JP4649816B2 - 環境ストレス抵抗性を改良した植物及びその作出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の改良された環境ストレス抵抗性を有する植物、詳細には改良された酸化ストレス抵抗性、除草剤ストレス抵抗性、塩ストレス抵抗性、浸透圧ストレス抵抗性、水ストレス抵抗性、低温ストレス抵抗性を有する植物に関する。また、本発明は該植物の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物はそれぞれの生息地の温度や塩などの様々な環境ストレスに適応して生活している。しかし、例えば温度ストレスにおいては、植物が生育適温の上限または下限を越えるような環境に遭遇すると高温ストレスや低温ストレスを受け、徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて障害をひきおこす。これまで、種々の温度環境に適応した野生の植物を食料作物や工芸作物などに利用するために、選抜や交雑育種など育種的手段によって作物の温度適応性の拡大に努めてきた。また、野菜や花卉、果樹等の園芸作物においては育種的手段に加えて、施設園芸で栽培可能な期間の拡大を図ってきた。しかし、特に日本は南北に長く、地域によっては気候が著しく異なるとともに、四季の変化が著しいので地域や季節によっては作物は生育に不適な温度環境にさらされる危険性が大きい。例えば、熱帯を起源とするイネは、明治以来の品種改良によって東北地方や北海道などの冷涼地でも栽培できるようになり、現在ではこれらの地域の基幹作物として栽培されているが、これらの地域では初夏に異常低温があると冷害を受け、著しい減収になることが現在でも問題になっている。近年、地球温暖化やエルニーニョ現象が原因と考えられる異常気象によって作物が重大な被害を受け、１９９３年のひどい冷害による米不足は記憶に新しい。また、野菜類についてみると、トマト、キュウリ、メロン、スイカなど果菜類の中には熱帯起源の作物が多い。これらの作物は需要が大きく農業経営上も重要性の大きい作物で早くから施設栽培に取り入れられてきた。しかし、昭和４９年のオイルショック以来、施設園芸における省資源や暖房コストの低減が問題となっている。施設園芸における省資源については温室の構造的なものから栽培技術まで各方面から検討されているが、最も基本的なことは作物の低温ストレス抵抗性を高めることである。
【０００３】
塩ストレスについては全陸地面積の約１０％が塩害地域といわれ、近年東南アジアやアフリカなどの乾燥地を中心に塩類土壌の拡大が農業上深刻な問題となっている。
【０００４】
水ストレス（浸透圧ストレス）は植物にとって重要なストレスで、温度が制限要因とならないときには降雨量とその分布によって大きな影響を受ける。特に、主要な作物栽培地域である半乾燥地帯などでは、作物の生育や収量は水ストレスによって著しく左右される。
種々の環境ストレス抵抗性を高めるために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。
【０００５】
これまでに遺伝子工学技術を利用した、環境ストレス抵抗性植物の作出が行われている。低温ストレス抵抗性の改良に用いられたに遺伝子としては、生体膜脂質の脂肪酸の不飽和化酵素遺伝子（ω−３デサチュラーゼ遺伝子、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、ステアロイル−ＡＣＰ−不飽和化酵素遺伝子）や光合成に関与するピルビン酸リン酸ジキナーゼ遺伝子、凍結保護・防止活性を持つタンパク質をコードする遺伝子（ＣＯＲ１５、ＣＯＲ８５、ｋｉｎ１）等が報告されている。
【０００６】
塩ストレスや水ストレス抵抗性の改良に用いられた遺伝子としては、浸透圧調節物質のグリシンベタイン合成酵素遺伝子（コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）、プロリン合成酵素遺伝子（１−ピロリン−５−カルボン酸シンセターゼ）等が報告されている。
【０００７】
酸化ストレス抵抗性の改良に用いられた遺伝子としては、活性酸素分子種の消去系酵素遺伝子（スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンレダクターゼ等）等が報告されている。
除草剤ストレス抵抗性の改良に用いられた遺伝子としては、芳香族アミノ酸の生合成酵素遺伝子（５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンダーゼ遺伝子）、無毒化酵素遺伝子（ニトリラーゼ遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等が報告されている。しかし、これらの遺伝子を形質転換した植物は、除草剤ストレス抵抗性植物では一部実用化されているが、多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。
【０００８】
ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては▲１▼核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化▲２▼種々の核酸合成系への促進作用▲３▼タンパク質合成系の活性化▲４▼細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化などが知られている。植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されている。
【０００９】
近年、ポリアミンの種々の環境ストレスに対する関わりが報告されている。低温ストレス（非特許文献１、２、３）、塩ストレス（非特許文献４）、酸ストレス（非特許文献５）、浸透ストレス（非特許文献６）、オゾンストレス（非特許文献７）、病原菌感染ストレス（非特許文献８）、除草剤ストレス（非特許文献９）などとの関わりが報告されているが、いずれの報告も生長発育反応やストレス抵抗性とポリアミン濃度の変化の関連性からポリアミンの関与を推定したものであり、ポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連酵素遺伝子と環境ストレス抵抗性との遺伝子レベルでの関与についてはほとんど報告されていない。
【００１０】
植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（非特許文献１０）、トマト（非特許文献１１）、シロイヌナズナ（非特許文献１２）、エンドウ（非特許文献１３）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（非特許文献１４）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（非特許文献１５）、ホウレンソウ（非特許文献１６）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（非特許文献１７）等から単離されている。ＳＰＭＳ遺伝子はシロイヌナズナ（非特許文献１８）から単離されている。
【００１１】
【非特許文献１】
J. Japan Soc. Hortic. Sci., 68, 780-787, 1999
【００１２】
【非特許文献２】
J. Japan Soc. Hortic. Sci., 68, 967-973, 1999
【００１３】
【非特許文献３】
Plant Physiol. 124, 431-439, 2000
【００１４】
【非特許文献４】
Plant Physiol., 91, 500-504, 1984
【００１５】
【非特許文献５】
Plant Cell Physiol., 38(10), 156-1166, 1997
【００１６】
【非特許文献６】
Plant Physiol. 75, 102-109, 1984
【００１７】
【非特許文献７】
Environ. Pollut., 61, 95-106, 1989
【００１８】
【非特許文献８】
New Phytol., 135, 467-473, 1997
【００１９】
【非特許文献９】
Plant Cell Physiol., 39(9), 987-992, 1998
【００２０】
【非特許文献１０】
Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990
【００２１】
【非特許文献１１】
Plant Physiol., 103, 829-834, 1993
【００２２】
【非特許文献１２】
plant physiol., 111, 1077-1083, 1996
【００２３】
【非特許文献１３】
Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995
【００２４】
【非特許文献１４】
Biocem. J., 314, 241-248, 1996
【００２５】
【非特許文献１５】
Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994
【００２６】
【非特許文献１６】
Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995
【００２７】
【非特許文献１７】
Plant cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998
【００２８】
【非特許文献１８】
The EMBO Journal, 19(16), 4248-4256, 2000
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を人為的に制御して、ポリアミンレベルを変化させることによって、環境ストレス抵抗性が改良された組換え植物を作出することである。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、ポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離して、該遺伝子を植物に導入して内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させて種々の環境ストレス抵抗性のパラメーターが改良されることを見出した。
【００３１】
ポリアミンは分子中にアミンを多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとしては二分子のアミンを含むプトレシン、三分子のアミンを含むスペルミジン、四分子のアミンを含むスペルミン等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはプトレシンについてはＡＤＣ、ＯＤＣ、スペルミジンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＤＳ、スペルミンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＭＳ等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子についても既に幾つかの植物で単離されている。さらに、幾つかのポリアミン代謝関連酵素遺伝子については植物への導入が試みられているが、得られた形質転換植物で環境ストレス抵抗性の改良についてはほとんど報告されていない。
【００３２】
このような状況下に、本発明者らは植物の低温ストレス抵抗性を改良するために鋭意、検討した結果、低温ストレス抵抗性を示す植物組織では低温ストレス遭遇時に特にポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、スペルミン含量が増大することを見いだし、実際に低温ストレス抵抗性を示す植物組織からスペルミジンやスペルミン生合成に関わるポリアミン代謝関連遺伝子（ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ）とシロイヌナズナからスペルミン合成酵素遺伝子（ＳＰＭＳ）を単離、同定した。さらに、該遺伝子を植物に導入して内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させて種々の環境ストレス抵抗性のパラメーターが改良されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３３】
本発明は、以下の発明を提供するものである。
１． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物に比べて少なくとも１種の環境ストレス抵抗性が改良された植物及びその子孫。
２０． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する植物の作出方法。
２２． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する植物の作出方法。
３９． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列の抑制因子を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する植物体を再生し、
（３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
（４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する形質が固定された植物の作出方法。
４０． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列の抑制因子を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞からカルスを誘導する
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する形質が固定されたカルスの作出方法。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明において「環境ストレス」とは、高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、浸透圧、乾燥、カドミウム、オゾン、大気汚染、紫外線、重金属、病原体、塩、除草剤、強光、冠水、害虫などの環境からうけるストレスをいう。
本発明で得られる植物は、栽培環境に左右されずポリアミンの発現量が増大し、種々の環境ストレス抵抗性を改良することができる。ポリアミン量を調節する核酸配列としては、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が挙げられる。内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は植物体中のポリアミン量を増加させる。例えば、スペルミン合成酵素遺伝子の抑制因子を植物体中で発現させることで、スペルミジンまたはプトレシン量を増加させることができる。
本発明において「該ポリアミン量を調節する核酸配列を有していない植物」とは該核酸配列（例えば内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子）をゲノム上に有しないあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにポリアミン代謝関連酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジェニック植物などをすべて包含する。
【００３５】
本発明で言うところの「ポリアミン」は生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物である。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミンなどが挙げられる。
本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミジンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、スペルミンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。
【００３６】
アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：arginine decarboxylase EC4.1.1.19.）はＬ−アルギニンからアグマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ornithine decarboxylase EC4.1.1.17.）はＬ−オルニチンからプトレシンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ：S-adenosylmethionine decarboxylase EC4.1.1.50.）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチルチオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：spermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ：spermine synthase EC2.5.1.22.）はスペルミジンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。
【００３７】
本発明における「内因性」とは、植物が生来有しているものを意味する。従って本発明の「内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」は、宿主植物が生来染色体上に有しているポリアミン代謝関連酵素遺伝子を意味する。「内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子」とは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制するものであれば特に限定されず、例えばポリアミン代謝関連酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡが例示される。これらのアンチセンスＤＮＡは、いずれの由来であってもいいが、例えば、種々の植物から単離することができる。具体的には、双子葉植物、例えばウリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルファルファ、カウピー（Vigna unguiculata）等のマメ科；アオイ科；キク科；アカザ科；ヒルガオ科からなる群から選ばれたもの、又は単子葉植物、例えば稲、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。好ましくは、ウリ科またはアブラナ科植物、より好ましくはクロダネカボチャまたはシロイヌナズナがよい。
【００３８】
植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡを単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織から単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。さらに好ましくは環境ストレス抵抗性を示す部位である。
【００３９】
本発明において使用される内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子の好ましい例として、スペルミジン合成酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミン合成酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、
・配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号７に示される塩基配列中塩基番号１〜１０２０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
のアンチセンスＤＮＡが挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡが挙げられる。更に、
・該上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡが挙げられる。
ここでいう「ストリンジェント条件」とは、特定ポリアミン代謝関連酵素遺伝子配列にコードされるポリアミン代謝関連酵素と同等の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制する塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
ここでいう「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、挿入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。本発明にはこのような修飾が加えられ、かつポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、polyＡテールや５‘、３’末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、アミノ酸を欠失するような範囲で塩基が「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が「付加」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制することが必要である。好ましくは、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。
このような改変されたＤＮＡは例えば、部位特異的変異法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982）等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００４０】
本発明における「内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子」は遺伝子工学的手法で少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現が抑制できればいかなる方法でも良く、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法、Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンを用いた遺伝子破壊法等が挙げられる。好ましくはアンチセンス法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法が挙げられる。
【００４１】
アンチセンス法とは、標的となる遺伝子のｃＤＮＡ又はそのｍＲＮＡ前駆体に相補的な配列のＤＮＡ断片（アンチセンスＤＮＡ）を植物体に導入して、アンチセンスＲＮＡを産生させる方法である。産生したアンチセンスＲＮＡは、その標的遺伝子のｍＲＮＡと塩基対形成を生じさせることで標的遺伝子のタンパク質の翻訳を阻害する方法である。アンチセンスＤＮＡの配列は少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡと塩基対を形成するものであればいかなるものでもよい。好ましくは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と同じ由来の配列、またはポリアミン代謝関連酵素遺伝子は種間相同性が高いことから、由来が異なる配列でもよい。アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡと塩基対形成を生じさせる長さであればよいことから、全長配列、部分配列であってもよい。必ずしも同じ由来の配列である必要はない。
本発明における「アンチセンスＤＮＡ」とは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する遺伝子を意味する。アンチセンスＤＮＡは、例えば配列番号１、３、５、７の塩基配列に相補的なものであり、アンチセンスＲＮＡはそれらから産生されるものである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法とは、近年開発された方法で、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入することで、そのｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡを特異的に分解し、遺伝子発現を抑制する手法である。植物におけるＲＮＡｉは、１９９８年にヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写させて形質転換イネを作製し、外因性遺伝子であるＧＵＳ（β―グルクロニダーゼ）遺伝子の発現抑制（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959-13964, 1998）、２０００年にはシロイヌナズナの内因性遺伝子の発現抑制（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4985-4990, 2000）が報告されている。さらに、ｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を直接、若しくはヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写するベクターを植物体に遺伝子導入することや、プロトプラストにエレクトロポレーションすることでＲＮＡｉが起こることが報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11981-11986, 2002、Plant J., 24, 895-903, 2000）。これまでに、イネ、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ワタなど多くの植物で報告（Plant J., 27, 581-590, 2001、Plant Cell, 14, 857-867, 2002）され、ＲＮＡｉは多岐にわたり普遍的な機構であることが示されている。
本発明の「２本鎖ＲＮＡ」とは少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制する領域を持つ配列であればいかなるものでもよい。好ましくは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と同じ由来の配列、またはポリアミン代謝関連酵素遺伝子は種間相同性が高いことから、由来が異なる配列でもよい。２本鎖ＲＮＡの長さは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡと塩基対形成を生じさせる長さであればよいことから、全長配列、部分配列であってもよい。必ずしも同じ由来の配列である必要はない。「２本鎖ＲＮＡを形成するセンスＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ」とは、例えば植物中で機能し得るプロモーターにポリアミン代謝関連酵素遺伝子のセンスＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リンカー等を含む発現ベクターを植物体に遺伝子導入することで２本鎖ＲＮＡが形成されるものであればよい。
【００４２】
本発明において、「環境ストレス」としては、上述のごとく、高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、浸透圧、乾燥、カドミウム、オゾン、大気汚染、紫外線、重金属、病原体、塩、除草剤、強光、冠水、害虫などの環境から受けるストレスが例示される。この中で「酸化ストレス」とは、植物の生育適活性酸素濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、酸化ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「除草剤ストレス」とは、植物の生育適除草剤濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、除草剤ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「塩ストレス」とは、植物の生育適塩濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、塩ストレスを受けた植物は過剰な塩が細胞内に流入して徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「浸透圧ストレス」とは、植物の生育適浸透圧の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、浸透圧ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「水ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、水ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「低温ストレス」とは、植物の生育適温度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、低温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。
本発明において、「環境ストレス抵抗性が改良された植物」および「改良された環境ストレス抵抗性を有する植物」とは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して環境ストレス抵抗性が付与若しくは向上した植物をいう。ポリアミンは種々の環境ストレス（高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、浸透圧、塩、乾燥、カドミウム、オゾン、大気汚染、紫外線、病原体、害虫、除草剤など）抵抗性に関わっていることから、これらの様々な環境ストレス抵抗性が改良される。例えば、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を植物に導入することにより、酸化ストレス抵抗性（耐性）、除草剤ストレス抵抗性（耐性）、塩ストレス抵抗性（耐性）、浸透圧ストレスに対する抵抗性（耐性）、若しくは水ストレスに対する抵抗性（耐性）が、該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を有していない植物に比べて向上した植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
具体的には、「酸化ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する酸化ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「除草剤ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する除草剤ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「塩ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する塩ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「浸透圧ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する浸透圧ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「水ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する水ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。これによって、栽培の安定化、生産性、収量の向上、栽培地域、面積の拡大などが期待できる。更に、「除草剤ストレス抵抗性が改良された植物」においては、除草剤の使用量の低下や安定な除草剤の広範な使用などが期待できる。
【００４４】
本発明の植物には、植物体全体（全樹）に限らず、そのカルス、種子、あらゆる植物組織、葉、茎、根、花、果実、繊維などが含まれる。更にその子孫も本発明の植物に含まれる。
【００４５】
本発明において「植物及びその子孫から得られる有用物質」とは、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して環境ストレス抵抗性が付与若しくは向上した植物およびその子孫で生産された有用物質をさし、有用物質としては例えば、アミノ酸、油脂、デンプン、タンパク質、フェノール、炭化水素、セルロース、天然ゴム、色素、酵素、抗体、ワクチン、医薬品、生分解性プラスチックなどが含まれる。
【００４６】
本発明の植物は、該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を有していない植物に、遺伝子工学的手法により内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が導入された当代の植物体で該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が発現し、それによって環境ストレス抵抗性が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましい。該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。
【００４７】
植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。
【００４８】
３５Ｓプロモーターのような器官全体に恒常的に発現させるプロモーターだけでなく、低温、高温、塩、乾燥、光、熱、ホルモンあるいは傷害等の調節性のプロモーターを用いれば、生活環境に応じて目的核酸配列（例えば抑制因子）を発現させることができる。例えば、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、BN115プロモーター：Plant physiol.,106, 917-928, 1999）を用いることによって、低温時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し低温ストレス抵抗性を改良することができる。さらに、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子と植物が乾燥に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、Atmyb2プロモーター：The Plant Cell, 5, 1529-1539, 1993）を用いることによって、乾燥時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し乾燥ストレス抵抗性を改良することができる。
【００４９】
また、器官、または組織特異的なプロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけにポリアミン代謝を制御することができる。
【００５０】
本発明の発現ベクターにおいて、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。例えば、ターミネーターＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子等が挙げられる。
【００５１】
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧がかかった条件を実現できるという利点もある。
【００５２】
さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、ｐＵＣ系またはｐＢＲ系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。
【００５３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacteriumu rhizogenes）による感染を利用して外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の２５ｂｐボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１やｐＢＩ１２１（ともにCLONTECH社）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するVir領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあってトランスに作用する。
【００５４】
植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の課程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の課程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法および、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意な部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的核酸配列（例えば抑制因子）も植物体全体に導入される。
【００５５】
以下に、具体例として、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得方法とアグロバクテリウムによる目的核酸配列（例えば抑制因子）の導入および形質転換植物の作出方法を例示する、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子に関しては以下の記載を参考にして当業者は容易に植物に導入し、形質転換植物を作出することが可能である。
１．ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得
（１）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
昼１８℃／夜１４℃・３日間の低温処理を行ったクロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）の根組織から常法に従い、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを抽出する。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡから市販のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等を用いてＰＣＲ用に使用するｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、３’末端に２つのｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎを持つ修飾ｌｏｃｋ−ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用いてｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したｃＤＮＡを得る。該２本鎖ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼにより末端を平滑化し、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡアダプターをライゲーション反応により結合させ、アダプター結合二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
（２）ＰＣＲプライマーの設計
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子としてＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＳＰＭＳ遺伝子、ＯＤＣ遺伝子を単離することができる。ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナやヒヨス、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ、ホウレンソウ、タバコ、ＡＤＣ遺伝子はダイズ、エンドウ、トマト、ＳＰＭＳ遺伝子はシロイヌナズナ、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）等から単離されており、既に塩基配列が決定している。従って、決定している既知の塩基配列を比較し、非常に保存されている領域を選抜し、ＤＮＡオリゴマーを合成しＰＣＲ用プライマーを設計することができる。
(３)ＰＣＲによるＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＳＰＭＳ遺伝子断片の取得
上記（１）の方法で作製したＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、上記（２）の方法で設計したプライマーを使用して、それぞれＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離し、グラスミルク法などで精製する。精製したＰＣＲ産物はＴＡベクターなどのクローニングベクターに連結させる。
【００５６】
クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはダイデオキシ法等により決定できる。いずれの方法も市販されているキットを用いて行うことができ、配列決定を自動的に行うオートシーケンサーを使用してもよい。
（４）完全長遺伝子の単離
完全長の遺伝子を得るためには、常法に従って、プラークハイブリダイゼーション、ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）法やＭａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ法等により完全長の遺伝子を得ることができる。
【００５７】
このようにして取得した遺伝子は、ポリアミン生合成に関与する遺伝子であり、この遺伝子を利用して巧妙に、即ち、遺伝子発現を分子生物学的に制御することにより、ポリアミンレベルの制御が可能となり、種々の環境ストレス抵抗性が改良された植物の作出も可能になる。
２．シロイヌナズナにおけるアグロバクテリウムによる目的核酸配列（例えば抑制因子）の導入、および形質転換植物の作出。
【００５８】
上記１．で取得した遺伝子から得られた核酸配列（例えば抑制因子）を植物宿主に導入することにより、種々の環境ストレス抵抗性が改良された特性を有するトランスジェニック植物を作出することができる。
（１）発現コンストラクトの作製および、アグロバクテリウムの形質転換
発現コンストラクトの作製は前記１．で得られたポリアミン代謝関連酵素遺伝子の核酸配列（例えば抑制因子）をオープンリーディングフレームをすべて含むまたは含まないような適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適当なリンカーを連結し、植物形質転換用ベクターに挿入して作製することができる。植物形質転換用ベクターとしては、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１などを用いることができる。
【００５９】
作製した発現コンストラクトを大腸菌中で増幅後、発現コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１等に、三者接合法（Nucleic Acid Research, 12, 8711, 1984）、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により形質転換することができる。例えば、三者接合法は目的核酸配列（例えば抑制因子）を含んだ発現コンストラクトを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養して、抗生物質（例えばリファピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン等）を含んだ培地上で培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得ることができる。
（２）トランスジェニック植物の作出
本発明において、遺伝子導入を行う植物としては、植物体全体、植物器官（例えば葉、茎、根、花器、生長点、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞などを挙げることができる。
（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えばカルス再生法（Plant Cell Reports, 12, 7-11, 1992）で植物に感染させて目的核酸配列（例えば抑制因子）を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシゲ・スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ｍｌ／リットル、ｐＨ６．２）に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用いてＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μｇ／ｍｌ、カイネチンを０．０５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上でカルス培養を行う。プロモーターに目的核酸配列（例えば抑制因子）を接続し、カナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、カルス化した根の切片を浸し、数日間ＣＩＭプレート上で共存培養する。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行い、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、N6-[2-イソペンテニル] アデニンを終濃度５μｇ／ｍｌ、インドール酢酸（ＩＡＡ）を終濃度０．１５μｇ／ｍｌ、クラフォランを終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上で数日間培養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳプレート（カナマイシンおよびハイグロマイシンＢを含有するプレート）上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が５ｍｍ程度の大きさになり、ロゼット葉を形成するまで培養する。完全なロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩＭプレート（ＭＳＯプレートにＩＡＡを終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）に移植する。大きなカルスが付いていると、発根してもカルスを介して根が出ていて、ロゼットとは維管束がつながっていないことが多い。約８〜１０日後、無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮＯ3 、２．５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4 、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3 ）2 、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ Ｈ3 ＢＯ3 、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2 、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4 、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ4 、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ2 ）１ｍｌ／リットル〕に浸したロックウール上に定植する。開花し、さやを形成した植物体は無機塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロマイシンＢを終濃度５Ｕ／ｍｌとなるように加えたもの）に播種して発芽させることにより形質転換体を得ることができる。
さらに、（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えば減圧浸潤法（The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999）で植物に感染させて目的核酸配列（例えば抑制因子）を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って培養土（例えばメトロミックス等）に播種して、２２℃、長日条件下（例えば１６時間日長・８時間暗黒等）で栽培する。約３〜４週間後に伸長した主軸（花茎）を切除して、側枝の誘導を開始させる。摘心約１週間をに培養した形質転換アグロバクテリウム懸濁液にシロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れてバキュームポンプで約−０．０５３Ｍｐａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、１０分間、室温放置する。感染後の鉢を深底トレイに移して、横倒しに置き、トレイの底に少量の水を滴下して透明な覆いを被せ多湿条件下で約１日放置する。感染後の鉢を起こして、２２℃・長日条件下で栽培を開始して、種子の収穫を行う。
【００６０】
約２〜４週間の間、種子の収穫を行い、収穫した種子は茶こしなどで莢やゴミを取り除き、デシケーター内で乾燥保存する。
【００６１】
トランスジェニック植物体の選択は、収穫した種子を常法に従って殺菌処理して、約９ｍｌの０．１％寒天水溶液に懸濁して、選択培地（例えば、１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．８％ 寒天、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、４０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンなど）に広げ、２２℃で無菌栽培する。抗生物質に対して抵抗性を示すトランスジェニック植物体は順調に生長して、約１〜２週間で同定することができる。本葉が約４〜６枚展開したトランスジェニック植物体を培養土を含んだ鉢に移植して２２℃で長日栽培を開始する。
【００６２】
得られたトランスジェニック植物より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、遺伝子導入の有無を確認することができる。
【００６３】
また、トランスジェニック植物や、非トランスジェニック植物より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のセンス配列、もしくはアンチセンス配列を有するプローブを作製し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行い、目的核酸配列（例えば抑制因子）の発現の状態を調べることができる。
【００６４】
また、得られたトランスジェニック植物からカルス誘導を行い、カルスを作出することができる。
【００６５】
減圧浸潤法で得られたトランスジェニック植物（Ｔ１）の、自家受粉により得られるＴ２種子の形質転換出現比率は、通常メンデルの法則に従う。例えば、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が一遺伝子座にヘテロ（heterozygous）に組み込まれた場合、Ｔ２種子では形質転換体は３：１の割合で分離する。Ｔ２種子を栽培して、自家受粉させて得られるＴ３種子において、形質転換体がすべての種子で出現すれば、該Ｔ２形質転換植物はホモ接合体（homozygote）であり、該形質転換植物が３：１に分離すれば、該Ｔ２形質転換植物は導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてヘテロ（heterozygote）であると決定できる。
【００６６】
このようにして選抜された、導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてホモ接合体である植物は、改良された環境ストレス抵抗性が固定された系統として、種子産業の分野において極めて有用である。
【００６７】
上記に示した、サザン解析やノーザン解析でポリアミン代謝関連酵素遺伝子の遺伝子発現解析を行ったトランスジェニック植物はポリアミン含量や種々の環境ストレス抵抗性の評価を行うことができる。
【００６８】
例えば、ポリアミンの定量は、０．０５〜１ｇの試料をサンプリングして、５％過塩素酸水溶液を加えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシル化またはベンゾイル化等で蛍光標識したの後、ＵＶ検出器を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析することができる。
【００６９】
例えば、酸化・除草剤ストレス抵抗性は、０〜３μＭのパラコートを含んだ培地上で、２０〜２５℃で生育させて生育状況（発芽率、生存率など）等を調べることにより評価することができる。塩ストレス抵抗性は１０〜３００ｍＭのＮａＣｌを含んだ培地上で、２０〜２５℃で生育させて生育状況や塩ストレス障害等を調べることにより評価できる。浸透圧・水ストレス抵抗性は、５０〜５００ｍＭのソルビトールを含んだ培地上で、２０〜２５℃で生育させて生育状況や浸透圧・水ストレス障害等を調べることにより評価することができる。低温ストレス抵抗性は−１０〜１５℃に１〜７日間低温処理後、２０〜２５℃で生育させて生育状況や低温障害等を調べることにより評価することができる。
【００７０】
本発明の形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物などが挙げられる。例えば、サツマイモ、トマト、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、マメ、サトイモ、ホウレンソウ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ナタネ、ソルガム、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、サトウキビ、アカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、キク、ペチュニア、トレニア、キンギョソウ、シクラメン、カスミソウ、ゼラニウム、ヒマワリ、シバ、ワタ、マツタケ、シイタケ、キノコ、チョウセンニンジン、柑橘類、バナナ、キウイ等が挙げられる。好ましくは、サツマイモ、トマト、キュウリ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ペチュニア、トレニア、ユーカリ、ワタである。
【００７１】
本発明の環境ストレス抵抗性が改良された植物は、環境ストレスを受ける地域のみならず、環境ストレスを受けない地域であっても予測できない環境ストレスに対処するために使用（生育）されるものであるが、環境ストレスを受ける地域に専ら使用されるものであってもよい。
本発明により、植物の環境ストレス耐性を改良することができ、植物の生育過程において遭遇する様々な環境ストレスによる障害の回避や生長抑制を軽減することができ栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大、除草剤の低減などが期待できる。
【００７２】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローニング
（１）ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製
クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）をバーミキュライトに播種し、子葉展開時に市販の床土（サンサン床土；タキイ種苗社製）を詰めた鉢に移植した。鉢上げしたクロダネカボチャを植物栽培用のインキュベーター（気温 昼２６℃／夜２２℃、１３時間日長）内に置いた。第２本葉展開時にインキュベーター内の温度を昼１８℃／夜１４℃まで下げ低温処理を開始した。低温処理３日後に、根、茎、葉に分けてサンプリングした。ＲＮＡ抽出まで−８０℃のフリーザーに保存した。
【００７３】
約４gのクロダネカボチャの根組織を直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕した。その後、10 mlの抽出用0.2Mトリス酢酸緩衝液〔5M guanidine thiocyanate、0.7%β−mercaptoethanol、1%polyvinylpyrrolidone（M.W.360,000）、0.62%N−Lauroylsarcosine Sodium Salt、pH8.5）を加えポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA社製）を用い氷冷下2分間粉砕した。ただし、β−メルカプトエタノールとポリビニルピロリドンは使用する直前に添加した。その後、粉砕液を17,000×gで20分間遠心分離し、上清を回収した。
【００７４】
この上清をミラクロスに濾渦し、その濾液を超遠心分離管に入れた5.7M塩化セシウム溶液1.5 mlに静かに重層し、155,000×g、20℃で20時間遠心した後、上清を捨てRNAの沈殿を回収した。この沈殿を3mlの10mM Tris-HCl、1mM EDTA・2Na、pH8.0（ＴＥ緩衝液と呼ぶ）に溶解し、さらに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（容積比、25:24:1）を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を回収した。得られた水層に、1/10倍量の3M 酢酸ナトリウム（氷酢酸でpH6.2に調製）と、2.5倍量のエタノールを添加して良く混合し、-20℃で一晩静置した。その後、17,000×gで20分間遠心分離し、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。
【００７５】
この乾燥標品を500μlの前述のTE緩衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を65℃で5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに2×結合緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、1M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）を等量になるようにＲＮＡ溶液に加え、平衡化緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、0.5M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）で予め平衡化したオリゴｄＴセルロースカラム（Clontech社製）に重層した。次いで、カラムを約１０倍量の前述の平衡化緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、pH7.5）でpoly(A)+RNAを溶出した。
【００７６】
得られた溶出液に1/10倍量の前述の3M 酢酸ナトリウム水溶液と、2.5倍量のエタノールを加え混合し、-70℃で静置した。その後、10,000×gで遠心分離を行い、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度500μlのTE緩衝液に溶解し、オリゴｄＴセルロースカラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したクロダネカボチャの根由来のpoly(A)+RNAはＰＣＲ用のｃＤＮＡライブラリーと完全長遺伝子単離用のｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。
（２）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
cDNAライブラリーの作製はMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャの根由来のpoly(A)+RNAを鋳型として３’末端に２つのdegenerate nucleotide position を持つ修飾lock-docking オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983)）に従い２本鎖cDNAを合成した。
得られたcDNAの両末端にMarathon cDNAアダプター（T4 DNA ligaseによりds cDNAの両末端へ結合しやすくなるように５’末端をリン酸化したもの）を連結した。得られたアダプター結合のｃＤＮＡをクロダネカボチャ根由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーとした。
【００７７】
シロイヌナズナ由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーはクイッククローンｃＤＮＡ（クロンテック社製）を用いた。
（３）ＰＣＲ用プライマーの設計
既に植物や哺乳類から単離されているアルギンニン脱炭酸酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子の決定されている塩基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存されている領域を選び出し、ＤＮＡオリゴマーを合成した（配列プライマーＩ〜VI）。
ＳＰＤＳプライマーＩ（配列番号９）：５’−ＧＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＣＡ−３’
ＳＰＤＳプライマーII（配列番号１０）：５’−ＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡ−３’
ＳＡＭＤＣプライマーIII（配列番号１１）：５’−ＴＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣ−３’
ＳＡＭＤＣプライマーIV（配列番号１２）：５’−ＧＣＴＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴ−３’
ＡＤＣプライマーＶ（配列番号１３）：５’−ＧＧＧＣＴ（Ｔ／Ｇ）ＧＧＡ（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＣＴＡ（Ｃ／Ｔ）−３’
ＡＤＣプライマーVI（配列番号１４）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＴＣ（Ｇ／Ａ）ＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＧＴ−３’
ＳＰＭＳプライマーVII（配列番号１５）：５’−ＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧＡＧＧＴＣＡＴ−３’
ＳＰＭＳプライマーVIII（配列番号１６）：５’−ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＣＡＣ−３’
（４）ＰＣＲによる増幅
（２）で得られたＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、（３）で設計した配列プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのステップは最初、９４℃、３０秒、４５℃、１分間、７２℃、２分間で５サイクル、続いて９４℃、３０秒、５５℃、１分間、７２℃、２分間で３０サイクル行った。
（５）アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロース電気泳動で分離し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。
（６）ＰＣＲ産物の確認と回収
検出された増幅バンドを確認し、カミソリの刃を用いてアガロースゲルから切り出した。切り出したゲルを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてゲルからＤＮＡ断片を単離精製を行った。回収したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴクローニングベクター（Promega社製）にサブクローニングし、大腸菌に形質転換後、常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
（７）塩基配列決定
得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行った。ＳＰＤＳ遺伝子については３種類の遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子については１種類の遺伝子、ＡＤＣ遺伝子については２種類の遺伝子、ＳＰＭＳ遺伝子は１種類の遺伝子が単離された。
（８）ホモロジー検索
これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデータベースとホモロジーサーチを行うとＳＰＤＳ遺伝子は既知の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子と７０％の相同性を示した。ＳＡＭＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子と７０％以上の相同性を示した。ＡＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＡＤＣ遺伝子と６７％以上の相同性を示した。ＳＰＭＳ遺伝子についてはシロイヌナズナ由来のＳＰＭＳ遺伝子と１００％の相同性を示し、完全長鎖の遺伝子を単離した。
（９）完全長遺伝子の取得
完全長遺伝子はプラークハイブリダイゼーション法で取得した。cDNAライブラリーの作製はZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャ根由来のpoly(A)+RNAを鋳型としてオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983)）に従い２本鎖cDNAを合成した。
【００７８】
得られたcDNAの両末端にEcoRIアダプター（内部にXho IとSpe Iサイトを持つ）を連結し、Xho Iで消化した後、それをλファージベクター、λZAP IIアームのEcoRIとXho I部位に連結後、インビトロパッケージングキット（Stratagene社製、GIGAPACK Gold）を用い、パッケージングを行い、大腸菌SURE株（OD660=0.5）に感染させることにより多数の組換えλファージを得た。これをクロダネカボチャ根由来のcDNAライブラリーとした。このライブラリーのサイズは8.0×106であった。
【００７９】
プローブの作製は（６）で調製したＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子のプラスミドＤＮＡからインサートｃＤＮＡを単離・調製し、得られたcDNAを鋳型として、Random Primed DNA Labeling Kit（USB社製）を用いて、32P標識プローブを作製した。得られた32P標識cDNAをプローブに用いた。
【００８０】
前記、クロダネカボチャ根由来のcDNAライブラリーを構成するファージを大腸菌に感染させてLB寒天培地上で増殖させ、約50,000個のファージDNAをナイロンメンブレン（ハイボンド−N、アマシャム社製）に写し取った。
【００８１】
ファージDNAを写し取ったナイロンメンブレンをアルカリ変性液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）を含んだ濾紙上に移し、4分間放置し、次に中和液（0.5M Tris-HCl、1.5M NaCl、pH8.0）を含んだ濾紙上に移し５分間放置した。2×SSC（0.3M NaCl、0.03Ｍ クエン酸三ナトリウム）で洗浄した後、メンブレンをストラタリンカー（Stratagene社製）を用いDNAの固定を行なった。固定処理を行ったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液（50%ホルムアミド、0.5%SDS、6×SSPE（3M NaCl、0.2M NaH2PO4、20mMEDTA・2Na、pH7.4）、5×デンハルト溶液（0.1% Ficoll、0.1% Polyvinylpyrrolidone、0.1% bovine serum albumin）、50μg/ml変性サケ精子DNAを含有中において、42℃で3時間プレハイブリさせ、作製したcDNAプローブを加え42℃で18時間ハイブリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、2×SSC、1×SSC、0.5×SSCおよび0.1×SSCを含有する溶液を用いて、42℃で1時間〜2時間洗浄した。このメンブレンを乾燥した後、Ｘ線フィルムを密着させて一晩感光させた。
【００８２】
その結果、ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子断片から得たプローブでハイブリダイズした陽性クローンを選抜することができた。
【００８３】
陽性クローンのファージDNAそれぞれから、インビボ・エクシジョン法によりcDNAインサートを持つプラスミドクローンを調製した。インビボ・エクシジョン法は、ZAP-cDNA Synthesis Kit（stratagene社製）の方法に従った。
【００８４】
ＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子を含む各ファージ液200μl、大腸菌XL1-Blue懸濁液200μl、ヘルパーファージR408懸濁液１μlを混ぜ37℃で15分間インキュベートした後、3mlの2×YT培地を加え37℃で2時間振蘯培養し、70℃で20分間処理し、遠心分離（4,000×g、10分間）して上清を回収した。得られた上清30μlと大腸菌SURE懸濁液30μlを混ぜ、37℃で15分間インキュベートした後、アンピシリンを50ppm含むLB寒天培地に数μl植菌し、37℃で一晩培養した。コロニーを形成した大腸菌は、cDNAインサートを持つプラスミドクローンを含んでいた。これらプラスミドの挿入配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行った。その結果、開始コドンを含むプラスミドであることが明らかとなった。
【００８５】
得られた完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子をＦＳＰＤ１（配列番号１，２）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＳＡＭ２４（配列番号３，４）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＡＤＣ７６（配列番号５，６）と命名した。シロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子をＦＳＰＭ５（配列番号７，８）と命名した。
【００８６】
得られたＦＳＰＤ１と既知の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表１）。表１の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＰＤ１は他の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
得られたＦＳＡＭ２４と既知の植物由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表２）。表２の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＡＭ２４は他の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００８９】
【表２】
【００９０】
得られたＦＡＤＣ７６と既知の植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表３）。表３の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＡＤＣ７６は他の植物由来のＡＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
得られたＦＳＰＭ５とシロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子（ＡＣＬ５ｃＤＮＡ：GenBankアクセッションナンバーAF184093）とアミノ酸比較を行い、オープンリーディングフレームでアミノ酸が完全に一致した。
実施例２：トランスジェニックシロイヌナズナの作製
（１）発現コンストラクトの作製
配列番号１に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−と命名した。
配列番号３に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−と命名した。
配列番号５に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＡＤＣ７６の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−と命名した。
配列番号７に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＭ５の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断した。これらの断片をＸｈｏI処理した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−と命名した。
（２）プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃・１晩、アグロバクテリウムＣ５８株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃・２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達（三者接合法）させた。１から２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＣ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−と命名した。トランスジェニックシロイヌナズナの作製は減圧浸潤法〔以下（３）〜（６）〕または、カルス再生法〔以下（７）〜（１２）〕で行った。
（３）シロイヌナズナの栽培
培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）をプラスチック鉢に入れ、表面を網戸用のメッシュで覆い、メッシュの間にシロイヌナズナコロンビア株（以下「コロンビア株」又は「野生株」という）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供）を２〜５粒づつ播種した。２日間・４℃の低温室にいれ発芽処理後、２２℃・長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）に移して栽培を行った。約４〜６週間後に主軸花茎が５〜１０ｃｍ伸長した植物体について、摘心して側枝の誘導を行った。摘心約１〜２週間後にアグロバクテリウム感染処理を行った。
（４）アグロバクテリウム懸濁液の調製
前記（２）で作製したアグロバクテリウムを感染２日前に、抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養した。さらに、この培養液を分取して抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０００ｍｌ ＬＢ培地に移して、さらに、２８℃、約２４時間振とう培養した（ＯＤ600が１．２〜１．５になるまで）。培養液を室温下で集菌して、ＯＤ600が０．８〜１になるように浸潤用懸濁培地（０．５×ＭＳ塩、０．５×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．４４μＭ ベンジルアミノプリン、０．０２％ Ｓｉｌｗｅｔ−７７）に再懸濁した。
（５）アグロバクテリウムの感染
前記（３）で作製したシロイヌナズナの鉢に前記（４）で調製したアグロバクテリウム懸濁液が培養土中に吸収されるのを抑えるために、鉢の培養土中に水を与えた。１０００ｍｌのビーカーに約２００〜３００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を分取し、シロイヌナズナの鉢を逆さにして、植物体を懸濁液に浸けた。鉢を入れたビーカーをデシケーター内に入れ、バキュームポンプで約−０．０５３ＭＰａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、約１０分間放置した。徐々に陰圧を解除した後、植物をアグロバクテリウム懸濁液から取り出して、キムタオルで余分なアグロバクテリウム懸濁液を取り除き、深底トレイに横倒しした。少量の水を入れて、サランラップを被せた。この状態で約１日放置した。サランラップを外して、鉢を起こして約１週間給水を停止した。その後、徐々に培養土に水を与え、約３〜５週間の間、成熟したさやから種子の収穫を行った。収穫した種子は、茶こしを用いて、さややゴミを取り除きデシケーター内に入れ十分に乾燥させた。
（６）形質転換植物の取得
前記（５）で取得した種子を１００μｌ（約２０００粒）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移して、７０％エタノール中で２分間、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中に１５分間それぞれ浸して、最後に滅菌水で５回洗浄して種子の殺菌を行った。殺菌後の種子を１５ｍｌのファルコンチューブに移して、約９ｍｌの０．１％無菌寒天溶液を加えて、激しく混合した。種子０．１％寒天混合液をファージをプレートする要領で選択培地（１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．８％ 寒天、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、４０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、８ｇ／ｌ Ｐｈｙｔａｇａｒ、ｐＨ５．７）に均一になるように広げた。クリーンベンチ内で約３０分乾燥後、４℃、２日間の低温処理後、２２℃のグロースチャンバーに移して、抗生物質に対して抵抗性を示す形質転換体を選抜した。本葉が３〜５枚した植物体を再度新しい選択培地に移して本葉が４〜６枚になるまで栽培した。抗生物質に対して抵抗性を示した形質転換植物（Ｔ１）を培養土を含んだ鉢に定植して、約５〜７日間多湿条件下で順化させた。順化後、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培させた。得られた形質転換植物（Ｔ１）、および該形質転換植物から得られた種子（Ｔ２）から生育させたＴ２植物体についてＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによる導入遺伝子の解析とノーザンハイブリダイゼーションによる発現レベルの解析を行い、目的のポリアミン代謝関連酵素遺伝子が安定に組み込まれ、且つ発現している形質転換体を確認した。さらに、Ｔ２植物体からＴ３種子を収穫し、抗生物質に対する抵抗性試験（分離比検定）を行って形質転換出現比率からホモ接合体（Ｔ２）を取得した。Ｔ２種子とホモ接合体から取得したＴ３種子（Ｔ３ホモセルライン）を以下の実験に用いた。
（７）無菌シロイヌナズナの栽培
シロイヌナズナＷａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ株（以下ＷＳ株と称す）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、新名惇彦博士より提供）数１０粒を１．５mlチューブに入れ、７０％エタノール１mlを加え３分間放置した。続いて滅菌液（５％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、ＭＳＯプレート（ムラシゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ml／リットル、ｐＨ６．２）に置床した。このプレートを４℃に２日間放置して低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（サンヨー製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中に２２℃、光強度６０００ルクス、長日条件下（明期１６時間、暗期８時間）にて、２１日間培養した。感染効率を上げるために再度植物を無菌的に引き抜いて、新たなＭＳＯプレートの表面に根を広げ、さらに２日間培養を続けた。
（８）アグロバクテリウムの感染
前記で２１日間培養したＷＳ株の根を数株ずつそろえて、メスで１．５〜２．０ｃｍ程度に切りそろえ、ＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチンを０．０５μg／mlとなるように加えたもの）に置き並べた。光強度３０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で２日間培養した。前記（２）で作製したアグロバクテリウムを抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養し、アグロバクテリウムを、ＭＳ希釈液（ムラシゲ−スクーグ無機塩類６．４ｇ／ｌ、ｐＨ６．３）で３倍に希釈した。アグロバクテリウム希釈液をそれぞれ１mlずつチューブに分注し、この中にカルス化した根の切片を１０分間浸した。２枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水分を除き、新しいＣＩＭプレートに各々置き並べた。同条件にて２日間共存培養した。
（９）除菌
各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μg／mlになるように加えたもの）に移し、ゆっくり振蘯させて６０分間洗浄した。この操作を５回繰り返した後、滅菌ろ紙上で水分を取り除き、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、２−ｉｐを終濃度５μg／ml、ＩＡＡを終濃度０．１５μg／ml、クラフォランを終濃度５００μg／mlとなるように加えたもの）に置き並べ、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で２日間培養した。
（１０）形質転換植物の選択
前記で２日間培養した切片をＳＩＭＣＳプレート（ＳＩＭＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度４．６Ｕ／mlとなるように加えたもの）に移植し、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で培養した。以後、１週間毎に新しいＳＩＭＣＳプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転換体は褐変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑色を呈し、約１カ月後、葉が形成され、その後ロゼット葉となった。
（１１）形質転換植物の再生
ロゼット葉となった植物体の根本を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレートに軽く乗せるように挿した。８〜１０日後、１〜２ｃｍ程度の根が数本形成したものをピンセットで無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮＯ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ Ｈ3ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ4、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ2）１ml／リットル〕に浸したロックウールミニポット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花し、莢形成後は、パーライトとバーミキュライト（ＴＥＳ社製）を１：１に混合し無機塩類混合培地に浸した土に植え換えた。約１カ月後、１株につき数百粒の種子が得られた。これを以後、Ｔ２種子と称す。
（１２）抗生物質耐性株の取得
Ｔ２種子約１００粒を（７）と同様の方法で滅菌し、ＭＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハイグロマイシンＢ耐性株が発芽した。
（１３）ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイゼーション
前記で発芽したＴ２種子を無機塩類培地に浸したロックウールミニポットにピンセットで移植し、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期、２２℃の条件下で培養した。２週間後、ロックウールの表面をナイフで撫でるようにメスで地上部を切り取り、直ちに液体窒素で凍結した。これを液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕し、１ｇ当たり、３mlのＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、１００μg／ml ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ〕を加え十分撹拌した。６０℃１時間インキュベート後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）し上清をミラクロスで濾渦し新しいチューブに移した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を３回行った後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０μgずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち１μgのＤＮＡを用いて、それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。
【００９３】
また、形質転換を行っていないＷＳ株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIによる消化を行い、１％アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション用プローブは各ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６、ＦＳＰＭ１遺伝子断片を用いた。
【００９４】
サザンハイブリダイゼーションは、モレキュラー クローニング，ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第９章、第３１〜５８頁〔コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ）社、１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル電気泳動を行い、泳動後、アルカリ変性を行いナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）に一晩サザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）に３分間照射させ、ＤＮＡを固定した。このメンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×デンハルト液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０μg／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中で５０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。プローブを加え、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液で室温１０分間２回洗浄し、続いて同じ洗浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。メンブレンは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社製）を入れたカセット内で−８０℃一晩感光させ、オートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っていない株（１）、ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６を導入した形質転換体（２）、ベクターのみを導入した形質転換体（３）について、サザンハイブリダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを比較した。
【００９５】
（２）には、（１）、（２）、（３）共通の内在性シグナルのほかに、ＥｃｏＲＩで切断したサンプルと、ＨｉｎｄIIIで切断したサンプルでは特異的なシグナルが観察され、目的アンチセンスＤＮＡが（２）に組み込まれていることが観察された。
実施例３：ノーザンブロット解析
実施例２で得られたＴ２形質転換体で、抑制因子によって内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現が抑制されているかを確かめるために、ノーザンブロッティングを下記に示す様に行った。
【００９６】
形質転換を行っていない野生株（ＷＴ）とＴ２形質転換体（セルライン：ＴＳＰ−２０、２１、２２）のロゼット葉から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は定法に従って行った。得られた全RNA10μgを1.5%ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンドNナイロンメンブランに一晩ブロッティングした。UVクロスリンカーでRNAを固定した後、プレハイブリダイゼーションバッファー（50% Formamide、5X SSPE、5X Denhardt's、 0.1% SDS、80μg/ml Salmon sperm DNA、pH7.0）で、42℃、2時間プレハイブリダイゼーションを行った。シロイヌナズナ由来の内因性ＳＰＤＳ遺伝子断片のcDNAを32P-dCTPとランダムラベルキット（アマシャム社製）を用いて、プローブを作製した。シロイヌナズナ由来のＳＰＤＳ遺伝子断片は前記実施例１と同様な方法で取得した。このプローブをプレハイブリダイゼーションに加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブランを2×SSC、0.1% SDSを含む洗浄液からスタートし、最終的には0.1× SSC、0.1% SDSを含む洗浄液で55℃30分2回まで洗浄した。メンブランをX線フィルム（Kodak社製）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。
【００９７】
ノーザンブロッティングの結果を図2に示した。図2の結果から、野生株（ＷＴ）比べて形質転換体（ＴＳＰ−２０、２１、２２）ではシロイヌナズナ由来の内因性ＳＰＤＳ遺伝子の発現レベルが低く、抑制因子によって発現が抑制されていることが確認された。他の形質転換体においても、内因性ＳＡＭＤＣ遺伝子、内因性ＡＤＣ遺伝子、内因性ＳＰＭＳ遺伝子の発現レベルが、抑制因子によって減少していることを確認した。
実施例４：ポリアミン含量の評価
（１）ポリアミン含量の分析
実施例３で内因性ＳＰＤＳ遺伝子の発現が抑制されていたセルライン、ＴＳＰ−２０、２１、２２についてポリアミン含量を調べた。同時に栽培した野生株（コロンビア）と形質転換体（ＴＳＰ）から約０．０５〜０．２ｇのロゼット葉（または本葉）をサンプリングして密閉可能なポリ製のバイアル瓶に移して凍結保存させた。サンプリングした試料にプトレシン、スペルミジン、スペルミンの希釈内部標準液（内部標準量＝２．５ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり４ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、４℃、３６，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取した。上清液から正確に１．０ｍｌを遠心管に入れて、さらに正確に１２ＮＨＣｌを１．０ｍｌを遠心管に加えて、密栓後、１１０℃の乾燥機に入れて１８時間加水分解した。分解後、濃縮乾固した後、正確に１．０ｍｌの５％過塩素酸水を加えて十分に溶解させた。得られた溶液をカチオン交換樹脂（５０Ｗ−４Ｘ、２００−４００メッシュ、Ｈ＋型：バイオラッド社製）カラムに通した。０．７Ｎ ＮａＣｌ／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、水、１Ｎ塩酸を順次流してカラムを洗浄し、ポリアミン以外のアミノ酸や有機物を除去した。６Ｎ塩酸をカラムに加え、液が出なくなるまで流出し、ポリアミンを回収した。溶出液を７０℃で減圧乾固し、これに５％過塩素酸を加えポリアミンを溶解した。プトレシン、スペルミジン、スペルミンのポリアミン量の定量はダンシル化した後、ＵＶ検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表４に示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
表４より、明らかなようにポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルラインＴＳＰ−２０、２１、２２は、プトレシン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増大していることが明らかとなった。さらに、シロイヌナズナ由来のＦＳＰＭ５をアンチセンス方向に導入した形質転換体のセルラインでは、スペルミジン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増大していることも確認された。
【０１００】
以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物にアンチセンス方向で遺伝子導入することで、植物内のポリアミン含量を増加させることが可能であることが示された。これらのことから、抑制因子としてポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが認められた。
実施例５：環境ストレス抵抗性の評価
（１）酸化・除草剤ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（セルライン：ｐＢＩ１２１（３５Ｓ−ＧＵＳ）、ＴＳＰ−２０、ＴＳＰ−２１、ＴＳＰ−２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２ｕＭのパラコート（ＰＱ）を含んだ発芽生育培地（２ｕＭ ＰＱ、１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、１０日目に発芽個体数（発芽率）、さらに２０日目に生存個体数（生存率）を観察した。その結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５の結果から野生株とベクターコントロールのライン（ｐＢＩ１２１）は、明らかにパラコートによる毒性効果で発芽率と生存率が著しく低下しているのに対して、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１）をアンチセンスで導入したセルラインＴＳＰ−２０、２１、２２の発芽率、生存率は高い値で維持された。さらに、シロイヌナズナ由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子（ＦＳＰＭ５）をアンチセンスで導入したセルラインも同様な評価を行ったところ、野生株に比べて有意に発芽率と生存率が高まることが確認された。
【０１０３】
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、酸化・除草剤ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
（２）塩ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２１）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を７５ｍＭのＮａＣｌを含んだ発芽生育培地（７５ｍＭ ＮａＣｌ、１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、５週間目に発芽生育培地上の植物体の生育程度を観察した。その結果を図３に示す。
【０１０４】
図３の結果からコントロールであるＷＴは７５ｍＭのＮａＣｌを含んだ培地上では著しい生育阻害が観察されて、ほとんどの個体が白色化して枯死した。一方、形質転換体（ＴＳＰ−２１）ではほとんどの個体が緑色を呈して生存しており、遅いながらもそのまま生育を続けた。
【０１０５】
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を７５ｍＭと１００ｍＭのＮａＣｌを含んだ、または含まない発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。栽培開始日から１７日目まで毎日発芽率を測定した。その結果を図４に示す。
【０１０６】
図４の結果からコントロールであるＷＴは７５ｍＭおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含んだ培地上では発芽日が遅れて発芽速度が低下した。一方形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）は発芽日の遅れや発芽速度の低下が小さく、ＷＴに比べて塩ストレスによる阻害効果が顕著に軽減していることが確認された。
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、塩ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
（３）浸透圧・水ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２５０ｍＭと３００ｍＭのソルビトールを含んだ、または含まない発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。栽培開始日から１９日目まで毎日発芽率を測定した。その結果を図５に示す。
【０１０７】
図５の結果からコントロールであるＷＴは２５０ｍＭおよび３００ｍＭのソルビトールを含んだ培地上では発芽日が遅れて発芽速度が低下した。一方形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）は発芽日の遅れや発芽速度の低下が小さく、ＷＴに比べて浸透圧・水ストレスによる阻害効果が顕著に軽減していることが確認された。
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、浸透圧・水ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
（４）低温ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２枚の発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で７日間子葉が展開するまで育成した。２枚の培地のうち１枚を５℃・２４０μmol m-2 sec-1 PPFD、１枚を２２℃・２４０μmol m-2 sec-1 PPFDの条件下に移して５日間温度処理を行った。処理後２２℃・弱光の長日条件下に戻して２週間育成した後に各個体の新鮮重を測定した。その結果を図６に示す。
【０１０８】
図６の結果からコントロールであるＷＴは５℃の低温ストレスに遭遇することによって２２℃に比べて顕著な生育抑制が見られたが、形質転換体（ＴＳＰ−２２）では明らかに低温ストレスによる生育抑制が小さかった。
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、低温ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
【０１０９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現コンストラクトの構造を示す図である。
【図２】形質転換体におけるシロイヌナズナ（内因性）ＳＰＤＳ遺伝子の発現結果を示す図である。
【図３】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との塩ストレス抵抗性（生育）の比較を示す図である。
【図４】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との塩ストレス抵抗性（発芽率）の比較を示す写真である。
【図５】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との浸透圧・水ストレス抵抗性（発芽率）の比較を示す図である。
【図６】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との低温ストレス抵抗性（生育）の比較を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の改良された環境ストレス抵抗性を有する植物、詳細には改良された酸化ストレス抵抗性、除草剤ストレス抵抗性、塩ストレス抵抗性、浸透圧ストレス抵抗性、水ストレス抵抗性、低温ストレス抵抗性を有する植物に関する。また、本発明は該植物の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物はそれぞれの生息地の温度や塩などの様々な環境ストレスに適応して生活している。しかし、例えば温度ストレスにおいては、植物が生育適温の上限または下限を越えるような環境に遭遇すると高温ストレスや低温ストレスを受け、徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて障害をひきおこす。これまで、種々の温度環境に適応した野生の植物を食料作物や工芸作物などに利用するために、選抜や交雑育種など育種的手段によって作物の温度適応性の拡大に努めてきた。また、野菜や花卉、果樹等の園芸作物においては育種的手段に加えて、施設園芸で栽培可能な期間の拡大を図ってきた。しかし、特に日本は南北に長く、地域によっては気候が著しく異なるとともに、四季の変化が著しいので地域や季節によっては作物は生育に不適な温度環境にさらされる危険性が大きい。例えば、熱帯を起源とするイネは、明治以来の品種改良によって東北地方や北海道などの冷涼地でも栽培できるようになり、現在ではこれらの地域の基幹作物として栽培されているが、これらの地域では初夏に異常低温があると冷害を受け、著しい減収になることが現在でも問題になっている。近年、地球温暖化やエルニーニョ現象が原因と考えられる異常気象によって作物が重大な被害を受け、１９９３年のひどい冷害による米不足は記憶に新しい。また、野菜類についてみると、トマト、キュウリ、メロン、スイカなど果菜類の中には熱帯起源の作物が多い。これらの作物は需要が大きく農業経営上も重要性の大きい作物で早くから施設栽培に取り入れられてきた。しかし、昭和４９年のオイルショック以来、施設園芸における省資源や暖房コストの低減が問題となっている。施設園芸における省資源については温室の構造的なものから栽培技術まで各方面から検討されているが、最も基本的なことは作物の低温ストレス抵抗性を高めることである。
【０００３】
塩ストレスについては全陸地面積の約１０％が塩害地域といわれ、近年東南アジアやアフリカなどの乾燥地を中心に塩類土壌の拡大が農業上深刻な問題となっている。
【０００４】
水ストレス（浸透圧ストレス）は植物にとって重要なストレスで、温度が制限要因とならないときには降雨量とその分布によって大きな影響を受ける。特に、主要な作物栽培地域である半乾燥地帯などでは、作物の生育や収量は水ストレスによって著しく左右される。
種々の環境ストレス抵抗性を高めるために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。
【０００５】
これまでに遺伝子工学技術を利用した、環境ストレス抵抗性植物の作出が行われている。低温ストレス抵抗性の改良に用いられたに遺伝子としては、生体膜脂質の脂肪酸の不飽和化酵素遺伝子（ω−３デサチュラーゼ遺伝子、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、ステアロイル−ＡＣＰ−不飽和化酵素遺伝子）や光合成に関与するピルビン酸リン酸ジキナーゼ遺伝子、凍結保護・防止活性を持つタンパク質をコードする遺伝子（ＣＯＲ１５、ＣＯＲ８５、ｋｉｎ１）等が報告されている。
【０００６】
塩ストレスや水ストレス抵抗性の改良に用いられた遺伝子としては、浸透圧調節物質のグリシンベタイン合成酵素遺伝子（コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）、プロリン合成酵素遺伝子（１−ピロリン−５−カルボン酸シンセターゼ）等が報告されている。
【０００７】
酸化ストレス抵抗性の改良に用いられた遺伝子としては、活性酸素分子種の消去系酵素遺伝子（スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンレダクターゼ等）等が報告されている。
除草剤ストレス抵抗性の改良に用いられた遺伝子としては、芳香族アミノ酸の生合成酵素遺伝子（５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンダーゼ遺伝子）、無毒化酵素遺伝子（ニトリラーゼ遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等が報告されている。しかし、これらの遺伝子を形質転換した植物は、除草剤ストレス抵抗性植物では一部実用化されているが、多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。
【０００８】
ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては▲１▼核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化▲２▼種々の核酸合成系への促進作用▲３▼タンパク質合成系の活性化▲４▼細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化などが知られている。植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されている。
【０００９】
近年、ポリアミンの種々の環境ストレスに対する関わりが報告されている。低温ストレス（非特許文献１、２、３）、塩ストレス（非特許文献４）、酸ストレス（非特許文献５）、浸透ストレス（非特許文献６）、オゾンストレス（非特許文献７）、病原菌感染ストレス（非特許文献８）、除草剤ストレス（非特許文献９）などとの関わりが報告されているが、いずれの報告も生長発育反応やストレス抵抗性とポリアミン濃度の変化の関連性からポリアミンの関与を推定したものであり、ポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連酵素遺伝子と環境ストレス抵抗性との遺伝子レベルでの関与についてはほとんど報告されていない。
【００１０】
植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（非特許文献１０）、トマト（非特許文献１１）、シロイヌナズナ（非特許文献１２）、エンドウ（非特許文献１３）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（非特許文献１４）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（非特許文献１５）、ホウレンソウ（非特許文献１６）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（非特許文献１７）等から単離されている。ＳＰＭＳ遺伝子はシロイヌナズナ（非特許文献１８）から単離されている。
【００１１】
【非特許文献１】
J. Japan Soc. Hortic. Sci., 68, 780-787, 1999
【００１２】
【非特許文献２】
J. Japan Soc. Hortic. Sci., 68, 967-973, 1999
【００１３】
【非特許文献３】
Plant Physiol. 124, 431-439, 2000
【００１４】
【非特許文献４】
Plant Physiol., 91, 500-504, 1984
【００１５】
【非特許文献５】
Plant Cell Physiol., 38(10), 156-1166, 1997
【００１６】
【非特許文献６】
Plant Physiol. 75, 102-109, 1984
【００１７】
【非特許文献７】
Environ. Pollut., 61, 95-106, 1989
【００１８】
【非特許文献８】
New Phytol., 135, 467-473, 1997
【００１９】
【非特許文献９】
Plant Cell Physiol., 39(9), 987-992, 1998
【００２０】
【非特許文献１０】
Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990
【００２１】
【非特許文献１１】
Plant Physiol., 103, 829-834, 1993
【００２２】
【非特許文献１２】
plant physiol., 111, 1077-1083, 1996
【００２３】
【非特許文献１３】
Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995
【００２４】
【非特許文献１４】
Biocem. J., 314, 241-248, 1996
【００２５】
【非特許文献１５】
Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994
【００２６】
【非特許文献１６】
Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995
【００２７】
【非特許文献１７】
Plant cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998
【００２８】
【非特許文献１８】
The EMBO Journal, 19(16), 4248-4256, 2000
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を人為的に制御して、ポリアミンレベルを変化させることによって、環境ストレス抵抗性が改良された組換え植物を作出することである。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、ポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離して、該遺伝子を植物に導入して内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させて種々の環境ストレス抵抗性のパラメーターが改良されることを見出した。
【００３１】
ポリアミンは分子中にアミンを多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとしては二分子のアミンを含むプトレシン、三分子のアミンを含むスペルミジン、四分子のアミンを含むスペルミン等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはプトレシンについてはＡＤＣ、ＯＤＣ、スペルミジンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＤＳ、スペルミンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＭＳ等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子についても既に幾つかの植物で単離されている。さらに、幾つかのポリアミン代謝関連酵素遺伝子については植物への導入が試みられているが、得られた形質転換植物で環境ストレス抵抗性の改良についてはほとんど報告されていない。
【００３２】
このような状況下に、本発明者らは植物の低温ストレス抵抗性を改良するために鋭意、検討した結果、低温ストレス抵抗性を示す植物組織では低温ストレス遭遇時に特にポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、スペルミン含量が増大することを見いだし、実際に低温ストレス抵抗性を示す植物組織からスペルミジンやスペルミン生合成に関わるポリアミン代謝関連遺伝子（ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ）とシロイヌナズナからスペルミン合成酵素遺伝子（ＳＰＭＳ）を単離、同定した。さらに、該遺伝子を植物に導入して内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させて種々の環境ストレス抵抗性のパラメーターが改良されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３３】
本発明は、以下の発明を提供するものである。
１． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物に比べて少なくとも１種の環境ストレス抵抗性が改良された植物及びその子孫。
２０． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する植物の作出方法。
２２． 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する植物の作出方法。
３９． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列の抑制因子を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する植物体を再生し、
（３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
（４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する形質が固定された植物の作出方法。
４０． 以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列の抑制因子を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞からカルスを誘導する
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された環境ストレス抵抗性を有する形質が固定されたカルスの作出方法。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明において「環境ストレス」とは、高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、浸透圧、乾燥、カドミウム、オゾン、大気汚染、紫外線、重金属、病原体、塩、除草剤、強光、冠水、害虫などの環境からうけるストレスをいう。
本発明で得られる植物は、栽培環境に左右されずポリアミンの発現量が増大し、種々の環境ストレス抵抗性を改良することができる。ポリアミン量を調節する核酸配列としては、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が挙げられる。内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は植物体中のポリアミン量を増加させる。例えば、スペルミン合成酵素遺伝子の抑制因子を植物体中で発現させることで、スペルミジンまたはプトレシン量を増加させることができる。
本発明において「該ポリアミン量を調節する核酸配列を有していない植物」とは該核酸配列（例えば内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子）をゲノム上に有しないあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにポリアミン代謝関連酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジェニック植物などをすべて包含する。
【００３５】
本発明で言うところの「ポリアミン」は生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物である。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミンなどが挙げられる。
本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミジンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、スペルミンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。
【００３６】
アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：arginine decarboxylase EC4.1.1.19.）はＬ−アルギニンからアグマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ornithine decarboxylase EC4.1.1.17.）はＬ−オルニチンからプトレシンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ：S-adenosylmethionine decarboxylase EC4.1.1.50.）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチルチオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：spermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ：spermine synthase EC2.5.1.22.）はスペルミジンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。
【００３７】
本発明における「内因性」とは、植物が生来有しているものを意味する。従って本発明の「内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」は、宿主植物が生来染色体上に有しているポリアミン代謝関連酵素遺伝子を意味する。「内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子」とは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制するものであれば特に限定されず、例えばポリアミン代謝関連酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡが例示される。これらのアンチセンスＤＮＡは、いずれの由来であってもいいが、例えば、種々の植物から単離することができる。具体的には、双子葉植物、例えばウリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルファルファ、カウピー（Vigna unguiculata）等のマメ科；アオイ科；キク科；アカザ科；ヒルガオ科からなる群から選ばれたもの、又は単子葉植物、例えば稲、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。好ましくは、ウリ科またはアブラナ科植物、より好ましくはクロダネカボチャまたはシロイヌナズナがよい。
【００３８】
植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のアンチセンスＤＮＡを単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織から単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。さらに好ましくは環境ストレス抵抗性を示す部位である。
【００３９】
本発明において使用される内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子の好ましい例として、スペルミジン合成酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミン合成酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、
・配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号７に示される塩基配列中塩基番号１〜１０２０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
のアンチセンスＤＮＡが挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡが挙げられる。更に、
・該上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡが挙げられる。
ここでいう「ストリンジェント条件」とは、特定ポリアミン代謝関連酵素遺伝子配列にコードされるポリアミン代謝関連酵素と同等の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制する塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
ここでいう「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、挿入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。本発明にはこのような修飾が加えられ、かつポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、polyＡテールや５‘、３’末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、アミノ酸を欠失するような範囲で塩基が「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が「付加」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制することが必要である。好ましくは、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。
このような改変されたＤＮＡは例えば、部位特異的変異法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982）等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００４０】
本発明における「内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子」は遺伝子工学的手法で少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現が抑制できればいかなる方法でも良く、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法、Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンを用いた遺伝子破壊法等が挙げられる。好ましくはアンチセンス法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法が挙げられる。
【００４１】
アンチセンス法とは、標的となる遺伝子のｃＤＮＡ又はそのｍＲＮＡ前駆体に相補的な配列のＤＮＡ断片（アンチセンスＤＮＡ）を植物体に導入して、アンチセンスＲＮＡを産生させる方法である。産生したアンチセンスＲＮＡは、その標的遺伝子のｍＲＮＡと塩基対形成を生じさせることで標的遺伝子のタンパク質の翻訳を阻害する方法である。アンチセンスＤＮＡの配列は少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡと塩基対を形成するものであればいかなるものでもよい。好ましくは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と同じ由来の配列、またはポリアミン代謝関連酵素遺伝子は種間相同性が高いことから、由来が異なる配列でもよい。アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡと塩基対形成を生じさせる長さであればよいことから、全長配列、部分配列であってもよい。必ずしも同じ由来の配列である必要はない。
本発明における「アンチセンスＤＮＡ」とは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する遺伝子を意味する。アンチセンスＤＮＡは、例えば配列番号１、３、５、７の塩基配列に相補的なものであり、アンチセンスＲＮＡはそれらから産生されるものである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法とは、近年開発された方法で、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入することで、そのｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡを特異的に分解し、遺伝子発現を抑制する手法である。植物におけるＲＮＡｉは、１９９８年にヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写させて形質転換イネを作製し、外因性遺伝子であるＧＵＳ（β―グルクロニダーゼ）遺伝子の発現抑制（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959-13964, 1998）、２０００年にはシロイヌナズナの内因性遺伝子の発現抑制（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4985-4990, 2000）が報告されている。さらに、ｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を直接、若しくはヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写するベクターを植物体に遺伝子導入することや、プロトプラストにエレクトロポレーションすることでＲＮＡｉが起こることが報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11981-11986, 2002、Plant J., 24, 895-903, 2000）。これまでに、イネ、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ワタなど多くの植物で報告（Plant J., 27, 581-590, 2001、Plant Cell, 14, 857-867, 2002）され、ＲＮＡｉは多岐にわたり普遍的な機構であることが示されている。
本発明の「２本鎖ＲＮＡ」とは少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現を抑制する領域を持つ配列であればいかなるものでもよい。好ましくは内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と同じ由来の配列、またはポリアミン代謝関連酵素遺伝子は種間相同性が高いことから、由来が異なる配列でもよい。２本鎖ＲＮＡの長さは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のｍＲＮＡと塩基対形成を生じさせる長さであればよいことから、全長配列、部分配列であってもよい。必ずしも同じ由来の配列である必要はない。「２本鎖ＲＮＡを形成するセンスＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ」とは、例えば植物中で機能し得るプロモーターにポリアミン代謝関連酵素遺伝子のセンスＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リンカー等を含む発現ベクターを植物体に遺伝子導入することで２本鎖ＲＮＡが形成されるものであればよい。
【００４２】
本発明において、「環境ストレス」としては、上述のごとく、高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、浸透圧、乾燥、カドミウム、オゾン、大気汚染、紫外線、重金属、病原体、塩、除草剤、強光、冠水、害虫などの環境から受けるストレスが例示される。この中で「酸化ストレス」とは、植物の生育適活性酸素濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、酸化ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「除草剤ストレス」とは、植物の生育適除草剤濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、除草剤ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「塩ストレス」とは、植物の生育適塩濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、塩ストレスを受けた植物は過剰な塩が細胞内に流入して徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「浸透圧ストレス」とは、植物の生育適浸透圧の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、浸透圧ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「水ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、水ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「低温ストレス」とは、植物の生育適温度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、低温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。
本発明において、「環境ストレス抵抗性が改良された植物」および「改良された環境ストレス抵抗性を有する植物」とは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して環境ストレス抵抗性が付与若しくは向上した植物をいう。ポリアミンは種々の環境ストレス（高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、浸透圧、塩、乾燥、カドミウム、オゾン、大気汚染、紫外線、病原体、害虫、除草剤など）抵抗性に関わっていることから、これらの様々な環境ストレス抵抗性が改良される。例えば、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を植物に導入することにより、酸化ストレス抵抗性（耐性）、除草剤ストレス抵抗性（耐性）、塩ストレス抵抗性（耐性）、浸透圧ストレスに対する抵抗性（耐性）、若しくは水ストレスに対する抵抗性（耐性）が、該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を有していない植物に比べて向上した植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
具体的には、「酸化ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する酸化ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「除草剤ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する除草剤ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「塩ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する塩ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「浸透圧ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する浸透圧ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。「水ストレス抵抗性が改良された植物」とは、植物の生育過程において遭遇する水ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができた植物である。これによって、栽培の安定化、生産性、収量の向上、栽培地域、面積の拡大などが期待できる。更に、「除草剤ストレス抵抗性が改良された植物」においては、除草剤の使用量の低下や安定な除草剤の広範な使用などが期待できる。
【００４４】
本発明の植物には、植物体全体（全樹）に限らず、そのカルス、種子、あらゆる植物組織、葉、茎、根、花、果実、繊維などが含まれる。更にその子孫も本発明の植物に含まれる。
【００４５】
本発明において「植物及びその子孫から得られる有用物質」とは、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して環境ストレス抵抗性が付与若しくは向上した植物およびその子孫で生産された有用物質をさし、有用物質としては例えば、アミノ酸、油脂、デンプン、タンパク質、フェノール、炭化水素、セルロース、天然ゴム、色素、酵素、抗体、ワクチン、医薬品、生分解性プラスチックなどが含まれる。
【００４６】
本発明の植物は、該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を有していない植物に、遺伝子工学的手法により内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくとも１種類の内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が導入された当代の植物体で該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が発現し、それによって環境ストレス抵抗性が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましい。該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。
【００４７】
植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。
【００４８】
３５Ｓプロモーターのような器官全体に恒常的に発現させるプロモーターだけでなく、低温、高温、塩、乾燥、光、熱、ホルモンあるいは傷害等の調節性のプロモーターを用いれば、生活環境に応じて目的核酸配列（例えば抑制因子）を発現させることができる。例えば、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、BN115プロモーター：Plant physiol.,106, 917-928, 1999）を用いることによって、低温時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し低温ストレス抵抗性を改良することができる。さらに、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子と植物が乾燥に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、Atmyb2プロモーター：The Plant Cell, 5, 1529-1539, 1993）を用いることによって、乾燥時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し乾燥ストレス抵抗性を改良することができる。
【００４９】
また、器官、または組織特異的なプロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけにポリアミン代謝を制御することができる。
【００５０】
本発明の発現ベクターにおいて、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。例えば、ターミネーターＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子等が挙げられる。
【００５１】
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧がかかった条件を実現できるという利点もある。
【００５２】
さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、ｐＵＣ系またはｐＢＲ系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。
【００５３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacteriumu rhizogenes）による感染を利用して外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の２５ｂｐボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１やｐＢＩ１２１（ともにCLONTECH社）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するVir領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあってトランスに作用する。
【００５４】
植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の課程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の課程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法および、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意な部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的核酸配列（例えば抑制因子）も植物体全体に導入される。
【００５５】
以下に、具体例として、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得方法とアグロバクテリウムによる目的核酸配列（例えば抑制因子）の導入および形質転換植物の作出方法を例示する、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子に関しては以下の記載を参考にして当業者は容易に植物に導入し、形質転換植物を作出することが可能である。
１．ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の取得
（１）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
昼１８℃／夜１４℃・３日間の低温処理を行ったクロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）の根組織から常法に従い、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを抽出する。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡから市販のＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等を用いてＰＣＲ用に使用するｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、３’末端に２つのｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎを持つ修飾ｌｏｃｋ−ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用いてｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したｃＤＮＡを得る。該２本鎖ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼにより末端を平滑化し、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡアダプターをライゲーション反応により結合させ、アダプター結合二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
（２）ＰＣＲプライマーの設計
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子としてＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＳＰＭＳ遺伝子、ＯＤＣ遺伝子を単離することができる。ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナやヒヨス、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ、ホウレンソウ、タバコ、ＡＤＣ遺伝子はダイズ、エンドウ、トマト、ＳＰＭＳ遺伝子はシロイヌナズナ、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）等から単離されており、既に塩基配列が決定している。従って、決定している既知の塩基配列を比較し、非常に保存されている領域を選抜し、ＤＮＡオリゴマーを合成しＰＣＲ用プライマーを設計することができる。
(３)ＰＣＲによるＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＳＰＭＳ遺伝子断片の取得
上記（１）の方法で作製したＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、上記（２）の方法で設計したプライマーを使用して、それぞれＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離し、グラスミルク法などで精製する。精製したＰＣＲ産物はＴＡベクターなどのクローニングベクターに連結させる。
【００５６】
クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはダイデオキシ法等により決定できる。いずれの方法も市販されているキットを用いて行うことができ、配列決定を自動的に行うオートシーケンサーを使用してもよい。
（４）完全長遺伝子の単離
完全長の遺伝子を得るためには、常法に従って、プラークハイブリダイゼーション、ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）法やＭａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ法等により完全長の遺伝子を得ることができる。
【００５７】
このようにして取得した遺伝子は、ポリアミン生合成に関与する遺伝子であり、この遺伝子を利用して巧妙に、即ち、遺伝子発現を分子生物学的に制御することにより、ポリアミンレベルの制御が可能となり、種々の環境ストレス抵抗性が改良された植物の作出も可能になる。
２．シロイヌナズナにおけるアグロバクテリウムによる目的核酸配列（例えば抑制因子）の導入、および形質転換植物の作出。
【００５８】
上記１．で取得した遺伝子から得られた核酸配列（例えば抑制因子）を植物宿主に導入することにより、種々の環境ストレス抵抗性が改良された特性を有するトランスジェニック植物を作出することができる。
（１）発現コンストラクトの作製および、アグロバクテリウムの形質転換
発現コンストラクトの作製は前記１．で得られたポリアミン代謝関連酵素遺伝子の核酸配列（例えば抑制因子）をオープンリーディングフレームをすべて含むまたは含まないような適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適当なリンカーを連結し、植物形質転換用ベクターに挿入して作製することができる。植物形質転換用ベクターとしては、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１などを用いることができる。
【００５９】
作製した発現コンストラクトを大腸菌中で増幅後、発現コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１等に、三者接合法（Nucleic Acid Research, 12, 8711, 1984）、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により形質転換することができる。例えば、三者接合法は目的核酸配列（例えば抑制因子）を含んだ発現コンストラクトを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養して、抗生物質（例えばリファピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン等）を含んだ培地上で培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得ることができる。
（２）トランスジェニック植物の作出
本発明において、遺伝子導入を行う植物としては、植物体全体、植物器官（例えば葉、茎、根、花器、生長点、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞などを挙げることができる。
（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えばカルス再生法（Plant Cell Reports, 12, 7-11, 1992）で植物に感染させて目的核酸配列（例えば抑制因子）を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシゲ・スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ｍｌ／リットル、ｐＨ６．２）に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用いてＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μｇ／ｍｌ、カイネチンを０．０５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上でカルス培養を行う。プロモーターに目的核酸配列（例えば抑制因子）を接続し、カナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、カルス化した根の切片を浸し、数日間ＣＩＭプレート上で共存培養する。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行い、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、N6-[2-イソペンテニル] アデニンを終濃度５μｇ／ｍｌ、インドール酢酸（ＩＡＡ）を終濃度０．１５μｇ／ｍｌ、クラフォランを終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上で数日間培養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳプレート（カナマイシンおよびハイグロマイシンＢを含有するプレート）上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が５ｍｍ程度の大きさになり、ロゼット葉を形成するまで培養する。完全なロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩＭプレート（ＭＳＯプレートにＩＡＡを終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）に移植する。大きなカルスが付いていると、発根してもカルスを介して根が出ていて、ロゼットとは維管束がつながっていないことが多い。約８〜１０日後、無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮＯ3 、２．５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4 、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3 ）2 、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ Ｈ3 ＢＯ3 、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2 、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4 、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ4 、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ2 ）１ｍｌ／リットル〕に浸したロックウール上に定植する。開花し、さやを形成した植物体は無機塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロマイシンＢを終濃度５Ｕ／ｍｌとなるように加えたもの）に播種して発芽させることにより形質転換体を得ることができる。
さらに、（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えば減圧浸潤法（The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999）で植物に感染させて目的核酸配列（例えば抑制因子）を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って培養土（例えばメトロミックス等）に播種して、２２℃、長日条件下（例えば１６時間日長・８時間暗黒等）で栽培する。約３〜４週間後に伸長した主軸（花茎）を切除して、側枝の誘導を開始させる。摘心約１週間をに培養した形質転換アグロバクテリウム懸濁液にシロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れてバキュームポンプで約−０．０５３Ｍｐａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、１０分間、室温放置する。感染後の鉢を深底トレイに移して、横倒しに置き、トレイの底に少量の水を滴下して透明な覆いを被せ多湿条件下で約１日放置する。感染後の鉢を起こして、２２℃・長日条件下で栽培を開始して、種子の収穫を行う。
【００６０】
約２〜４週間の間、種子の収穫を行い、収穫した種子は茶こしなどで莢やゴミを取り除き、デシケーター内で乾燥保存する。
【００６１】
トランスジェニック植物体の選択は、収穫した種子を常法に従って殺菌処理して、約９ｍｌの０．１％寒天水溶液に懸濁して、選択培地（例えば、１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．８％ 寒天、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、４０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンなど）に広げ、２２℃で無菌栽培する。抗生物質に対して抵抗性を示すトランスジェニック植物体は順調に生長して、約１〜２週間で同定することができる。本葉が約４〜６枚展開したトランスジェニック植物体を培養土を含んだ鉢に移植して２２℃で長日栽培を開始する。
【００６２】
得られたトランスジェニック植物より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、遺伝子導入の有無を確認することができる。
【００６３】
また、トランスジェニック植物や、非トランスジェニック植物より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子のセンス配列、もしくはアンチセンス配列を有するプローブを作製し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行い、目的核酸配列（例えば抑制因子）の発現の状態を調べることができる。
【００６４】
また、得られたトランスジェニック植物からカルス誘導を行い、カルスを作出することができる。
【００６５】
減圧浸潤法で得られたトランスジェニック植物（Ｔ１）の、自家受粉により得られるＴ２種子の形質転換出現比率は、通常メンデルの法則に従う。例えば、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が一遺伝子座にヘテロ（heterozygous）に組み込まれた場合、Ｔ２種子では形質転換体は３：１の割合で分離する。Ｔ２種子を栽培して、自家受粉させて得られるＴ３種子において、形質転換体がすべての種子で出現すれば、該Ｔ２形質転換植物はホモ接合体（homozygote）であり、該形質転換植物が３：１に分離すれば、該Ｔ２形質転換植物は導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてヘテロ（heterozygote）であると決定できる。
【００６６】
このようにして選抜された、導入されたポリアミン代謝関連酵素遺伝子についてホモ接合体である植物は、改良された環境ストレス抵抗性が固定された系統として、種子産業の分野において極めて有用である。
【００６７】
上記に示した、サザン解析やノーザン解析でポリアミン代謝関連酵素遺伝子の遺伝子発現解析を行ったトランスジェニック植物はポリアミン含量や種々の環境ストレス抵抗性の評価を行うことができる。
【００６８】
例えば、ポリアミンの定量は、０．０５〜１ｇの試料をサンプリングして、５％過塩素酸水溶液を加えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシル化またはベンゾイル化等で蛍光標識したの後、ＵＶ検出器を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析することができる。
【００６９】
例えば、酸化・除草剤ストレス抵抗性は、０〜３μＭのパラコートを含んだ培地上で、２０〜２５℃で生育させて生育状況（発芽率、生存率など）等を調べることにより評価することができる。塩ストレス抵抗性は１０〜３００ｍＭのＮａＣｌを含んだ培地上で、２０〜２５℃で生育させて生育状況や塩ストレス障害等を調べることにより評価できる。浸透圧・水ストレス抵抗性は、５０〜５００ｍＭのソルビトールを含んだ培地上で、２０〜２５℃で生育させて生育状況や浸透圧・水ストレス障害等を調べることにより評価することができる。低温ストレス抵抗性は−１０〜１５℃に１〜７日間低温処理後、２０〜２５℃で生育させて生育状況や低温障害等を調べることにより評価することができる。
【００７０】
本発明の形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物などが挙げられる。例えば、サツマイモ、トマト、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、マメ、サトイモ、ホウレンソウ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ナタネ、ソルガム、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、サトウキビ、アカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、キク、ペチュニア、トレニア、キンギョソウ、シクラメン、カスミソウ、ゼラニウム、ヒマワリ、シバ、ワタ、マツタケ、シイタケ、キノコ、チョウセンニンジン、柑橘類、バナナ、キウイ等が挙げられる。好ましくは、サツマイモ、トマト、キュウリ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ペチュニア、トレニア、ユーカリ、ワタである。
【００７１】
本発明の環境ストレス抵抗性が改良された植物は、環境ストレスを受ける地域のみならず、環境ストレスを受けない地域であっても予測できない環境ストレスに対処するために使用（生育）されるものであるが、環境ストレスを受ける地域に専ら使用されるものであってもよい。
本発明により、植物の環境ストレス耐性を改良することができ、植物の生育過程において遭遇する様々な環境ストレスによる障害の回避や生長抑制を軽減することができ栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大、除草剤の低減などが期待できる。
【００７２】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローニング
（１）ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製
クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）をバーミキュライトに播種し、子葉展開時に市販の床土（サンサン床土；タキイ種苗社製）を詰めた鉢に移植した。鉢上げしたクロダネカボチャを植物栽培用のインキュベーター（気温 昼２６℃／夜２２℃、１３時間日長）内に置いた。第２本葉展開時にインキュベーター内の温度を昼１８℃／夜１４℃まで下げ低温処理を開始した。低温処理３日後に、根、茎、葉に分けてサンプリングした。ＲＮＡ抽出まで−８０℃のフリーザーに保存した。
【００７３】
約４gのクロダネカボチャの根組織を直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕した。その後、10 mlの抽出用0.2Mトリス酢酸緩衝液〔5M guanidine thiocyanate、0.7%β−mercaptoethanol、1%polyvinylpyrrolidone（M.W.360,000）、0.62%N−Lauroylsarcosine Sodium Salt、pH8.5）を加えポリトロンホモジナイザー（KINEMATICA社製）を用い氷冷下2分間粉砕した。ただし、β−メルカプトエタノールとポリビニルピロリドンは使用する直前に添加した。その後、粉砕液を17,000×gで20分間遠心分離し、上清を回収した。
【００７４】
この上清をミラクロスに濾渦し、その濾液を超遠心分離管に入れた5.7M塩化セシウム溶液1.5 mlに静かに重層し、155,000×g、20℃で20時間遠心した後、上清を捨てRNAの沈殿を回収した。この沈殿を3mlの10mM Tris-HCl、1mM EDTA・2Na、pH8.0（ＴＥ緩衝液と呼ぶ）に溶解し、さらに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（容積比、25:24:1）を加え良く混合した後、遠心分離を行って上層の水層を回収した。得られた水層に、1/10倍量の3M 酢酸ナトリウム（氷酢酸でpH6.2に調製）と、2.5倍量のエタノールを添加して良く混合し、-20℃で一晩静置した。その後、17,000×gで20分間遠心分離し、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。
【００７５】
この乾燥標品を500μlの前述のTE緩衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を65℃で5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに2×結合緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、1M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）を等量になるようにＲＮＡ溶液に加え、平衡化緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、0.5M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）で予め平衡化したオリゴｄＴセルロースカラム（Clontech社製）に重層した。次いで、カラムを約１０倍量の前述の平衡化緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、pH7.5）でpoly(A)+RNAを溶出した。
【００７６】
得られた溶出液に1/10倍量の前述の3M 酢酸ナトリウム水溶液と、2.5倍量のエタノールを加え混合し、-70℃で静置した。その後、10,000×gで遠心分離を行い、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度500μlのTE緩衝液に溶解し、オリゴｄＴセルロースカラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したクロダネカボチャの根由来のpoly(A)+RNAはＰＣＲ用のｃＤＮＡライブラリーと完全長遺伝子単離用のｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。
（２）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
cDNAライブラリーの作製はMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャの根由来のpoly(A)+RNAを鋳型として３’末端に２つのdegenerate nucleotide position を持つ修飾lock-docking オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983)）に従い２本鎖cDNAを合成した。
得られたcDNAの両末端にMarathon cDNAアダプター（T4 DNA ligaseによりds cDNAの両末端へ結合しやすくなるように５’末端をリン酸化したもの）を連結した。得られたアダプター結合のｃＤＮＡをクロダネカボチャ根由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーとした。
【００７７】
シロイヌナズナ由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーはクイッククローンｃＤＮＡ（クロンテック社製）を用いた。
（３）ＰＣＲ用プライマーの設計
既に植物や哺乳類から単離されているアルギンニン脱炭酸酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子の決定されている塩基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存されている領域を選び出し、ＤＮＡオリゴマーを合成した（配列プライマーＩ〜VI）。
ＳＰＤＳプライマーＩ（配列番号９）：５’−ＧＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＣＡ−３’
ＳＰＤＳプライマーII（配列番号１０）：５’−ＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡ−３’
ＳＡＭＤＣプライマーIII（配列番号１１）：５’−ＴＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣ−３’
ＳＡＭＤＣプライマーIV（配列番号１２）：５’−ＧＣＴＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴ−３’
ＡＤＣプライマーＶ（配列番号１３）：５’−ＧＧＧＣＴ（Ｔ／Ｇ）ＧＧＡ（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ｇ／Ｃ）ＧＡＣＴＡ（Ｃ／Ｔ）−３’
ＡＤＣプライマーVI（配列番号１４）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＴＣ（Ｇ／Ａ）ＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＧＴ−３’
ＳＰＭＳプライマーVII（配列番号１５）：５’−ＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧＡＧＧＴＣＡＴ−３’
ＳＰＭＳプライマーVIII（配列番号１６）：５’−ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＣＡＣ−３’
（４）ＰＣＲによる増幅
（２）で得られたＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、（３）で設計した配列プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのステップは最初、９４℃、３０秒、４５℃、１分間、７２℃、２分間で５サイクル、続いて９４℃、３０秒、５５℃、１分間、７２℃、２分間で３０サイクル行った。
（５）アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロース電気泳動で分離し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。
（６）ＰＣＲ産物の確認と回収
検出された増幅バンドを確認し、カミソリの刃を用いてアガロースゲルから切り出した。切り出したゲルを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてゲルからＤＮＡ断片を単離精製を行った。回収したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴクローニングベクター（Promega社製）にサブクローニングし、大腸菌に形質転換後、常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
（７）塩基配列決定
得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行った。ＳＰＤＳ遺伝子については３種類の遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子については１種類の遺伝子、ＡＤＣ遺伝子については２種類の遺伝子、ＳＰＭＳ遺伝子は１種類の遺伝子が単離された。
（８）ホモロジー検索
これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデータベースとホモロジーサーチを行うとＳＰＤＳ遺伝子は既知の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子と７０％の相同性を示した。ＳＡＭＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子と７０％以上の相同性を示した。ＡＤＣ遺伝子については既知の植物由来のＡＤＣ遺伝子と６７％以上の相同性を示した。ＳＰＭＳ遺伝子についてはシロイヌナズナ由来のＳＰＭＳ遺伝子と１００％の相同性を示し、完全長鎖の遺伝子を単離した。
（９）完全長遺伝子の取得
完全長遺伝子はプラークハイブリダイゼーション法で取得した。cDNAライブラリーの作製はZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を使用した。（１）で得られたクロダネカボチャ根由来のpoly(A)+RNAを鋳型としてオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (1983)）に従い２本鎖cDNAを合成した。
【００７８】
得られたcDNAの両末端にEcoRIアダプター（内部にXho IとSpe Iサイトを持つ）を連結し、Xho Iで消化した後、それをλファージベクター、λZAP IIアームのEcoRIとXho I部位に連結後、インビトロパッケージングキット（Stratagene社製、GIGAPACK Gold）を用い、パッケージングを行い、大腸菌SURE株（OD660=0.5）に感染させることにより多数の組換えλファージを得た。これをクロダネカボチャ根由来のcDNAライブラリーとした。このライブラリーのサイズは8.0×106であった。
【００７９】
プローブの作製は（６）で調製したＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子のプラスミドＤＮＡからインサートｃＤＮＡを単離・調製し、得られたcDNAを鋳型として、Random Primed DNA Labeling Kit（USB社製）を用いて、32P標識プローブを作製した。得られた32P標識cDNAをプローブに用いた。
【００８０】
前記、クロダネカボチャ根由来のcDNAライブラリーを構成するファージを大腸菌に感染させてLB寒天培地上で増殖させ、約50,000個のファージDNAをナイロンメンブレン（ハイボンド−N、アマシャム社製）に写し取った。
【００８１】
ファージDNAを写し取ったナイロンメンブレンをアルカリ変性液（0.5M NaOH、1.5M NaCl）を含んだ濾紙上に移し、4分間放置し、次に中和液（0.5M Tris-HCl、1.5M NaCl、pH8.0）を含んだ濾紙上に移し５分間放置した。2×SSC（0.3M NaCl、0.03Ｍ クエン酸三ナトリウム）で洗浄した後、メンブレンをストラタリンカー（Stratagene社製）を用いDNAの固定を行なった。固定処理を行ったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション溶液（50%ホルムアミド、0.5%SDS、6×SSPE（3M NaCl、0.2M NaH2PO4、20mMEDTA・2Na、pH7.4）、5×デンハルト溶液（0.1% Ficoll、0.1% Polyvinylpyrrolidone、0.1% bovine serum albumin）、50μg/ml変性サケ精子DNAを含有中において、42℃で3時間プレハイブリさせ、作製したcDNAプローブを加え42℃で18時間ハイブリダイズさせた。その後、メンブレンを取り出し、2×SSC、1×SSC、0.5×SSCおよび0.1×SSCを含有する溶液を用いて、42℃で1時間〜2時間洗浄した。このメンブレンを乾燥した後、Ｘ線フィルムを密着させて一晩感光させた。
【００８２】
その結果、ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ遺伝子断片から得たプローブでハイブリダイズした陽性クローンを選抜することができた。
【００８３】
陽性クローンのファージDNAそれぞれから、インビボ・エクシジョン法によりcDNAインサートを持つプラスミドクローンを調製した。インビボ・エクシジョン法は、ZAP-cDNA Synthesis Kit（stratagene社製）の方法に従った。
【００８４】
ＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子を含む各ファージ液200μl、大腸菌XL1-Blue懸濁液200μl、ヘルパーファージR408懸濁液１μlを混ぜ37℃で15分間インキュベートした後、3mlの2×YT培地を加え37℃で2時間振蘯培養し、70℃で20分間処理し、遠心分離（4,000×g、10分間）して上清を回収した。得られた上清30μlと大腸菌SURE懸濁液30μlを混ぜ、37℃で15分間インキュベートした後、アンピシリンを50ppm含むLB寒天培地に数μl植菌し、37℃で一晩培養した。コロニーを形成した大腸菌は、cDNAインサートを持つプラスミドクローンを含んでいた。これらプラスミドの挿入配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行った。その結果、開始コドンを含むプラスミドであることが明らかとなった。
【００８５】
得られた完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子をＦＳＰＤ１（配列番号１，２）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＳＡＭ２４（配列番号３，４）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＡＤＣ７６（配列番号５，６）と命名した。シロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子をＦＳＰＭ５（配列番号７，８）と命名した。
【００８６】
得られたＦＳＰＤ１と既知の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表１）。表１の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＰＤ１は他の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００８７】
【表１】
得られたＦＳＡＭ２４と既知の植物由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表２）。表２の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＳＡＭ２４は他の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００８９】
【表２】
得られたＦＡＤＣ７６と既知の植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸比較を行った（表３）。表３の結果からクロダネカボチャ根由来のＦＡＤＣ７６は他の植物由来のＡＤＣ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。
【００９１】
【表３】
得られたＦＳＰＭ５とシロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子（ＡＣＬ５ｃＤＮＡ：GenBankアクセッションナンバーAF184093）とアミノ酸比較を行い、オープンリーディングフレームでアミノ酸が完全に一致した。
実施例２：トランスジェニックシロイヌナズナの作製
（１）発現コンストラクトの作製
配列番号１に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−と命名した。
配列番号３に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−と命名した。
配列番号５に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＡＤＣ７６の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−と命名した。
配列番号７に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＭ５の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断した。これらの断片をＸｈｏI処理した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−と命名した。
（２）プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃・１晩、アグロバクテリウムＣ５８株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃・２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達（三者接合法）させた。１から２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＣ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５−と命名した。トランスジェニックシロイヌナズナの作製は減圧浸潤法〔以下（３）〜（６）〕または、カルス再生法〔以下（７）〜（１２）〕で行った。
（３）シロイヌナズナの栽培
培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）をプラスチック鉢に入れ、表面を網戸用のメッシュで覆い、メッシュの間にシロイヌナズナコロンビア株（以下「コロンビア株」又は「野生株」という）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供）を２〜５粒づつ播種した。２日間・４℃の低温室にいれ発芽処理後、２２℃・長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）に移して栽培を行った。約４〜６週間後に主軸花茎が５〜１０ｃｍ伸長した植物体について、摘心して側枝の誘導を行った。摘心約１〜２週間後にアグロバクテリウム感染処理を行った。
（４）アグロバクテリウム懸濁液の調製
前記（２）で作製したアグロバクテリウムを感染２日前に、抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養した。さらに、この培養液を分取して抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０００ｍｌ ＬＢ培地に移して、さらに、２８℃、約２４時間振とう培養した（ＯＤ600が１．２〜１．５になるまで）。培養液を室温下で集菌して、ＯＤ600が０．８〜１になるように浸潤用懸濁培地（０．５×ＭＳ塩、０．５×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．４４μＭ ベンジルアミノプリン、０．０２％ Ｓｉｌｗｅｔ−７７）に再懸濁した。
（５）アグロバクテリウムの感染
前記（３）で作製したシロイヌナズナの鉢に前記（４）で調製したアグロバクテリウム懸濁液が培養土中に吸収されるのを抑えるために、鉢の培養土中に水を与えた。１０００ｍｌのビーカーに約２００〜３００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を分取し、シロイヌナズナの鉢を逆さにして、植物体を懸濁液に浸けた。鉢を入れたビーカーをデシケーター内に入れ、バキュームポンプで約−０．０５３ＭＰａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、約１０分間放置した。徐々に陰圧を解除した後、植物をアグロバクテリウム懸濁液から取り出して、キムタオルで余分なアグロバクテリウム懸濁液を取り除き、深底トレイに横倒しした。少量の水を入れて、サランラップを被せた。この状態で約１日放置した。サランラップを外して、鉢を起こして約１週間給水を停止した。その後、徐々に培養土に水を与え、約３〜５週間の間、成熟したさやから種子の収穫を行った。収穫した種子は、茶こしを用いて、さややゴミを取り除きデシケーター内に入れ十分に乾燥させた。
（６）形質転換植物の取得
前記（５）で取得した種子を１００μｌ（約２０００粒）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移して、７０％エタノール中で２分間、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中に１５分間それぞれ浸して、最後に滅菌水で５回洗浄して種子の殺菌を行った。殺菌後の種子を１５ｍｌのファルコンチューブに移して、約９ｍｌの０．１％無菌寒天溶液を加えて、激しく混合した。種子０．１％寒天混合液をファージをプレートする要領で選択培地（１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．８％ 寒天、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、４０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、８ｇ／ｌ Ｐｈｙｔａｇａｒ、ｐＨ５．７）に均一になるように広げた。クリーンベンチ内で約３０分乾燥後、４℃、２日間の低温処理後、２２℃のグロースチャンバーに移して、抗生物質に対して抵抗性を示す形質転換体を選抜した。本葉が３〜５枚した植物体を再度新しい選択培地に移して本葉が４〜６枚になるまで栽培した。抗生物質に対して抵抗性を示した形質転換植物（Ｔ１）を培養土を含んだ鉢に定植して、約５〜７日間多湿条件下で順化させた。順化後、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培させた。得られた形質転換植物（Ｔ１）、および該形質転換植物から得られた種子（Ｔ２）から生育させたＴ２植物体についてＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによる導入遺伝子の解析とノーザンハイブリダイゼーションによる発現レベルの解析を行い、目的のポリアミン代謝関連酵素遺伝子が安定に組み込まれ、且つ発現している形質転換体を確認した。さらに、Ｔ２植物体からＴ３種子を収穫し、抗生物質に対する抵抗性試験（分離比検定）を行って形質転換出現比率からホモ接合体（Ｔ２）を取得した。Ｔ２種子とホモ接合体から取得したＴ３種子（Ｔ３ホモセルライン）を以下の実験に用いた。
（７）無菌シロイヌナズナの栽培
シロイヌナズナＷａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ株（以下ＷＳ株と称す）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、新名惇彦博士より提供）数１０粒を１．５mlチューブに入れ、７０％エタノール１mlを加え３分間放置した。続いて滅菌液（５％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、ＭＳＯプレート（ムラシゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ml／リットル、ｐＨ６．２）に置床した。このプレートを４℃に２日間放置して低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（サンヨー製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中に２２℃、光強度６０００ルクス、長日条件下（明期１６時間、暗期８時間）にて、２１日間培養した。感染効率を上げるために再度植物を無菌的に引き抜いて、新たなＭＳＯプレートの表面に根を広げ、さらに２日間培養を続けた。
（８）アグロバクテリウムの感染
前記で２１日間培養したＷＳ株の根を数株ずつそろえて、メスで１．５〜２．０ｃｍ程度に切りそろえ、ＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μg／ml、カイネチンを０．０５μg／mlとなるように加えたもの）に置き並べた。光強度３０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で２日間培養した。前記（２）で作製したアグロバクテリウムを抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養し、アグロバクテリウムを、ＭＳ希釈液（ムラシゲ−スクーグ無機塩類６．４ｇ／ｌ、ｐＨ６．３）で３倍に希釈した。アグロバクテリウム希釈液をそれぞれ１mlずつチューブに分注し、この中にカルス化した根の切片を１０分間浸した。２枚重ねた滅菌ろ紙上に並べ、余分な水分を除き、新しいＣＩＭプレートに各々置き並べた。同条件にて２日間共存培養した。
（９）除菌
各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μg／mlになるように加えたもの）に移し、ゆっくり振蘯させて６０分間洗浄した。この操作を５回繰り返した後、滅菌ろ紙上で水分を取り除き、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、２−ｉｐを終濃度５μg／ml、ＩＡＡを終濃度０．１５μg／ml、クラフォランを終濃度５００μg／mlとなるように加えたもの）に置き並べ、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で２日間培養した。
（１０）形質転換植物の選択
前記で２日間培養した切片をＳＩＭＣＳプレート（ＳＩＭＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度４．６Ｕ／mlとなるように加えたもの）に移植し、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期で培養した。以後、１週間毎に新しいＳＩＭＣＳプレートに移植した。形質転換した切片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルスとなるが、非形質転換体は褐変した。形質転換体は約２週間後、カルスが緑色を呈し、約１カ月後、葉が形成され、その後ロゼット葉となった。
（１１）形質転換植物の再生
ロゼット葉となった植物体の根本を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレートに軽く乗せるように挿した。８〜１０日後、１〜２ｃｍ程度の根が数本形成したものをピンセットで無機塩類培地〔５ｍＭ ＫＮＯ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ Ｈ3ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．２ｍＭ ＮａＭｏＯ4、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＣｏＣｌ2）１ml／リットル〕に浸したロックウールミニポット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花し、莢形成後は、パーライトとバーミキュライト（ＴＥＳ社製）を１：１に混合し無機塩類混合培地に浸した土に植え換えた。約１カ月後、１株につき数百粒の種子が得られた。これを以後、Ｔ２種子と称す。
（１２）抗生物質耐性株の取得
Ｔ２種子約１００粒を（７）と同様の方法で滅菌し、ＭＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハイグロマイシンＢ耐性株が発芽した。
（１３）ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイゼーション
前記で発芽したＴ２種子を無機塩類培地に浸したロックウールミニポットにピンセットで移植し、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期、２２℃の条件下で培養した。２週間後、ロックウールの表面をナイフで撫でるようにメスで地上部を切り取り、直ちに液体窒素で凍結した。これを液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕し、１ｇ当たり、３mlのＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、１００μg／ml ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ〕を加え十分撹拌した。６０℃１時間インキュベート後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）し上清をミラクロスで濾渦し新しいチューブに移した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を３回行った後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０μgずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち１μgのＤＮＡを用いて、それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。
【００９３】
また、形質転換を行っていないＷＳ株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIによる消化を行い、１％アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション用プローブは各ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６、ＦＳＰＭ１遺伝子断片を用いた。
【００９４】
サザンハイブリダイゼーションは、モレキュラー クローニング，ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第９章、第３１〜５８頁〔コールド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ）社、１９８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわち、それぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル電気泳動を行い、泳動後、アルカリ変性を行いナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム社製）に一晩サザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）に３分間照射させ、ＤＮＡを固定した。このメンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×デンハルト液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０μg／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中で５０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。プローブを加え、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液で室温１０分間２回洗浄し、続いて同じ洗浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。メンブレンは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社製）を入れたカセット内で−８０℃一晩感光させ、オートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っていない株（１）、ＦＳＰＤ１、ＦＳＡＭ２４、ＦＡＤＣ７６を導入した形質転換体（２）、ベクターのみを導入した形質転換体（３）について、サザンハイブリダイゼーションにより検出されたシグナルのパターンを比較した。
【００９５】
（２）には、（１）、（２）、（３）共通の内在性シグナルのほかに、ＥｃｏＲＩで切断したサンプルと、ＨｉｎｄIIIで切断したサンプルでは特異的なシグナルが観察され、目的アンチセンスＤＮＡが（２）に組み込まれていることが観察された。
実施例３：ノーザンブロット解析
実施例２で得られたＴ２形質転換体で、抑制因子によって内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現が抑制されているかを確かめるために、ノーザンブロッティングを下記に示す様に行った。
【００９６】
形質転換を行っていない野生株（ＷＴ）とＴ２形質転換体（セルライン：ＴＳＰ−２０、２１、２２）のロゼット葉から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は定法に従って行った。得られた全RNA10μgを1.5%ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンドNナイロンメンブランに一晩ブロッティングした。UVクロスリンカーでRNAを固定した後、プレハイブリダイゼーションバッファー（50% Formamide、5X SSPE、5X Denhardt's、 0.1% SDS、80μg/ml Salmon sperm DNA、pH7.0）で、42℃、2時間プレハイブリダイゼーションを行った。シロイヌナズナ由来の内因性ＳＰＤＳ遺伝子断片のcDNAを32P-dCTPとランダムラベルキット（アマシャム社製）を用いて、プローブを作製した。シロイヌナズナ由来のＳＰＤＳ遺伝子断片は前記実施例１と同様な方法で取得した。このプローブをプレハイブリダイゼーションに加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブランを2×SSC、0.1% SDSを含む洗浄液からスタートし、最終的には0.1× SSC、0.1% SDSを含む洗浄液で55℃30分2回まで洗浄した。メンブランをX線フィルム（Kodak社製）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。
【００９７】
ノーザンブロッティングの結果を図2に示した。図2の結果から、野生株（ＷＴ）比べて形質転換体（ＴＳＰ−２０、２１、２２）ではシロイヌナズナ由来の内因性ＳＰＤＳ遺伝子の発現レベルが低く、抑制因子によって発現が抑制されていることが確認された。他の形質転換体においても、内因性ＳＡＭＤＣ遺伝子、内因性ＡＤＣ遺伝子、内因性ＳＰＭＳ遺伝子の発現レベルが、抑制因子によって減少していることを確認した。
実施例４：ポリアミン含量の評価
（１）ポリアミン含量の分析
実施例３で内因性ＳＰＤＳ遺伝子の発現が抑制されていたセルライン、ＴＳＰ−２０、２１、２２についてポリアミン含量を調べた。同時に栽培した野生株（コロンビア）と形質転換体（ＴＳＰ）から約０．０５〜０．２ｇのロゼット葉（または本葉）をサンプリングして密閉可能なポリ製のバイアル瓶に移して凍結保存させた。サンプリングした試料にプトレシン、スペルミジン、スペルミンの希釈内部標準液（内部標準量＝２．５ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり４ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、４℃、３６，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取した。上清液から正確に１．０ｍｌを遠心管に入れて、さらに正確に１２ＮＨＣｌを１．０ｍｌを遠心管に加えて、密栓後、１１０℃の乾燥機に入れて１８時間加水分解した。分解後、濃縮乾固した後、正確に１．０ｍｌの５％過塩素酸水を加えて十分に溶解させた。得られた溶液をカチオン交換樹脂（５０Ｗ−４Ｘ、２００−４００メッシュ、Ｈ＋型：バイオラッド社製）カラムに通した。０．７Ｎ ＮａＣｌ／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、水、１Ｎ塩酸を順次流してカラムを洗浄し、ポリアミン以外のアミノ酸や有機物を除去した。６Ｎ塩酸をカラムに加え、液が出なくなるまで流出し、ポリアミンを回収した。溶出液を７０℃で減圧乾固し、これに５％過塩素酸を加えポリアミンを溶解した。プトレシン、スペルミジン、スペルミンのポリアミン量の定量はダンシル化した後、ＵＶ検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表４に示す。
【００９８】
【表４】
表４より、明らかなようにポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルラインＴＳＰ−２０、２１、２２は、プトレシン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増大していることが明らかとなった。さらに、シロイヌナズナ由来のＦＳＰＭ５をアンチセンス方向に導入した形質転換体のセルラインでは、スペルミジン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増大していることも確認された。
【０１００】
以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物にアンチセンス方向で遺伝子導入することで、植物内のポリアミン含量を増加させることが可能であることが示された。これらのことから、抑制因子としてポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが認められた。
実施例５：環境ストレス抵抗性の評価
（１）酸化・除草剤ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（セルライン：ｐＢＩ１２１（３５Ｓ−ＧＵＳ）、ＴＳＰ−２０、ＴＳＰ−２１、ＴＳＰ−２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２ｕＭのパラコート（ＰＱ）を含んだ発芽生育培地（２ｕＭ ＰＱ、１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、１０日目に発芽個体数（発芽率）、さらに２０日目に生存個体数（生存率）を観察した。その結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
表５の結果から野生株とベクターコントロールのライン（ｐＢＩ１２１）は、明らかにパラコートによる毒性効果で発芽率と生存率が著しく低下しているのに対して、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１）をアンチセンスで導入したセルラインＴＳＰ−２０、２１、２２の発芽率、生存率は高い値で維持された。さらに、シロイヌナズナ由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子（ＦＳＰＭ５）をアンチセンスで導入したセルラインも同様な評価を行ったところ、野生株に比べて有意に発芽率と生存率が高まることが確認された。
【０１０３】
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、酸化・除草剤ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
（２）塩ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２１）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を７５ｍＭのＮａＣｌを含んだ発芽生育培地（７５ｍＭ ＮａＣｌ、１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、５週間目に発芽生育培地上の植物体の生育程度を観察した。その結果を図３に示す。
【０１０４】
図３の結果からコントロールであるＷＴは７５ｍＭのＮａＣｌを含んだ培地上では著しい生育阻害が観察されて、ほとんどの個体が白色化して枯死した。一方、形質転換体（ＴＳＰ−２１）ではほとんどの個体が緑色を呈して生存しており、遅いながらもそのまま生育を続けた。
【０１０５】
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を７５ｍＭと１００ｍＭのＮａＣｌを含んだ、または含まない発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。栽培開始日から１７日目まで毎日発芽率を測定した。その結果を図４に示す。
【０１０６】
図４の結果からコントロールであるＷＴは７５ｍＭおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含んだ培地上では発芽日が遅れて発芽速度が低下した。一方形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）は発芽日の遅れや発芽速度の低下が小さく、ＷＴに比べて塩ストレスによる阻害効果が顕著に軽減していることが確認された。
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、塩ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
（３）浸透圧・水ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２５０ｍＭと３００ｍＭのソルビトールを含んだ、または含まない発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。栽培開始日から１９日目まで毎日発芽率を測定した。その結果を図５に示す。
【０１０７】
図５の結果からコントロールであるＷＴは２５０ｍＭおよび３００ｍＭのソルビトールを含んだ培地上では発芽日が遅れて発芽速度が低下した。一方形質転換体（ＴＳＰ−２１、２２）は発芽日の遅れや発芽速度の低下が小さく、ＷＴに比べて浸透圧・水ストレスによる阻害効果が顕著に軽減していることが確認された。
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、浸透圧・水ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
（４）低温ストレス耐性の評価
実施例３で得られた形質転換体（ＴＳＰ−２２）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例３の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２枚の発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％ ＭＥＳ、５ｇ／ｌ Ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で７日間子葉が展開するまで育成した。２枚の培地のうち１枚を５℃・２４０μmol m-2 sec-1 PPFD、１枚を２２℃・２４０μmol m-2 sec-1 PPFDの条件下に移して５日間温度処理を行った。処理後２２℃・弱光の長日条件下に戻して２週間育成した後に各個体の新鮮重を測定した。その結果を図６に示す。
【０１０８】
図６の結果からコントロールであるＷＴは５℃の低温ストレスに遭遇することによって２２℃に比べて顕著な生育抑制が見られたが、形質転換体（ＴＳＰ−２２）では明らかに低温ストレスによる生育抑制が小さかった。
以上の結果から、抑制因子として植物にポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、低温ストレス抵抗性が有意に増大した植物が得られることが明らかとなった。
【０１０９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現コンストラクトの構造を示す図である。
【図２】形質転換体におけるシロイヌナズナ（内因性）ＳＰＤＳ遺伝子の発現結果を示す図である。
【図３】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との塩ストレス抵抗性（生育）の比較を示す図である。
【図４】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との塩ストレス抵抗性（発芽率）の比較を示す写真である。
【図５】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との浸透圧・水ストレス抵抗性（発芽率）の比較を示す図である。
【図６】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した植物と野生株との低温ストレス抵抗性（生育）の比較を示す図である。
Claims (7)
- 植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあり、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子の発現を抑制する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない植物に比べて酸化ストレス抵抗性、および除草剤ストレス抵抗性からなる群から選ばれる少なくとも１種の環境ストレス抵抗性が改良された植物の作出方法。
- 前記形質転換細胞から植物体を再生する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
- 前記核酸配列が導入された形質転換植物を選択する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
- 前記核酸配列が導入されたホモ接合体を取得する工程をさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
- 前記形質転換植物から受粉により種子を採取する工程、および
該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜する工程
をさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。 - 前記核酸配列が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）配列表配列番号７（ＳＰＭＳ、１０２０）に示される塩基配列中塩基番号１〜１０２０で示される塩基配列のアンチセンスＤＮＡ、
（ｂ）上記配列表配列番号７（ＳＰＭＳ、１０２０）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ内因性ＳＰＭＳ遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡ、
（ｃ）配列表配列番号７（ＳＰＭＳ、１０２０）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列の相補鎖からなり、且つ内因性ＳＰＭＳ遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＤＮＡ。 - 前記核酸配列が、ＳＰＭＳ遺伝子のイントロンまたはエクソン、該遺伝子のプロモーターを含む５‘上流側の調節領域または終止コドンの下流側であって、遺伝子発現に影響する領域のいずれかのアンチセンスＤＮＡである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
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