KR101342300B1 - 병저항성 관련 아르지닌 디카르복실라아제 유전자 ＣａＡＤＣ１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체 - Google Patents

병저항성 관련 아르지닌 디카르복실라아제 유전자 ＣａＡＤＣ１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병저항성 관련 유전자 CaADC1 ( C apsicum a nnuum A rginine D e c arboxylase 1 ), 이를 이용한 식물병 저항성 탐색방법 및 형질전환 식물체에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 상기 유전자는 세균의 비병원성 단백질 AvrBsT와 상호작용하는 신규 저항성 관련 유전자로서 병원균의 공격에 대한 식물체의 방어 반응 및 병저항성 식물체의 효율적이고 효과적인 분자적 육종을 위한 유전재료로서 유용하게 사용될 수 있으며, 식물병 저항성에 대한 탐색 및 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있는 이점이 있다.

Description

병저항성 관련 아르지닌 디카르복실라아제 유전자 ＣａＡＤＣ１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Disease resistance-related arginine decarboxylase gene CaADC1, and transgenic plants using the same}
본 발명은 식물병 저항성에 관련된 신규 유전자인 아르지닌 디카르복실라아제 유전자 CaADC1 유전자 (CaADC1: C apsicum a nnuum A rginine D e c arboxylase), 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되어 세균의 비병원성 단백질 AvrBsT와 상호작용하는 식물병 저항성 관련 신규 유전자인 고추 유래의 CaADC1 유전자의 염기서열 및 그에 따른 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용하여 생물적(biotic) 또는 비생물적 (abiotic) 처리시 저항성 관련 유전자 CaADC1의 차별적인 발현 여부를 확인하는 식물체의 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 바이러스 유도 유전자 억제(Virus-induced gene silencing) 기술과 애기장대에 형질전환을 통하여 CaADC1 유전자를 각각 발현억제(knock-down)와 과발현(overexpression)시키고, 담배(Nicotiana benthamiana ) 식물에서 일시적 발현 (transient expression) 시켜서 폴리아민 (polyamine) 형성 증가 및 병 저항성 유도를 확인하여 병 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것에 관한 것이다.
지구가 지진, 홍수, 폭설 등의 자연재해로 크게 피해를 받고 있고 온난화 현상으로 병해충의 발생이 증가되어 인간 및 자연환경에 유해한 화학농약의 과도한 사용으로 환경오염과 인축에 대한 유해성 때문에 친환경 녹색성장이 일반에게 화두가 되고 있다. 따라서 모든 산업과 사회의 전반적인 생활 양식이 친환경적으로 전환하는 것이 의무화 되어가는 추세이다. 농업에 있어서 친환경 녹색성장을 이룩하기 위해서는, 식물병의 방제를 위해 농약과 같은 화학적 방제가 필요하지 않은 병저항성 품종의 개량 및 육종 방법을 찾는 것이 절실하다. 식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학기술적 가치를 지닌다. 또한 식물저항성 관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.
우리나라에서 집약적으로 재배되는 고추 (Capsicum annuum L.)는 주요 경제 작물로써 다양한 식물병에 피해를 받고 있으며, 이에 대한 식물의 방어 반응을 분자세포학적으로 연구하는 것이 필요하다. 고추 세균성점무늬병원균과 고추와의 상호작용에서 방어반응에 관여하는 유전자의 분자적 클로닝과 기능 분석은 고추의 병방어 반응 경로의 이해를 증진시키고, 저항성관련 유전자를 고추식물에서 발현시킨 병저항성 형질전환식물의 개발을 위한 유전자원의 토대가 된다.
식물체는 병원균에 감염되면 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 활성화하는데, 이러한 방어기작은 병원체에 대한 기주세포의 인식을 시발점으로 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응, 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 폴리아민 (polyamine) 등 여러 종류의 2차 대사산물과 항균성 물질을 생성하고, 병방어 관련 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재 저항성 반응시 생성되는 대사산물, 특히 직접 식물에 보호효과를 주는 폴리아민과 같은 2차 대사산물이 식물병 저항성에 어떻게 기여하는지 이들 2차 대사과정과 관련된 유전자에 대한 연구가 매우 미흡한 실정이다. 따라서 폴리아민 생성에 역할하는 식물병저항성 관련 아르지닌 디카르복실라아제(ADC) 유전자를 동정하고 클로닝 하여 분석하는 것이 병저항성 작물 품종을 육종하는데 실질적으로 기여할 것으로 기대된다.
본 발명의 배경이 되는 기술로서 홍성회의 한국농화학회지 제39권 제2호(1996)에는 벼의 아르기닌 디카르복실라아제 DNA 클론의 재조합 및 염기서열 분석이 기재되어 있으나, 고추에서 유래된 ADC 유전자에 대해서는 개시되어 있지 않다. 또한, 미국 특허공보 US 7,328,861 (2007.07.03)에는 다양한 환경스트레스에 대한 향상된 내성을 갖는 식물체 및 폴리아민 메타폴리즘 관련 효소 유전자로서 야생호박에서 유래된 ADC 유전자가 공개되어 있으나, 고추 유래의 ADC 유전자에 대해서는 개시되어 있지 않다.
미국 특허공보 US 7,328,861 (2007.07.03)
홍성회 외, 한국농화학회지 제39권 제2호 pp. 112-117(1996)
본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 관련 유전자의 하나인 아르지닌 디카르복실라아제 (CaADC1: C apsicum a nnuum A rginine D e c arboxylase 1 ) 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 CaADC1 유전자를 이용하여 식물병, 화학물질 또는 환경스트레스에 대한 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.
더 나아가, 본 발명은 상기 CaADC1 유전자를 이용하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 상기 목적은, 고추 녹광 품종 (Capsicum annuum L. cv. Nockwang) 식물이 고추 세균성 점무늬병 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되어 세균의 비병원성 단백질 AvrBsT와 상호작용하는 신규 저항성 관련 유전자 CaADC1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, 이를 이용하여 병원균, 화학물질 처리를 통하여 CaADC1의 발현 여부를 조사하고, VIGS를 통한 CaADC1의 유전자가 억제된 고추식물과 이 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 CaADC1 유전자의 식물병 저항성 유도 기능을 확인하여 달성하였다.
따라서 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자(CaADC1)를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자(CaADC1)를 제공한다.
나아가 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaADC1)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자(CaADC1)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 상기 재조합 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 pBIN35S:CaADC1, 또는 pTRV:CaADC1이다.
나아가, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 식물세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
또한, 본 발명은 식물체로부터 mRNA 분리하여 CaADC1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고 그리고 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리를 이용하여 이스트 투-하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)을 수행하여 점무늬병균의 비병원성 단백질인 AvrBsT(NCBI Accession No. GQ266402; Nak Hyun Kim et al., MPMI Vol. 23, No. 8, 2010, pp. 1069-1082.)와 상호작용하는 cDNA 클론을 동정하였다. 이 클론을 이스트(yeast) 세포에서 분리 정제하여 유전자의 염기서열을 해독함으로써, CaADC1 으로 명명된 고추 녹광품종의 아르지닌 디카르복실라아제 단백질 코딩 유전자 염기서열(서열번호 1) 및 그에 따른 아미노산 서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).
본 발명에 의한 CaADC1 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 식물의 아르지닌 디카르복실라아제 (arginine decarboxylase)에서 전형적으로 나타나는 아르지닌 디카르복실라아제 시그네처 도메인 (arginine decarboxylase family 2 signature domain)을 가지고 있었고, 담배 (Nicotiana tabacum)의 아르지닌 디카르복실라아제 (accession no. AAQ14851)와는 단백질 수준에서 86 %, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 아르기닌 디카르복실라아제 (accession no. NP_195197)와는 단백질 수준에서 71 %의 상동성을 나타냄으로써 신규임을 알 수 있었다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, nucleotide blast program).
다음에, 본 발명은 생물적/화학적 처리를 한 식물체로부터 mRNA를 분리하여 CaADC1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병 또는 화학물질(환경스트레스) 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 상기 생물적 처리는 고추 세균성 점무늬병의 병원성, 비병원성 세균 그리고 고추 역병의 난균 등의 병원균을 예로 들 수 있다. 상기 화학적 처리는 식물 호르몬인 살리실산, 메틸자스몬산 및 에칠렌을 예로 들 수 있다. 상기 CaADC1 유전자 발현 여부 확인은 노던 블럿, 실시간 RT-PCR, 마이크로어레이법 외에도 mRNA의 발현을 측정할 수 있는 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 CaADC1 유전자가 식물 병원균 또는 화학물질 처리에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaADC1 유전자는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 CaADC1 유전자 발현을 억제하는 재조합 벡터를 이용하여 특이적으로 CaADC1 유전자가 억제된 고추 식물체를 제작하고 병 감수성이 증대되는 것을 확인하고, CaADC1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물의 식물병 저항성이 증가하는 것을 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 CaADC1 유전자 발현을 증가시키는 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체에 병 저항성을 부여하는 방법도 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명은 바이러스 유도 유전자 억제 기술(virus-induced gene silencing (VIGS))에 이용되어지는 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaADC1 유전자를 TRV 벡터(참고문헌: Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2:109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV:CaADC1를 제작하였다. 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CaADC1의 발현이 억제된 VIGS 식물체를 제조하여 저항성이 감소되는 것을 확인하였다 (도 6 ~ 도 8 참조).
나아가 본 발명에 의한 CaADC1 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pBIN35S:CaADC1)와 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여, 애기장대 식물에서의 형질전환 발현(transgenic expression)을 통한 CaADC1 유전자의 식물체 병저항성 증가를 확인하고 병저항성 형질전환 식물체를 제공할 수 있었다(도 12 및 도 13 참조).
상술한 바와 같이 본 발명에서 CaADC1가 고추 식물의 병저항성 조절에 중추적 역할을 한다는 것을 확인하고 CaADC1의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질 (PR protein)의 유전자 정보를 축적할 수 있게 되어 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하는 데에 실용적으로 이용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 식물 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되어 세균의 비병원성 단백질 AvrBsT와 상호작용하는 식물병 저항성 관련 유전자인 CaADC1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 식물병 또는 화학물질 스트레스 저항성 탐색방법을 제공할 수 있게 되었다.
아울러 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현을 억제하거나, 과발현시켜 식물병 저항성에 기여함을 확인하여 본 발명에 의한 CaADC1는 병 저항성 식물체의 육종을 위한 재료로서 저항성 품종 개발을 촉진할 수 있는 효과가 있으므로 본 발명은 식물육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종 (Capsicum annnuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 CaADC1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,
도 2는 고추 녹광 품종의 각 기관에서 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,
도 3은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때, 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaADC1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 4는 살리실산(salicylic acid), 메칠자스몬산(methyl jasmonic acid) 및 에칠렌(ethylene)을 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 5는 바이러스 유도 유전자 억제(virus-induced gene silencing; VIGS)의 방법을 사용하여 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, 병 감수성이 증대되어 감수성이 병징이 확대된 것을 나타낸 도면이고,
도 6은 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 각각 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, 감염 고추 잎 조직에서의 세균 생장을 나타낸 그래프이고,
도 7은 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, 본 발명에 의한 CaADC1의 효과적인 발현 억제와 저항성 관련 유전자의 발현 차이를 나타낸 결과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 본 발명에 의한 CaADC1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, 폴리아민 축적량을 정량한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 9는 재조합벡터 pBIN35S:CaADC1 , pBIN35S:CaADC1 K154A 그리고 pBIN35S:avrBsT와 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 담배(Nicotiana benthamiana) 식물에서 CaADC1 , CaADC1 K154A 그리고 avrBsT 유전자를 여러 조합으로 과발현시켰을 때 세포사멸 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이고,
도 10은 CaADC1 , CaADC1 K154A 그리고 avrBsT 유전자를 여러 조합으로 과발현시킨 담배(Nicotiana benthamiana ) 식물에서 산화질소의 축적을 확인한 결과를 나타낸 도면이고,
도 11은 CaADC1 , CaADC1 K154A 그리고 avrBsT 유전자를 여러 조합으로 과발현시킨 담배(Nicotiana benthamiana ) 식물에서 폴리아민의 축적을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 12는 형질전환 애기장대 식물에서 본 발명에 의한 CaADC1 유전자가 과발현되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 13은 본 발명에 의한 CaADC1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 흑반병원균인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst DC 3000) 균주 접종시 식물체 내에서 병원균 생장을 검정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] CaADC1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정
고추 세균성 점무늬병에 대한 병저항성 관련 단백질 중 하나인 아르지닌 디카르복실라아제 (CaADC1: C apsicum a nnuum A rginine D e c arboxylase 1 ) 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성세포사멸반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.
다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 그리고 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리를 이용하여 이스트 투-하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)을 수행하여 점무늬병균의 비병원성 단백질인 AvrBsT와 상호작용하는 cDNA 클론을 동정하였다. 이 클론을 이스트(yeast) 세포에서 분리 정제하여 수득하였다.
수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CaADC1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 아르지닌 디카르복실라아제 (CaADC1) 유전자로 명명하였다. CaADC1 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 식물의 아르지닌 디카르복실라아제 (arginine decarboxylase)에서 전형적으로 나타나는 아르지닌 디카르복실라아제 시그네처 도메인 (arginine decarboxylase family 2 signature domain)을 가지고 있었고, 담배 (Nicotiana tabacum)의 아르지닌 디카르복실라아제 (accession no. AAQ14851)와는 단백질 수준에서 86 %, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 아르기닌 디카르복실라아제 (accession no. NP_195197)와는 단백질 수준에서 71 %의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 알 수 있었다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, nucleotide blast program). 확인된 CaADC1의 유전자 염기서열(서열번호 1)과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 도 1에 나타내었다.
[ 실시예 2] 병원균 접종에 의한 고추식물에서의 CaADC1 유전자의 발현 탐색
상기 실시예 1에서 수득한 CaADC1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.
[단계 1]
먼저 저항성 탐색 방법을 구체적으로 제시하기 위하여, 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 YN(Yeast- Nutrient) 배지에서 배양한 후, 108 cfu/㎖의 농도로 6엽기의 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)의 3, 4엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 침투시켜 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실 처리 하였다. 접종 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후에 각각 접종된 잎을 샘플링 하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.
다음으로 실시예 1에서 수득된 CaADC1 유전자에 클레나우 효소(Klenow enzyme)를 이용하여 동위원소가 붙은 α-32P[dCTP] 을 표지한 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24 시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 동위원소가 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막(Hybond N+)에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 (Hybond N+) 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 동위원소가 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 발현 유무와 정도를 알아볼 수 있게 하였다.
상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일 량의 RNA 시료가 로딩 되었음을 확인하였다. 이상의 실험결과를 도 3에 나타내었으며 실험의 결과 CaADC1 유전자는 비병원성 고추세균성점무늬병 접종 후 10시간 이후에 발현이 시작되고 접종 후 25시간 이후에는 점차 발현이 감소하였다.
[ 실시예 3] 식물 호르몬 및 화학적 유도체에 의한 CaADC1 유전자의 유도 발현
본 발명의 CaADC1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 식물 호르몬 및 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
[단계 1]
먼저, CaADC1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 살리실산(salicylic acid), 메칠자스몬산(methyl jasmonic acid) 및 에칠렌(ethylene)을 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다. 모든 실험에 6엽기의 고추 잎이 이용되었다.
살리실산은 5 mM, 메칠자스몬산은 100 μM의 농도로 고추 잎에 스프레이 하는 방법으로 처리하였으며 메칠자스몬산을 처리한 후에는 밀봉 처리하였다. 에칠렌은 20 μl/L의 농도로 하여 기체상태로 식물체가 있는 밀폐된 유리 용기에 주입하는 방법으로 처리하였다. 각각의 식물들은 1, 5, 10, 15, 20, 25시간 후에 잎을 수거하였고 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시킨 후 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다.
실시예 1에서 수득된 CaADC1 유전자에 클레나우 효소(Klenow enzyme)를 이용하여 동위원소가 붙은 α-32P[dCTP] 을 표지한 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 동위원소가 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막(Hybond N+)에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 (Hybond N+) 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 동위원소가 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 발현 유무와 정도를 알아볼 수 있게 하였다. 상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일 량의 RNA 시료가 로딩 되었음을 확인하였다.
실험의 결과 CaADC1 유전자는 도 4에서 보이는 것과 같이 살리실산 처리 후 발현이 5시간부터 10시간 발현되었다가 감소한 뒤 20시간부터 다시 유도되어 25시간까지 발현이 강하게 유지되는 것을 관찰할 수 있었고, 에칠렌 처리 이후 20시간에 발현이 되었고, 메칠자스몬산 처리 후에는 1시간에 발현이 유도되어 25시간 이후까지 발현이 강하게 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.
[ 실시예 4] CaADC1 유전자 발현의 억제에 의한 병 저항성의 변화
고추식물에서 CaADC1 유전자의 발현이 특이적으로 억제되었을 때 병 발생과 관련 다른 유전자들의 발현감소 여부 및 병에 대한 감수성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaADC1 유전자를 바이러스 유도 유전자 억제(VIGS, virus-induced gene silencing)에서 이용되어지는 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaADC1 유전자를 TRV2 벡터에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV:CaADC1를 제조하였다 (참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113).
이렇게 제조한 재조합벡터 TRV:CaADC1를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법 (electrophoration)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 고추 유묘 (seedling)의 떡잎에 주사기를 이용, 엽육주사 (infiltration) 방법으로 접종하여 고추식물에 도입함으로써 CaADC1 유전자의 발현의 억제를 유도시켰다.
[단계 1]
CaADC1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성의 변화를 알아보기 위하여, 상기의 CaADC1의 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 대조구로서 TRV:00 벡터를 접종한 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 107 과 10 8cfu ml-1의 농도로 접종한 후 2일 이후 접종 잎의 병징을 관찰하였고(도 5), 5 x 104 cfu ml-1로 접종하여 접종 후 0, 3일에 감염 식물조직에서의 세균 생장을 측정하였다(도 6).
그리고, 병원균 107 cfu ml-1 농도로 접종 후 1, 2일 후에 실험구와 대조구의 감염 잎에서 RNA를 추출하여 실시간 알티-피시알 (real-time RT-PCR)을 통해 CaADC1의 특이적인 유전자 억제 효과와 함께 병 접종 시 대조구 식물과 비교하여 병저항성 관련 유전자의 발현 차이를 관찰하였다(도 7). 또한 동일한 시점에 시료로부터 폴리아민을 GC-Mass 기법으로 정량하여 병 저항성 관련 대사산물 축적의 변동사항을 관찰하였다 (도 8).
도 5에서와 같이 실험결과 VIGS로 CaADC1의 발현이 억제된 식물에서 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 접종 후 병징을 관찰한 결과, 비병원성 균주 접종시 대조구 식물에서 2일째 국부적 저항성 반응으로 세포사멸이 나타나지만 CaADC1의 발현이 억제된 식물에서는 국부적 세포사멸이 현저히 감소한 것을 관찰하였다. 그리고 도 6에서와 같이 감염조직에서 병원성 균과 비병원성 균의 세균 생장을 측정한 결과 대조구에 비교하여 CaADC1의 발현이 억제된 식물에서 비병원성 세균의 생장이 현저히 증가하였다. 알티-피시알 시험 결과 도 7과 같이, CaADC1이 억제된 식물에서 효과적으로 유전자의 억제가 나타나는 것이 관찰되었고, CaPR1 등(Young Jin Kim et al., PHYSIOLOGIA PLANTARUM 108: 51-60. 2000; Chang-Jin Park et al., The Plant Journal (2004) 37, 186-198)과 같은 병 저항성 마커 유전자의 발현이 줄어든 것으로 나타났다. 폴리아민 축적량을 도 8과 같이 확인한 결과 CaADC1의 발현이 억제된 식물에서는 폴리아민의 축적이 현저히 감소하였다.
[ 실시예 5] CaADC1 과 AvrBsT 동시발현시 세포사멸 변화
모델식물로 사용되는 담배(Nicotiana benthamiana ) 식물체에서 AvrBsT 단백질은 세포사멸을 일으킨다. AvrBsT와 상호작용하는 CaADC1이 AvrBsT가 일으키는 세포사멸에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 동시에 발현시켜서 세포사멸의 변동사항과 세포사멸 관련물질인 산화질소 (NO) 그리고 폴리아민의 축적량을 확인하였다. 실시예 1에서 수득한 CaADC1 및 CaADC1의 효소기능 불활성 돌연변이 CaADC1 K154A 유전자를 식물 과발현용 pBIN35S 벡터에 도입시켜 pBIN35S:CaADC1 , pBIN35S:CaADC1 K154A을 제조한 후 이렇게 제조된 재조합 벡터인 pBIN35S:CaADC1 , pBIN35S:CaADC1 K154A을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기 천공법 (electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 기존의 pBIN35S:avrBsT 함유 균주와 섞어 4주차 담배(Nicotiana benthamiana)잎에 접종하여 일시적으로 CaADC1 또는 CaADC1 K154A와 avrBsT 유전자의 과다발현을 유도시켜 시험을 수행하였다.
[단계 1]
CaADC1을 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaADC1), 효소기능이 불활성화된 CaADC1 K154A를 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaADC1 K154A), avrBsT를 과발현하는 재조합벡터 (35S:avrBsT)와 어떠한 유전자도 과발현하지 않는 대조구 벡터 (35S:EV)를 이용하여 형질전환시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)을 Yeast-Peptone (YEP: yeat extract 10g, peptone 10g, sodium chloride 5g/L) 배지에서 진탕배양 한 뒤 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 균주현탁액 농도를 흡광도 600(optical density 600, OD600)에서 0.2 또는 0.05로 맞추고 이를 여러 조합으로 섞어 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에 각각 접종하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 접종 3일째, avrBsT을 발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium )을 고농도로 접종한 잎에서 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 반면 avrBsT을 발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium )을 저농도로 접종한 잎에서는 UV램프 하에서만 차이가 나는 수준의 세포사멸이 일어났다. CaADC1나 CaADC1 K154A를 발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium )을 고농도로 접종한 잎에서는 세포사멸이 나지 않았다. 그런데 avrBsT와 CaADC1를 저농도로 섞어 접종한 잎에서 세포사멸이 avrBsT를 고농도로 접종한 수준으로 나타났다. avrBsT와 CaADC1 K154A를 저농도로 섞어 접종한 잎에서는 세포사멸이 avrBsT를 저농도로 단독 접종한 수준으로 나타났다.
[단계 2]
상기와 같은 조합으로 접종된 잎에서 세포사멸관련 물질인 산화질소 축적량을 접종후 2일 후 산화질소(NO) 특이적 형광염색시약인 DCF-2DA로 염색하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, CaADC1이나 avrBsT를 고농도로 접종하거나 CaADC1와 avrBsT를 저농도로 섞어 접종한 잎에서는 산화질소 축적량이 높은 현상을 관찰하였다. CaADC1 K154A 고농도, avrBsT 저농도, CaADC1와 avrBsT를 저농도로 섞어 접종한 잎에서는 산화질소가 거의 축적되지 않은 것으로 나타났다.
[단계 3]
상기와 같은 조합으로 접종된 잎에서 폴리아민 축적량을 접종후 1, 2일 후 GC-mass 기기로 측정하였다. 도 11과 같이 CaADC1이나 avrBsT를 고농도로 접종하거나 CaADC1와 avrBsT를 저농도로 섞어 접종한 잎에서는 접종후 2일째에 모든 폴리아민의 축적량이 높은 현상을 관찰하였다. CaADC1 K154A 고농도, avrBsT 저농도, CaADC1와 avrBsT를 저농도로 섞어 접종한 잎에서는 폴리아민이 대조구와 비슷한 수준으로 축적된 것으로 나타났다.
[ 실시예 6] CaADC1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaADC1 유전자의 과다발현에 의한 애기장대 식물의 병 저항성 변화
모델식물로 사용되는 애기장대 식물체에서 CaADC1 유전자의 과다발현시 다른 병 발생과 관련된 유전자들의 유도 여부 및 병에 대한 저항성의 증가 여부에 대하여 알아보기 위하여, 실시예 5에서 제작한 pBIN35S:CaADC1를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법 (electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 통하여 애기장대 식물에 도입함으로써 CaADC1 유전자의 과다발현을 유도시킨 형질전환 애기장대를 제작하고 아래와 같은 시험을 수행하였다.
본 발명에 의한 CaADC1 유전자가 과다 발현된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 증가하였는지의 여부를 알아보기 위하여, 상기 CaADC1 유전자가 과다 발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에서 CaADC1 유전자의 발현을 관찰하였으며 그 결과를 도 12에 나타내었다. #13, #15, #17 는 사용된 형질 전환 식물의 계통번호를 나타내고, 실험결과 CaADC1 유전자가 과다 발현됨을 관찰할 수 있었다.
상기와 같이 CaADC1이 과다 발현된 식물에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 균주를 접종하고 감염조직에서 세균생장을 관찰한 결과 CaADC1 유전자가 과다발현된 식물에서 세균 생장이 야생형 식물 감염조직에서의 세균생장보다 적은 것을 알 수 있었다 (도 13).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자(CaADC1 ).
  2. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자(CaADC1 ).
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaADC1).
  4. 제2항 기재의 유전자(CaADC1)를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 애기장대, 고추 또는 담배 식물체.
  6. 삭제
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JP2004180588A (ja) 2002-12-03 2004-07-02 Toyobo Research Center Co Ltd 環境ストレス抵抗性を改良した植物及びその作出方法
JP2007000021A (ja) 2005-06-21 2007-01-11 Toyobo Co Ltd ポリアミン代謝制御による環境ストレス耐性を改良した植物、及びその作出方法

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