JP2004242510A - 生産性を改良した植物、及びその作出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生産性が改良された組換え植物を作出する。
【解決手段】本発明は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を安定に保持する生産性ないし形質が改良された植物及びその子孫；該植物の作出方法；該植物のカルスの作出方法に関する。
【選択図】図３Ａ

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、改良された生産性ないし形質を有する植物、詳細には改良された茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及び胚珠などを有する植物に関する。
また、本発明は該植物の作出方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、該植物から有用物質（例えばデンプン）或いはその誘導体（例えば生分解性プラスチック）を得ることを目的とする。
【０００３】
【従来の技術】
地球規模で食料危機が問題となっており、植物の生産性ないし形質（生産ポテンシャル、以下、従来技術の欄において単に「生産性」ということがある）を向上させることは重要な課題となっている。
【０００４】
植物の生産性を改良するために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。特に、イネを中心に交雑育種で生産性の改良が試みられており、これまでに生産性が飛躍的に向上した多収性品種も数多く開発されている。遺伝子工学技術による育種では光合成や炭水化物代謝などに関するキー酵素の遺伝子を用いた生産性の改良が行われている。
【０００５】
例えば、ラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスフォスファターゼ遺伝子をタバコの葉緑体中で発現させることで、光合成能が強化されて光合成代謝中間体（ヘキソース、シュクロース、デンプン）の含量が増加し、生育が促進され生産性が向上した（特許第３３５７９０９号）。さらに、炭水化物代謝のショ糖リン酸合成酵素（ＳＰＳ）が炭素分配だけでなくて生産能力の向上にも影響すると考えられ、ＳＰＳ遺伝子がトマト、ジャガイモ、タバコに導入された。トマトではＳＰＳ遺伝子を導入することで、栄養生長期の地上部の乾物重が多くなる傾向が確認された（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０１，５３５， １９９３、Ｐｌａｎｔａ， １９６， ３２７， １９９５）。ジャガイモでは地上部（葉と茎）および塊茎の乾物重が増大していることが確認された（Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．， ６５， １０２， １９９６、Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ， ６５， １４３， １９９６）。しかしながら、これらの遺伝子により形質転換された植物の多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。
【０００６】
ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては▲１▼核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、▲２▼種々の核酸合成系への促進作用、▲３▼タンパク質合成系の活性化、▲４▼細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化などが知られている。
植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されているが、最近ではポリアミンと環境ストレス耐性との関わりも注目されている。生産性の改良とポリアミンとの関与に関する報告はこれまで見つかっていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、実用的な植物の生産性ないし形質を高める技術を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、ポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離して、該遺伝子を植物に導入して過剰発現することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、栽培環境と無関係に、換言すれば環境ストレスがあってもなくても生産性ないし形質のパラメーターが改良されることを見出した。
ポリアミンは分子中にアミンを多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとしては二分子のアミンを含むプトレシン、三分子のアミンを含むスペルミジン、四分子のアミンを含むスペルミン等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはプトレシンについてはＡＤＣ、ＯＤＣ、スペルミジンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＤＳ、スペルミンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＭＳ等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子についても既に幾つかの植物で単離されている。例えば、植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２４， ４３１−４３６， １９９０）、トマト（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０３， ８２９−８３４， １９９３）、シロイヌナズナ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １１１， １０７７−１０８３， １９９６）、エンドウ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２８， ９９７−１００９， １９９５）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ）（Ｂｉｏｃｅｍ． Ｊ．， ３１４， ２４１−２４８， １９９６）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６， ３２７−３３８， １９９４）、ホウレンソウ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０７， １４６１−１４６２， １９９５）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３９（１）， ７３−７９， １９９８）等から単離されている。さらに、幾つかのポリアミン代謝関連酵素遺伝子については植物への導入が試みられているが、得られた形質転換植物で生産性ないし形質の改良については報告されていない。
【０００９】
このような状況下に、本発明者らは植物の生産性ないし形質を改良するために鋭意検討した結果、生産性ないし形質の改良において、特にポリアミンであるスペルミジンやスペルミン含量が重要であることを見いだし、実際に植物組織からスペルミジンやスペルミン生合成に関わるポリアミン代謝関連遺伝子（ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ）を単離、同定した。さらに、該遺伝子を植物に導入して過剰発現させることで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、生産性ないし形質のパラメーターが改良されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の発明を提供するものである。
１． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良されたトランスジェニック植物及びその子孫。
１７． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された植物を作出する方法。
１９． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された植物を作出する方法。
３１． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された生産性ないし形質を有する植物体を再生し、
（３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
（４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に改良された生産性ないし形質を有する形質が固定された植物の作出方法。
３２． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列の抑制因子を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞からカルスを誘導する
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に改良された生産性ないし形質を有する形質が固定されたカルスの作出方法。
３３． 改良された生産性ないし形質を有する植物が、サツマイモ植物である、項１９から３２のいずれかに記載の方法。
３４． 項３３に記載の方法により得られたサツマイモ植物を栽培し、サツマイモを収穫することを特徴とする比較対照サツマイモに比べて環境ストレスの有無ないし程度にかかわらず生産性ないし形質が改良されたサツマイモの製造方法。
３５． 項３３に記載の方法により得られたサツマイモ植物を栽培し、サツマイモを収穫する工程、
得られたサツマイモからサツマイモデンプンを分離する工程
を包含するサツマイモデンプンの製造方法。
３６． 項３３に記載の方法により得られたサツマイモ植物を栽培し、サツマイモを収穫する工程、
得られたサツマイモからサツマイモデンプンを分離する工程
該サツマイモデンプンを生分解性プラスチックに変換する工程
を包含する生分解性プラスチックの製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において「生産性ないし形質が改良される」とは、植物のあらゆる器官（組織）、例えば、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠などのサイズ、総重量、数量などが増大することや生育期間が短縮すること（生産性の改良）、該器官（組織）に関わる形質（例えば、トマト、キュウリ、バナナなどは着果した果実の数や大きさの増大、ジャガイモやキャッサバなどは塊茎の数や大きさの増大、サツマイモなどは塊根の数や大きさの増大、トウモロコシ、イネ、ダイズなどは種子（胚乳）の数や大きさの増大、ワタなどはコットンボール、胚珠の数や大きさが増大することで繊維量の増大、ペチュニア、トレニアなどでは花の数や大きさの増大、その他、形の変化、着色（例えば色素間のバランスの変化や色素産生量の増大）など）が改良されることをいう。
【００１２】
本発明で得られる植物は、栽培環境（例えば環境ストレス）に左右されずポリアミンの発現量が増大し、生産性を改良することができる。
ポリアミン量を調節する核酸配列としては、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が挙げられる。外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は植物体中のポリアミン量を増大させることができ、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は植物体中のポリアミン量を減少と増大させることができる。
本発明において「該ポリアミン量を調節する核酸配列を有していない比較対照植物」、とは該核酸配列（例えば外因性のポリアミン代謝関連酵素遺伝子又は内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子）を導入する前のあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにポリアミン代謝関連酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジェニック植物などをすべて包含する。
【００１３】
本発明で言うところの「ポリアミン」は生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物である。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミンなどが挙げられる。
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子
本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミジンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、スペルミンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。
【００１４】
アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ＥＣ４．１．１．１９．）はＬ−アルギニンからアグマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ＥＣ４．１．１．１７．）はＬ−オルニチンからプトレシンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ：Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ＥＣ４．１．１．５０．）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチルチオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＥＣ２．５．１．１６．）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。
【００１５】
これらの遺伝子は、いずれの由来であってもいいが、例えば、種々の植物から単離することができる。具体的には、双子葉植物、例えばウリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルファルファ、カウピー（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）等のマメ科；アオイ科；キク科；アカザ科；ヒルガオ科からなる群から選ばれたもの、又は単子葉植物、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。好ましくは、ウリ科植物、より好ましくはクロダネカボチャがよい。
【００１６】
本発明の植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織から単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。
本発明において使用されるポリアミン代謝関連酵素遺伝子の好ましい例として、スペルミジン合成酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、
・配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
が挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。更に、
・該上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
ここでいう「ストリンジェント条件」とは、特定ポリアミン代謝関連酵素遺伝子配列にコードされるポリアミン代謝関連酵素と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
ここでいう「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、挿入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。本発明にはこのような修飾が加えられ、かつポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、ｐｏｌｙＡテールや５’、３’末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、アミノ酸を欠失するような範囲で塩基が「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が「付加」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、ポリアミン代謝関連酵素活性を有することが必要である。好ましくは、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。
このような改変されたＤＮＡは例えば、部位特異的変異法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ． ２０， ６４８７−６５００， １９８２）等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
本発明における「アンチセンス遺伝子」とはポリアミン代謝関連酵素遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する遺伝子を意味する。アンチセンスＤＮＡは、例えば配列番号１、３、５の塩基配列に相補的なものであり、アンチセンスＲＮＡはそれらから産生されるものである。
内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子
該抑制因子は、該遺伝子の発現を抑制するものであれば特に制限されず、例えば該遺伝子及びその上流又は下流から選ばれる配列のアンチセンスＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が例示される。該アンチセンスＤＮＡは、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５’上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかに相補的であればよい。アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも３００塩基、特に少なくとも５００塩基を有する。該アンチセンスＤＮＡの転写産物は、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするか、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子或いはその上流又は下流の配列の非コーディング領域（例えばプロモーター、イントロン、転写終結因子）にハイブリダイズする。
生産性が改良された植物及びその子孫
本発明において、「生産性」としては、上述のごとく、植物のあらゆる器官（組織）、例えば、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠などを包含し、該器官（組織）の形質として数量、生育期間、形、着色、性質、特性が例示される。
本発明において、「生産性が改良された植物」および「改良された生産性を有する植物」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して生産性に関わる形質である、数量、生育期間、形、着色、性質、特性が付与若しくは向上若しくは抑制した植物をいう。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を植物に導入することにより、茎、葉、根、花、子房、種子に関わる形質が、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を有していない植物に比べて向上した植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
これによって植物（器官・組織など）の生産性、収量、収穫量、品質の向上、商品性の向上などが期待できる。また、野菜、果物等の可食性植物では、食用部分（葉、果実、塊茎、根茎など）のポリアミン量を減らすことで品質などの特性に好影響を与える可能性がある。従って、これらの食用部分では抑制因子を発現させ、その他の部分ではポリアミン関連酵素遺伝子を発現させて品質を向上しつつ収量の向上を図ることも可能である。
さらに、本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、植物は栄養生長期における外観上の相違は小さいが（葉が濃緑色になる）、生殖生長期において葉、花、茎、根等の生産性の改良がより著しく認められ、これは植物の潜在能力（ポテンシャル）を向上させたものと理解される。
【００１８】
本発明の植物には、植物体全体（全樹）に限らず、そのカルス、種子、あらゆる植物組織、葉、茎、塊茎、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、胚珠、繊維などが含まれる。更にその子孫も本発明の植物に含まれる。
【００１９】
本発明において「植物及びその子孫から得られる有用物質」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、導入前に比して生産性が向上した植物およびその子孫で生産された有用物質をさし、有用物質としては例えば、アミノ酸、油脂、デンプン、タンパク質、フェノール、炭化水素、セルロース、天然ゴム、色素、酵素、抗体、ワクチン、医薬品、生分解性プラスチックなどが含まれる。
【００２０】
本発明の植物は、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物に、遺伝子工学的手法により外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくともポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入された当代の植物体で該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が発現し、それによって器官形成が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましい。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。
【００２１】
また、ここで「外因性」とは、植物が生来有しておらず、外部より導入されたものを意味する。従って、本発明の「外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」は、遺伝子操作により外部より導入される、宿主植物と同種の（すなわち、該宿主植物由来の）ポリアミン代謝関連酵素遺伝子であってもよい。コドン使用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）の同一性を考慮すれば、宿主由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子の使用もまた好ましい。
【００２２】
外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子はいかなる遺伝子工学的手法によって植物に導入されてもよく、例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有する異種植物細胞とのプロトプラスト融合、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を発現するように遺伝子操作されたウイルスゲノムを有する植物ウイルスによる感染、あるいはポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含有する発現ベクターによる宿主植物細胞の形質転換が挙げられる。
【００２３】
好ましくは、本発明の植物は、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現ベクターで、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換することにより得られる、トランスジェニック植物である。
【００２４】
植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。
【００２５】
３５Ｓプロモーターのような器官全体に恒常的に発現させるプロモーターだけでなく、器官または組織特異的プロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の器官又は組織だけ生産性を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と花器に特異的に働くプロモーター（例えば、ＷＯ９９／４３８１８、特開平１１−１７８５７２、特開２０００−３１６５８２）を用いることによって、花の器官のみで花の数や花の大きさを改良することができる。さらに、果実、子房に特異的に働くプロモーター（例えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １１， ６５１−６６２， １９８８）を用いることによって、子房、果実の数や大きさを改良することができる。
【００２６】
時期特異的なプロモーターを用いれば、特定の時期だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の時期だけに生産性を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と栄養生長期に働くプロモーターを用いることによって、栄養生長期のみで生産性を改良することができる。
【００２７】
本発明の発現ベクターにおいて、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。例えば、ターミネーターＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子等が挙げられる。
【００２８】
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧がかかった条件を実現できるという利点もある。
【００２９】
さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、ｐＵＣ系またはｐＢＲ系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。
【００３０】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）による感染を利用して外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の２５ｂｐボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１やｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するＶｉｒ領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあってトランスに作用する。
【００３１】
植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の課程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の課程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法および、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意の部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的遺伝子も植物体全体に導入される。これらの方法は、当該分野に置いて周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当該者により適宜選択され得る。
【００３２】
上記に示した方法で作製された形質転換植物は、サザン解析やノーザン解析でポリアミン代謝関連酵素遺伝子の遺伝子発現解析、ポリアミン量の分析、生産性の評価を行うことができる。
【００３３】
例えば、ポリアミンの定量は、０．０５〜１ｇの試料をサンプリングして、５％過塩素酸水溶液を加えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシル化またはベンゾイル化等で標識した後、蛍光又はＵＶ検出器を接続した高速液体クロンマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析することができる。
【００３４】
例えば、生産性の評価として茎については、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて茎（例えば主花茎、側花茎、枝、蔓、塊茎など）の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。葉については、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて葉（例えばロゼット葉、本葉など）の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。花については、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて花の数、大きさ、形、色等を調べることにより評価することができる。子房については、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて子房（例えばさや、果実など）の数、大きさ、形、色等を調べることにより評価することができる。種子については、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて種子の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。根については、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の自家受粉で得られたＴ２種子又はＴ３種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて根（塊根、肥大根、細根など）の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。
本発明において、生産性の向上（改良）方法とは、植物を植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持することで比較対照植物に比して果実（例えばトマト、キュウリ、バナナ）、塊茎（例えばジャガイモ、キャッサバ）、塊根（例えばサツマイモ）、種子（例えばイネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ）、繊維（例えばワタ）などの収量ないし有用物質（例えばデンプン、油脂、タンパク質、セルロース等）の量（含有率）が増大する方法をいう。好ましくは、該方法により果実、野菜等の食用物質の味覚は劣化せず、比較対照植物と同等以上である。
本発明の形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物などが挙げられる。例えば、サツマイモ、トマト、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、マメ、サトイモ、ホウレンソウ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ナタネ、ソルガム、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、サトウキビ、アカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、ペチュニア、トレニア、キンギョソウ、シクラメン、カスミソウ、ゼラニウム、ヒマワリ、シバ、ワタ、 キャッサバ、サゴヤシ、マツタケ、シイタケ、キノコ、チョウセンニンジン、柑橘類、バナナ、キウイ等が挙げられる。好ましくは、サツマイモ、トマト、キュウリ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ペチュニア、トレニア、ユーカリ、ワタ、キャッサバである。
本発明は、例えばサツマイモについて好適に実施できる。
サツマイモからはサツマイモデンプン等の糖質が多量に得られ、該糖質は生分解性プラスチックの製造原料とすることができる。生分解性プラスチックとしては、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンサクシネート、ポリ（Ｄ，Ｌ，ＤＬ）乳酸（ポリラクチド）、ポリグリコール酸（ポリグリコリド）、酢酸セルロース、キトサン／セルロース／デンプン、変性デンプンなど、或いはこれらの２元共重合体、３元共重合体が例示される。これらの生分解性プラスチックは公知であり、公知の発酵法、化学合成法などを用いて製造することができる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、植物の生産性を改良することができ、植物の器官や組織の品質、価値、生産性、収量の向上などが期待できる。具体的には、茎（塊茎を含む）、葉、根（根茎を含む）、花、子房、果実、さや、種子の数や大きさが増加することによって、該器官が農作物として生産される場合、品質、生産性、収量の増加が期待される。例えば、イネは１株当たりの種子数が増加することで収穫できる米の収量が増大することが期待できる。果樹は着果した果実（子房）の数が増加して、発達期間が長くなることで生産性の向上が期待される。観賞植物は花、茎、葉、特に花の数や大きさが増加することで見栄えが良くなり、商品価値が高まることが期待される。さらに、植物の形や形態が変化することで様々な環境適応性が向上し、栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大なども期待できる。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローニング
（１）ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの調製
クロダネカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｆｉｃｉｆｏｌｉａ Ｂｏｕｃｈｅ）をバーミキュライトに播種し、子葉展開時に市販の床土（サンサン床土；タキイ種苗社製）を詰めた鉢に移植した。鉢上げしたクロダネカボチャを植物栽培用のインキュベーター（気温 昼２６℃／夜２２℃、１３時間日長）内に置いた。第２本葉展開時にインキュベーター内の温度を昼１８℃／夜１４℃まで下げ低温処理を開始した。低温処理３日後に、根、茎、葉に分けてサンプリングした。ＲＮＡ抽出まで−８０℃のフリーザーに保存した。
【００３７】
約４ｇのクロダネカボチャの根組織を直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕した。その後、１０ ｍｌの抽出用０．２Ｍトリス酢酸緩衝液〔５Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、０．７％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１％ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（Ｍ．Ｗ．３６０，０００）、０．６２％Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ、ｐＨ８．５）を加えポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用い氷冷下２分間粉砕した。ただし、β−メルカプトエタノールとポリビニルピロリドンは使用する直前に添加した。その後、粉砕液を１７，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収した。
【００３８】
この上清をミラクロスで濾渦し、その濾液を超遠心分離管に入れた５．７Ｍ塩化セシウム溶液１．５ ｍｌに静かに重層し、１５５，０００×ｇ、２０℃で２０時間遠心した後、上清を捨てＲＮＡの沈殿を回収した。この沈殿を３ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０（ＴＥ緩衝液と呼ぶ）に溶解し、さらに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（容積比、２５：２４：１）を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を回収した。得られた水層に、１／１０倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム（氷酢酸でｐＨ６．２に調製）と、２．５倍量のエタノールを添加して良く混合し、−２０℃で一晩静置した。その後、１７，０００×ｇで２０分間遠心分離し、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄して減圧乾燥した。
【００３９】
この乾燥標品を５００μｌの前述のＴＥ緩衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに２×結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）を等量になるようにＲＮＡ溶液に加え、平衡化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）で予め平衡化したオリゴｄＴセルロースカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に重層した。次いで、カラムを約１０倍量の前述の平衡化緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．５）でｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを溶出した。
【００４０】
得られた溶出液に１／１０倍量の前述の３Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液と、２．５倍量のエタノールを加え混合し、−７０℃で静置した。その後、１０，０００×ｇで遠心分離を行ない、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度５００μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、オリゴｄＴセルロースカラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したクロダネカボチャの根由来のｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡはＰＣＲ用のｃＤＮＡライブラリーと完全長遺伝子単離用のｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。
（２）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーの作製はＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャの根由来のｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを鋳型として３’末端に２つのｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ を持つ修飾ｌｏｃｋ−ｄｏｃｋｉｎｇ オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ， ２５， ２６３−２６９， １９８３）に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００４１】
得られたｃＤＮＡの両末端にＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡアダプター（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅによりｄｓ ｃＤＮＡの両末端へ結合しやすくなるように５’末端をリン酸化したもの）を連結した。得られたアダプター結合のｃＤＮＡをクロダネカボチャ根由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーとした。
（３）ＰＣＲ用プライマーの設計
既に植物や哺乳類から単離されているアルギンニン脱炭酸酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子の決定されている塩基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存されている領域を選び出し、ＤＮＡオリゴマーを合成した（配列プライマーＩ〜ＶＩ）。
ＳＰＤＳプライマーＩ（配列番号７）：５’−ＧＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＣＡ−３’
ＳＰＤＳプライマーＩＩ（配列番号８）：５’−ＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡ−３’
ＳＡＭＤＣプライマーＩＩＩ（配列番号９）：５’−ＴＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣ−３’
ＳＡＭＤＣプライマーＩＶ（配列番号１０）：５’−ＧＣＴＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴ−３’
ＡＤＣプライマーＶ（配列番号１１）：５’−ＧＧＧＣＴ（Ｔ／Ｇ）ＧＧＡ（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＣＴＡ（Ｃ／Ｔ）−３’
ＡＤＣプライマーＶＩ（配列番号１２）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＴＣ（Ｇ／Ａ）ＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＧＴ−３’
（４）ＰＣＲによる増幅
（２）で得られたＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、（３）で設計した配列プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのステップは最初、９４℃、３０秒、４５℃、１分間、７２℃、２分間で５サイクル、続いて９４℃、３０秒、５５℃、１分間、７２℃、２分間で３０サイクル行った。
（５）アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロースで電気泳動し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。
（６）ＰＣＲ産物の確認と回収
検出された増幅バンドを確認し、カミソリの刃を用いてアガロースゲルから切り出した。切り出したゲルを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲルからＤＮＡ断片を単離精製した。回収したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、大腸菌に形質転換後、常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
（７）塩基配列決定
得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １０１， ２０−７８， １９８３）により行った。ＳＰＤＳ遺伝子については３種類の遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子については１種類の遺伝子、ＡＤＣ遺伝子については２種類の遺伝子が単離された。
（８）ホモロジー検索
これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデータベースとホモロジーサーチを行うとＳＰＤＳ遺伝子は既知の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子と７０％の相同性を示した。ＳＡＭＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子と７０％以上の相同性を示した。ＡＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＡＤＣ遺伝子と６７％以上の相同性を示した。
（９）完全長遺伝子の取得
完全長遺伝子はプラークハイブリダイゼーション法で取得した。ｃＤＮＡライブラリーの作製はＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャ根由来のｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを鋳型としてオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ， ２５， ２６３−２６９ ，１９８３）に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００４２】
得られたｃＤＮＡの両末端にＥｃｏＲＩアダプター（内部にＸｈｏ ＩとＳｐｅ Ｉサイトを持つ）を連結し、Ｘｈｏ Ｉで消化した後、それをλファージベクター、λＺＡＰ ＩＩアームのＥｃｏＲＩとＸｈｏ Ｉ部位に連結後、インビトロパッケージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ＧＩＧＡＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ）を用い、パッケージングを行ない、大腸菌ＳＵＲＥ株（ＯＤ６６０＝０．５）に感染させることにより多数の組換えλファージを得た。これをクロダネカボチャ根由来のｃＤＮＡライブラリーとした。このライブラリーのサイズは８．０×１０^６であった。
【００４３】
プローブの作製は（６）で調製したＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子のプラスミドＤＮＡからインサートｃＤＮＡを単離・調製し、得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いて、^３２Ｐ標識プローブを作製した。得られた^３２Ｐ標識ｃＤＮＡをプローブに用いた。
【００４４】
前記、クロダネカボチャ根由来のｃＤＮＡライブラリーを構成するファージを大腸菌に感染させてＬＢ寒天培地上で増殖させ、約５０，０００個のファージＤＮＡをナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）に写し取った。
【００４５】
ファージＤＮＡを写し取ったナイロンメンブレンをアルカリ変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を含んだ濾紙上に移し、４分間放置し、次に中和液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を含んだ濾紙上に移し５分間放置した。２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸三ナトリウム）で洗浄した後、メンブレンをストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いＤＮＡの固定を行った。固定処理を行ったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液（０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、０．１％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有中において、４２℃で３時間プレハイブリさせ、作製したｃＤＮＡプローブを加え４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣを含有する溶液を用いて、４２℃で１時間〜２時間洗浄した。このメンブレンを乾燥した後、Ｘ線フィルムを密着させて一晩感光させた。
【００４６】
その結果、ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子断片から得たプローブでハイブリダイズした陽性クローンを選抜することができた。
【００４７】
陽性クローンのファージＤＮＡそれぞれから、インビボ・エクシジョン法によりｃＤＮＡインサートを持つプラスミドクローンを調製した。インビボ・エクシジョン法は、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の方法に従った。
【００４８】
ＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子を含む各ファージ液２００μｌ、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ懸濁液２００μｌ、ヘルパーファージＲ４０８懸濁液１μｌを混ぜ３７℃で１５分間インキュベートした後、３ｍｌの２×ＹＴ培地（１．６％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ， １％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ， ０．５％ ＮａＣｌ）を加え３７℃で２時間振蘯培養し、７０℃で２０分間処理し、遠心分離（４，０００×ｇ、１０分間）して上清を回収した。得られた上清３０μｌと大腸菌ＳＵＲＥ懸濁液３０μｌを混ぜ、３７℃で１５分間インキュベートした後、アンピシリンを５０ｐｐｍ含むＬＢ（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ， ０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ， １％ ＮａＣｌ）寒天培地に数μｌ植菌し、３７℃で一晩培養した。コロニーを形成した大腸菌は、ｃＤＮＡインサートを持つプラスミドクローンを含んでいた。これらのプラスミドの挿入配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １０１， ２０−７８， １９８３）により行った。その結果、開始コドンを含むプラスミドであることが明らかとなった。
【００４９】
得られた完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子をＦＳＰＤ１（配列番号１，２）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＳＡＭ２４（配列番号３，４）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＡＤＣ７６（配列番号５，６）と命名した。
【００５０】
得られたＦＳＰＤ１と既知の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表１）。表１の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＰＤ１は他の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００５１】
【表１】

【００５２】
得られたＦＳＡＭ２４と既知の植物由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表２）。表２の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＡＭ２４は他の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００５３】
【表２】

【００５４】
得られたＦＡＤＣ７６と既知の植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表３）。表３の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＡＤＣ７６は他の植物由来のＡＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００５５】
【表３】

【００５６】
実施例２：トランスジェニックサツマイモの作製
（１）発現コンストラクトの作製
配列番号１に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。
配列番号３に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。その発現コンストラクト（センス方向のみ）の構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。
配列番号５に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＡＤＣ７６の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。その発現コンストラクト（センス方向のみ）の構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。
（２）プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達（三者接合法）させた。１から２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。
（３）形質転換用サツマイモカルスの作製
サツマイモ高系１４号（石川県立農業短期大学農業資源研究所より提供、以下「高系１４号」又は「野生株」という）を鉢植えにて通常の栽培管理により栽培し、茎頂を含む５ｃｍ程度の茎先端部数十本を採取した。これを滅菌した３００ｍｌビーカーに入れた７０％エタノール１５０ｍｌに２分浸漬の後、同様に滅菌したビーカーに入れた滅菌液（５％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）１５０ｍｌに２分浸漬して滅菌を行った。滅菌した茎先端部は、滅菌ビーカーに入れた滅菌水で３回洗浄を行った。洗浄後、実体顕微鏡下で無菌的に茎頂分裂組織を含む０．５ｍｍ程度の組織を摘出した。これを胚性（Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ）カルス誘導培地〔４Ｆ１プレート：ＬＳ培地（１．９ｇ／ｌ ＫＮＯ_３、１．６５ｇ／ｌ ＮＨ_４ＮＯ_３、０．３２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．４４ｇ／ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１７ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２２．３ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ、８．６ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．８３ｍｇ ＫＩ、６．２ｍｇ Ｈ_３ＢＯ_３、２７．８ｍｇ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３７．３ｍｇ／ｌ Ｎａ_２・ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｌ ｍｙｏ−イノシトール、０．４ｍｇ／ｌ 塩酸チアミン）、１ｍｇ／ｌ ４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（４ＦＡ）、３０ｇ／ｌ ショ糖、３．２ｇ／ｌ ゲランガム、ｐＨ５．８〕上に置床し、植物インキュベーター（サンヨー社製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中で２６℃、暗黒条件下にて培養した。約１ヶ月後、増殖した組織より植物体への再分化能を持つ胚性カルスを選抜した。選抜した胚性カルスは以後、１ヶ月毎に新しい４Ｆ１プレートに移植し、増殖させた。
（４）アグロバクテリウムの感染
形質転換アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−を５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＬＢ寒天培地にて２７℃、２晩培養後、菌体を飯粒２粒程度掻き取り、感染培地（ＬＳ培地、２０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン、１ｍｇ／ｌ ４ＦＡ、３０ｇ／ｌ ショ糖、ｐＨ５．８）５０ｍｌに懸濁し、１００ｒｐｍ、２６℃、暗黒条件下にて１時間振とうした。この菌体懸濁液を、滅菌したステンレスネット製バスケットを入れた３００ｍｌ滅菌ビーカーに移した。前記（３）で移植後２週間〜３週間培養した胚性カルスをこのビーカーのバスケットに入れて２分間浸したのち、２枚重ねた滅菌濾紙上にバスケットごと乗せて余分な水分を除き、共存培養培地（４Ｆ１Ａ２０プレート：ＬＳ培地、１ｍｇ／ｌ ４ＦＡ、２０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン、３０ｇ／ｌ ショ糖、３．２ｇ／ｌ ゲランガム、ｐＨ５．８）に移して、２２℃、暗黒条件下にて３日間共存培養した。
（５）除菌
前記（４）にて３日間共存培養した胚性カルスを、除菌液（滅菌水にカルベニシリンを終濃度５００ｍｇ／ｌとなるように加えたもの）５０ｍｌを入れた滅菌したステンレスバスケット入り３００ｍｌビーカーのバスケットに移し、ピンセットでバスケットをつまみ、数分間良く洗浄した。次に胚性カルスを、バスケットごと除菌液を入れた３００ｍｌ滅菌ビーカーに移し、再び洗浄を行った。同じ操作を再度繰り返した後、滅菌濾紙上で余分な水分を除き、選抜培地（４Ｆ１ＨｍＣａｒプレート：ＬＳ培地、１ｍｇ／ｌ ４ＦＡ、２５ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、３０ｇ／ｌ ショ糖、３．２ｇ／ｌ ゲランガム、ｐＨ５．８）に並べて２６℃、暗黒条件下にて培養した。
（６）形質転換カルスの選択
前記（５）で２週間培養した胚性カルスは、以後２週間毎に新しい４Ｆ１ＨｍＣａｒプレートに移植し、培養した。非形質転換カルスは褐変したが、一部の形質転換された細胞は淡黄色の胚性カルスを形成した。
（７）形質転換植物の再生
形質転換された胚性カルスは、選抜培地置床後６０日で、体細胞胚形成培地（Ａ４Ｇ１ＨｍＣａｒプレート：ＬＳ培地、４ｍｇ／ｌ ＡＢＡ、１ｍｇ／ｌ ＧＡ３、２５ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、３０ｇ／ｌ ショ糖、３．２ｇ／ｌ ゲランガム、ｐＨ５．８）に移植し２６℃、弱光（３０〜４０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ）、全日長条件下にて２週間培養の後、植物体形成培地（Ａ０．０５ＨｍＣａｒプレート：ＬＳ培地、０．０５ｍｇ／ｌ ＡＢＡ、２５ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、３０ｇ／ｌショ糖、３．２ｇ／ｌ ゲランガム、ｐＨ５．８）に移植し、同条件で培養した。以後２週間毎に新しいＡ０．０５ＨｍＣａｒプレートに移植した。形質転換された細胞は緑色を呈する胚性カルス由来体細胞胚を形成するので、これを植物生育培地（０Ｇプレート：ＬＳ培地、３０ｇ／ｌ ショ糖、３．２ｇ／ｌ ゲランガム、ｐＨ５．８）に移植し、シュートを形成させた。
（８）ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイゼーション
前記で得られた形質転換体から葉を切り取り、直ちに液体窒素で凍結した。これを液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕し、１ｇ当たり、３ｍｌのＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、１００μｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ〕を加え十分撹拌した。６０℃で１時間インキュベート後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）して、その上清をミラクロスで濾渦し新しいチューブに移した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を３回行った後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０μｇずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち１μｇのＤＮＡを用いて、それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。
【００５７】
また、形質転換されていない野生株についても同様な条件下で栽培し、同様にＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化を行ない、１％アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション用プローブは各ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６遺伝子断片を用いた。
【００５８】
サザンハイブリダイゼーションは、モレキュラー クローニング，ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第９章、第３１〜５８頁〔コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ）社、１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル電気泳動を行ない、泳動後、アルカリ変性を行ないナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）に一晩サザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）に３分間照射させ、ＤＮＡを固定した。このメンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×デンハルト液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）５ｍｌ中で５０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。プローブを加え、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液で室温１０分間２回洗浄し、続いて同じ洗浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。メンブレンは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社製）を入れたカセット内で−８０℃一晩感光させ、オートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っていない株（１）、ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６を導入した形質転換体（２）、ベクターのみを導入した形質転換体（３）について、サザンハイブリダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを比較した。
（２）には、（１）、（２）、（３）共通の内在性シグナルのほかに、ＥｃｏＲＩで切断したサンプルと、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したサンプルでは特異的なシグナルが観察され、目的遺伝子が（２）に組み込まれていることが観察された。
実施例３：ノーザンブロット解析
実施例２で得られた形質転換体で目的の遺伝子が実際に遺伝子発現しているかを確かめるために、ノーザンブロッティングを下記に示す様に行った。
【００５９】
形質転換を行っていない野生株（ＷＴ）と形質転換体（ＴＳＰ）の若葉から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は定法に従って行った。得られた全ＲＮＡ１０μｇを１．５％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンドＮナイロンメンブランに一晩ブロッティングした。ＵＶクロスリンカーでＲＮＡを固定した後、プレハイブリダイゼーションバッファー（５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、５Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ ＳＤＳ、８０μｇ／ｍｌ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、ｐＨ７．０）で、４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。形質転換を行ったクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子断片、ＳＡＭＤＣ遺伝子断片、ＡＤＣ遺伝子断片のｃＤＮＡを^３２Ｐ−ｄＣＴＰとランダムラベルキット（アマシャム社製）を用いて、プローブを作製した。このプローブをプレハイブリダイゼーションに加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む洗浄液からスタートし、最終的には０．１× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む洗浄液で５５℃・３０分２回まで洗浄した。メンブレンをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ社製）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。その結果、野生株（ＷＴ）では外因性クロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子の発現は検出されなかったが、形質転換を行った全ての形質転換体では非常に高いレベルでクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子（ＦＳＰＤ１）、ＳＡＭＤＣ遺伝子（ＦＳＡＭ２４）、ＡＤＣ遺伝子（ＦＡＤＣ７６）が発現していることが確認された。
実施例４：ポリアミン含量の評価
（１）系統（セルライン）の選抜
実施例２で作製した形質転換体について、ＰＣＲ（またはサザン解析）とノーザン解析による目的遺伝子の導入確認でセルラインの選抜を行った。その結果、確実にポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ該遺伝子を安定的に発現している系統についてポリアミン分析を行った。ＦＳＰＤ１がセンス方向（＋）で導入されているセルライン、ＴＳＰ−ＳＳ−１、ＴＳＰ−ＳＳ−２、ＴＳＰ−ＳＳ−３、ＴＳＰ−ＣＳ−１、ＴＳＰ−ＣＳ−３、ＴＳＰ−ＣＳ−４を選抜し、ＴＳＰ−ＳＳ−１、ＴＳＰ−ＳＳ−２、ＴＳＰ−ＳＳ−３はプロモーターとしてＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが導入されている系統、ＴＳＰ−ＣＳ−１、ＴＳＰ−ＣＳ―３、ＴＳＰ−ＣＳ−４は西洋わさび由来のペルオキシダーゼプロモーター（Ｃ２プロモーター）が導入されている系統である。ＦＳＰＤ１がアンチセンス方向（−）で導入されているセルライン、ＴＳＰ−ＳＡ−１、ＴＳＰ−ＳＡ−２を選抜し、いずれもＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが導入されている系統である。ＦＳＡＭ２４がセンス方向（＋）で導入されているセルライン、ＴＳＰ−ＳＭ−１、ＴＳＰ−ＳＭ−２、ＴＳＰ−ＳＭ−５を選抜し、ＴＳＰ−ＳＭ−１、ＴＳＰ−ＳＭ−２、ＴＳＰ−ＳＭ−５はプロモーターとしてＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが導入されている系統である。
（２）ポリアミン含量の分析
同時に栽培を行った野生株（ＷＴ）と形質転換体（ＴＳＰ）から約０．３〜０．９ｇの若葉をサンプリングして凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、内部標準量＝７．５ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり５〜１０ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、４℃・３５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに４００μｌの遊離型ポリアミン溶液、２００μｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液、２００μｌのダンシルクロライド／アセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて軽く混和した。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で多い、６０℃のウォーターバスで１時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで３０分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、６００μｌのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して２相に分かれた後に、上層のトルエン層を３００μｌマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに２００μｌのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】

【００６１】
表４より、明らかなようにポリアミン代謝関連酵素遺伝子をセンス方向に導入したセルラインは、プトレシン含量、スペルミジン含量、スペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増大し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に増大していることが明らかとなった。特にスペルミジンとスペルミン含量の増加が顕著であった。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルラインは、特にスペルミジン含量とスペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に減少し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に減少していることが明らかとなった。
【００６２】
以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物にセンス方向又はアンチセンス方向で遺伝子導入することで、植物内のポリアミン含量を増加又は減少させることが可能であることが明らかとなった。これらのことから、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが示された。
実施例５：生産性の評価
（１）茎（蔓）・葉・根（塊根）の評価
実施例２で得られた形質転換体（ＴＳＰ）と野生株（ＷＴ：高系１４号）の幼苗を培養土（サンサン床土：タキイ種苗社製）を詰めたプランターに定植して７日間、２３℃、長日条件（１６時間日長・８時間暗黒）、多湿条件下で活着させた。その後、２３℃、弱光長日条件下で約１ヶ月間順化育成した後に自然光型グロースチャンバー（コイトトロンＳＢＨ−３０３０、小糸工業社製）に移して、温度（昼／夜：２６℃／２４℃）、湿度（５０〜６０％）、光（なりゆき）条件下で通常栽培を開始した。通常栽培から１ヶ月後に蔓（茎）と葉について調査を行った。その結果を図２に示した。図２の結果から、形質転換体（ＴＳＰ）は野生株（ＷＴ）に比べて、茎（蔓）が長く、葉数が増大していることが明らかとなった。さらに、蔓を詳細に調べたところ、形質転換体（ＴＳＰ）は野生株（ＷＴ）比べて節間が短く、野生株（ＷＴ）の葉柄（葉）数が５個（５枚）であるのに対して、形質転換体（ＴＳＰ）の葉柄（葉）数は１７個（１７枚）であり顕著に増加していた。さらに、通常栽培から３ヶ月後に塊根（イモ）の調査を行った。その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。形質転換体（ＴＳＰ）と野生株（ＷＴ）の一株当たりの塊根数を比較したところ、形質転換体（ＴＳＰ）の方がイモの数が多かった。さらに、イモの収量を調べたところ、形質転換体（ＴＳＰ）は一株当たりのイモの新鮮重が３２５．９９ｇと２００．１８ｇであるのに対して、野生株（ＷＴ）の新鮮重は７９．０８ｇと１０１．３６ｇであり、形質転換体（ＴＳＰ）の方がイモの収量が顕著に増大していることが明らかとなった。
（２）根（塊根）の評価
実施例２で得られた形質転換体（ＴＳＰ−ＳＳ−１，ＴＳＰ−ＣＳ−３）と野生株（ＷＴ：高系１４号）の苗から挿し穂（一節挿し木法）を培養土（サンサン床土：タキイ種苗社製）を詰めたプランターに挿し込んで７日間、２３℃、長日条件（１６時間日長・８時間暗黒）、多湿条件下で発根させた。その後、２３℃、弱光長日条件下で約１ヶ月間順化育成した後に自然光型グロースチャンバー（コイトトロンＳＢＨ−３０３０、小糸工業社製）に移して、温度（昼／夜：２６℃／２４℃）、湿度（５０〜６０％）、光（なりゆき）条件下で通常栽培を開始した。通常栽培から２ヶ月後に塊根（イモ）の肥大形成について調査を行った。その結果を図４に示した。図４の結果から、野生株（ＷＴ）は全株において塊根の肥大形成が見られなかったが、形質転換体（ＴＳＰ−ＳＳ−１，ＴＳＰ−ＣＳ−３）は全株で塊根の肥大形成が観察された。
以上の結果から、サツマイモにポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することで、葉、茎（蔓）、根（塊根）等の生産性が増加し、植物の生産性が改良できることが立証された。
【００６３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現コンストラクトの構造を示す図である。
【図２】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したサツマイモと野生株との茎・葉・蔓の比較を示す写真である。
【図３Ａ】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したサツマイモと野生株との根（塊根、イモ）の比較を示す写真である。
【図３Ｂ】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したサツマイモと野生株との根（塊根、イモ）の比較を示す写真である。
【図４】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したサツマイモと野生株との根（塊根、イモ）の肥大形成の比較を示す写真である。

Claims (37)

1. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良されたトランスジェニック植物及びその子孫。
2. ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項１記載の植物及びその子孫。
3. 該生産性ないし形質が改良された植物が、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物を形質転換して得られる形質転換植物である、請求項１記載の植物及びその子孫。
4. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の植物及びその子孫。
5. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、スペルミジン合成酵素をコードする遺伝子である請求項４記載の植物及びその子孫。
6. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項２記載の植物及びその子孫。
   （ａ）配列番号１（ＳＰＤＳ、１３２８）に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
   （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
7. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２記載の植物及びその子孫。
   （ａ）配列番号３（ＳＡＭＤＣ、１８１４）に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、
   （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
8. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２記載の植物及びその子孫。
   （ａ）配列番号５（ＡＤＣ、３０３７）に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
   （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
9. 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５’上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかのアンチセンスＤＮＡである請求項２に記載の植物及びその子孫。
10. 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５’上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域で２本鎖ＲＮＡを形成するセンスまたはアンチセンスＤＮＡである請求項２に記載の植物及びその子孫。
11. 生産性ないし形質が改良される器官が、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及び胚珠からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の植物及びその子孫。
12. 生産性ないし形質が栄養生長期よりも生殖生長期において顕著に改良される請求項１に記載の植物及びその子孫。
13. 改良された生産性ないし形質を有する植物が、双子葉植物である、請求項１に記載の植物及びその子孫。
14. 葉、茎、根、花、子房、果実、種子、繊維又はカルスの形態である請求項１に記載の植物及びその子孫。
15. 請求項１〜１０のいずれかに記載の植物及びその子孫から得られる葉、茎、根、花、子房、果実、種子、繊維又はカルス。
16. 請求項１〜１０のいずれかに記載の植物及びその子孫から得られる有用物質。
17. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された植物を作出する方法。
18. ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項１７記載の方法。
19. 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された植物を作出する方法。
20. ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子である請求項１９記載の方法。
21. 該形質転換細胞から植物体を再生する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
22. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２０に記載の方法。
23. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項２０記載の方法。
    （ａ）配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
24. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２０記載の方法。
    （ａ）配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
25. 該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２０記載の方法。
    （ａ）配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
    （ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
26. 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５’上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかである請求項２０に記載の方法。
27. 内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が、該遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５’上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域で２本鎖ＲＮＡを形成するセンスＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡである請求項２０に記載の植物及びその子孫。
28. 器官が、茎、塊茎、葉、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維及び胚珠からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１９に記載の方法。
29. 生産性ないし形質が栄養生長期よりも生殖生長期において顕著に改良される請求項１９に記載の方法。
30. 改良された生産性ないし形質を有する植物が、双子葉植物である、請求項１９に記載の方法。
31. 以下の工程：
    （１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
    （２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された生産性ないし形質を有する植物体を再生し、
    （３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
    （４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
    を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に改良された生産性ないし形質を有する形質が固定された植物の作出方法。
32. 以下の工程：
    （１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列の抑制因子を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
    （２）該形質転換細胞からカルスを誘導する
    を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に改良された生産性ないし形質を有する形質が固定されたカルスの作出方法。
33. 改良された生産性ないし形質を有する植物が、サツマイモ植物である、請求項１９から３２のいずれかに記載の方法。
34. 請求項３３に記載の方法により得られたサツマイモ植物を栽培し、サツマイモを収穫することを特徴とする比較対照サツマイモに比べて環境ストレスの有無ないし程度にかかわらず生産性ないし形質が改良されたサツマイモの製造方法。
35. 請求項３３に記載の方法により得られたサツマイモ植物を栽培し、サツマイモを収穫する工程、
    得られたサツマイモからサツマイモデンプンを分離する工程
    を包含するサツマイモデンプンの製造方法。
36. 請求項３３に記載の方法により得られたサツマイモ植物を栽培し、サツマイモを収穫する工程、
    得られたサツマイモからサツマイモデンプンを分離する工程
    該サツマイモデンプンを生分解性プラスチックに変換する工程
    を包含する生分解性プラスチックの製造方法。
37. 生分解性プラスチックがポリ乳酸である請求項３６に記載の方法。

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