 표시되는 지방산 엘롱가아제(elongase) 유전자의 서열을 나타낸다. SEQ ID No.1은 The plant cell, vol 7, 1995,316 p에 나타나 있다.

SEQ ID No.2는 SEQ ID No.1에 묘사된 서열과 관련이 있는 것이지만 꼭 이것으로부터 유도된 것은 아닌 유전자 서열을 나타낸다.

SEQ ID No.3과 4는 벡터 pFL 30과 pFL 44를 준비하는데 사용하였던 PCR 시발체(primer)를 그린 것이다.

SEQ ID No.5, 6은 GUS 유전자 시발체를 그린 것이다.

SEQ ID No.7은 pfu 중합 효소와 사용하기 위한 시발체를 그린 것이다.

SEQ ID No.8은 SEQ ID No.2로 묘사된 서열과 관련된- 꼭 이것으로부터 유도된 것은 아닌- 유전자의 서열을 나타낸다.

도 1 은 pGEMT 벡터(Promega)안으로 클론된 Arabidopsis C24, 라인 590의 교정(proofreading)PCR DNA 클론을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 2 는 벡터 pMOG 553을 그린 것이다.

도 3 은 클론 pFL 44와 pFL 30 사이의 관계를 도식화한 것이다.

도 4 는 pFL13을 도식화 한 것이다.

도 5 는 pMOG 1017의 클로닝을 도식화 한 것이다.

도 6 은 작체(construct) pMOG 1017에 의해 형질 전환되고 이어서 공변 세포내에서의 GUS 활성에 대한 조직화학적으로(histochemical) 염색을 한 Arabidopsis 잎을 그린 것이다. 이 그림에서 "검은색 점"은 자연적으로는 청색인 염색 부분을 나타낸다.

도 7 은 기공 내에 존재하는, 구체적으로 공변 세포 내에 존재하는 염색 부위를 더 명확하게 보여주는 도 6 에 나타난 잎을 확대한 것이다.

본 실시예는 기공의 수를 조절하는데 관련된 유전자를 준비하는 것을 보여준다. 이 유전자는 Arabidopsis 에코 타입 C24 내에서 시발체 트랩 스크린을 통해 분리해 냈다. β글루크로니다아제 효소 합성 유전자(GUS)의 전사된 서열로 구성된 포획용 작체, pMOG553을 모두 E-coli에서부터 유도된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제 유전자 (hyg)에 연결시킨다. 내생성의 포획된 시발체를 통해 이 구조물을 발현시키면 돌연변이를 분리해 내기 위한 항생물질 선택 마커와 GUS 활성에 대해 염색시키므로서 유전자 발현의 위치를 알 수 있게 만든다. GUS 리포터 유전자를 기준으로하여, 공변 세포에 특이적인 발현을 나타내는 시초인(primary) 돌연변이(M1) 식물(이것과 이것의 자손을 이후로는 Tag 590이라고 부르겠다)을 확인하였는데 이는 공변 세포 특이적 유전자들이 붕괴되었음을 나타낸다.

Tag 590 식물의 준비

Goddijin과 그의 동료는(The Plant J. 4(5),863-873,1993)표지용(tagging)작체, pMOG 553( T-DNA 상에 시발체가 없는 GUS)의 생산 방법에 관해 기술하였다. 이 문헌에는 또한 이 구조물로 Arabidopsis thaliana를 형질 전환시키는 것이 기록되어있으며 GUS 분석에 사용되는 조직화학적 검증법에 관한 설명이 들어있다. GUS 분석법에서, 검정 배지(assay medium, 0.1M 포스페이트 버퍼 pH 7, 10mM EDTA, 0.5 mM 포타슘 페리시아나이드, 0.5mM 포타슘페로시아나이드, 2.0 mM X-Gluc(Gold Biotechnology), 0.1% Triton X-100)(Stomp, 1992)안에 잎사귀들(떡잎 포함) 또는 잎 부분을 잠기에 하여 GUS 활성을 시험하였다. 큰 조직 샘플은 마이크로퓨즈 튜브에 넣고 작은 모종 또는 떡잎들은 마이크로타이터 플레이트 위에 놓았다. 15분 동안 계속 감압 하여 스며들게 한 뒤 샘플들을 37℃에서 22시간 동안 인큐베이션 시켰다. 엽록소와 산화된 페놀성 화합물들을 제거하기 위하여 샘플들을 슬라이드 위에 올려놓거나 또는 클로르알락토페놀(chloralactophenol, CLP, 클로랄하이드레이트, 락트산, 페놀크리스탈의 2;2;1 혼합물, (Sigma), Beckman ＆ Engler, 1994)에 잠기게 하여 조직을 깨끗하에 만들었다. Fugichrom Sensia 200 슬라이드 필름으로 결과를 사진 찍어 기록하였다.

GUS 유전자의 시간적, 공간적 발현

Tag 590 라인에서 GUS 발현이 일어나는 것은 기공의 공변 세포(또는 hydratodes)에 우세하게 집중되는데 이는 공변 세포에 특이적인 유전자들이 붕괴되었음을 의미한다. 이 표지된 라인은 유전자 이식이 공변 세포 내에서만 발현될 수 있도록 하는 특이한 시발체를 분리해 낼 기회를 제공한다. 그 중에서도 특히 식물 내에서의 추정되는 신호 형질 도입 유전자 생성물(putative signal transduction gene product)의 역할을 분석하기 위해 생체 내 모델로서 공변 세포를 활용할 수 있게 만들고 공변 세포의 행동을 조절하기 위해 기공의 세포 유전자 발현을 조작할 수 있게 만든다.

하이그로마이신(라인 5/1 -5/12)의 선택을 기초로 하여 총 12개의 Tag 590 S2 라인들을 확인하였다. 그런 뒤 라인 5는 상기한 GUS 발현 결과를 확인하는데 이용되었다. 조직화학적 염색의 농도를 기본으로 하여, 연령이 2 주되는 식물의 첫 번째 두 (true) 잎에서 발현이 극대화되었다. 기공의 공변 세포에 집중하여 GUS가 발현되었다. 연령이 더 많은 잎에서는 GUS 염색의 농도가 덜하였고 이를 검출하기 위해서는 기질(substrate)내에서 밤새 인큐베이션시킬 필요가 있다. 이 결과는 발현은 성장하고 있는 젊은 식물의 공변 세포에서 최대화되며 성숙한 식물에서는 유전자가 약하게 발현된다는 사실을 나타내는 것이다. 다른 한편으로, 이는 성숙한 식물에서는 GUS 단백질이 덜 안정하거나 또는 공변 세포가 기질에 대해 덜 영향을 받는다는 사실을 반영하는 것이다. 늙은 잎에서는 hydratodes와 관다발 조직 안에서 염색이 되었음을 관찰하였다. 연이어 모든 12 라인에 대해 실험하였더니 라인 3, 9, 및 11에서 GUS 발현의 수준이 최고로 높게 나왔다.

Tag 590 식물 내에서 붕괴된 유전자의 분리

Tag 590 식물 재료(로제트 잎)에서부터 게놈 DNA(gDNA)를 분리하였다. 프로브로서 사용되는 GUS 유전자의 5` 부분으로 EcoR V,Msc I를 이용한 상기 게놈 DNA를 제한 효소 분석하여 T - DNA 주입물의 복제수를 결정하였다. 이 제한 조직(regime)의 정체는 적당한 전기 영동법의 단말 밴드로서 나타난다. 다음의 GUS 유전자 시발체를 이용하여 Tag 590의 gDNA 상에서 역 (inverse)PCR을 실행하였다(Barthels의 p2131 fig.7에 기술된 방법에 따라서).

시발체 7 : 5`-GTA.ATG.CTC.TAC.ACC.ACG.CCG-3`(SEQ ID No.5)

시발체 5 : 5`-CTT.TCC.CAC.CAA.CGC.TAG.TC-3` (SEQ ID No.6)

EcoR V 단편의 경우, 크기가 1.6kb인 테그에서부터 약 1.8kb의 밴드를 얻었다. Msc I 단편의 경우에도 동일한 결과를 얻었다. 이 단편을 PROMEG에서부터 pGEM T 벡터안에 클로닝하여 pFL 13으로 표시되는 플라즈미드를 얻었다. 제 4 도 참조. 이 클론은 부분적으로 서열되었으며 1.4kb 의 Pst1 단편을 분리해 내고 이것을 Barthele et al,1997 Plant Cell, Vol 9, pp 2119-2134에 기재된 방법으로 구성된 야생형 C24 Arabidopsis의 게놈 DNA 라이브러리를 선별(screen)하기 위해 프로브(제 4도 참조)로서 사용하였다. 클론 정제 과정을 3회 한 후에 5개의 클론을 분리해 내었는데 이중 둘이 동일하고 나머지 셋이 동일하였다. 5.5 kb 단편 또한 (나머지 Bg1II 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 변형된 pUC 18 벡터인) pUC 28 의 Bg1II 부위에 클론되어 pFL30 으로 표시된 플라즈미드를 만들었다.

pFU 중합 효소(교정 능력)를 이용하여 오리지날 TAG 590에서부터 게놈 DNA위에서 발생된 PCR 단편을 생산하는데 다음과 같은 시발체들을 사용하였다. 그런 뒤 이 단편을 pFL 44로서 라벨된 작체를 pGEMP로 클론되었다.

GUS 9 : 5`-CAG.AAA.CTT.ACG.TAC.ACT.TTT.C-3`(SEQ ID 7)

590-5`: 5`-CAT.CTT.CTT.CTA.TGC.CTA.CTC-3`(SEQ ID 3)

pFL 44 가 어떤 인지 가능한 시발체 서열을 함유하지는 않는 반면 식물로 전환되었을 때 특이한 발현을 나타내었는데 이는 이것이 어떤 조직에 특이적인 조절 요소들을 포함한다는 것을 의미한다.

PCR 단편(pFL 44)는 두 가닥 모두 위에서 완전하에 배열되었다. GUS 테그는 트랜스포손 태깅(transposon tagging) 실험으로 미리 알아냈으며 FAE I로 지정된 Arabidopsis 유전자와 매우 유사하지만 명확하게 동일하지는 않은 유전자내로 삽입된다. SEQ ID No.2 로 묘사된 서열은 최소한 두 개의 엑손(exon, 남아있는 부분)을 함유하며 추정되는 번역 개시 및 종결 지점을 가지나 FAE I(N-종결 말단부와 C-종결 말단부에서 각각 110과 120 개의 아미노산들이 빠진) 보다 훨씬 짧은 펩티드를 암호화하는 것으로 나타났다. 따라서, 이 클론된 단편 안에 있지 않는 또다른 코딩 영역이 있을수도 있다. 이 GUS 태그는 두 번째 엑손의 3`에 삽입되며 (추정되는 번역 정지 코돈의 3`에 180 bp)이는 아마 전사된 서열의 말단부를 막게 되거나 또는 그렇지 않으면 인트론(intron) 안에 있게 될 것이다. 또다른 유전자가 Fae 같은 코딩 서열에서부터 이 거리 안에 있을 가망은 없다.

게놈 클론(pFL 30)의 해당 영역은 동일한 내부 시발체들을 이용하여 배열되었다. 이 더 긴 클론은(i) 만일 더 있다면 또다른 엑손을 확인하기 위해; (i) 확인된 코딩 서열의 상부에 놓여있는 잠재적인 유전자 프로모터 영역을 특성화하기 위한 ; 관점에서 배열된다. FAE I는 사슬이 매우 긴 지방산을 생산하는데 필요한 지방산 엘롱가아제를 암호화하는 것으로 여겨진다. 트랜스포손이 테그된 FAE I 돌연변이는 그 종자안에 있는 C 18 보다 사슬이 더 긴 지방산(즉, 20:0, 20:1 및 22:1)을 축적하는데 실패하였다. FAE I 는 말로닐(malonyl) CoA와의 축합 반응에 촉매 작용을 하는 종자에 특이적인 케토아실 합성효소(synthase)를 암호화하는 것으로 생각된다. FAE I안에 대략 50개의 아미노산을 갖고있는 단백질 영역은 이것이 다른 식물 내에서 말로닐 CoA 축합용 효소(예컨데 CHS 및 STS) 안에 있는 영역에 약간의 유사한 서열을 할당하는 것으로 확인되었다. DNA 수준에서, 4개의 Arabidopsis ESTS, T6700, T44939, T-44368 과 ATTS 1282과 약간 닮은 점이 있다. 이러한 상동성은 SEQ ID No.2 서열의 제안된 코딩 영역 내에 들어있다. 이것은 FAE I를 포함하면 Arabidopsis 게놈 안에 있는 Tag 590 코딩 영역과 유사한 최소한 4개의 다른 서열이 있다는 것을 암시한다. 이러한 6 개의 유전자들은 종자에 특이적이고 Tag 590 공변 세포에 특이적인 FAE I와는 다른 발현 패턴을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 결과들은 Tag 590 유전자가 성장하고 있는 공변 세포내에 특이적으로 발현되는 추정되는 지방산 엘롱가아제를 암호화한다는 것을 시사한다. 이 효소는 변하는 이산화탄소 농도에 감응하여 기공의 밀도를 결정하는 역할(이후에 기술될)을 수행한다.

기공 공변 세포 프로모터로서 FAE 서열의 사용 방법

본 실험은 FAE 서열이 기공의 공변 세포에 특이적인 프로모터로서의 역할을 할 수 있다는 것을 예시하기 위한 것이다. 플라즈미드 pFL 44를 SnaBI(GUS 유전자의 5` 말단에 위치한)로 침지시켜 1.8kb 단편을 만들었다. 이 단편을 pFL7(프로모터가 없는 GUS 유전자와 35S 터미네이터를 숨기고 있는 다중 복사 작체인)의 SnaBI/SmaI 부위에 클론하여 GUS 의 5` 말단을 대체하여 "새로운 다중 복사 작체"라고 명기된 구조물을 만든다. 이 "새로운 다중 복사 작체"에서부터 다음과 같은: Tag 590 "프로모터' ; GUS 유전자 및 35S 터미네이터같은 성분들을 숨기고있는 EcoRI/Bam HI 단편을 pMOG 800안에 클론하였다. 최종적인 구조물 pMOG 1017을 Arabidopsis C24 형질 전환하는데 사용하여 40개의 유전자 이식 라인이 만들어 졌으며 이 잎들을 GUS 발현에 관해 조직화학적으로 테스트하였다. 사진의 1 또는 2에서만 14개의 라인이 기공 안에서 GUS 유전자가 특이적으로 발현되는 것을 명확히 나타냈다. 나머지 26개의 라인은 명확한 발현을 나타내지 않았으며 이는 발현이 적거나 전혀 없는 것으로 생각되어진다.

식물 및 재배 조건

하나의 M1식물에 M2 라인들을 발현하는 공변 세포에 특이적인 12개의 GUS를 자가(self) 생산하였다. 파종을 하기 전에 종자의 표면을 여과지 위에서 멸균시켰다(10% v/v 표백제로 1회 세척(5분)한 뒤 멸균된 증류수로 헹군다(5 ×1 mL)). 이 종자를 1% w/v 수크로즈와 pH 5.8(KOH), 0.6% w/v 조직 배양용 아가가 들어간 1/2 농도의 Murashige ＆ Skoog 기본 배지 위에서 발아시켰다. 야생형 종자의 경우에는 항생제를 부가하지 않고 만들거나 또는 돌연변이 묘종을 선택하기 위해서는 10 mg/l 하이그로마이신 B(Calbiochem)을 넣어 10 cm 표준 배양 플레이트들을 만들었다. 씨를 뿌린 플레이트들은 48시간 동안 인공적으로 발육을 촉진시키는 춘화처리(0 - 4℃)를 한 뒤 일생동안 재배 조건 상태로 옮긴다(낮엔 22℃, 밤엔 17℃, 낮과 밤을 10/14 시간 비율로 조절하여, R/H 〉60% ; 400 W 오스람 메탈 할라이드 250 - 300 마이크로몰 m²/sec) 식물들을 채집하여 토양으로 옮겼다(3:1 혼합 SHL 다목적 혼합 비료(William Sinclair Horticulture Ltd.) :고운 "실버" 모래).

형태학적 특성화

이산화탄소의 농도를 보통 수준(350 - 450 ppm)과 높은 수준(보통 + 650 ppm)으로 환경을 조절한 챔버를 이용하여 식물을 길렀다. 이러한 조건하에서 , 꽃과 꽃잎의 겉보기, 식물의 성장 및 개화 시기 등을 모두 기록하였다. 형질 전환되지 않은 비교 대조용으로서 야생형 C24를 사용하고 GUS 양성 비교용으로서 35S 구성(constitutive) GUS 발현 인자들(expressor)을 사용하였다. 식물들을 빛(dal)에 16일 또는 35일 노출시키고 난 뒤 챔버로 옮겼다. 16일 노출시킨 그룹의 경우 식물들을 35일 까지 기른 반면 더 오래된 식물은 실험을 마치기 전에 종자를 얻을 때 까지 길렀다. 각각의 식물에 대해 개화 시기를 67일 까지 기록하였다. 모든 식물을 거둬들일 때의 사진을 찍어 놓았다. 외피의 축 부분이 아닌 곳의 본을 뜨기 위해 Xantopren 치과용 본 뜨는 재료(Dental Links Products)를 사용하였는데 잎의 수는 식물 하나 당 2 - 3개이고 잎의 수 보다는 크기를 비교하여 선택된 것이다. Xantopren 본으로부터 실제 모양을 만들기 위해 광학적으로 맑은 아세톤을 기본으로 하는 바니쉬를 사용하였다. 200배로 확대한 광학 현미경으로 각 실제물의 세 가지 다른 부위에서부터 단위 면적 당 기공 세포 및 표피 세포의 수 (9.2^-2mm²)을 얻었다. 이러한 데이터를 이용하여 CO₂의 농도가 정상인 때와 높았을 때 가 라인에 대한 평균 기공 지수(SI) 값(SI=기공의 빈도/표피 세포의 빈도 + 기공의 빈도 ×100)을 계산하였다. 실험 결과를 CO₂조건이 정상이었을 경우 C24와 Tag 590 식물 사이의 기공의 빈도수 또는 기공 지수의 차이가 없다고 나타났다. 이산화탄소의 농도가 높은 조건에서는 C24 식물의 기공 지수가 감소한 반면 Tag 590 식물의 경우에는 기공 지수가 증가하는 대조적인 차이를 나타냈다. 이 결과는 35와 67 dal 식물 모두에서 볼 수 있었다. 모든 라인에서 돌연변이 Tag 590이 존재하는지 또는 그렇지 않은지를 검증하기 위해 GUS 발현에 관한 조직화학적 검증을 실시하였다. C24와 35S/GUS (구조적 GUS 발현) 식물을 비교 대조용으로서 포함시켰다.

Tag 590 라인의 표현형

GUS 발현 데이터를 기초로 하여 공변 세포에 특이적인 유전자를 붕괴시켰다. 이산화탄소의 농도가 높은 상태에서 이 공변 세포들은 두 가지 구분되는 반응들을 나타내는 것으로 알려졌다. 이중 하나로 기공의 크기가 줄어든다는 것은 온실 재배를 하는 전문적인 재배자들에게는 잘 알려져 있는 것으로 이 경우 CO₂의 농도가 높은 상태에서 재배하면 수득률로 전환된다는 모든 잇점을 얻지 못하게 된다. 다른 하나는 성장에 관한 감응이며 CO₂의 농도가 높은 상태에서 성장한 식물에서의 기공의 수가 감소하므로서 어떤 종(spieces)내에서 나타나게 된다. 다음에 기술될 결과들은 Tag 590 식물의 표현형과 C24 비교 대조용을 정상적인, 또 높은 CO₂농도 하에서 비교한 실험의 결과이다.

실험 1

본 실험에는 :(i) C24 비교용(앞 부분 참조)(4개의 식물/처리);(ii) 라인 5/10 (7개 식물/처리;이것은 GUS 유전자 발현이 매우 적은 라인이다) ; 및 (iii)라인5/5 (2개 식물/이 GUS 발현 라인의 처리)의 세 개의 라인들을 사용하였다. 식물들의 연령이 4주가 되면 이들을 온실로 옮긴 뒤 17일 동안 유지시키는데 이산화탄소의 농도는 보통 조건 또는 보통보다 250 ppm 더 높은 조건을 유지시킨다. 실험의 마지막에 기공의 수를 평가하였다.

실험 1의 결과

가장 충격적인 결과는 Tag 590 5/5 라인에서의 개화 시기가 변한 것이다. C24와 비교하거나 또는 5/10 비교용 라인과 비교할 때 5/5 라인에서 특히 꽃이 피기 시작하는 것이 지연되었다. 기공의 수를 세었을 때 (표 1) C24 또는 5/10 식물들의 경우에는 CO₂조건이 보통이거나 높은 경우에 차이가 없다는 것을 발견하였다. 그러나, 너무나 대조적으로 강력하게GUS 발현된 라인 (5/5)에서의 기공의 수는 증가하였다.

CO₂농도에 따른 재배 조건이 기공의 수에 미치는 효과

기공 지수
	보통 조건	높은 조건
C24	28.8	27.2
590 5/10	29.2	29.2
590 5/5	27.6	31.6

실 험 2

본 실험의 목적은 Tag 590 표현형을 보다 정확하게 조사하기 위해 보다 조심스럽게 조절된 재배 조건을 이용하기 위한 것이다. 이 실험에서는 CO₂농도를 컴퓨터 제어하고 실험 과정 내내 기록하는(logged), 재배 조건을 조사하는 두 개의 연결된 재배용 캐비넷을 사용하였다. 첫 번째 캐비넷에서 실험 과정 내내 CO₂의 농도를 보통(정상) 상태로 유지하였다. 두 번째 캐비넷의 경우는 CO₂의 농도를 정상보다 650 ppm 더 높게 유지시켰다. 이 농도는 실험 1 에 사용하였던 것처럼 높았지만 대량 생산하는 재배자들이 사용하는 CO₂관리 양식을 보다 정확하게 반영하도록 선택된 것이었다.

실 험 2의 결 과

재배실 안에서 종자들을 발아시키고 화분에 심고 45일이 되면 재배용 캐비넷으로 옮겼다. 이들을 22일 동안 더 기른 뒤 실험의 마지막에 기공의 수와 개화 시기를 기록하였다. 실험 처리를 하는 동안 성장한 잎들의 기공의 수만을 기록하는 것에 주의하는 것이 중요하다. 이 실험에서도 높은 CO₂농도에서 태그된 식물들의 개화가 늦어진 것을 다시 볼 수 있었다. 태그된 라인들 모두는 CO₂농도가 보통 상태, 높은 상태에서 비교 대조용보다 더 늦게 개화하였다(약 7일 늦게) 기공의 수를 측정한 결과는 표 2에 요약하였다. 이로부터 CO₂농도가 높은 조건에서 재배된 비교 대조용 식물에서는 기공의 수가 줄어들었지만 태그된 두 라인에서는 증가되므로서 이는 CO₂의 농도가 높아진 것에 감응하여 기공의 수가 증가되는 것을 가르키는 앞서의 실험 결과를 확인시키는 것임에 분명하다.

CO₂농도가 높거나 보통인 재배 조건이 기공의 수에 미치는 영향

기 공 의 밀 도
	보통 조건	높은 조건
C24	13.1(식물 6개)	11.3(식물 6개)
512	14.4(식물 6개)	17.1(식물 3개)
Sill	13.9(식물 6개)	17.2(식물 5개)

이 결과는 태그된 돌연변이 라인들은 CO₂농도를 조정하여도 정상적으로 감응하지 않음을 의미한다. CO₂농도가 높을 때 기공의 밀도가 감소되는 것을 나타내는 대신에 기공의 밀도를 증가시키는 것으로서 감응한다. 따라서 이것은 CO₂에 감응하여 기공을 패턴하는데 관여되는 유전자들이 붕괴되었다는 것을 나타낸다. 추정상 붕괴된 유전자들의 서열을 확인하고 SEQ ID No.2로 주어진다. 이 유전자의 프로모터 영역에 큰 관심을 갖는데 그 이유는 이것이 (i) 직접적으로 공변 세포에 특이적인 유전자 발현을 하는 성분 ;과 (ii) CO₂감응 성분들을 함유하는 것으로 여겨지기 때문이다. 돌연변이 590 표현형과 돌연변이된 유전자를 특성화 하였다. 얻어진 결과로부터 이 유전자 또는 이것의 생성물은; (i) 기공 밀도를 조절하는데 관련되고 : (ii) CO₂에 감응하며 (iii)이 유전자 생성물이 사슬이 긴 지방산을 합성하는데 관련되는 지방산 엘롱가아제(FAE)이거나 또는 이것에 관련된다. 이러한 결과는 모두 사슬이 긴 지방산 또는 이것의 대사 산물은 기공의 패턴을 조절하는데 중요한 역할을 하며 이 유전자의 암호화하지 않은 부분은 공변 세포에 특이적이고 CO₂로 유도되는 프로모터들을 포함한다는 것을 제안한다. 대량 생산하는 상업용 식물에 관심이 있는 것 이외에도 생화학 기술자들은 기공의 행동을 제어하기를 바라며 유전자 및 이의 프로모터를 온실 재배 작물의 경우에 그 가치가 있을 것이다. 이러한 상화에서, 탄소 포착력(및 수율)을 최대화시키기 위한 시도로, 대량 생산하는 재배자들은 종종 이들을 높은 CO₂농도에서 재배한다. 그러나, CO₂농도가 높으면 기공의 전도성이 감소되므로서 잠재적인 이득이 줄어든다는 것을 알게되었다. 기공 세포의 수가 증가하면 최소한 어느 정도까지는 이러한 효과는 보상하게 된다.

타겟된 돌연 변이 라인들에서 개화가 늦춰지는 것은 유전자 붕괴의 두 번째 효과이다. 즉, 이 식물 내에서의 기공 밀도를 조절하면 탄소의 포착율이 변하게 되어 꽃의 분열 조직을 개시시키는데 영향을 미치게된다.

업계의 숙련자들은 본 발명이 상술한 것으로만 국한되는 것을 아니라는 것을 인정할 것이며 이 범주 내에서 다양한 변형이 가능하고 보호받기 위한 것들은 다음의 청구 범위에 정하였다. 예를 들어 실시예에는 SEQ ID No.2로 묘사된 서열의 발현을 유도하는 기공 세포에 특이적인 프로모터가 Arabidopsis에서부터 유도된 것이어도 얼룩(blotting) 실험에서는 프로모터 서열이 Arabidopsis 만이 아닌 다른 식물 내에 존재한다는 것을 보여준다. 이러한 식물에는 예를 들어 감자, 토마토 및 당근이 포함된다. 더욱이, 비록 구체적으로 예를 들지는 않았지만 유사한 서열을 가지고있는 내생 유전자의 활성을 방해하기 위해 SEQ ID No.1 및/또는 SEQ ID No.2로 묘사된 서열을 식물 재료 안으로 형질 전환시키면 이렇게 형질 전환된 재료에서부터 재생되었을 때 이산화탄소의 농도를 높이고 형질 전환되지 않은 비교 대조용 식물과 비교해 보았을 때 증가된 기공 수를 갖게될 식물을 제공할 수 있게될 것이다. 이에 더하여 SEQ ID No.8로 묘사된 서열들이 기공에 특이적인 프로모터 활성에 있어서 SEQ ID No.2와 동일한 방식으로 작용할 것이라는 것은 의심할 여지가 없다.

참 고 문 헌(앞서 구체적으로 언급한 것 이외의)

Beckman, A.A. ＆ Engler, A.A.(1994) 조직화학적으로 염색된 식물 조직을 깨끗하게 만드는 쉬운 방법. Plant Molecular Biology Reporter ; 12(1), 37-42.

Linsey,K., Wei,W., Clark, M.C., McArdel, H,F.,Rooke, L.M., Topping, J.F.(1993) Tagging gemonic sequences that direct transgene expression by promoter trap in plants. Transgenic Res. 2, 33-47.

Stomp,A.M.(1992). Histochemical Localisation of B-glucuronidase In Gus Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of gene expression(Gallagher, S.R., ed.) San Diego: American Press. pp. 103-113.

Weyers, J. D.B. and Johansen, L.G.(1985) Accurate estimation of stomatal aperture from silicon rubber impressions. New Phyt. 101,109-115.

SEQUENCE LISTING

＜110＞ ZENECA LIMITED

＜120＞ POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES AND THEIR USE IN A METHOD OF

PRODUCING PLANTS WITH AN INCREASED NUMBER OF STOMATA

＜130＞ PPD50334/WO

＜140＞

＜141＞

＜150＞ 9808304.1

＜151＞ 1998-04-20

＜160＞ 8

＜170＞ PatentIn Ver. 2.0

＜210＞ 1

＜211＞ 1792

＜212＞ DNA

＜213＞ Arabidopsis thaliana

＜300＞

＜303＞ Cell

＜304＞ 7

＜306＞ 309-319

＜307＞ MARCH 1995

＜400＞ 1

taaaacgtaa cggaccacaa aagaggatac atacaaatac atctcatagc ttcctccatt 60

aattttccga cacaaacaga gcaatgacgt ccgttaacgt taagctcctt taccgttacg 120

tcttaaccaa ctttttcaac ctctgtttgt tcccgttaac ggcgttcctc gccggaaaag 180

cctctcggct taccataaac gatctccaca acttcctttc ctatctccaa cacaacctta 240

taacagtaac tttactcttt gctttcactg ttttcggttt ggttctctac atcgtaaccc 300

gacccaatcc ggtttatctc gttgactact cgtgttacct tccaccaccg catctcaaag 360

ttagtgtctc taaagtcatg gatattttct accaaataag aaaagctgat acttcttcac 420

ggaacgtggc atgtgatgat ccgtcctcgc tcgatttcct gaggaagatt caagagcgtt 480

caggtctagg tgatgagacg tacagtcctg agggactcat tcacgtacca ccgcggaaga 540

cttttgcagc gtcacgtgaa gagacagaga aggttatcat cggtgcgctc gaaaatctat 600

tcgagaacac caaagttaac cctagagaga ttggtatact tgtggtgaac tcaagcatgt 660

ttaatccaac tccttcgcta tccgctatgg tcgttaatac tttcaagctc cgaagcaaca 720

tcaaaagctt taatctagga ggaatgggtt gtagtgctgg tgttattgcc attgatttgg 780

ctaaagactt gttgcatgtt cataaaaaca cttatgctct tgtggtgagc actgagaaca 840

tcacacaagg catttatgct ggagaaaata gatcaatgat ggttagcaat tgcttgtttc 900

gtgttggtgg ggccgcgatt ttgctctcta acaagtcggg agaccggaga cggtccaagt 960

acaagctagt tcacacggtc cgaacgcata ctggagctga tgacaagtct tttcgatgtg 1020

tgcaacaaga agacgatgag agcggcaaaa tcggagtttg tctgtcaaag gacataacca 1080

atgttgcggg gacaacactt acgaaaaata tagcaacatt gggtccgttg attcttcctt 1140

taagcgaaaa gtttcttttt ttcgctacct tcgtcgccaa gaaacttcta aaggataaaa 1200

tcaagcatta ctatgttccg gatttcaagc ttgctgttga ccatttctgt attcatgccg 1260

gaggcagagc cgtgatcgat gagctagaga agaacttagg actatcgccg atcgatgtgg 1320

aggcatctag atcaacgtta catagatttg ggaatacttc atctagctca atttggtatg 1380

aattagcata catagaggca aagggaagaa tgaagaaagg gaataaagct tggcagattg 1440

ctttaggatc agggtttaag tgtaatagtg cggtttgggt ggctctacgc aatgtcaagg 1500

catcggcaaa tagtccttgg caacattgca tcgatagata tccggttaaa attgattctg 1560

atttgtcaaa gtcaaagact catgtccaaa acggtcggtc ctaatttgat gtatctgagt 1620

gccaacgttt actttgtctt tcctttcttt tattggttat gaattagatg tttactaatg 1680

ttcctctctt tttcgttata aataaagaag ttcaattctt cctatagttt caaacgcgat 1740

tttaagcgtt tctatttagg tttacatgaa tttcttttac aaaccatctt tt 1792

＜210＞ 2

＜211＞ 1584

＜212＞ DNA

＜213＞ Arabidopsis thaliana

＜400＞ 2

cagatctcga gatatccatc ttcttctatg cctactcaac cacccggtct aaaccgcggt 60

ttacctagtg gatttctcat gtcaccaacc cacggattct tgcaaaatct catccgaaac 120

gttcttcaac atggccaaag gcgctcaact ctacaccgaa gaaacaatcc aattcatgac 180

gaggatacta aaccggtccg gtttaggaga cgatacgtac tccccacgtt gcatgttaac 240

ctctccacca actccatcaa tgtacgaggc gagacatgaa tccgaattag tcatcttcgg 300

agttcttaac tcactattta agaaaaccgg aatcgaaccg agagaagtcg gaatcttcat 360

cgtaaactgc agcttgttta accctaaccc atctctctcg tccatgatcg taaaccggta 420

caagcttaaa accgacgtca aaacttacaa tctctccggt atgggatgca gcgccggggc 480

ttgacgaggc cgataaattt atattacgca atcgttactg tccatcttta tcagccaact 540

ccccagtttc tatctttcct tttagagttt accactcttc atagcttctt gaactttctt 600

taggaatctc cgtggacctc gccacaaatc tactaaaggc aaaccctaat acctacgcag 660

ttattgttag tacggagaac atgactctaa gcatgtatcg aggcaacgac cggtcaatgt 720

tagtccctaa ctgtctattc cgagtaggtg gcgctgcggt tatgctctca aaccggagtc 780

aagcccgagt ccggtctaag tacgaattga ctcatattgt aaggactcac aaaggctcta 840

gcgataaaca ctacacttgt gctgaacaaa aagaagatag taaaggtatc gttggagtcg 900

cactctctaa agaactaacg gttgttgctg tgacacgtta aagacgaatc taacagcact 960

tggtccgctt gttttgcctt tatctgaaaa actccggttt atcctctttt tggtaaagag 1020

taagcttttc cggttaaagg ttagtccata tgttccggat tttaaactat gtttcaagca 1080

tttctgtatt cacgctggtg gtagagcgtt acttgacgcg gttgaaaaag gtcttggact 1140

tagtgagttt gatcttgagc cgtctcggat gactttgcac cgctttggaa acacttcaag 1200

ctcgtcgctg tggtacgagc tggcttacgt ggaggctaaa tgtcgggtca aacgaggaga 1260

tagggtttgg cagttggcgt ttgggtcggg ttttaaatgt aatagtattg tgtggagagc 1320

attgagaacg attccggcta acgagtcagt ggtgggtaac ccgtggggtg actcggttca 1380

taagtatcca gttcacgtga cctaagtttt aagtaatact actacgcgtg tgaagtcacg 1440

ttacaagtta tcataagtca acaatatgtt attagctttc tattaaagtg tagctttttt 1500

tttttgtttc tctccccaca aatatgtatt atttgcttgt ttttgccaac aatttggtat 1560

ctatttcttc ccatatattg tggt 1584

＜210＞ 3

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:PCR PRIMER

＜400＞ 3

catcttcttc tatgcctact c 21

＜210＞ 4

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:PCR PRIMER

＜400＞ 4

gaaatagata ccaaattgtt gg 22

＜210＞ 5

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:PCR Primer

＜400＞ 5

gtaatgctct acaccacgcc g 21

＜210＞ 6

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:PCR Primer

＜400＞ 6

ctttcccacc aacgctgatc 20

＜210＞ 7

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:PCR Primer

＜400＞ 7

cagaaactta cgtacacttt t 21

＜210＞ 8

＜211＞ 2073

＜212＞ DNA

＜213＞ Arabidopsis thaliana

＜400＞ 8

ctagtcactt ggcataagca aaccaagcta tccagccaaa taattagtgt tgggctagtg 60

gtgaacgtca tgcgaatagt ctggataccc tagtttgagt ttaagttgag agggtttcta 120

aacgattttt ggaaatacat taactttggt tcagactttc tcgattaatt accattaaaa 180

atcaaaaggt caatgttgtc gaaaatgtaa aagtataggc ttcaaatagt acaatggtac 240

aatcaatgcc caacgaaacg aacgaagcat atgaaacaaa tatagtggta gatacatgtg 300

atcgtgtatg attagaattt gctactctcg aattatttct gtttagtttc tagagagttt 360

ggttggttta ctatttgcag atagatcatg gagaatgcta cttcgacctc aatctctggg 420

aaccatatac tcactaatca tcttcaaacg gatttgtccc aaaacaacgt atattactaa 480

ctgcgtttga tgttttgaat atgtatgata aggttaaaca tatagagcgt atagattttc 540

aaaagcatgg tagctgttgg tgaaaatgca tggcttatta gtgtttcttt tagagaagct 600

aacgttgtat atagcattaa tttacatatc taattttgtc aattgtaatg agactttgga 660

tacaacaaca tccggctgcg aaataattgt gactttatat gtatttttaa taaattaaat 720

ggtccaacta acacagaaaa cgtacgagta cactgtctca atatttgttt ctcattggtc 780

cacgtccaac ttgggccagc cactgaccac ttcaactaca atttaaaaat gaactggaca 840

aatctcccaa cccaaacact gacccgtaat aaattctatc tatctttaga gacttcgagt 900

cctttccctt ttctactttc ctctttagga ttcattaatt aactacacaa atcaatttga 960

ggaaaatcac atgattctaa cacacttctt tcaggtaaag tgtcaaaagt ttcacagacc 1020

atatcaattc aaatactcca tgcgaaatta atttattaat gctatgaaag tgtgcaaccg 1080

gtgcacccat gggaaacaat cataacacaa ataattggta tacatatttt gtaataaaca 1140

tggtaacaat tagaatggtt aaaatgttta aacagtgaat tgagataagt tttaactcgt 1200

gatcagaact atttttatgc tctttggttt aaaatggtcg tattcatgtg tccttatacg 1260

tataaagtca caaaaagacg accatttttt aaaagtgcgt tcacctattt gtacaacttg 1320

cggtaacgat tttgtgtttt aataaacggt aaccttaaaa cgcagaccac attttccgcg 1380

ggcacaaacg cgcttaacgc catctctata aattaaaacc cacccaatgc ccaatatttt 1440

ctcatatgtt cattgcaatg gcagatttca aaattctttt gcttatactc atccttatat 1500

ctctctttga acttgatcta cttcattttc accatgactt cttctctcct tatccggtca 1560

agatcggttt actcctgata tccatcttct tctatgccta ctcaaccacc cggtctaaac 1620

cggtttacct agtggatttc tcatgtcacc aacccacgga ttcttgcaaa atctcatccg 1680

aaacgttctt caacatggcc aaaggcgctc aactctacac cgatgaaaca atccaattca 1740

tgacgaggat attaaaccgg tccggtttag gagacgatac gtactcccca cgttgcatgt 1800

taacctctcc accaactcca tcaatgtacg aggcgagaca tgaatccgaa ttagttatct 1860

tcggagctct taactcacta ttcaagaaaa ccggaatcga accgagagaa gtcggaatct 1920

tcattgtaaa ctgcagcttg tttaacccta acccatctct ctcgtccatg atcgtaaacc 1980

ggtacaagct taaaaccgac gtcaaaactt acaatctctc cggtatggga tgcagcgccg 2040

gcgcaatctc cgtcgacctc gccacaaatc tac 2073

Claims

(i) 식물 재료 내에서 분류 14-3-3의 전사 인자의 합성을 자극하는 지방산이 생산되는 것을 억제하거나 그렇지 않으면 지방산이 상기 인자의 합성을 자극하지 못하도록 막는 단계;

(ii) 이렇게 억제된 물질을 선택하는 단계;

(iii) 이렇게 선택된 물질을 식물 내에서 재생시키고 비교 대조용 식물과 비교해 보았을 때 기공의 수가 증가된 이들 식물을 재생물 집단에서부터 선택해 내는 ; 단계로 구성된, 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는 방법.
(i) SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 로 묘사된 폴리누클레오티드로 구성된 내생 유전자의 기능을 억제하거나 또는 활성을 방해하는 단계;

(ii) 이렇게 억제된 재료를 선택하는 단계;

(iii)이렇게 선택된 재료를 식물 안에서 재생시키고 재생된 집단에서부터 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 선택하는 단계; 로 구성된; 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기한 내생 유전자가 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시키고 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2 로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 폴리누클레오티드 서열로 구성된 방법.
(i) SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2로 묘사되는 서열로 구성된 폴리누클레오티드로 식물 재료를 형질 전환시키고;

(ii) 이렇게 형질 전환된 재료를 선택하고;

(iii)이렇게 선택된 재료를 식물 안에서 재생시키고 재생된 집단에서 부터 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 선택하는 단계; 로 구성된, 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기한 폴리누클레오티드는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시키고 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 것으로 구성된 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드가 안티-센스 오리엔테이션 상태인 방법.
제 1항부터 제 6항까지 중 어느 한 항에 있어서, 기공의 수가 증가한 식물들은 형질 전환되지 않은 비교용 식물들과 형질 전환된 식물 모두를 발아 후에 다음과 같은 (i) 이산화탄소가 증가된 조건; (ii) 칼슘이 증가된 조건; (iii) 극심한 온도 및 압력 조건; (iv) 물 이용 가능성이 줄어든 조건; (v) 오존, 질소 또는 황 산화물과 같은 오염물 가스가 증가된 환경 조건; 및(vi) 빛이 강화된 조건; 중 최소한 한가지 조건에 노출시켰을 때 이 둘 사이의 차이점을 기준으로 선택된 방법.
제 7 항에 있어서, 이산화탄소의 농도가 약 450 ppm 보다 큰 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 이산화탄소의 농도가 약 650ppm 보다 큰 방법.
제 1항부터 제 9항까지 중 어는 한 항의 재료에서부터 재생된 형태학적으로 정상이며 번식 가능한 완전한 식물 및 이의 자손으로, 기공의 수가 비교 대조용 식물 및 이의 자손에 비해 증가한 식물 및 이의 자손.
제 10 항에 있어서, 간장콩, 목화, 담배, 사탕무, 씨에서 기름을 짜는 평지, 캐놀라, 아마, 해바라기, 감자, 토마토, 알파파, 상추, 옥수수, 밀, sorghum(수수 속(屬) 식물), 호밀, 바나나, 보리(대맥),귀리, 잔디풀, 마초(forage grass), 사탕수수, 완두콩, 야생콩(field bean), 쌀, 파인, 포플러, 사과, 포도, 덩굴 식물, 오이, 고추, 귤 및 견과류 나무로 구성된 그룹에서부터 선택된 형태학적으로 정상인 생식 능력이 있는 완전한 식물.
비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가한 식물을 생산하는 방법에 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2로 묘사된 서열로 구성된 폴리누클레오티드를 사용하는 용도.
제 12 항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드가 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1 또는 SEQ ID No.2로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 용도.
제 12 또는 제 13항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드가 식물에 실시 가능한 프로모터의 발현 조절 하에 있으며 또한 상기 폴리누클레오티드의 단백질 암호화 영역의 하부인 전사 종결 영역으로 더 구성되는 용도.
제 12 항부터 제 14항까지 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 CaMV35S ; FMV35S ; NOS ; OCS ; 및 E9 으로 구성된 그룹에서부터 선택된 용도.
제 14 항에 있어서, 상기 프로모터가 기공의 공변 세포에 특이적인 용도.
제 16 항에 있어서, 상기 프로모터가 SEQ ID No.2로 묘사된 서열의 프로모터 활성 영역으로 구성된 용도.
비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하기 위한 제 1항부터 제 9항까지 중 어느 한 항의 방법에 제 12 항부터 제 17항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드를 사용하는 용도.
60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시킨 뒤 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1로 묘사된 서열로 잡종화될 수 있는, 그러나 상기 온도가 65 - 70℃ 사이 일때는 잡종화 되지 않는 것에 상보적인 서열로 구성되는 폴리누클레오티드.
제 19 항에 있어서, SEQ ID No.2로 묘사된 서열로 구성된 폴리누클레오티드.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 폴리누클레오티드로 구성된 단백질 암호화 영역이 식물에 조작 가능한 프로모터와 터미네이터에의해 결합되는 폴리누클레오티드.
제 19항에서부터 제 20항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드로를 포함하는 식물 형질 전환 벡터.
5`에서 3` 방향으로 제 19항에서부터 제 21항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드의 상보물을 포함하는 서열로 구성된 식물 형질 전환 벡터.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 폴리누클레오티드의 단백질 암호화 영역이 기공의 공변 세포에 특이적인 프로모터의 발현 조절 하에 있는 식물 형질 전환 벡터.
제 19 항에부터 제 21항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드에의해 암호화된 번역 생성물.
제 25 항에 있어서, 지방산 엘롱가아제 활성을 가지고있는 생성물.
제 19 항부터 제 21항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드로, 제 22항부터 제 24 항까지 중 어느 한 항의 벡터로, 또는 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션시키고 동일한 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 여전히 SEQ ID No.1로 묘사된 서열로 잡종화되는 것에 상보적인 서열고 구성된 폴리누클레오티드로 형질 전환된 식물 재료.
제 27항에 있어서, 식물이 제초제, 해충, 건조 및/또는 진균, 박테리아 또는 바이러스 감염에 견디거나 또는 저항하게 만들 수 있는 단백질을 암호화하는 영역으로 구성된 폴리누클레오티드로 형질 전환된 식물 재료.
제 28 항에 있어서, 제초제에 대한 내성을 제공할 수 있는 단백질이 글리포세이트 옥시도-리덕타아제(GOX), 5-에놀-피루빌-3-포스포신키메이트 신테타아제 (EPSPS) 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(PAT), 하이드록시 페닐 피루베이트 디옥시게나아제(HPPD), 글루타티온 S 트랜스퍼라아제(GST), 사이토크롬 P450, 아세틸-COA 카복실라아제(ACCase), 아세토락테이트 신타아제(ALS), 프로토포피리노겐 옥시다아제(PROTOX), 디하이드롭테로에이트 신타아제, 폴리아민 트랜스포트 프로테인, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 브로목시닐 니트릴라아제, 피토엔 디쎄추라아제(PDS), Alcaligenes eutrophus에서 얻을 수 있는 tfdA 유전자 생성물, 및 상기 단백질의 돌연변이 또는 변형된 변이체로 구성된 그룹에서부터 선택된 식물 재료.
제 27항부터 제 29 항까지 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 암호화 서열이 (i) 이 영역의 번역 생성물을 엽록체, 미토콘드리아, 기타 세포 소기관 또는 식물의 세포벽 같은 색소체에 맞출 수 있는 펩티드; 및/또는 (ii) 번역되지 않은 번역증진용 서열을 : 암호화하는 단백질 암호화 영역 5`로 구성되는 식물 재료.
제 27 항에서부터 제 30 항 까지중 어느 한 항에 있어서, 재료를 형질 전환시키는데 사용되는 폴리누클레오티드는 mRNA 불안정 암호화 특성 및/또는 뜻 밖의 재접합(splice) 영역이 제거된다는 점에서 변형된 것이며, 또는 제초제에 대한 내성을 부여하는 영역에 있어서 만일 이렇게 변형된 폴리누클레오티드가 변형된 폴리누클레오티드안에 있는 단백질 암호화 영역과 상기 식물 안에 내생적으로 존재하면서 거의 동일한 단백질을 암호화하는 유사 단백질 암호화 영역 사이의 동일한 정도가 약 70% 미만인 식물에 바람직한 코돈으로 구성되는 조건을 만족한다면 이렇게 변형된 폴리누클레오티드가 식물 안에 발현되어 변형되지 않은 폴리누클레오티드의 단백질 암호화 영역이 내생성인 유기체 내에서 변형되지 않은 폴리누클레오티드가 발현 되므로서 얻어진 것과 거의 유사한 활성/기능을 가지고 있는 거의 유사한 단백질을 생산할 수 있도록 식물에 바람직한 코돈들을 이용하는 식물 재료.
제 27 항부터 제 31 항까지 중 어느 한 항의 재료로부터 생산된 형태학적으로 정상이며 번식 능력이 있는 완전한 식물, 이 식물의 자손, 이 식물과 그 자손의 종자, 및 이러한 식물과 그 자손의 일 부분.
제 32 항에 있어서, 간장콩, 목화, 담배, 사탕무, 씨에서 기름을 짜는 평지, 캐놀라, 아마, 해바라기, 감자, 토마토, 알파파, 상추, 옥수수, 밀, sorghum(수수 속(屬) 식물), 호밀, 바나나, 보리(대맥),귀리, 잔디풀, 마초(forage grass), 사탕수수, 완두콩, 야생콩(field bean), 쌀, 파인, 포플러, 사과, 포도, 덩굴 식물, 오이, 고추, 귤 및 견과류 나무로 구성된 그룹에서부터 선택된 식물.
(i) 60 - 65℃ 사이의 온도에서 0.1% SDS가 함유된 농도 0.3시트레이트 버퍼 염류액 안에서 인큐베이션 시키고 이어서 같은 온도에서 0.1% SDS 가 함유된 농도 0.3 시트레이트 버퍼 염류액으로 헹구었을 때 SEQ ID No.1로 묘사되는 서열로 여전히 잡종화되는 것에 상보적인 서열로 구성된 식물의 내생 유전자의 기능을 억제하거나 그렇지 않으면 이것의 활성을 방해하고;

(ii) 이렇게 억제된 재료를 선택하고;

(iii) 이렇게 선택된 재료를 식물 내로 재생시키는; 단계로 구성된, 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가한 식물을 생산하는 방법.
제 34 항에 있어서, 식물 재료가 제 19 항부터 제 21 항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드로, 또는 제 22 항에서부터 제 24 항까지 중 어느 한 항의 벡터로 형질 전환된 방법.
제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 형질 전환되지 않은 비교 대조용 식물과 형질 전환된 식물을 발아 후 다음과 같은 최소한 한 가지 조건,즉 (i) 높아진 이산화탄소의 농도;(ii) 증가된 칼슘; (iii) 극심한 온도 및 압력 조건;(iv) 줄어든 물의 이용 가능성; (v) 예를 들면 질소 또는 황 산화물, 오존 같은 증가된 주변의 오염 가스; (vi) 증대된 빛 조건 등에 노출시켰을 때 이 두 식물의 차이를 기준으로 하여 기공의 수가 증가된 식물을 선택하는 방법.
제 36 항에 있어서, 상기한 차이라는 것이 (i)개화가 지연되는 것; (ii)성장 특성이 변화되는 것; 및 (iii) 기공 지수가 높아지는 것; 으로 구성된 그룹에서부터 선택된 방법.
제 34 항에서부터 제 37 항까지 중 어느 한 항에 있어서, 이렇게 선택된 식물, 또는 이의 자손을 형질 전환되지 않은 유사 식물과 교배하는 단계로 더 구성되는 방법.
제 38 항에 있어서, 교배하여 만들어진 식물이 유전자 이식에 대해 동형 접합되는 방법.
제 34 항부터 제 39 항까지 중 어느 한 항의 방법으로 만든 식물, 이러한 식물의 자손, 이러한 식물 및 자손의 종자, 및 이러한 식물 및 자손의 일부분.
열매, 꺽꽂이용 꽃(cut flowers)및 종자로 구성된 그룹에서부터 선택된 제 40 항의 식물의 일부분.
형질 전환되지 않은 비교 대조용 식물에 비해 기공의 수가 증가된 식물을 생산하기 위한 방법에 제 19 항에서부터 제 21 항까지 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드 또는 제 22 항부터 제 24 항까지 중 어느 한 항의 벡터를 사용하는 방법.
SEQ ID No.2로 묘사된 서열로 구성된 발현 조절 서열.
SEQ ID No.2로 묘사된 서열을 포함하는 분리된(isolated) 폴리누클레오 티드.
SEQ ID No.8로 묘사된 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드.
SEQ ID No.8로 묘사된 서열로 구성된 발현 조절 서열.