WO2010004070A1 - Planta con resistencia a estrés por bajas temperaturas y método de producción de la misma - Google Patents

Planta con resistencia a estrés por bajas temperaturas y método de producción de la misma Download PDF

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WO2010004070A1
WO2010004070A1 PCT/ES2009/000363 ES2009000363W WO2010004070A1 WO 2010004070 A1 WO2010004070 A1 WO 2010004070A1 ES 2009000363 W ES2009000363 W ES 2009000363W WO 2010004070 A1 WO2010004070 A1 WO 2010004070A1
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plants
sequence
adc1
plant
gene
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PCT/ES2009/000363
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Antonio FERNÁNDEZ TIBURCIO
Teresa Altabella Artigas
Alejandro FERRANDO MONLEÓN
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Universidad De Barcelona
Universitat De València
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to plants that have improved resistance at low temperatures.
  • the present invention describes a method for the production of said plants.
  • plants adapt to different types of environmental stress such as the temperature of their habitat.
  • environmental stress such as the temperature of their habitat.
  • plants are susceptible to heat or cold temperatures when they are exposed to environments above or below their optimum maximum or minimum growth temperature, which leads to their weakness due to The gradual or sudden loss of the physiological functions of the cells.
  • Polyamines a general term applied to aliphatic hydrocarbons with 2 or more primary amino groups, are natural substances ubiquitous in organisms, with more than 20 types discovered so far.
  • Typical polyamines include putrescine, spermidine and spermine.
  • Known enzymes related to the polyamine metabolism involved in the biosynthesis of the aforementioned polyamines include arginine decarboxylase (ADC), ornithine decarboxylase (ODC), S-adenosyl-methionine decarboxylase (SAMDC), spermidine synthase (SPDS), and spermine synthase (SPMS). Recently it has been published that some of the enzymes related to polyamine metabolism are involved in different types of environmental stress.
  • EP 1,329,153 teaches that in plant tissues that exhibit resistance to cold stress, the content of spermidine and spermine is increased.
  • this patent application it is exemplified that by introducing the spermidine synthase gene into a plant, the levels of spermidine and spermine are increased. When the transgenic plant was subjected to low temperatures, it was confirmed that it had greater resistance to cold stress.
  • US patent application 2006/0225154 teaches that the levels of spermidine, spermine and putrescine are increased when a plant is transformed with a spermidine synthase gene. This patent application indicates that the low temperature stress defense can be implemented in the plant by introducing the spermidine synthase gene.
  • ADC1 and ADC2 cfr. Galoway et al., "Phylogenetic utility of the nuclear gene Arginine Decarboxylase: an example from Brassicaceae", Molecular Biology and Evolution, 1998, v. 15, p. 1312-1320).
  • the different functions performed by each of the paralogues have been studied.
  • the inventors of the present invention have found that by introducing a sequence of the ADC1 gene into a plant, the resulting transgenic plant exhibits resistance to low temperature stress.
  • the phenotype of the transgenic plant does not differ from the phenotype of the wild-type plant, as illustrated below.
  • ADC1 gives the plant resistance to stress due to low temperatures and does not affect the phenotype or growth of the transgenic plant.
  • resistance to low temperature stress is achieved by overexpression of the ADC1 gene, regardless of the promoter used for its expression.
  • the construction used to introduce the ADC1 gene into The plant comprised a constitutive promoter other than the orthologous promoter of the gene. Therefore, the inventors of the present invention have found that the relevant factor to confer resistance to stress by low temperatures is the overexpression of the ADC1 gene, regardless of whether the orthologous promoter of ADC1 is present in the construction used to transform the plant.
  • the inventors have discovered that when the ADC1 gene is overexpressed in the plant: a) there is an accumulation of putrescine; b) spermidine levels almost do not change; and c) spermine levels are reduced (levels compared to a wild-type plant).
  • This discovery contravenes the disclosures made in the state of the art using another polyamine synthesis gene (ie the spermidine synthase gene), in which the observed effects were based on an increase in spermidine and / or spermine as a result of an accumulation of putrescine, or a stable production of the polyamines mentioned.
  • the present invention relates to a method of producing plants with improved resistance to stress due to low temperatures, which comprises the passage of the transformation of cells of a plant with an exogenous sequence of the ADC1 gene of the arginine decarboxylase under the control of a promoter capable of operating in the plant.
  • the present invention refers to a transformed plant obtainable by the method defined in accordance with the first aspect of the invention.
  • FIG. 1 Structure of the expression construct that contains the ADC1 putrescine biosynthesis gene under the control of the constitutive promoter CaMV35S.
  • FIG. 2 Relative levels of transcript of the ADC1 putrescine biosynthesis gene in transgenic plants (111, 17, 19) and control (wt).
  • FIG. 3 Polyamine levels in wild-type (wt) Arabidopsis plants and transgenic overexpressors of ADC1 (111, 17, 19).
  • FIG. 4 Tolerance to freezing of wild and transgenic plants. 3-week-old plants were exposed to different freezing temperatures for 6 hours: (A) - 5 0 C (not acclimatized), and (B) -12 0 C (acclimatized to cold). Freezing tolerance was estimated as the percentage of plants that survive each specific temperature after 14 days of recovery under stress-free conditions.
  • FIG. 5 PCR analysis of genomic tobacco DNA prepared from wild-type (C-) yolks and kanamycin-resistant regenerates.
  • FIG. 6 Analysis by reverse transcriptase (RT-PCR) of Arabidopsis ADC1 transcript in T 0 transgenic tobacco plants. Primers specific for ADC1 and Actin were used.
  • FIG. 7 Polyamine levels in wild-type (wt) and transgenic overexpressing plants of the Arabidopsis ADC1 gene (A1.6, A1.13, A1.16).
  • FIG. 8 Freezing resistance of wild-type tobacco plants
  • FIG. 9 PCR analysis of genomic tomato DNA prepared from wild-type and regenerated kanamycin-resistant yolks.
  • FIG. 10 Relative levels of Arabidopsis ADC1 transcript in transgenic tomato plants (847-2, 847-3, 847-4, 847-5) and control (ctrl).
  • plants with improved resistance to low temperature stress are plants in which the growth limitation or damage caused by low temperature stress can be eliminated or reduced.
  • an "exogenous sequence of the ADCf gene can be a gene that encodes the ADC1 enzyme homologous to the host plant (ie, derived from the host plant) that is introduced externally by genetic manipulation.
  • the use of a gene derived from the host encoding the enzyme ADC1 is preferable when considering the identity of the use of codons.
  • the method also comprises the regeneration of the plant from the transformed cells containing the exogenous gene sequence of the ADC1 gene under the control of a promoter capable of functioning in plants.
  • ADC1 gene The complete sequence of the ADC1 gene is available in the GenBank database with the gene reference ID 816149.
  • the coding sequence of the ADC1 gene of the arginine decarboxylase of Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1) is available in the GenBank database. Its access number is NM 127204.
  • the amino acid sequence of the arginine decarboxylase ADC1 (SEQ ID NO: 2) is available in the GenBank database. Your access number is Q9SI64.
  • the exogenous sequence of the ADC1 gene of the arginine decarboxylase is selected from a group consisting of: a) a nucleotide sequence comprising the sequence SEQ ID NO: 1; b) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence comprising the sequence SEQ ID NO: 2; c) a nucleotide sequence that hybridizes with SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof under severe conditions and that encodes a protein with arginine decarboxylase activity, and d) a nucleotide sequence that encodes a protein with arginine decarboxylase activity that It comprises the sequence (a) with one or more deleted, substituted, inserted or added bases.
  • the sequence corresponds to SEQ ID NO: 1.
  • the exogenous sequence of the ADC1 gene can be introduced into the cells by any genetic engineering method. Examples include fusion of protoplasts with heterologous plant cells that have the sequence of the ADC1 gene, infection with plant viruses with the genetically engineered viral genome to express the gene encoding the ADC1 enzyme, or transformation of host plant cells using a vector of expression that contains the gene that encodes the enzyme ADC1.
  • promoters capable of functioning in plants include the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV) that is structurally expressed in plant cells, the promoter of the gene encoding nopaline synthase (NOS), the promoter of the gene which encodes octopine synthase (OCS), the promoter of the gene encoding phenylalanine ammonium lyase (PAL) and the promoter of the gene encoding chalcona synthase (CHS).
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • NOS nopaline synthase
  • OCS octopine synthase
  • PAL phenylalanine ammonium lyase
  • CHS chalcona synthase
  • Other well-known plant promoters are also available in addition to those mentioned.
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91.1) i
  • Temperatures, stress, drought, light, heat, hormones, mechanical damage or the like can be used to express the target gene according to the environment.
  • a specific organ or tissue promoter can also be used to express the target gene only in specific organs or tissues.
  • the expression cassette that includes the gene encoding the ADC1 enzyme can be inserted into the T-DNA region (region that is transferred to the plant's chromosome) in a plasmid Ti or Ri of the cells.
  • binary vector systems are used in the standard transformation methods with Agrobacterium. Examples of commercial binary vectors include plasmids pBI101 and pBI121 (both marketed by Clontech).
  • the Vir region involved in the incorporation of T-DNA has a trans action in the Ti (or Ri) plasmid, in a vector known as a helper plasmid.
  • Examples include the PEG method, in which protoplasts are isolated from plant cells by treatment with an enzyme that degrades the cell wall such as cellulase or hemicellulase, and polyethylene glycol is added to a suspension of protoplasts next to an expression vector which contains the expression cassette of the gene encoding the ADC1 enzyme mentioned above, to incorporate the expression vector in the protoplasts by a process such as endocytosis; the liposome method in which an expression vector is introduced by ultrasonic treatment or the like in lipid membrane vesicles such as phosphatidylcholine, and the vesicles are fused with the protoplasts in the presence of PEG; fusion methods in a similar process using micelles; and by electroporation, in which electrical pulses are applied to a suspension of protoplasts and an expression vector to incorporate the vectors found in the external solution in the protoplasts.
  • PEG method in which protoplasts are isolated from plant cells by treatment with an enzyme that degrades the cell wall such as cellul
  • Processes to introduce the gene of interest in intact cells with cell wall include the direct injection as the microinjection in which a micropipette is inserted into the cells to inject the vector DNA by gas or hydraulic pressure, or the particle cannon method in which metal microparticles covered with DNA are accelerated by the detonation of an explosive or gaseous pressure and in this way they are introduced into the cells, and methods that employ the infection with Agrobacterium.
  • the disadvantages of microinjection are the need for considerable experience and the small number of cells that are manipulated. Therefore, it is more advisable to transform plants with more practical methods such as the Agrobacter ⁇ um method and the particle cannon method.
  • tiny metal balls (usually gold) covered with the DNA of interest are fired directly on the plant cell.
  • the particle cannon method is useful since genes can be introduced directly into the apical meristem of plants while they are cultivated.
  • Agrobacter ⁇ um tumefaciens is a soil bacterium that contains, in addition to its chromosome, an extra circular mini-chromosome called a tumor-inducing plasmid (Ti). Part of the Ti plasmid is transferred to the chromosomes of the host plant where it is integrated (T-DNA).
  • vir virulence
  • Illustrative non-limiting examples of plant cells that can be transformed with the exogenous ADC1 gene according to the first aspect of the invention are cells derived from: calluses, seeds, leaves, stems, branches, roots, root or stem tubers, Flowers and the like.
  • plants that can be transformed with the process according to the first aspect of the invention include, but are not limited to, dicotyledonous, monocotyledonous, herbaceous plants and shrubs.
  • Examples include sweet potatoes, tomatoes, cucumbers, squash, melons, watermelons, tobacco (Nicotinia tabacum), Arabidopsis thaliana, peppers, eggplant, beans, taro, spinach, carrots, strawberries, white potatoes, rice, corn, alfalfa, wheat, barley, soybeans, rapeseed, sorghum, eucalyptus, elm, kenaf, Eucommia ulmoides, sugarcane, beet, cassaya, cica, Chenopodium album, lilies, orchids, carnations, roses, chrysanthemum, petunias, Torenia tenter ⁇ , antirrhinum, cyclamen, gypsohila, geranium, sunflower, Zoisi
  • base sequences with one or more deleted, substituted, inserted or added bases are widely known to those skilled in the art, to sometimes retain physiological activity even when the amino acid sequence of a protein that generally has said physiological activity has one or more amino acids substituted, deleted, inserted or added.
  • the genes that have said modifications and that encode an ADC1 enzyme are included in the scope of the present invention. However, it is essential that said modifications do not result in a loss of activity for the mentioned enzyme.
  • the "severe conditions” referred to herein mean conditions under which only base sequences that encode a polypeptide with ADC1 enzyme activity equivalent to the ADC1 enzyme encoded by a specific gene sequence of the ADC1 enzyme form hybrids with the specific sequence (referred to herein as specific hybrids), and base sequences encoding polypeptides that do not have said equivalent activity do not form hybrids with the specific sequence (referred to herein as non-specific hybrids).
  • specific hybrids base sequences encoding polypeptides that do not have said equivalent activity do not form hybrids with the specific sequence
  • non-specific hybrids One skilled in the art can easily select such conditions by varying the temperature during the hybridization reaction and washing process, the concentration of salts during the hybridization reaction and washing process, and so on.
  • Example 1 Obtaining transgenic Arabidopsis plants
  • the Arabidopsis ADC1 cDNA was amplified by PCR from genomic DNA, using the following primers: direct sense 5'- ATGCCTGCTCTAGCTTTTG-3 '(SEQ ID NO: 3), and reverse direction 5'- ACCGAAATAAGACCAATTC-S 1 (SEQ ID NO: 4).
  • the amplified DNA fragment was cloned into the pGEM vector (Stratagene, Heidelberg) and checked by sequencing.
  • This construction was introduced by electroporation in Agrobacterium tumefaciens C58C1, which was used to transform different plant species, as explained below.
  • Arabidopsis thaliana CoIO plants were transformed with A.tumefaciens, which contained the construction pBI121- / 4DC7 by floral immersion (cf. Clough SJ et al., "Floral dip: a simplified method for / ⁇ gro ⁇ > acter / um-mediated transformation I heard Arabidopsis thaliana ", Plant J., 1998, v. 16, p. 735-743).
  • the seeds produced by these plants were collected and selected in the culture medium of Murashige and Skoog, abbreviated from now on as “MS” (cfr. Murashige T. et al., "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaceous tissue culture ", Physiol.
  • Plant., 1962, v. 15, p. 473-497 which contained 50 mg / I of kanamycin as an antibiotic for the selection of transformants.
  • the progeny of kanamycin-resistant plants was analyzed for the segregation of kanamycin resistance.
  • the seeds of the plants with a 3: 1 segregation ratio were cultivated again and the resulting progeny was analyzed again for the kanamycin resistance segregation to identify homozygous plants for the inserted T-DNA.
  • Three homozygous lines (17, 19 and 111) were selected for further analysis.
  • RNA was obtained from the whole aerial part of Arabidopsis thaliana plants of 4 weeks not transformed (wt) and transformed with plasmid pBI12 ⁇ ADC1 (17, 19, 111) using the TRIzol reagent (lnvitrogen, Carlsbad, CA). A microgram of total RNA was treated with DNase amplification grade (lnvitrogen) to eliminate contamination with genomic DNA. The complementary cDNA strand was obtained with degenerated hexamers using the SuperScript III retrotranscription system (Invitrogen), following the manufacturer's specifications. Real-time RT-PCR with the SYBR Green I marking method was carried out using the first cDNA strand as a template in a sequence detector system (model 7700; Applied Biosystems, Foster, CA).
  • the amplification efficiency of each sample analyzed was determined using the DART-PCR spreadsheet (cf. Peirson SN et al. "Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis", Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, e73), which uses a simple algorithm (cf. Tichopad A. et al., "Standardized determination of real-time PCR efficiencies from a single reaction set-up", Nucleic Acids Res., 2003, v .31, e122.) And the untreated fluorescence data, which allows to obtain comparable results without the need for calibration curves with standards.
  • the amplification efficiencies were calculated for each individual reaction from its amplification profile and checked by ANOVA to detect anomalous samples (outliners) and differences between groups (amplification equivalence) using the same DART-PCR calculation sheet.
  • the initial fluorescence mean (R 0 ) obtained from the average efficiency was normalized using Actin2 mRNA as an internal control in each experiment. These analyzes were carried out twice in independent experiments with very similar results.
  • ADC1 direct sense: 5'- GTGGTGATAAGGGGAACGACA-3 '(SEQ ID NO: 5), reverse direction: 5'- CAACCGAAATAAGACCA-ATTCTCAT-3' (SEQ ID NO: Q )
  • Actinal direct sense: ⁇ '-GATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-S '(SEQ ID NO: 7), reverse direction: 5'-TGGATTCCAGCAGCTT-CCAT-3' (SEQ ID NO: 8).
  • PAs Polyamine analysis Polyamines
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the low temperature treatments were carried out by transferring the plants to growth chambers programmed at 4 ⁇ 1 ° C for different periods of time under the light and photoperiod conditions described above.
  • Freezing tests were performed in a programmable temperature freezer. Plants of 3 weeks not acclimatized or acclimatized to cold (7 days, 4 ° C) were exposed at 4 ° C for 30 min in the dark and then the temperature was lowered 2 ° C per hour. The final freezing temperature (-5 0 C for non-acclimatized, and -11 0 C for cold acclimatized) was maintained for 6 hours, and then the temperature was increased again to 4 0 C at the same speed. After thawing at 4 ° C for 12 hours in the dark, the plants were returned to their original growth conditions (see above). The freezing resistance was determined as Ia ability of plants to resume growth after 14 days of recovery under control conditions.
  • the transgenic plants that overexpress the exogenous ADC1 gene are more resistant to stress due to low temperatures, showing, at the same time, the same phenotypic characteristics as wild-type plants.
  • Example 2 Obtaining transgenic tobacco plants
  • Leaf discs of tobacco plants are transformed with Agrobacter ⁇ um tumefaciens LBA4404 carrying the construction of interest as described in Horsch et al. (cf. R.B. Horsch et al., "A simple and general method for transferring genes into plants” Science 1985, vol. 227, pp. 1229-1231).
  • the medium for the development of yolks contains mineral salts MS (Duchefa, ND), vitamins B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg / I of benziladenine (BA, Sigma), 0.1 mg / l naphthalenacetic acid (NAA, Sigma), 50 mg / l of kanamycin as an antibiotic for the selection of transformed cells and 100 mg / l of Claforan to prevent the growth of A. tumefaciens. After 6-7 weeks in this medium, buds of adequate size are obtained to be transferred to rooting medium. The regenerated yolks are separated and transferred to rooting medium: MS with 50 mg / l kanamycin but without hormones (BA, NAA).
  • Kanamycin-resistant plants (3-10 cm high) are transferred to the substrate with fertilizer and grown in a greenhouse. After 3 months the plants are blooming and self-pollination is achieved by covering an entire inflorescence and the yolks with a paper bag. Normally, one month later the seeds are ripe and can be used for germination. These seeds are analyzed for segregation by resistance to kanamycin, and plants that are capable of growing in the presence of kanamycin are used for further analysis.
  • the levels of ADC1 expression in transgenic plants, as well as putrescine levels, are determined in the aerial part of 4-week tobacco plants as described in the Arabidopsis protocol.
  • the freezing resistance of 3 transgenic lines selected for their High levels of putrescine is determined as described for Arabidopsis.
  • Example 3 Obtaining transgenic tobacco plants
  • Plasmid pBI121 -ADC7 described in example 1 was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by the thermal shock transformation method.
  • the Agrobacteria were grown at 28 0 C with shaking (200 rpm) in YEB medium containing 100 ug / ml streptomycin, 100 ug / ml rifampicin and 50 / ml kanamycin.
  • a bacterial suspension of OD 6 oo 0.80 was used.
  • Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) were generated by the standard procedure of leaf disc transformation (cf. Horsch et al. Supra).
  • Sterile leaf discs (0.5 x 0.5 cm 2 ) of tobacco plants were introduced into an Agrobacterium suspension, which contained the pBI121-ADC1 construct, for 5-10 min with occasional agitation.
  • Discs infected with Agrobacterium leaf grown in MS medium at 25 0 C for 2 days and transferred to medium bud formation containing salt mixture MS (Duchefa, ND), Gamborg B5 Vitamins (Duchefa), 1 mg / l of benzylaminopurine (BAP, Sigma), 0.1 mg / l of naphthalene acetic acid (NAA, Sigma), 100 mg / l of kanamycin as an antibiotic for the selection of transformed cells and 250 mg / l of Claforan to prevent the growth of A tumefaciens After 7-8 weeks in this medium, the regenerated yolks had an adequate size to be cleaved and transferred to rooting medium: MS with 100 mg / l kanamycin but without hormones (BAP, NAA
  • Kanamycin-resistant plants (5-10 cm tall) were transferred to a fertilizer substrate and grew in the greenhouse (To plants). After 5 months the plants were flowering and self-pollination was achieved covering the entire inflorescence and the yolks with paper bags. About a month later the seeds were normally ripe and could be used for germination. These seeds were analyzed for segregation by kanamycin resistance, and plants that were able to grow in the presence of kanamycin were used to subsequent analyzes (T 1 plants).
  • Genomic DNA was extracted from T 0 transgenic plants from 5 to 6 weeks of age, using the Qiagen DNeasy Plant Mini kit, and approximately 50 ng of DNA was used for PCR.
  • Transgenic putative plants were confirmed by amplifying the genomic DNA 35S-F (5'- GGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3 ', SEQ ID NO: 9) as a direct primer, designed against the promoter region CaMV35S, and ADC1-R (5'- TCCGACTCCCCCGATTTAGA- 3 ', SEQ ID NO: 10) as the reverse primer, designed against the ORF of ADC1.
  • PCR amplifications were performed by taking 1 ⁇ l of the cDNA solution in a total reaction volume of 20 ⁇ l containing 0.25 mM of each dNTP, 1x of reaction buffer, 0.5 U of Taq DNA polymerase (Takara) and 0.5 ⁇ M of the pair appropriate primer: AtADCI (direct: 5'- AGAAGCTGGTTCCAAGCCTG-3 'SEQ ID NO: 11, reverse: 5'- GCTTTCACGATCACCACGC-3' SEQ ID NO: 12) and NtActin (direct: 5'- CATTGGCGCTGAGAGATTCC-3 ' NO: 13, reverse: 5'- GCAGCTTCCATTCCGATCA-3 'SEQ ID NO: 14).
  • AtADCI direct: 5'- AGAAGCTGGTTCCAAGCCTG-3 'SEQ ID NO: 11
  • NtActin direct: 5'- CATTGGCGCTGAG
  • PCR conditions for amplification they consisted of an initial denaturation at 95 0 C for 5 min, followed by 35 cycles of 95 ° C / 30 sec, 62 ° C / 30 sec and 72 ° C / 2 min, and finally 10 min extension at 72 0 C.
  • the PCR products were electrophoresed on a 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide and visualized under UV. Expression was normalized using NtActin as an internal control (FIG. 6).
  • the Arabidopsis ADC1 gene was expressed in the transgenic lines, although the level of expression varied somewhat (FIG. 6). In the tobacco plants that overexpressed the Arabidopsis ADC1 gene, no abnormal morphological or growth / development phenotypes were observed. The independent transgenic lines A1.6, A1.13 and A1.16 were selected for further studies because these lines had high levels of ADC1 expression.
  • the PA levels were determined in the aerial part of 4-week-old tobacco plants of the generation " Pi as described in the Arabidopsis protocol (section C.2). Since this is not a homogeneous population, it was used a mixture of several plants (over 50) for the extraction and quantification of polyamines.As shown in FIG. 7, the levels of putrescine in the transgenic lines were higher than in the control plants, while in the spermidine levels and spermine, no significant differences were observed From the results obtained, it can be concluded that in tobacco the overexpression of Arabidopsis ADC1 induces the accumulation of putrescine.
  • the freezing tolerance of the 3 transgenic lines selected for their high expression of Arabidopsis ADC1 was determined in a manner similar to that described for Arabidopsis (section C.3), but at a different temperature 3-week-old plants grown at 24 ⁇ 1 0 C under long day photoperiod (16 hours light / 8 hours dark) were exposed to 4 0 C for 30 min in the dark and then the temperature was lowered 2 0 C per hour up to -3 0 C. The freezing temperature is He held for 4 hours, and then increased again at 4 0 C. After 12 h at 4 0 C the plants were returned to the original conditions of growth, and plants able to resume growth after two weeks were considered resistant .
  • transgenic tobacco plants that overexpress the Arabidopsis ADC1 gene are more resistant to freeze stress, and have the same phenotypic characteristics as wild-type plants.
  • the survival percentage in the transgenic lines is 10-14% higher than in the control plants.
  • Plasmid pB ⁇ 2 ⁇ -ADC1 was introduced into Agrobacter ⁇ um tumefaciens LBA4404 by the thermal shock transformation method.
  • the explants were removed and dried directly, with the beam facing down on Whatman sterile filter paper located directly on GCF10 medium containing 375 ⁇ M acetosyringone in Petri dishes and placed again in a culture chamber in The darkness for approximately 48 hours.
  • the cotyledons were transferred to GCF10 medium containing 500 ⁇ g / ml carbenicillin and 40 ⁇ g / ml kanamycin.
  • the cotyledons were placed with the beam down.
  • After 3 weeks of incubation green corns or buds were seen that indicated the success of the transformation.
  • the green corns were transferred to GCF11 medium containing 250 ⁇ g / ml carbenicillin and 40 ⁇ g / ml kanamycin.
  • ADC1-1 F (5'-CCAGCTTCTGCATTTTCACA-3 'SED ID NO : 15)
  • ADC1-1 R 5'- CCATTGTTGTCCATCTCGTG-3 SEQ ID NO: 16. So far, 3 independent transgenic lines have been obtained (FIG. 9).
  • Mio-lnositol 100 mg / L 50 mg / L 100 mg / L 100 mg / L 50 mg / L
  • RNA was obtained from the aerial part of transformed and non-transformed Licopersicum sculentum plants as described in examples 1 and 2.
  • the relative degree of ADC1 expression was determined by real-time RT-PCR as described in the example. 1 (section C.1). In this case, as an internal control to normalize the results, 18S RNA was used.

Abstract

La presente invención está relacionada con un método de producción de plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, comprendiendo la etapa de transformación de células de una planta con una secuencia del gen exógeno ADC1 de la arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de funcionar en la planta. Las plantas así obtenidas muestran resistencia a estrés por bajas temperaturas sin ser afectado el fenotipo cuando se compara con el fenotipo de las plantas de tipo silvestre.

Description

Planta con resistencia a estrés por bajas temperaturas v método de producción de la misma
La presente invención está relacionada con plantas que tienen resistencia mejorada a bajas temperaturas. Además, Ia presente invención describe un método para Ia producción de dichas plantas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las plantas se adaptan a diferentes tipos de estrés ambiental tales como Ia temperatura de su habitat. Sin embargo, en condiciones de estrés por temperatura, por ejemplo, las plantas son susceptibles al calor o a temperaturas frías cuando están expuestas a ambientes por encima o por debajo de su temperatura óptima de crecimiento máxima o mínima, Io que lleva a su debilidad debida a Ia pérdida gradual o súbita de las funciones fisiológicas de las células.
Se han realizado esfuerzos para ampliar Ia adaptación de las plantas a Ia temperatura mediante procedimientos de mejora tales como Ia selección o cruzamiento con el objeto de utilizar plantas silvestres adaptadas a diferentes temperaturas ambientales como cultivos comestibles, plantas de horticultura, y similares. El período en el que pueden cultivarse verduras, flores y plantas ornamentales, árboles frutales y similares se ha expandido mediante estos procedimientos de mejora, así como mediante horticultura protegida.
Las poliaminas, término general aplicado a hidrocarburos alifáticos con 2 o más grupos amino primarios, son sustancias naturales ubicuas en los organismos, con más de 20 tipos descubiertos hasta el momento. Las poliaminas típicas incluyen Ia putrescina, Ia espermidina y Ia espermina. Las enzimas conocidas relacionadas con el metabolismo de poliaminas implicadas en Ia biosíntesis de las poliaminas mencionadas incluyen Ia arginina descarboxilasa (ADC), Ia ornitina descarboxilasa (ODC), Ia S- adenosil-metionina descarboxilasa (SAMDC), Ia espermidina sintasa (SPDS), y Ia espermina sintasa (SPMS). Recientemente se ha publicado que algunas de las enzimas relacionadas con el metabolismo de poliaminas están implicadas en diferentes tipos de estrés ambiental. La solicitud de patente europea EP 1.329.153 enseña que en tejidos vegetales que exhiben resistencia a estrés por frío, se incrementa el contenido de espermidina y espermina. En esta solicitud de patente se ejemplifica que introduciendo el gen de Ia espermidina sintasa en una planta, se incrementan los niveles de espermidina y espermina. Cuando Ia planta transgénica se sometió a bajas temperaturas, se confirmó que tenía mayor resistencia a estrés por frío.
La solicitud de patente de número US 2006/0225154 enseña que los niveles de espermidina, espermina y putrescina están incrementados cuando una planta se transforma con un gen espermidina sintasa. Esta solicitud de patente indica que Ia defensa a estrés por bajas temperaturas puede ser implementada en Ia planta introduciendo el gen de Ia espermidina sintasa.
Respecto a Ia utilización del gen ADC para conferir resistencia a estrés por frío en plantas, es destacable el hecho de que en Ia familia de las Brassicaceae, el gen ADC parece estar duplicado, dando lugar así a dos parálogos, denominados generalmente ADC1 y ADC2 (cfr. Galoway et al., "Phylogenetic utility of the nuclear gene Arginine Decarboxylase: an example from Brassicaceae", Molecular Biology and Evolution, 1998, v. 15, p.1312- 1320). Se han estudiado las diferentes funciones desempeñadas por cada uno de los parálogos.
En Hummel I. et al. (cfr. Hummel etal, "Differetlal expresión oí ARGININE DECARBOXYLASE ADC1 y ADC2 in Arabidopsis thaliana: characterization of transcriptional regulation during seed germination and seedllng development", New Phytologist, 2004, v. 163, p. 519-531), se estudiaron las actividades de los promotores de ADCI y ADC2 en plantas transformadas de forma estable. En este estudio, se demostró que el frío tenía un poderoso efecto en Ia actividad de los promotores de ADC1 y ADC2. Se concluyó que en Arabidopsis Ia respuesta de poliaminas al frío se demuestra que correlaciona con Ia activación transcripcional del promotor del gen ADCI.
En Alcázar eí al. (Alcázar et al., "Overexpression of ADC2 in Arabidopsis induces dwarfism and late-flowering through GA deficiency", The Plant Journal, 2005, v. 43, p. 425-436) se generó una planta transgénica de Arabldopsis. La planta transgénica sobreexpresaba el gen ADC2, dando lugar a una acumulación de putrescina, sin afectar los niveles de espermidina o espermina. Además, las plantas sobreexpresoras de ADC2 mostraron enanismo y retraso en Ia floración.
A pesar de los esfuerzos previos realizados en el estado de Ia técnica, Ia búsqueda de nuevas plantas con resistencia mejorada a estrés y de métodos para su obtención es todavía un campo activo.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de Ia presente invención han encontrado que introduciendo en una planta una secuencia del gen ADC1, Ia planta transgénica resultante presenta resistencia a estrés por baja temperatura. Además, el fenotipo de Ia planta transgénica no difiere del fenotipo de Ia planta de tipo silvestre, tal como se ¡lustra más abajo.
En Alcázar et al. (ver más arriba), se describió que sobreexpresando el gen ADC2 (el parálogo del gen ADC1), Ia planta transgénica resultante experimentaba cambios en su fenotipo (tales como enanismo) y en su crecimiento (retraso en Ia floración).
Por otra parte, en Hummel I. et al. (ver más arriba) se menciona que el efecto del frío estaba correlacionado con cambios en los niveles de RNAm, y era coherente con Ia presencia específica de dos copias de un elemento de respuesta a bajas temperaturas en el promotor de ADC1 y con el impacto potencial del elemento transponible en Ia expresión del gen, ya que una copia de este elemento de respuesta a temperaturas bajas forma parte del elemento transponible de ADC1.
Sorprendentemente, se encontró que Ia sobreexpresión de ADC1 confiere a Ia planta resistencia a estrés por las bajas temperaturas y no afecta al fenotipo o crecimiento de Ia planta transgénica.
Además, y tal como se ilustra más abajo, Ia resistencia a estrés por bajas temperaturas se consigue por sobreexpresión del gen ADC1, independientemente del promotor utilizado para su expresión. Tal como se muestra más abajo, Ia construcción utilizada para introducir el gen ADC1 en Ia planta comprendía un promotor constitutivo distinto al promotor ortólogo del gen. Por tanto, los inventores de Ia presente invención han encontrado que el factor relevante para conferir resistencia a estrés por bajas temperaturas es Ia sobreexpresión del gen ADC1, independientemente de si el promotor ortólogo de ADC1 está presente en Ia construcción utilizada para transformar Ia planta.
Por otra parte, los inventores han descubierto que cuando el gen ADC1 se sobreexpresa en Ia planta: a) hay una acumulación de putrescina; b) los niveles de espermidina casi no cambian; y c) los niveles de espermina se reducen (niveles comparados con una planta de tipo silvestre). Este descubrimiento contraviene las divulgaciones realizadas en el estado de Ia técnica utilizando otro gen de síntesis de poliaminas (i.e. el gen espermidina sintasa), en el que los efectos observados se basaban en un incremento de espermidina y/o espermina como consecuencia de una acumulación de putrescina, o una producción estable de las poliaminas mencionadas.
Así, en un primer aspecto Ia presente invención se refiere a un método de producción de plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende el paso de Ia transformación de células de una planta con una secuencia exógena del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de funcionar en Ia planta.
Los inventores creen que las plantas transgénicas resultantes no presentan alteraciones en su desarrollo debido a Ia diferente localización subcelular de ADC1 , incrementándose Ia productividad y el rendimiento, en comparación con las que sobreexpresan ADC2.
En un segundo aspecto, Ia presente invención se refiere a una planta transformada obtenible por el método definido de acuerdo con en el primer aspecto de Ia invención.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 : Estructura de Ia construcción de expresión que contiene el gen de Ia biosíntesis de putrescina ADC1 bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S.
FIG. 2: Niveles relativos de transcrito del gen de Ia biosíntesis de putrescina ADC1 en plantas trasgénicas (111 , 17, 19) y control (wt).
FIG. 3: Niveles de poliaminas en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre (wt) y transgénicas sobreexpresoras de ADC1 (111 , 17, 19).
FIG. 4: Tolerancia a Ia congelación de plantas de tipo silvestre y transgénicas. Plantas de 3 semanas de edad se expusieron a diferentes temperaturas de congelación durante 6 horas: (A)- 50C (no aclimatadas), y (B) -120C (aclimatadas al frío). La tolerancia a Ia congelación se estimó como el porcentaje de plantas que sobreviven a cada temperatura específica después de 14 días de recuperación en condiciones de ausencia de estrés.
FIG. 5: Análisis por PCR del DNA genómico de tabaco preparado a partir de yemas de tipo silvestre (C-) y regeneradas resistentes a kanamicina. M marcador DNA λ digerido con Pstl. C+ plásmido pBI121-ADC1 , A1.1-A1.16 líneas resistentes a kanamicina.
FIG. 6: Análisis por transcriptasa reversa (RT-PCR) del transcrito ADC1 de Arabidopsis en plantas transgénicas de tabaco T0. Se utilizaron cebadores específicos para ADC1 y Actina.
FIG. 7: Niveles de poliaminas en plantas de tobaco de tipo silvestre (wt) y transgénicas sobreexpresoras del gen ADC1 de Arabidopsis (A1.6, A1.13, A1.16).
FIG. 8: Resistencia a congelación de plantas de tabaco de tipo silvestre y
; HOJA RECTIFICADA (REGLA 91.1) i
W r i. -> transgénicas. Se expusieron plantas de tres semanas de edad a -3 0C durante 4 h. La resistencia a congelación se determinó como el porcentaje de plantas que sobrevivieron después de 14 días de recuperación en condiciones de ausencia de estrés.
FIG. 9: Análisis por PCR del DNA genómico de tomate preparado a partir de yemas de tipo silvestre y regeneradas resistentes a kanamicina.
FIG. 10: Niveles relativos de transcrito ADC1 de Arabidopsis en plantas de tomate transgénicas (847-2, 847-3, 847-4, 847-5) y control (ctrl).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PARTICULARES
En Ia presente invención "plantas con resistencia mejorada a estrés por temperaturas bajas" son plantas en las que Ia limitación de crecimiento o el daño ocasionados por el estrés por bajas temperaturas puede eliminarse o reducirse.
Como se usa aquí, 'exógeno', indica que no es intrínseco a Ia planta sino que se ha introducido externamente. De este modo, una "secuencia exógena del gen ADCf puede ser un gen que codifica Ia enzima ADC1 homólogo a Ia planta huésped (es decir, derivado de Ia planta huésped) que se introduce externamente por manipulación genética. El uso de un gen derivado del huésped que codifica Ia enzima ADC1 es preferible al considerar Ia identidad del uso de codones.
En una realización del primer aspecto de Ia invención, el método además comprende Ia regeneración de Ia planta a partir de las células transformadas que contienen Ia secuencia génica exógena del gen ADC1 bajo el control de un promotor capaz de funcionar en plantas.
La secuencia completa del gen ADC1 está disponible en Ia base de datos GenBank con Ia referencia génica ID 816149.
La secuencia codificante del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1) está disponible en Ia base de datos GenBank. Su número de acceso es NM 127204. La secuencia de aminoácidos de Ia arginina descarboxilasa ADC1 (SEQ ID NO: 2) está disponible en Ia base de datos GenBank. Su número de acceso es Q9SI64.
En otra realización del primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia exógena del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa se selecciona de un grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 2; c) una secuencia de nucleótidos que híbrida con Ia SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de Ia misma en condiciones severas y que codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa, y d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa que comprende Ia secuencia (a) con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas. Preferiblemente, Ia secuencia corresponde a Ia SEQ ID NO: 1.
La secuencia exógena del gen ADC1 puede ser introducida en las células por cualquier método de ingeniería genética. Ejemplos incluyen fusión de protoplastos con células vegetales heterólogas que tienen Ia secuencia del gen ADC1 , infección con virus de plantas con el genoma viral manipulado genéticamente para expresar el gen que codifica Ia enzima ADC1 , o transformación de células de Ia planta huésped usando un vector de expresión que contiene el gen que codifica Ia enzima ADC1.
Ejemplos de promotores capaces de funcionar en plantas incluyen el promotor 35S del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV) que se expresa de forma estructural en las células vegetales, el promotor del gen que codifica Ia nopalina sintasa (NOS), el promotor del gen que codifica Ia octopina sintasa (OCS), el promotor del gen que codifica Ia fenilalanína amonio liasa (PAL) y el promotor del gen que codifica Ia chalcona sintasa (CHS). También hay disponibles otros promotores de plantas bien conocidos además de los mencionados.
No sólo promotores que se expresan constitutivamente en todos los órganos como el promotor 35S, sino también promotores regulados por bajas
, HOJA RECTIFICADA (REGLA 91.1) i temperaturas, estrés, sequía, luz, calor, hormonas, daño mecánico o similar pueden utilizarse para expresar el gen diana de acuerdo con el medio ambiente. Por ejemplo, se puede utilizar un gen que codifica Ia enzima ADC1 y un promotor que active su transcripción sólo cuando Ia planta se expone a bajas temperaturas, para controlar el metabolismo de poliaminas de Ia planta sólo en condiciones de bajas temperaturas y así mejorar Ia resistencia a estrés por bajas temperaturas. Un promotor específico de órgano o tejido también puede utilizarse para expresar el gen diana sólo en órganos o tejidos específicos.
Cuando Ia secuencia del gen exógeno ADC1 se introduce por infección con Agrobacterium tumefaciens, el cásete de expresión que incluye el gen que codifica Ia enzima ADC1 puede insertarse en Ia región T-DNA (región que se transfiere al cromosoma de Ia planta) en un plásmido Ti o Ri de las células. En Ia actualidad se utilizan sistemas de vectores binarios en los métodos de transformación estándar con Agrobacterium. Ejemplos de vectores binarios comerciales incluyen los plásmidos pBI101 y pBI121 (ambos comercializados por Clontech). La región Vir implicada en Ia incorporación del T-DNA tiene acción en trans en el plásmido Ti (o Ri), en un vector conocido como plásmido de ayuda o 'helper'.
Para Ia transformación de plantas pueden utilizarse varios métodos conocidos convencionales. Ejemplos incluyen el método del PEG, en el que los protoplastos se aislan de células vegetales por tratamiento con un enzima que degrada Ia pared celular como Ia celulasa o Ia hemicelulasa, y se añade el polietilenglicol a una suspensión de protoplastos junto a un vector de expresión que contiene el cásete de expresión del gen que codifica Ia enzima ADC1 mencionado antes, para incorporar el vector de expresión en los protoplastos por un proceso como Ia endocitosis; el método de liposomas en el que un vector de expresión se introduce por tratamiento de ultrasonidos o similar en vesículas de membranas lipídicas como fosfatidilcolina, y las vesículas se fusionan con los protoplastos en presencia de PEG; métodos de fusión en un proceso similar utilizando micelas; y por electroporación, en el que se aplican pulsos eléctricos a una suspensión de protoplastos y un vector de expresión para incorporar los vectores que se encuentran en Ia solución externa en los protoplastos. Sin embargo, estos métodos son complejos puesto que requieren técnicas de cultivo para Ia re-diferenciación de los protoplastos en plantas. Procesos para introducir el gen de interés en células intactas con pared celular incluyen Ia inyección directa como Ia microinyección en Ia que una micropipeta se inserta en las células para inyectar el DNA del vector por presión a gas o hidráulica, o el método del cañón de partículas en el que se aceleran micropartículas de metal cubiertas con DNA por Ia detonación de un explosivo o presión gaseosa y de esta forma se introducen en las células, y métodos que emplean Ia infección con Agrobacteríum. Los inconvenientes de Ia microinyección son la necesidad de una experiencia considerable y el pequeño número de células que se manipulan. Por ello es más aconsejable transformar plantas con métodos más prácticos tales como el método Agrobacteríum y el método del cañón de partículas. En el método del cañón de partículas, bolas diminutas de metal (normalmente oro) cubiertas con el DNA de interés se disparan directamente sobre Ia célula vegetal. El método del cañón de partículas es útil ya que los genes pueden ser introducidos directamente en el meristemo apical de las plantas mientras son cultivadas. Agrobacteríum tumefaciens es una bacteria del suelo que contiene, además de su cromosoma, un minicromosoma extra circular denominado plásmido inductor de tumores (Ti). Parte del plásmido Ti se transfiere a los cromosomas de Ia planta huésped donde queda integrado (T-DNA). Varios loci génicos del cromosoma bacteriano y un grupo de genes de virulencia (vir) localizados en el plásmido Ti codifican para funciones que intervienen en el reconocimiento de Ia célula vegetal y su unión, así como en Ia excisión, transferencia e integración del T-DNA en el genoma de Ia planta. En general el método de Agrobacteríum está más aceptado que el cañón de partículas por Ia mayor frecuencia de inserciones únicas en el DNA foráneo, siendo más fácil su monitorización.
Ejemplos ilustrativos no limitantes de células vegetales que pueden ser transformadas con el gen exógeno ADC1 de acuerdo con el primer aspecto de Ia invención, son las células derivadas de: callos, semillas, hojas, tallos, sarmientos, raíces, tubérculos de raíz o tallo, flores y similares.
Ejemplos de plantas que pueden ser transformadas con el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de Ia invención incluyen, pero no están limitadas a, dicotiledóneas, monocotiledóneas, plantas herbáceas y arbustos. Ejemplos incluyen patatas dulces, tomates, pepinos, calabaza, melones, sandías, tabaco (Nicotinia tabacum), Arabidopsis thaliana, pimientos, berenjena, judías, taro, espinaca, zanahorias, fresas, patatas blancas, arroz, maíz, alfalfa, trigo, cebada, soja, colza, sorgo, Eucaliptos, olmo, kenaf, Eucommia ulmoides, caña de azúcar, remolacha, cassaya, cica, Chenopodium álbum, lirios, orquídeas, claveles, rosas, crisantemo, petunias, Torenia fournierí, antirrhinum, ciclamen, gypsohila, geranio, girasol, Zoisia japónica, algodón, hongos matsutake, hongos shiitake, champiñones, ginseng, frutos cítricos, bananas y kiwi.
Las "secuencias de base con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas" aquí referidas, son ampliamente conocidas para aquellas personas expertas en Ia materia, para retener algunas veces actividad fisiológica incluso cuando Ia secuencia de aminoácidos de una proteína que generalmente tiene dicha actividad fisiológica tiene uno o más aminoácidos sustituidos, deleccionados, insertados o añadidos. Los genes que tienen dichas modificaciones y que codifican una enzima ADC1 están incluidos en el ámbito de Ia presente invención. Sin embargo, es esencial que dichas modificaciones no resulten en una pérdida de actividad para Ia enzima mencionada.
Las "condiciones severas" aquí referidas, significan condiciones bajo las cuales sólo secuencias de bases que codifican un polipéptido con actividad enzimática ADC1 equivalente a Ia enzima ADC1 codificada por una secuencia génica específica de Ia enzima ADC1 forma híbridos con Ia secuencia específica (referido aquí como híbridos específicos), y secuencias de bases que codifican polipéptidos que no tienen dicha actividad equivalente no forman híbridos con Ia secuencia específica (referidos aquí como híbridos no específicos). Un experto en Ia materia puede seleccionar fácilmente tales condiciones variando Ia temperatura durante Ia reacción de hibridación y proceso de lavado, Ia concentración de sales durante reacción de hibridación y proceso de lavado, y así otras cosas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Obtención de plantas transqénicas de Arabidopsis
A. Construcción del Plásmido El cDNA de ADC1 de Arabidopsis se amplificó por PCR a partir de DNA genómico, utilizando los siguientes cebadores: sentido directo 5'- ATGCCTGCTCTAGCTTTTG-3' (SEQ ID NO: 3), y sentido inverso 5'- ACCGAAATAAGACCAATTC-S1 (SEQ ID NO: 4). El fragmento de DNA amplificado se clonó en el vector pGEM (Stratagene, Heidelberg) y se comprobó por secuenciación. La construcción que contiene el cDNA de ADC1, flanqueado por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV35S) y el terminador de Ia nopalina sintasa (NOS), en un vector binario (pBI121-/4DC7), se obtuvo reemplazando el gen GUS Smal/Sacl en el vector pBI121 (cfr. Chen et al., "Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning t-DNA ¡nsertion from transgenic plants", Molecular Breeding, 2003, v. 11 , p. 289-293; accession number AF485783), por el cDNA de ADOI, como un fragmento Xbal/Xbal (2.6 kb). Esta construcción se introdujo por electroporación en Agrobacterium tumefaciens C58C1 , que se utilizó para transformar diferentes especies vegetales, tal como se explica más abajo.
S. Transformación de Arabidopsis thaliana
Plantas de Arabidopsis thaliana CoIO se transformaron con A.tumefaciens, que contenía Ia contrucción pBI121-/4DC7 por inmersión floral (cfr. Clough S. J. et al., "Floral dip: a simplified method for/\gro¿>acter/um-mediated transformation oí Arabidopsis thaliana", Plant J., 1998, v. 16, p. 735-743). Las semillas producidas por estas plantas se recolectaron y se seleccionaron en medio de cultivo de Murashige and Skoog, abreviado a partir de ahora como "MS" (cfr. Murashige T. et al., "A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue culture", Physiol. Plant., 1962, v. 15, p. 473- 497), que contenía 50 mg/I de kanamicina como antibiótico para Ia selección de los transformantes. La progenie de las plantas resistentes a kanamicina se analizó para Ia segregación de resistencia a kanamicina. Las semillas de las plantas con una proporción de segregación 3:1 se cultivaron de nuevo y Ia progenie resultante se analizó de nuevo para Ia segregación de resistencia a kanamicina para identificar plantas homocigotas para el T-DNA insertado. Se seleccionaron tres líneas homocigotas (17, 19 e 111) para posteriores análisis.
C. Caracterización de las plantas transgénicas C.1. Estimación de RNAm de ADC1 por RT-PCR a tiempo real
El RNA total se obtuvo de toda Ia parte aérea de plantas de Arabidopsis thaliana de 4 semanas no transformadas (wt) y transformadas con el plásmido pBI12ΛADC1 (17, 19, 111) utilizando el reactivo TRIzol (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Un microgramo de RNA total se trató con DNasa de grado amplificación (lnvitrogen) para eliminar Ia contaminación con DNA genómico. La hebra complementaria de cDNA se obtuvo con hexámeros degenerados utilizando el sistema de retrotranscripción SuperScript III (Invitrogen), siguiendo las especificaciones del fabricante. La RT-PCR a tiempo real con el método de mareaje SYBR Green I se llevó a cabo utilizando Ia primera hebra de cDNA como molde en un sistema detector de secuencias (modelo 7700; Applied Biosystems, Foster, CA). La eficiencia de Ia amplificación de cada muestra analizada se determinó utilizando Ia hoja de cálculo DART-PCR (cfr. Peirson S. N. et al. "Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis", Nucleic Acids Res., 2003, v. 31 , e73), que utiliza un algoritmo simple (cfr. Tichopad A. et al., "Standardized determination of real-time PCR efficieney from a single reaction set-up", Nucleic Acids Res., 2003, v. 31 , e122.) y los datos de fluorescencia sin tratar, Io cual permite obtener resultados comparables sin necesidad de curvas de calibración con patrones. Las eficiencias de amplificación se calcularon para cada reacción individual a partir de su perfil de amplificación y se comprobaron por ANOVA para detectar muestras anómalas (outliners) y diferencias entre grupos (equivalencia de amplificación) utilizando Ia misma hoja de calculo DART-PCR. La media de fluorescencia inicial (R0) obtenida a partir de Ia eficiencia media se normalizó utilizando RNAm de Actina2 como control interno en cada experimento. Estos análisis se llevaron a cabo dos veces en experimentos independientes con resultados muy similares. Se utilizaron los siguiente juegos de cebadores específicos para cada gen: ADC1 (sentido directo: 5'- GTGGTGATAAGGGGAACGACA-3' (SEQ ID NO: 5), sentido inverso: 5'- CAACCGAAATAAGACCA-ATTCTCAT-3' (SEQ ID NO: Q)), y Actinal (sentido directo: δ'-GATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-S' (SEQ ID NO: 7), sentido inverso: 5'-TGGATTCCAGCAGCTT-CCAT-3' (SEQ ID NO: 8).
C.2. Análisis de poliaminas Las poliaminas (PAs) se analizaron por separación de los derivados de PAs con cloruro de dansilo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los métodos de extracción y determinación se habían descrito previamente (cfr. Mareé M. eí al., "Rapid high-perfomance liquid chromatographic method for quantitation of polyamines as their dansyl derivatives: Application to plant and animal tissues", J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 1995, v. 666, p. 329-33).
Como se muestra en Ia FIG. 3, los niveles de putrescina en las plantas transgénicas están incrementados, mientras que Ia espermidina no está afectada y el nivel de espermina está reducido. A partir de estos resultados, se puede concluir que Ia sobreexpresión de ADC1 incrementa Ia acumulación de putrescina.
C.3. Ensayos de congelación
En este ensayo se utilizaron plantas de 3 semanas (wt, 17, 19, 111). Para obtener las plantas, las semillas se sembraron en macetas que contenían una mezcla de tierra y vermiculita (3:1 v/v), se regaron con agua y una solución mineral de Hogland, y crecieron a 21±1°C en fotoperíodos de día neutro (12 horas de luz fluorescente blanca fría, flujo de fotones de 70-90 μmol m"2 seg'1).
Los tratamientos a bajas temperaturas se llevaron a cabo transfiriendo las plantas a cámaras de crecimiento programadas a 4±1°C durante diferentes períodos de tiempo en las condiciones de luz y fotoperíodo descritas más arriba.
Los ensayos de congelación se realizaron en un congelador de temperatura programable. Plantas de 3 semanas no-aclimatadas o aclimatadas a frío (7 días, 4°C) se expusieron a 4°C durante 30 min en Ia oscuridad y a continuación se bajó Ia temperatura 2°C por hora. La temperatura final de congelación (-50C para no aclimatadas, y -110C para aclimatadas a frío) se mantuvo durante 6 horas, y luego se incrementó de nuevo Ia temperatura hasta 40C a Ia misma velocidad. Tras descongelarlas a 4°C durante 12 horas en Ia oscuridad, las plantas se devolvieron a sus condiciones originales de crecimiento (ver arriba). La resistencia a congelación se determinó como Ia capacidad de las plantas para reanudar el crecimiento tras 14 días de recuperación en condiciones control.
Como se deduce de los resultados obtenidos, las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen exógeno ADC1 son más resistentes a estrés por bajas temperaturas mostrando, al mismo tiempo, las mismas características fenotípicas que las plantas de tipo silvestre.
Ejemplo 2: Obtención de plantas transαénicas de tabaco
Discos de hojas de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Burley 21 ) se transforman con Agrobacteríum tumefaciens LBA4404 portador de Ia construcción de interés tal como se describe en Horsch et al. (cfr. R.B. Horsch et al., "A simple and general method for transferring genes into plants" Science 1985, vol. 227, pp. 1229-1231) . El medio para el desarrollo de yemas contiene sales minerales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg/I de benziladenina (BA, Sigma), 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (NAA, Sigma), 50 mg/l de kanamicina como antibiótico para Ia selección de células transformadas y 100 mg/l de Claforan para evitar el crecimiento de A. tumefaciens. Tras 6-7 semanas en este medio, se obtienen yemas del tamaño adecuado para ser transferidas a medio de enraizamiento. Las yemas regeneradas se separan y se transfieren a medio de enraizamiento: MS con 50 mg/l kanamicina pero sin hormonas (BA, NAA). Las plantas resistentes a kanamicina (3-10 cm alto) se transfieren a substrato con abono y se cultivan en invernadero. Después de 3 meses las plantas están floreciendo y se consigue Ia autopolinización cubriendo una inflorescencia entera y las yemas con una bolsa de papel. Normalmente, un mes más tarde las semillas están maduras y pueden utilizarse para germinación. Estas semillas se analizan para segregación por resistencia a kanamicina, y las plantas que son capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizan para posteriores análisis.
Los niveles de expresión de ADC1 en las plantas transgénicas, así como los niveles de putrescina, se determinan en Ia parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas como se describe en el protocolo de Arabidopsis.
La resistencia a congelación de 3 líneas transgénicas seleccionadas por sus elevados niveles de putrescina se determina como se describe para Arabidopsis.
Ejemplo 3: Obtención de plantas transαénicas de tabaco
A. Transformación de Nicotiana tabacum
El plásmido pBI121 -ADC7 descrito en el ejemplo 1 se introdujo en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por el método de transformación de choque térmico. Los Agrobacteria se cultivaron a 28 0C con agitación (200 rpm) en medio YEB que contenía 100 μg/ml de estreptomicina, 100 μg/ml de rifampicina y 50 μg/ml de kanamicina. Para Ia transformación se utilizó una suspensión bacteriana de OD6oo = 0.80. Las plantas transgénicas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) se generaron por el procedimiento estándar de transformación del disco de hoja (cfr. Horsch et al. supra). Se introdujeron discos de hoja estériles (0.5 x 0.5 cm2) de plantas de tabaco en una suspensión de Agrobacterium, que contenía Ia construcción pBI121-ADC1 , durante 5-10 min con agitación ocasional. Los discos de hoja infectados con Agrobacterium se cultivaron en medio MS a 25 0C durante 2 días y se transfirieron a medio de formación de yemas, que contiene mezcla de sales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg (Duchefa), 1 mg/l de benzilaminopurina (BAP, Sigma), 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (NAA, Sigma), 100 mg/l de kanamicina como antibiótico para Ia selección de células transformadas y 250 mg/l de Claforan para evitar el crecimiento de A. tumefaciens. Tras 7-8 semanas en este medio, las yemas regeneradas tenían un tamaño adecuado para ser escindidas y transferidas a medio de enraizamiento: MS con 100 mg/l de kanamicina pero sin hormonas (BAP, NAA).
Las plantas resistentes a kanamicina (5-10 cm de alto) se transfirieron a un sustrato de abono y crecieron en el invernadero (plantas To). Transcurridos A- 5 meses las plantas estaban florecidas y se consiguió Ia autopolinización cubriendo Ia inflorescencia entera y las yemas con bolsas de papel. Aproximadamente un mes más tarde las semillas estaban normalmente maduras y podían ser utilizadas para germinación. Estas semillas fueron analizadas para segregación por resistencia a kanamicina, y las plantas que fueron capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizaron para posteriores análisis (plantas T1).
El DNA genómico se extrajo de plantas transgénicas T0 de 5 a 6 semanas de edad, utilizando el kit Qiagen DNeasy Plant Mini, y aproximadamente 50 ng de DNA fueron utilizados para PCR. Las plantas putativas transgénicas se confirmaron amplificando el DNA genómico 35S-F (5'- GGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3', SEQ ID NO: 9) como cebador directo, diseñado frente a Ia región promotora CaMV35S, y ADC1-R (5'- TCCGACTCCCCCGATTTAGA-3', SEQ ID NO: 10) como el cebador reverso, diseñado frente a Ia ORF de ADC1.
A partir del cribado de plantas regeneradas resistentes a kanamicina y Ia detección por PCR se obtuvieron un total de 11 líneas transgénicas independientes (FIG. 5). La progenie de estas plantas se analizó para segregación por resistencia a kanamicina. Las semillas de plantas con una proporción de segregación 3:1 , que se suponía que tenían una sola inserción del transgen, se cultivaron posteriormente y se utilizaron para análisis.
B. Caracterización de las plantas transgénicas
B.1. Estimación del nivel de expresión de ADC1 por RT-PCR semi- cuantitativa
El RNA total se aisló a partir de hojas de plantas de N. tabacum de 3 semanas de edad, transformadas o no con el plásmido pBI121-ADC1 , utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) y se trató con DNAsa libre de RNasa (Invitrogen). Se utilizaron dos microgramos de RNA total para Ia síntesis de cDNA utilizando el kit "Superscript III first-strand synthesis" (Invitrogen) con hexámeros degenerados, en un volumen final de 25 μl. Las amplificaciones por PCR se realizaron tomando 1 μl de Ia solución de cDNA en un volumen total de reacción de 20 μl conteniendo 0.25 mM de cada dNTP, 1x de tampón de reacción, 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Takara) y 0.5 μM del par apropiado de cebadores: AtADCI (directo: 5'- AGAAGCTGGTTCCAAGCCTG-3' SEQ ID NO: 11 , reverso: 5'- GCTTTCACGATCACCACGC-3' SEQ ID NO: 12) y NtActin (directo: 5'- CATTGGCGCTGAGAGATTCC-3' SEQ ID NO: 13, reverso: 5'- GCAGCTTCCATTCCGATCA-3' SEQ ID NO: 14). Las condiciones de PCR para la amplificación consistieron en una desnaturalización inicial a 95 0C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 95 °C/30 seg, 62 °C/30 seg y 72 °C/2 min, y finalmente 10 min de extensión a 72 0C. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo UV. La expresión se normalizó utilizando NtActin como control interno (FIG. 6).
El gen ADC1 de Arabidopsis se expresó en las líneas transgénicas, aunque el nivel de expresión varió en alguna medida (FIG. 6). En las plantas de tabaco que sobreexpresaban el gen ADC1 de Arabidopsis no se observaron fenotipos morfológicos ni de crecimiento/desarrollo anormales. Las líneas transgénicas independientes A1.6, A1.13 y A1.16 se seleccionaron para estudios posteriores porque estas líneas presentaban elevados niveles de expresión de ADC1.
B.2 Análisis de Poliaminas
Los niveles de PA se determinaron en Ia parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas de edad de Ia generación "Pi como se describe en el protocolo de Arabidopsis (apartado C.2). Puesto que ésta no es una población homogénea, se utilizó una mezcla de varias plantas (sobre 50) para Ia extracción y cuantificación de poliaminas. Como se muestra en Ia FIG. 7, los niveles de putrescina en las líneas transgénicas fueron más altos que en las plantas control, mientras que en los niveles de espermidina y espermina no se observaron diferencias significativas. A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que en tabaco Ia sobreexpresión de ADC1 de Arabidopsis induce Ia acumulación de putrescina.
B.3 Ensayos de tolerancia a congelación
La tolerancia a congelación de las 3 líneas transgénicas seleccionadas por su elevada expresión de ADC1 de Arabidopsis (A1.6, A1.13, A1.16) se determinó de una forma similar a Ia descrita para Arabidopsis (apartado C.3), pero a diferente temperatura. Plantas de 3 semanas de edad crecidas a 24±1 0C bajo fotoperíodo de día largo (16 horas luz/8 horas oscuridad) se expusieron a 40C durante 30 min en Ia oscuridad y a continuación se bajó Ia temperatura 2 0C por hora hasta -3 0C. La temperatura de congelación se mantuvo durante 4 horas, y luego se incrementó de nuevo a 40C. Después de 12 h a 40C las plantas se devolvieron a las condiciones de crecimiento originales, y las plantas capaces de reanudar el crecimiento después de dos semanas se consideraron como resistentes.
Como se deduce de los resultados obtenidos (FIG. 8), las plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan el gen ADC1 de Arabidopsis son más resistentes a estrés por congelación, y presentan las mismas características fenotípicas que las plantas de tipo silvestre. El porcentaje de supervivencia en las líneas transgénicas es 10-14% superior que en las plantas control.
Como se indica en el apartado B.2 estos ensayos se realizaron con plantas de Ia generación T-i, por esta razón se analizó una gran cantidad de plantas, Io que supone 6 experimentos independientes con 40-50 plantas de cada línea por experimento. Por tanto, estos resultados son Ia media de aproximadamente 250 plantas por línea. Se esperan diferencias más significativas cuando se utilice una población de plantas más homogénea (plantas homocigotos). En el caso de tabaco no se observaron diferencias en Ia tolerancia a congelación entre plantas aclimatadas y no aclimatadas.
Ejemplo 4: Obtención de plantas transqénicas de tomate
A. Transformación de Licopersicum sculentum
El plásmido pB^2^-ADC1 se introdujo en Agrobacteríum tumefaciens LBA4404 por el método de transformación de choque térmico. Se inoculó una colonia aislada de A. tumefaciens transformado en 3 mi de medio AB que contenía 100 μg/ml de estreptomicina, 100 μg/ml de rifampicina y 50 μg/ml kanamicina. Tras 8 h de incubación a 28 0C con agitación (180 rpm), se incubó 1 mi del cultivo bacteriano toda Ia noche, en las mismas condiciones, en 50 mi de medio AB que contenía los antibióticos mencionados anteriormente y 2% de glucosa. Posteriormente, Ia suspensión bacteriana se centrifugó a 3000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente y el precipitado, resuspendido en MSO a una concentración final de OD6oo=0.6, se utilizó para Ia transformación de plantas. Para la transformación se utilizaron cotiledones de plántulas de tomate {Licopersicum sculentum cv. UC82) de 10- a12-días de edad crecidas in vitro. Los cotiledones se cortaron en dos o tres piezas transversales y se situaron sobre una solución diluida de Agrobacteríum tumefaciens que contenía Ia construcción pBI121 -ADC1 con el haz hacia abajo. Después de 10 min se sacaron los explantos y se secaron directamente, con el haz hacia abajo en papel de filtro estéril Whatman situado directamente sobre medio GCF10 que contenía 375 μM de acetosiringona en placas de Petri y se situó de nuevo en una cámara de cultivo en Ia oscuridad durante aproximadamente 48 horas. Después de 48 h de cocultivo, los cotiledones se transfirieron a medio GCF10 que contenía 500 μg/ml de carbenicilina y 40 μg/ml de kanamicina. Los cotiledones se situaron con el haz hacia abajo. Después de 3 semanas de incubación se vieron callos verdes o yemas que indicaban el éxito de Ia transformación. Los callos verdes se transfirieron a medio GCF11 que contenía 250 μg/ml de carbenicilina y 40 μg/ml de kanamicina.
Después de ocho semanas de cultivo las yemas se transfirieron para el enraizamiento a medio TRI2 suplementado con 250 μg/ml de carbenicilina y 25 μg/ml kanamicina, en cajas Magenta, a 25 0C con períodos de 8 h luz/16 h oscuridad. Después, se sacaron de las cajas Magenta, se pusieron en macetas y se transfirieron al invernadero.
La integración del gen ADC1 de Arabidopsis en el genoma de tomate de plantas T0 se confirmó amplificando un fragmento interno de 810 pb por PCR, utilizando el siguiente par de cebadores: ADC1-1 F (5'- CCAGCTTCTGCATTTTCACA-3' SED ID NO: 15) y ADC1-1 R (5'- CCATTGTTGTCCATCTCGTG-3 SEQ ID NO: 16). Hasta el momento se han obtenido 3 líneas transgénicas independientes (FIG. 9).
Tabla 1. Composición de los diferentes medios
MEDIO MSO TRM GCF10 GCF11 TRI2
Sales MS 4.3 g/L 2.2 g/L 4.3 g/L 4.3 g/L 2.2 g/L
Tiamina 0.4 mg/L 0.2 mg/L 0.4 mg/L 0.5 mg/L 0.2 mg/L
Mio-lnositol 100 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 100 mg/L 50 mg/L
Glicina - - - 2.0 mg/L -
Piridoxina - - 0.5 mg/L 0.5 mg/L -
Acido Fólico * - - - 0.5 mg/L -
Biotina* - - - 0.05 mg/L -
Ribósido de Zeatina * - - 1.5 mg/L 1.9 mg/L -
NAA - - - - 0.1 mg/L
IAA - 0.2 mg/L 0.2 mg/L - -
Amcimidol* - - - - 0.5 mg/L
Acido Nicotínico - - 0.5 mg/L 4.9 mg/L -
Sacarosa 30 g/L 15 g/L 30 g/L 30 g/L 15 g/L
Carbenicilina* - - 500 mg/L 500 mg/L 250 mg/L
Kanamicina* - - 50+10 mg/L 50+10 25 mg/L mg/L
Agar - 8 g/L 8 g/L 8 g/L 8 g/L
PH 5.8 5.9 5.9 5.9 5.9
"(Esterilizado por filtración)
Tabla 2. AB (medio Agrobacterium)
K2HPO4 3.0 g/L
NaH2PO4 1.0 g/L
NH4CI 1.0 g/L
MgSO4-ZH2O 0.3 g/L
KCI 0.15 g/L
CaCI2 0.01 g/L
FeSO4-7H2O 2.5 g/L
Glucosa 5.0 g/L
Bacto-Agar 15 g/L
B. Caracterización de plantas transgénicas B.1. Estimación del nivel de expresión de ADC1 por RT-PCR a tiempo real
El RNA total se obtuvo de Ia parte aérea de plantas transformadas y no transformadas de Licopersicum sculentum como se describe en los ejemplos 1 y 2. El grado relativo de expresión de ADC1 se determinó por RT-PCR a tiempo real como se describe en el ejemplo 1 (apartado C.1). En este caso como control interno para normalizar los resultados se utilizó 18S RNA.
En las líneas transgénicas de tomate 847-3 y 947-4 se detectó un elevado nivel de expresión del gen ADC1 de Arabidopsis, aunque el nivel de expresión varió (FIG. 10). En las plantas de tomate sobreexpresoras del gen ADC1 de Arabidopsis no se observaron fenotipos anormales en Ia morfología ni en crecimiento/desarrollo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para producir plantas con resistencia mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende Ia etapa de transformar células de una planta con una secuencia exógena del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de funcionar en plantas.
2. Método según Ia reivindicación 1, que comprende además Ia etapa de regeneración de plantas a partir de las células transformadas.
3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, donde Ia secuencia exógena tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 2; c) una secuencia de nucleótidos que híbrida con SEQ ID NO: 1 , o una secuencia complementaria de Ia misma, en condiciones severas y codifica una proteína que tiene actividad arginina descarboxilasa, y d) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína con actividad arginina descarboxilasa, que comprende Ia secuencia (a) con una o más bases defeccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas.
4. Método según Ia reivindicación 3, donde Ia secuencia exógena tiene Ia secuencia SEQ ID NO: 1.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de expresión del gen exógeno ADC1 de Ia arginina descarboxilasa se incrementa en las células transformadas.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el nivel de expresión del gen exógeno ADC1 de Ia arginina descarboxiiasa se sobreexpresa en las células transformadas.
7. Planta transformada obtenible por el método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Uso de Ia secuencia del gen ADC1 de Ia arginina descarboxilasa para conferir resistencia a estrés por baja temperatura a una planta.
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