ES2543382T3 - Planta con resistencia a estrés por bajas temperaturas y método de producción de la misma - Google Patents
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Abstract
La presente invención está relacionada con un método de producción de plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, comprendiendo la etapa de transformación de células de unaplanta con una secuencia del gen exógeno ADC1 de la arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de funcionar en la planta. Las plantas así obtenidas muestran resistencia a estréspor bajas temperaturas sin ser afectado el fenotipo cuando se compara con el fenotipo de las plantas de tipo silvestre.
Description
Planta con resistencia a estrés por bajas temperaturas y método de producción de la misma.
La presente invención está relacionada con plantas que tienen resistencia mejorada a bajas temperaturas. Además, 5 la presente invención describe un método para la producción de dichas plantas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las plantas se adaptan a diferentes tipos de estrés ambiental tales como la temperatura de su hábitat. Sin embargo, 10 en condiciones de estrés por temperatura, por ejemplo, las plantas son susceptibles al calor o a temperaturas frías cuando están expuestas a ambientes por encima o por debajo de su temperatura óptima de crecimiento máxima o mínima, lo que lleva a su debilidad debida a la pérdida gradual o súbita de las funciones fisiológicas de las células.
Se han realizado esfuerzos para ampliar la adaptación de las plantas a la temperatura mediante procedimientos de 15 mejora tales como la selección o cruzamiento con el objeto de utilizar plantas silvestres adaptadas a diferentes temperaturas ambientales como cultivos comestibles, plantas de horticultura, y similares. El período en el que pueden cultivarse verduras, flores y plantas ornamentales, árboles frutales y similares se ha expandido mediante estos procedimientos de mejora, así como mediante horticultura protegida.
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Las poliaminas, término general aplicado a hidrocarburos alifáticos con 2 o más grupos amino primarios, son sustancias naturales ubicuas en los organismos, con más de 20 tipos descubiertos hasta el momento. Las poliaminas típicas incluyen la putrescina, la espermidina y la espermina. Las enzimas conocidas relacionadas con el metabolismo de poliaminas implicadas en la biosíntesis de las poliaminas mencionadas incluyen la arginina descarboxilasa (ADC), la ornitina descarboxilasa (ODC), la S-adenosil-metionina descarboxilasa (SAMDC), la 25 espermidina sintasa (SPDS), y la espermina sintasa (SPMS). Recientemente se ha publicado que algunas de las enzimas relacionadas con el metabolismo de poliaminas están implicadas en diferentes tipos de estrés ambiental.
La solicitud de patente europea EP 1.329.153 enseña que en tejidos vegetales que exhiben resistencia a estrés por frío, se incrementa el contenido de espermidina y espermina. En esta solicitud de patente se ejemplifica que 30 introduciendo el gen de la espermidina sintasa en una planta, se incrementan los niveles de espermidina y espermina. Cuando la planta transgénica se sometió a bajas temperaturas, se confirmó que tenía mayor resistencia a estrés por frío.
La solicitud de patente de número US 2006/0225154 enseña que los niveles de espermidina, espermina y putrescina 35 están incrementados cuando una planta se transforma con un gen espermidina sintasa. Esta solicitud de patente indica que el efecto de la defensa a estrés por bajas temperaturas puede ser implementada en la planta introduciendo el gen de la espermidina sintasa.
Respecto a la utilización del gen ADC para conferir resistencia a estrés por frío en plantas, es destacable el hecho 40 de que en la familia de las Brassicaceae, el gen ADC parece estar duplicado, dando lugar así a dos parálogos, denominados generalmente ADC1 y ADC2 (cfr. Galoway et al., “Phylogenetic utility of the nuclear gene Arginine Decarboxylase: an example from Brassicaceae”, Molecular Biology and Evolution, 1998, v. 15, p.1312-1320). Se han estudiado las diferentes funciones desempeñadas por cada uno de los parálogos.
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En Hummel I. et al. (cfr. Hummel et al, “Differetial expresión of ARGININE DECARBOXYLASE ADC1 y ADC2 in Arabidopsis thaliana: characterization of transcriptional regulation during seed germination and seedling development”, New Phytologist, 2004, v. 163, p. 519-531), se estudiaron las actividades de los promotores de ADC1 y ADC2 en plantas transformadas de forma estable. En este estudio, se demostró que el frío tenía un poderoso efecto en la actividad de los promotores de ADC1 y ADC2. Se concluyó que en Arabidopsis la respuesta de 50 poliaminas al frío se demuestra que correlaciona con la activación transcripcional del promotor de ADC1.
En Alcázar et al. (Alcazar et al., “Overexpression of ADC2 in Arabidopsis induces dwarfism and late-flowering through GA deficiency”, The Plant Journal, 2005, v. 43, p. 425-436) se generó una planta transgénica de Arabidopsis. La planta transgénica sobreexpresaba el gen ADC2, dando lugar a una acumulación de putrescina, sin 55 afectar los niveles de espermidina o espermina. Además, las plantas sobreexpresoras de ADC2 mostraron enanismo y retraso en la floración.
A pesar de los esfuerzos realizados en el estado de la técnica, la búsqueda de nuevas plantas con resistencia mejorada a estrés y de métodos para su obtención es todavía un campo activo. 60
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han encontrado que introduciendo en una planta una secuencia del gen ADC1, la planta transgénica resultante presenta resistencia a estrés por baja temperatura. Además, el fenotipo de la 5 planta transgénica no difiere del fenotipo de la planta de tipo silvestre, tal como se ilustra más abajo.
En Alcázar et al. (ver más arriba), se describió que sobreexpresando el gen ADC2 (el parálogo del gen ADC1), la planta transgénica resultante experimentaba cambios en su fenotipo (tales como enanismo) y en su crecimiento (retraso en la floración). 10
Por otra parte, en Hummel I. et al. (ver más arriba) se menciona que el efecto del frío estaba correlacionado con cambios en los niveles de RNAm, y era coherente con la presencia específica de dos copias de un elemento de respuesta a bajas temperaturas en el promotor de ADC1 y con el impacto potencial del elemento transponible en la expresión del gen, ya que una copia de este elemento de respuesta a temperaturas bajas forma parte del elemento 15 transponible de ADC1.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la sobreexpresión de ADC1 confiere a la planta resistencia a estrés por las bajas temperaturas y no afecta al fenotipo o crecimiento de la planta transgénica.
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Además, y tal como se ilustra más abajo, la resistencia a estrés por bajas temperaturas se consigue por sobreexpresión del gen ADC1, independientemente del promotor utilizado para su expresión. Tal como se muestra más abajo, la construcción utilizada para introducir el gen ADC1 en la planta comprendía un promotor constitutivo distinto al promotor ortólogo del gen. Por tanto, los inventores de la presente invención han encontrado que el factor relevante para conferir resistencia a estrés por bajas temperaturas es la sobreexpresión del gen ADC1, 25 independientemente de si el promotor ortólogo de ADC1 está presente en la construcción utilizada para transformar la planta.
Por otra parte, los inventores han descubierto que cuando el gen ADC1 se sobreexpresa en la planta: a) hay una acumulación de putrescina; b) el nivel de espermidina casi no cambia; y c) el nivel de espermina se reduce (niveles 30 comparados con una planta de tipo silvestre). Este descubrimiento contraviene las divulgaciones realizadas en el estado de la técnica utilizando otro gen de síntesis de poliaminas (i.e. el gen espermidina sintasa), en el que los efectos observados se basaban en un incremento de espermidina y/o espermina como consecuencia de la acumulación de putrescina, o una producción estable de las poliaminas mencionadas.
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Así, en un primer aspecto la presente invención se refiere a un método de producción de plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende el paso de la transformación de células de una planta con una secuencia exógena del gen ADC1 de la arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de funcionar en la planta.
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Sin estar limitados a una teoría, los inventores creen que las plantas transgénicas resultantes no presentan alteraciones en su desarrollo debido a la diferente localización subcelular de ADC1, incrementándose la productividad y el rendimiento, en comparación con las que sobreexpresan ADC2.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una planta transformada obtenible por el método definido 45 de acuerdo con en el primer aspecto de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y variantes de la palabra, tal como “comprendiendo”, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la 50 descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
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FIG. 1: Estructura de la construcción de expresión que contiene el gen de la biosíntesis de putrescina ADC1 bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S.
FIG. 2: Niveles relativos de transcrito del gen de la biosíntesis de putrescina ADC1 en plantas trasgénicas (I11, 17, 19) y control (wt). 60
FIG. 3: Niveles de poliaminas en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre (wt) y transgénicas sobreexpresoras de ADC1 (I11, 17, 19).
FIG. 4: Tolerancia a la congelación de plantas de tipo silvestre y transgénicas. Plantas de 3 semanas de edad se expusieron a diferentes temperaturas de congelación durante 6 horas: (A)- 5ºC (no aclimatadas), y (B) -12ºC (aclimatadas al frío). La tolerancia a la congelación se estimó como el porcentaje de plantas que sobreviven a cada temperatura específica después de 14 días de recuperación en condiciones de ausencia de estrés. 5
FIG. 5: Análisis de la PCR de DNA genómico de tabaco preparado a partir de brotes de tipo silvestre (C-) y regenerados resistentes a kanamicina. M marcadores de DNA digeridos con -PstI, C+ plásmido pBI121-ADC1, A1.1-A1.16 líneas resistentes a kanamicina.
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FIG. 6: Análisis de transcriptasa reversa (RT-PCR) del transcrito de ADC1 de Arabidopsis en plantas transgénicas de tomate To. Se utilizaron cebadores específicos de ADC1 y actina.
FIG. 7: Niveles de poliamina en plantas de tabaco silvestres (wt) y transgénicas que sobre-expresan el gen ADC1 de Arabidopsis (A1.6, A1.13, A1.16). 15
FIG. 8: Resistencia a congelación de plantas de tabaco silvestres (wt) y transgénicas. Plantas de tres semanas se expusieron a -3ºC durante 4 h. La resistencia a congelación se estimó como el porcentaje de plantas que sobrevivió después de 14 días de recuperación en condiciones de no estrés.
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FIG. 9: Análisis de la PCR de DNA genómico de tomate preparado a partir de brotes salvajes y regenerados resistentes a kanamicina.
FIG. 10: Niveles de transcrito relativos del gen ADC1 de Arabidopsis en plantas de tomate transgénicas (847-2, 847-3, 847-4, 847-5) y control (ctrl). 25
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PARTICULARES
En la presente invención “plantas con resistencia mejorada a estrés por temperaturas bajas” son plantas en las que 30 la limitación de crecimiento o el daño ocasionados por el estrés por bajas temperaturas puede eliminarse o reducirse.
Como se usa aquí, ‘exógeno’, indica que no es intrínseco a la planta sino que se ha introducido externamente. De este modo, una “secuencia exógena del gen ADC1” puede ser un gen que codifica la enzima ADC1 homólogo a la 35 planta huésped (es decir, derivado de la planta huésped) que se introduce externamente por manipulación genética. El uso de un gen derivado del huésped que codifica la enzima ADC1 es preferible al considerar la identidad del uso de codones.
En una realización del primer aspecto de la invención, el método además comprende la regeneración de la planta a 40 partir de las células transformadas que contienen la secuencia génica exógena del gen ADC1 bajo el control de un promotor capaz de funcionar en plantas.
La secuencia completa del gen ADC1 está disponible en la base de datos GenBank con la referencia génica ID 816149. 45
La secuencia codificante del gen ADC1 de la arginina descarboxilasa de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO: 1) está disponible en la base de datos GenBank. Su número de acceso es NM_127204.
La secuencia de aminoácidos de la arginina descarboxilasa ADC1 (SEC ID NO: 2) está disponible en la base de 50 datos GenBank. Su número de acceso es Q95I64.
En otra realización del primer aspecto de la invención, la secuencia exógena del gen ADC1 de la arginina descarboxilasa se selecciona del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEC ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que 55 comprende la secuencia SEC ID NO: 2; c) una secuencia de nucleótidos que hibrida con la SEC ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma en condiciones severas y que codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa, y d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa que comprende la secuencia (a) con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas. Preferiblemente, la secuencia corresponde a SEC ID NO: 1. 60
La secuencia exógena del gen ADC1 puede ser introducida en las células por cualquier método de ingeniería genética. Ejemplos incluyen fusión de protoplastos con células vegetales heterólogas que tienen la secuencia del
gen ADC1, infección con virus de plantas con el genoma viral manipulado genéticamente para expresar el gen que codifica la enzima ADC1, o transformación de células de la planta huésped usando un vector de expresión que contiene el gen que codifica la enzima ADC1.
Ejemplos de promotores capaces de funcionar en plantas incluyen el promotor 35S del virus del mosaico de la 5 coliflor (CaMV) que se expresa de forma estructural en las células vegetales, el promotor del gen que codifica la nopalina sintasa (NOS), el promotor del gen que codifica la octopina sintasa (OCS), el promotor del gen que codifica la fenilalanina amonio liasa (PAL) y el promotor del gen que codifica la chalcona sintasa (CHS). También hay disponibles otros promotores de plantas bien conocidos además de los mencionados.
10 No sólo promotores que se expresan constitutivamente en todos los órganos como el promotor 35S, sino también promotores regulados por bajas temperaturas, estrés, sequía, luz, calor, hormonas, daño o similar pueden utilizarse para expresar el gen diana de acuerdo con el medio ambiente. Por ejemplo, se puede utilizar un gen que codifica la enzima ADC1 y un promotor que active su transcripción sólo cuando la planta se expone a bajas temperaturas, para controlar el metabolismo de poliaminas de la planta sólo en condiciones de bajas temperaturas y así mejorar la 15 resistencia a estrés por bajas temperaturas. Un promotor específico de órgano o tejido también puede utilizarse para expresar el gen diana sólo en órganos o tejidos específicos.
Cuando la secuencia del gen exógeno ADC1 se introduce por infección con Agrobacterium tumefaciens, el casete de expresión que incluye el gen que codifica la enzima ADC1 puede insertarse en la región T-DNA (región que se 20 transfiere al cromosoma de la planta) en un plásmido Ti o Ri de las células. En la actualidad se utilizan sistemas de vectores binarios en métodos de transformación estándar con Agrobacterium. Ejemplos de vectores binarios comerciales incluyen los plásmidos pBI101 y pBI121 (ambos comercializados por Clontech). La región Vir implicada en la incorporación del T-DNA tiene acción en trans en el plásmido separado Ti (o Ri), en un vector conocido como plásmido de ayuda o ‘helper’. 25
Para la transformación de plantas pueden utilizarse varios métodos convencionales conocidos. Ejemplos incluyen el método del PEG, en el que los protoplastos se aíslan de células vegetales por tratamiento con una enzima que degrada la pared celular como la celulasa o la hemicelulasa, y se añade el polietilenglicol a una suspensión de protoplastos junto a un vector de expresión que contiene el casete de expresión del gen que codifica la enzima 30 ADC1 mencionado antes, para incorporar el vector de expresión en los protoplastos por un proceso como la endocitosis; el método de liposomas en el que un vector de expresión se introduce por tratamiento de ultrasonidos o similar en vesículas de membranas lipídicas como fosfatidilcolina, y las vesículas se fusionan con los protoplastos en presencia de PEG; métodos de fusión en un proceso similar utilizando micelas; y por electroporación, en el que se aplican pulsos eléctricos a una suspensión de protoplastos y un vector de expresión para incorporar los vectores que 35 se encuentran en la solución externa en los protoplastos. Sin embargo, estos métodos son complejos puesto que requieren técnicas de cultivo para la re-diferenciación de los protoplastos en plantas. Procesos para introducir el gen de interés en células intactas con pared celular incluyen la inyección directa como la microinyección en la que una micropipeta se inserta en las células para inyectar el DNA del vector por presión a gas o hidráulica, o el método del cañón de partículas en el que se aceleran micropartículas de metal cubiertas con DNA por la detonación de un 40 explosivo o presión gaseosa y de esta forma se introducen en las células, y métodos que emplean la infección con Agrobacterium. Los inconvenientes de la microinyección son la necesidad de una experiencia considerable y el pequeño número de células que se manipulan. Por ello es más aconsejable transformar plantas con métodos más prácticos tales como el método Agrobacterium y el método del cañón de partículas. En el método del cañón de partículas, bolas diminutas de metal (normalmente oro) cubiertas con el DNA de interés se disparan directamente 45 sobre la célula vegetal. El método del cañón de partículas es útil ya que los genes pueden ser introducidos directamente en el meristemo apical de las plantas mientras son cultivadas. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que contiene, además de su cromosoma, un minicromosoma extra circular denominado plásmido inductor de tumores (Ti). Parte del plásmido Ti se transfiere a los cromosomas de la planta huésped donde queda integrado (T-DNA). Varios loci génicos del cromosoma bacteriano y un grupo de genes de virulencia (vir) localizados 50 en el plásmido Ti codifican para funciones que intervienen en el reconocimiento de la célula vegetal y su unión, así como en la excisión, transferencia e integración del T-DNA en el genoma de la planta. En general el método de Agrobacterium está más aceptado que el cañón de partículas por la mayor frecuencia de inserciones únicas en el DNA foráneo, siendo más fácil su monitorización.
55 Ejemplos ilustrativos no limitantes de células vegetales que pueden ser transformadas con el gen exógeno ADC1 de acuerdo con el primer aspecto de la invención, son las células derivadas de: callos, semillas, hojas, tallos, sarmientos, raíces, tubérculos de raíz o tallo, flores y similares.
Ejemplos de plantas que pueden ser transformadas con el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la 60 invención incluyen, pero no se limitan a, dicotiledóneas, monocotiledóneas, plantas herbáceas y arbustos. Ejemplos incluyen patatas dulces, tomates, pepinos, calabaza, melones, sandías, tabaco (Nicotinia tabacum), Arabidopsis thaliana, pimientos, berenjena, judías, taro, espinaca, zanahorias, fresas, patatas blancas, arroz, maíz, alfalfa, trigo,
cebada, soja, colza, sorgo, Eucaliptos, olmo, kenaf, Eucommia ulmoides, caña de azúcar, remolacha, cassaya, cica, Chenopodium album, lirios, orquídeas, claveles, rosas, crisantemo, petunias, Torenia fournieri, antirrhinum, ciclamen, gypsohila, geranio, girasol, Zoisia japonica, algodón, hongos matsutake, hongos shiitake, champiñones, ginseng, frutos cítricos, bananas y kiwi.
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Las “secuencias de base con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas” aquí referidas, son ampliamente conocidas para aquellas personas expertas en la materia, para retener algunas veces actividad fisiológica incluso cuando la secuencia de aminoácidos de una proteína que generalmente tiene dicha actividad fisiológica tiene uno o más aminoácidos sustituidos, deleccionados, insertados o añadidos. Los genes que tienen dichas modificaciones y que codifican una enzima ADC1 están incluidos en el ámbito de la presente invención. Sin 10 embargo, es esencial que dichas modificaciones no resulten en una pérdida de actividad para la enzima mencionada.
Las “condiciones severas” aquí referidas, significan condiciones bajo las cuales sólo secuencias de bases que codifican un polipéptido con actividad enzimática ADC1 equivalente a la enzima ADC1 codificada por una secuencia 15 génica específica de la enzima ADC1 forma híbridos con la secuencia específica (referido aquí como híbridos específicos), y secuencias de bases que codifican polipéptidos que no tienen dicha actividad equivalente no forman híbridos con la secuencia específica (referidos aquí como híbridos no específicos). Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente tales condiciones variando la temperatura durante la reacción de hibridación y proceso de lavado, la concentración de sales durante reacción de hibridación y proceso de lavado, y así otras cosas. 20
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis
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A. Construcción del Plásmido
El cDNA de ADC1 de Arabidopsis se amplificó por PCR a partir de DNA genómico, utilizando los siguientes cebadores: sentido directo 5’-ATGCCTGCTCTAGCTTTTG-3’ (SEC ID NO: 3), y sentido inverso 5’-ACCGAAATAAGACCAATTC-3’ (SEC ID NO: 4). El fragmento de DNA amplificado se clonó en el vector pGEM 30 (Stratagene, Heidelberg) y se comprobó por secuenciación. La construcción que contenía el cDNA de ADC1, flanqueado por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) y el terminador de la nopalina sintasa (NOS), en un vector binario (pBI121-ADC1), se obtuvo reemplazando el gen GUS SmaI/SacI en el vector pBI121 (cfr. Chen et al., “Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning t-DNA insertion from transgenic plants”, Molecular Breeding, 2003, v. 11, p. 289-293; accession number AF485783), por el 35 fragmento XbaI/XbaI del cDNA de ADC1 (2.6 kb). Esta construcción se introdujo por electroporación en Agrobacterium tumefaciens C58C1, que se utilizó para transformar diferentes especies vegetales, tal como se explica más abajo.
B. Transformación de Arabidopsis thaliana 40
Plantas de Arabidopsis thaliana Col0 se transformaron con A.tumefaciens, que contenía la contrucción pBI121-ADC1 por inmersión floral (cfr. Clough S. J. et al., “Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”, Plant J., 1998, v. 16, p. 735-743). Las semillas producidas por estas plantas se recolectaron y se seleccionaron en medio de cultivo de Murashige and Skoog, abreviado a partir de ahora como 45 “MS” (cfr. Murashige T. et al., “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant., 1962, v. 15, p. 473-497), que contenía 50 mg/l de kanamicina como antibiótico para la selección de los transformantes. La progenie de las plantas resistentes a kanamicina se analizó para la segregación de resistencia a kanamicina. Las semillas de las plantas con una proporción de segregación 3:1 se cultivaron de nuevo y la progenie resultante se analizó de nuevo para la segregación de resistencia a kanamicina para identificar plantas homocigotas 50 para el T-DNA insertado. Se seleccionaron tres líneas homocigotas (I7, I9 e I11) para posteriores análisis.
C. Caracterización de las plantas transgénicas
C.1. Estimación de RNAm de ADC1 por RT-PCR a tiempo real 55
El RNA total se obtuvo de toda la parte aérea de plantas de Arabidopsis thaliana de 4 semanas no transformadas (wt) y transformadas con el plásmido pBI121ADC1 (I7, I9, I11) utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un microgramo de RNA total se trató con DNasa de grado amplificación (Invitrogen) para eliminar la contaminación con DNA genómico. La primera hebra de cDNA se obtuvo con hexámeros degenerados utilizando el 60 sistema de síntesis de primera hebra SuperScript III (Invitrogen), siguiendo las especificaciones del fabricante. La RT-PCR a tiempo real con el método de marcaje SYBR Green I se llevó a cabo utilizando la primera hebra de cDNA como molde en un sistema detector de secuencias (modelo 7700; Applied Biosystems, Foster, CA). La eficiencia de
la amplificación de cada muestra analizada se determinó utilizando la hoja de cálculo DART-PCR (cfr. Peirson S. N. et al. “Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis”, Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, e73), que utiliza un algoritmo simple (cfr. Tichopad A. et al., “Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up”, Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, e122.) y los datos de fluorescencia sin tratar, lo cual permite obtener resultados comparables sin necesidad de curvas de 5 calibración con patrones. Las eficiencias de amplificación se calcularon para cada reacción individual a partir de su perfil de amplificación y se comprobaron por ANOVA para detectar muestras anómalas (outliners) y diferencias entre grupos (equivalencia de amplificación) utilizando la misma hoja de calculo DART-PCR. La media de fluorescencia inicial (R0) obtenida a partir de la eficiencia media se normalizó utilizando RNAm de Actina2 como control interno en cada experimento. Estos análisis se llevaron a cabo dos veces en experimentos independientes con resultados muy 10 similares. Se utilizaron los siguiente juegos de cebadores específicos para cada gen: ADC1 (sentido directo: 5’- gtggtgataaggggaacgaca-3’ (SEC ID NO: 5), sentido inverso: 5’- caaccgaaataagacca-attctcat-3’ (SEC ID NO: 6)), y Actina2 (sentido directo: 5’-GATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-3’ (SEC ID NO: 7), sentido inverso: 5’-TGGATTCCAGCAGCTT-CCAT-3’ (SEC ID NO: 8).
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C.2. Análisis de poliaminas
Las poliaminas (PAs) se analizaron por separación de los derivados de PAs con cloruro de dansilo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los métodos de extracción y determinación habían sido descritos previamente (cfr. Marcé M. et al., “Rapid high-perfomance liquid chromatographic method for quantitation of 20 polyamines as their dansyl derivatives: Application to plant and animal tissues”, J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 1995, v. 666, p. 329-33).
Como se muestra en la FIG. 3, los niveles de putrescina en las plantas transgénicas están incrementados, mientras que la espermidina no está afectada y el nivel de espermina está reducido. A partir de estos resultados, se puede 25 concluir que la sobreexpresión de ADC1 incrementa la acumulación de putrescina.
C.3. Ensayos de congelación
En este ensayo se utilizaron plantas de 3 semanas (wt, I7, I9, I11). Para obtener las plantas, las semillas se 30 sembraron en macetas que contenían una mezcla de tierra y vermiculita (3:1 v/v), se regaron con agua y una solución mineral de Hogland, y crecieron a 21±1°C en fotoperíodos de día neutro (12 horas de luz fluorescente blanca fría, flujo de fotones de 70-90 μmol m-2 seg-1).
Los tratamientos a bajas temperaturas se llevaron a cabo transfiriendo las plantas a cámaras de crecimiento 35 programadas a 4±1°C durante diferentes períodos de tiempo en las condiciones de luz y fotoperíodo descritas más arriba.
Los ensayos de congelación se realizaron en un congelador de temperatura programable. Plantas de 3 semanas no-aclimatadas o aclimatadas a frío (7 días, 4°C) se expusieron a 4°C durante 30 min en la oscuridad y a continuación 40 se bajó la temperatura 2°C por hora. La temperatura final de congelación (-5ºC para no aclimatadas, y -11ºC para aclimatadas a frío) se mantuvo durante 6 horas, y luego se incrementó de nuevo la temperatura hasta 4°C a la misma velocidad. Tras descongelarlas a 4°C durante 12 horas en la oscuridad, las plantas se devolvieron a sus condiciones originales de crecimiento (ver arriba). La resistencia a congelación se determinó como la capacidad de las plantas para reanudar el crecimiento tras 14 días de recuperación en condiciones control. 45
Como se deduce de los resultados obtenidos, las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen exógeno ADC1 son más resistentes a estrés por bajas temperaturas mostrando, al mismo tiempo, las mismas características fenotípicas que las plantas de tipo silvestre.
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Ejemplo 2: Obtención de plantas transgénicas de tabaco
Discos de hojas de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Burley 21) se transforman con Agrobacterium tumefaciens LBA4404 portador de la construcción de interés tal como se describe en Horsch et al. (cfr. R.B. Horsch et al., “A simple and general method for transferring genes into plants” Science 1985, vol. 227, pp. 1229-1231) . El 55 medio para el desarrollo de yemas contiene sales minerales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg/l de benziladenina (BA, Sigma), 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (NAA, Sigma), 50 mg/l de kanamicina como antibiótico para la selección de células transformadas y 100 mg/l de Claforan para evitar el crecimiento de A. tumefaciens. Tras 6-7 semanas en este medio, se obtienen yemas del tamaño adecuado para ser transferidas a medio de enraizamiento. Las yemas regeneradas se separan y se transfieren a medio de enraizamiento: MS con 50 60 mg/l kanamicina pero sin hormonas (BA, NAA). Las plantas resistentes a kanamicina (3-10 cm alto) se transfieren a substrato con abono y se cultivan en invernadero. Después de 3 meses las plantas están floreciendo y se consigue la autopolinización cubriendo una inflorescencia entera y las yemas con una bolsa de papel. Normalmente, un mes
más tarde las semillas están maduras y pueden utilizarse para germinación. Estas semillas se analizan para segregación por resistencia a kanamicina, y las plantas que son capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizan para posteriores análisis.
Los niveles de expresión de ADC1 en las plantas transgénicas, así como los niveles de putrescina, se determinan en 5 la parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas como se describe en el protocolo de Arabidopsis.
La resistencia a congelación de 3 líneas transgénicas seleccionadas por sus elevados niveles de putrescina se determina como se describe para Arabidopsis.
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Ejemplo 3: Obtención de plantas transgénicas de tabaco
A. Transformación de Nicotiana tabacum
Se introdujo el plásmido pBl121-ADC1, descrito en el ejemplo 1, en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediante el método de transformación por frío. Las bacterias de Agrobacterium se hicieron crecer a 28 °C en un caldo YEB que contenía 100 µg/ml de estreptomicina, 100 µg/ml de rifampicina y 50 µg/ml de kanamicina y en agitación (200 15 rpm). Para la transformación se usó la suspensión bacteriana con un OD600 = 0.80. Las plantas de tabaco transgénicas (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) se generaron mediante el procedimiento de transformación de disco de hoja estándar (cf. Horsch et al. supra). Se sumergieron discos de hojas (0.5 × 0.5 cm2) de plantas de tabaco ésteriles en la suspensión de Agrobacterium, que contenía la construcción pBl121-ADC1, durante 5-10 min con agitación puntual. Los discos de hoja infectados por Agrobacterium se cultivaron en medio MS a 25 °C durante 2 días y se 20 transfirieron a un medio para el desarrollo de yemas, que contiene una mezcla de sales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg/l bencilaminopurina (BAP, Sigma), 0.1 mg/l ácido naftaleno acético (NAA, Sigma), 100 mg/l kanamicina como antibiótico para la selección de células transformadas y 250 mg/l de Claforan con el fin de evitar el crecimiento de A. tumefaciens.. Después de 7-8 semanas en el medio las yemas regeneradas eran de un tamaño adecuado para ser cortadas y transferidas a un medio de desarrollo de yemas: MS con 100 mg/l de 25 kanamicina pero sin hormonas (BAP, NAA).
Las plantas resistentes a kanamicina (de 5-10 cm de altura) se transfirieron a un sustrato con abono y crecieron en un invernadero (plantas T0). Después de 4-5 meses las plantas florecieron y se consiguió la autopolinización cubriendo una inflorescencia entera y los brotes con una bolsa de papel. Aproximadamente un mes más tarde las 30 semillas ya estaban maduras y se pudieron usar en la germinación. Se analizaron estas semillas por segregación de resistencia a kanamicina, y las plantas que fueron capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizaron para posteriores análisis (plantas T1).
Se extrajo el ADN genómico de plantas transgénicas de 5 a 6 semanas, usando Qiagen DNeasy Plant Mini kit, y 35 aproximadamente 50 ng de ADN se usó para la PCR. Las plantas transgénicas putativas se confirmaron por amplificación del ADN genómico con 35S-F (5'- GGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3', SEC ID NO: 9) como cebador sentido diseñado contra la región del promotor de CaMV 35S y ADC1-R (5'- TCCGACTCCCCCGATTTAGA-3', SEC ID NO: 10) como cebador antisentido, diseñado contra el ORF de ADC1.
40 Se obtuvieron un total de 11 líneas transgénicas independientes a partir del cribado de plantas regeneradas resistentes a kanamicina y detección por PCR (FIG. 5). Se analizó la progenie de estas plantas por la segregación de resistencia a kanamicina. Se cultivaron otra vez y se usaron para el análisis aquellas semillas de planta con una proporción de segregación 3:1, que son las que se suponen que tienen una única inserción del transgén.
B. Caracterización de plantas transgénicas 45
B.1. Estimación del nivel de expresión de ADC1 mediante RT-PCR semicuantitativa
Se aisló el RNA total de hojas de plantas de N. tabacum de 3 semanas, transformadas o no con el plásmido pB1121-ADC1, usando el reactivo Trizol (Invitrogen) y tratadas con DNAsa libre de RNasa (Invitrogen). Se usaron dos microgramos de RNA total para la síntesis del ADNc usando el kit de síntesis de primera hebra Superscript III (Invitrogen) con hexámeros aleatorios, a un volumen final de 25 µl. Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo 50 tomando 1 µl de la solución de ADNc en un volumen total de reacción de 20 µl que contenía 0.25 mM de cada dNTP, 1x de tampón para la reacción, 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Takara) y 0.5 µM del par de cebadores adecuados: AtADC1 (directo: 5'-AGAAGCTGGTTCCAAGCCTG-3' SEC ID NO: 11, inverso: 5'-GCTTTCACGA TCACCACGC-3' SEC ID NO: 12) y NtActin (directo: 5'-CATTGGCGCTGAGAGATTCC-3' SEC ID NO: 13, inverso: 5'-GCAGCTTCCATTCCGATCA-3' SEC ID NO: 14). Las condiciones de la PCR para la amplificación consistieron en 55
una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C/30 sec, 62 °C/30 sec y 72 °C/2 min, y finalmente una extensión de 10 min a 72ºC. Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, teñida con bromuro de etidio y se visualizó mediante UV. Se normalizó la expresión usando NtActin como control interno (FIG. 6).
5 El gen ADC1 de Arabidopsis se expresó en las líneas transgénicas, aunque el nivel de expresión varió en cierta medida (FIG. 6). No se observaron fenotipos morfológicos o de crecimiento/desarrollo anormales significativos en las plantas de tabaco que sobre-expresaban el gen ADC1 de Arabidopsis. Se escogieron las líneas transgénicas independientes A1.6, A1.13 y A1.16 para otros estudios por ser las líneas que mostraron unos niveles elevados de expresión de ADC1. 10
B.2 Análisis de poliaminas
Los niveles de PA se determinaron en la parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas de la generación T1 tal y como se describe en el protocolo para Arabidopsis (sección C.2). Puesto que no es una población homogénea, se usó una mezcla de varias plantas (aproximadamente 50) para la extracción y cuantificación de poliaminas. Como se muestra en la FIG. 7, los niveles de putrescina eran más elevados en las líneas transgénicas que en el control, 15 mientras que no se detectaron diferencias significativas en los niveles de espermidina y espermina. A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que la sobre-expresión de ADC1 de Arabidopsis en tabaco induce la acumulación de putrescina.
B.3 Ensayos de tolerancia a frío
Se determinó la tolerancia a frío de 3 líneas transgénicas seleccionadas por su elevada expresión de ADC1 de 20 Arabidopsis (A1.6, A1.13, A1.16) de una manera similar a la descrita para Arabidopsis (sección C.3), pero a una temperatura diferente. Plantas de tres semanas crecidas a 24±1 °C bajo fotoperiodos de día largo (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) se expusieron a 4 °C durante 30 min en la oscuridad y a continuación se bajó la temperatura 2 °C por hora hasta los -3 °C. La temperatura de congelación se mantuvo durante 4 horas, y a continuación se aumentó otra vez a 4 °C. Después de 12h at 4 °C las plantas se volvieron a someter a las condiciones de 25 crecimiento originales, y aquellas plantas capaces de retomar el crecimiento después de dos semanas fueron las consideradas como resistentes.
Como se deriva de los resultados obtenidos (FIG. 8), las plantas transgénicas de tabaco que sobre-expresan el gen ADC1 de Arabidopsis son más resistentes a estrés por congelación que el control, y presentan los mismos rasgos 30 fenotípicos que las plantas silvestres. El porcentaje de supervivencia en las líneas transgénicas es un 10-14% superior que en las plantas control.
Como se ha mencionado en la sección B.2 estos ensayos se llevaron a cabo con plantas procedentes de la generación T1, por esta razón se analizó una gran cantidad de plantas, que significa 6 experimentos independientes 35 con 40-50 plantas de cada línea por experimento. Así, estos resultados son la media de aproximadamente unas 250 plantas por línea. Se esperan diferencias más significativas cuando se use una población de plantas más homogénea (plantas homocigotas). En el caso del tabaco no se observaron diferencias en la tolerancia a frío entre plantas aclimatadas y no aclimatadas.
Ejemplo 4: Obtención de plantas transgénicas de tomate 40
A. Transformación de Licopersicum sculentum
Se introdujo el plásmido pBl121-ADC1 en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediante el método de transformación por frío. Se inoculó una única colonia de A. tumefaciens transformada en 3 ml de medio AB que contenía 100 µg/ml de estreptomicina, 100 µg/ml de rifampicina y 50 µg/ml de kanamicina. Después de 8 h de incubación a 28 °C con agitación (180 rpm), se hizo crecer 1 ml del cultivo de bacterias durante toda la noche, en las 45 mismas condiciones, en 50 ml medio AB medio que contenía los antibióticos mencionados más arriba y glucosa al 2%. Después de eso se centrifugó la suspensión bacteriana a 3000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente y el pellet, resuspendido en MSO a una concentración final con una OD600=0.6, se usó para la transformación de las plantas.
50 Se usaron cotiledones de plantones de tomate de 10- a 12-días (Licopersicum sculentum cv. UC82) crecidos in vitro para la transformación. Se cortaron los cotiledones en dos o tres partes transversales y se inviertieron boca abajo en una construcción de Agrobacterium tumefaciens que contenía la solución diluida de la construcción pB1121-ADC1. Después de 10 min se extrajeron los explantes y se secaron invertidos directamente en papel de filtro estéril de
Whatman colocado directamente encima del medio GCF10 que contenía 375 µM de acetosiringona en placas de Petri y se volvieron a hacer crecer a ambiente en oscuridad durante aproximadamente 48 horas. Después de 48 h de co-cultivo, los cotiledones se transfirieron a un medio GCF10 que contenía 500 µg/ml de carbenicilina y 40µg/ml de kanamicina. Se pusieron los cotiledones invertidos. Se observaron los brotes o callos verdes 3 semanas después de la incubación, demostrando que la transformación fue exitosa. Los callos verdes se transfirieron a un medio 5 GCF11 que contenía 250 µg/ml de carbenicilina y 40 µg/ml de kanamicina.
Después de ocho semanas de cultivo se transfirieron los brotes a un medio TRI2 para que arraigaran suplementado con 250 µg/ml carbenicilina y 25 µg/ml de kanamicina, en cajas Magenta, a 25 °C durante periodos de 8 h con poca luz/16 h de oscuridad. A continuación se extrajeron de las cajas Magenta, plantaron y transfirieron al invernadero. 10
Se confirmó la integración del gen ADC1 de Arabidopsis en el genoma de tomate de plantas To amplificando un fragmento interno de 810 pb mediante PCR, usando el siguiente par de cebadores: ADC1-1 F (5'-CCAGCTTCT GCATTTTCACA-3' SEC ID NO: 15) y ADC1-1R (5'-CCATTGTTGTCCATCTCGTG-3 SEC ID NO: 16). Hasta ahora se han obtenido 3 líneas transgénicas independentes (FIG. 9). 15
Tabla 1. Composición de los diferentes medios
- MEDIO
- MSO TRI1 GCF10 GCF11 TRI2
- Sales de MS
- 4.3 g/L 2.2 g/L 4.3 g/L 4.3 g/L 2.2 g/L
- Tiamina
- 0.4 mg/L 0.2 mg/L 0.4 mg/L 0.5 mg/L 0.2 mg/L
- Mio-Inositol
- 100 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 100 mg/L 50 mg/L
- Glicina
- - - - 2.0 mg/L -
- Piridoxina
- - - 0.5 mg/L 0.5 mg/L -
- Ácido Fólico*
- - - - 0.5 mg/L -
- Biotina*
- - - - 0.05 mg/L -
- Ribósido de Zeatina*
- - - 1.5 mg/L 1.9 mg/L -
- NAA
- - - - - 0.1 mg/L
- IAA
- - 0.2 mg/L 0.2 mg/L - -
- Amcimidol*
- - - - - 0.5 mg/L
- Ácido nicotínico
- - - 0.5 mg/L 4.9 mg/L -
- Sacarosa
- 30 g/L 15 g/L 30 g/L 30 g/L 15 g/L
- Carbenicilina*
- - - 500 mg/L 500 mg/L 250 mg/L
- Kanamicina*
- - - 50±10 mg/L 50±10 mg/L 25 mg/L
- Agar
- - 8 g/L 8 g/L 8 g/L 8 g/L
- pH
- 5.8 5.9 5.9 5.9 5.9
- *(Filtro esterilizado)
Tabla 2. AB (medio de Agrobacterium) 20
- K2HPO4
- 3.0 g/L
- NaH2PO4
- 1.0 g/L
- NH4Cl
- 1.0 g/L
- MgSO4·7H2O
- 0.3 g/L
- KCI
- 0.15 g/L
- CaCl2
- 0.01 g/L
- FeSO4·7H2O
- 2.5 g/L
- Glucosa
- 5.0 g/L
- Bacto-Agar
- 15 g/L
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Método para producir plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende la etapa de transformar células de una planta con una secuencia exógena del gen ADC1 de la arginina descarboxilasa bajo el 5 control de un promotor capaz de funcionar en la planta.
- 2. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de regenerar las plantas a partir de las células transformadas.10
- 3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, donde la secuencia exógena tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEC ID NO: 1;b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la 15 secuencia SEC ID NO: 2;c) una secuencia de nucleótidos que hibrida con SEC ID NO: 1, o una secuencia complementaria de la misma, en condiciones severas y codifica una proteína que tiene actividad arginina descarboxilasa, yd) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína con actividad arginina descarboxilasa, que comprende la secuencia (a) con una o más bases delecionadas, sustituidas, insertadas o añadidas. 20
- 4. Método según la reivindicación 3, donde la secuencia exógena tiene la secuencia SEC ID NO: 1.
- 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de expresión del gen exógeno de la arginina descarboxilasa ADC1 se incrementa en las células transformadas. 25
- 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el nivel de expresión del gen exógeno de la arginina descarboxilasa ADC1 se sobreexpresa en las células transformadas.
- 7. Planta transformada obtenible por el método según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 30
- 8. Uso de la secuencia del gen de la arginina descarboxilasa ADC1 para conferir resistencia a estrés por baja temperatura a una planta.
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