KR101191612B1 - 고추 병저항성 관련 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질 유전자 ＣａＸＥＧＩＰ１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체 - Google Patents
고추 병저항성 관련 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질 유전자 ＣａＸＥＧＩＰ１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 병 저항성 관련 고추 자일로글루칸 분해효소 억제 유전자 (CaXEGIP1: Capsicum annuum xyloglucanase inhibitor protein 1, 서열번호 1) 및 이를 이용한 병저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 식물체의 병 및 화학물질 저항성 탐색방법도 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체 병원균의 저항성반응의 표지 및 병저항성 식물체의 분자적 육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있고, 식물 체내에 자일로글루칸의 함량을 조절하고 식물의 생장을 촉진시킬 수 있는 이점이 있다.
Description
본 발명은 식물병 저항성에 관련된 신규 유전자인 고추 자일로글루칸 분해효소 억제 유전자 (CaXEGIP1: Capsicum annuum xyloglucanase inhibitor protein 1), 및 이를 이용한 생물적(biotic) 및 비생물적(abiotic) 스트레스 저항성 탐색방법과 병저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 균주와 비병원성 균주에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되는 식물병 저항성 관련 신규 유전자인 CaXEGIP1 유전자의 염기서열 및 그에 따른 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용하여 생물적(biotic) 또는 비생물적 (abiotic) 처리 시 저항성 관련 유전자 CaXEGIP1의 차별적인 발현여부를 확인하는 식물체의 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS, virus-induced gene silencing) 기술을 이용하여 상기 CaXEGIP1 유전자의 발현을 억제시키거나, 상기 CaXEGIP1 유전자를 고추 식물에 아그로박테리움 매개 일시적 발현(Agrobacterium-mediated transient expression) 방법을 이용하여 도입하거나 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 형질전환 시킴으로서 CaXEGIP1 유전자의 발현 증가를 유도시켜서, 이 유전자의 식물체 병저항성 증대 역할을 확인하여, 이를 통한 식물병 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것에 관한 것이다.
담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리 식생활에 가장 많이 사용되는 채소류의 하나로, 전체농가의 65%가 고추생산을 통한 농가소득에 의존하고 있어 주요한 경제작물이다. 고추 식물에서는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 다양하게 보고되고 있으며, 이러한 병을 방제하기 위해 지금까지는 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔다. 하지만, 농약의 과다한 사용은 그 독성으로 인해 생태계를 파괴하고 인류의 생존을 위협하기까지 이르렀다. 특히, 우리나라에서는 1996년 OECD 가입 후, 농약 사용의 규제에 대한 관심이 지속적으로 증가되고 있는 상황이다. 따라서 앞으로는, 병저항성 품종의 개량 및 육종 방법을 찾는 것이 지속 가능한 농업 (sustainable agriculture)을 위해 필요한 실정이다.
고추 식물이 병원균에 감염되면, 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 활성화하는데, 이러한 방어기작에서 가장 빠르고 강력한 반응의 하나로 과민성 세포사멸 (Hypersensitive cell death)이 보고되었다. 그러나 과민성 세포사멸에 어떤 유전적 인자들이 관여하고 있는지에 대해서는 아직까지 알려지지 않은 부분이 많이 남아있다. 특히, 병저항성 과정에서 나타나는 세포벽의 강화 (cell wall strengthening)를 포함한 세포벽 기반 방어 반응 (cell wall-based defense response)에 대한 연구가 부족한 상황이다.
식물의 세포벽은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 등의 화합물로 구성되며 헤미셀룰로오스로는 자일란, 자일로글루칸, 글루코만난 등이 있다. 세포벽은 병원균과 식물의 상호작용이 가장 처음으로 일어나는 장소로써 많은 방어관련 단백질들이 세포벽으로 이동하는 것이 보고되었다. 특히 XEGIP1 단백질은 토마토 식물에서 병원균이 분비하는 자일로글루카네이즈의 활성을 억제하여 병저항성을 증진시키는데 역할을 하는 것으로 보고되었다. 그러나 고추 식물에서는 아직까지 이에 대한 보고가 없으며, 따라서 세포벽에 위치하는 CaXEGIP1의 기능을 밝혀내는 것이 다양한 스트레스에 반응하는 식물체의 방어기작을 이해하는데 도움을 줄 뿐 아니라, 저항성품종 육종에 기여할 수 있게 된다할 것이다.
본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 관련 유전자의 하나인 자일로글루카네이즈 억제 단백질을 암호화하는 CaXEGIP1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 CaXEGIP1 유전자를 이용하여 식물병 또는 화학물질에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 식물체의 병저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.
더 나아가, 본 발명은 상기 CaXEGIP1 유전자를 식물체에 도입하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 상기 목적은, 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광 고추 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)으로부터 분리한 신규 저항성 관련 유전자 CaXEGIP1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, 이를 이용하여 병원균 처리 등을 통하여 CaXEGIP1의 발현 여부를 조사하고, 고추식물과 이 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 CaXEGIP1 유전자의 식물병 저항성 유도 기능을 확인하여 달성하였다.
따라서 본 발명은 식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질을 암호화하는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 (b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자(CaXEGIP1)를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질 (CaXEGIP1)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터 및 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, pBIN35S:CaXEGIP1, pTA7002:CaXEGIP1 또는 pTRV2:CaXEGIP1 인 것을 특징으로 한다.
나아가 본 발명은 식물체로부터 mRNA 분리하여 CaXEGIP1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다.
본 발명은 고추 유래 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질을 암호화하는 유전자 CaXEGIP1의 발현을 억제하여 식물체의 생장을 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 유전자 발현을 억제하는 방법은 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있는데, 예를 들어 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 CaXEGIP1을 TRV 벡터에 재조합하여 구축된 VIGS (virus induced gene silencing)용 벡터 pTRV2-CaXEGIP1를 식물체로 도입하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 고추 유래 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질을 암호화하는 유전자 CaXEGIP1의 발현을 조절하여 식물체 내의 자이로글루칸 함량을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 자일로글루칸은 식물에서 생성되는 주된 헤미셀룰로오스의 하나로 자일로글루칸 분해효소인 자일로글루카네이즈 활성을 억제하는 CaXEGIP1 단백질은 그 특성상 식물 생체 내에서 헤미셀룰로오스인 자일로글루칸의 함량을 조절하는데 활용되어 목재 또는 섬유의 질을 변경할 수 있으며, 이를 통해 바이오에너지 산업, 식품산업, 섬유산업 등에서 이용이 가능하다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 219~231 번째의 아미노산 서열(NIYNPKKIDISKD, 서열번호 3)을 항원(epitope)으로 이용하여 제작된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaXEGIP1)을 특이적으로 검출할 수 있는 항체(α-CaXEGIP1)를 제공한다.
상기 항체를 이용하면 본 발명에 의한 CaXEGIP1 단백질의 발현량을 정량 분석할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 Bv5-4a 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용한 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization) 과정을 수행하여 병저항성과 관련이 있을 것으로 예상되는 클론을 선발하였다. 이 클론들 중 이들 중 자일로글루카네이즈 억제 단백질 (Xyloglucanse inhibitor protein: XEGIP)을 암호화하는 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독함으로써, 고추 녹광 품종의 CaXEGIP1으로 명명된 유전자 염기서열(서열번호 1) 및 그로부터 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).
보다 구체적으로 본 발명에 의한 상기 수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 비교 분석함으로써 CaXEGIP1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 CaXEGIP1 유전자로 명명하였다. CaXEGIP1 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 N 말단 부위에 세포벽으로 단백질을 이동시키는 신호펩티드 (signal peptide) 부위를 가지는 것을 알 수 있었으며, 포도 (grape vine), 페추니아 (petunia), 당근 (carrot), 토마토 (tomato), 감자 (potato) 그리고 애기장대 (Arabidopsis)의 putative XEGIP 유전자(accession no. AK246240)와는 아미노산 수준에서 약 40 %의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 알 수 있었다. 확인된 CaXEGIP1의 유전자 염기서열과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.
본 발명에 의한 CaXEGIP1 단백질의 각 기관에서의 발현 결과를 확인하고(도 2 참조), CaXEGIP1 단백질이 식물 세포벽을 포함한 세포바깥쪽(extracellular region)에 위치하는 것으로 나타났다(도 7 참조).
다음에, 본 발명은 생물적 또는 비생물적 처리를 한 식물체로부터 RNA 분리하여 CaXEGIP1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병저항성을 탐색하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 상기 생물적 처리는 고추 세균성 점무늬병의 병원성 또는 비병원성 세균 등 병원균을 예로 들 수 있다. 상기 비생물적 처리는 화학적 유도체로서 살리실산을 예로 들 수 있다. 상기 CaXEGIP1 유전자 발현 여부 확인은 노던 블럿, 실시간 RT-PCR, 마이크로어레이법 외에도 mRNA의 발현을 측정할 수 있는 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 CaXEGIP1 유전자가 식물병원균 또는 살리실산에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaXEGIP1 유전자는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 219~231 번째의 아미노산 서열(NIYNPKKIDISKD, 서열번호 3)을 항원(epitope)으로 이용하여 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaXEGIP1)을 특이적으로 검출할 수 있는 항체(α-CaXEGIP1)를 제작하여 고추 식물에서 CaXFGIP1 단백질 발현을 탐색할 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).
본 발명에 의한 CaXEGIP1 유전자를 대장균 (Escherichia coli)에서 과발현하고 단백질을 순화하여 CaXEGIP1 단백질이 자이로글루칸 분해 효소 (xyloglucanase)의 활성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다(도 8 및 도 9 참조).
또한, 본 발명은 상기의 CaXEGIP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 고추식물에서 특이적으로 CaXEGIP1 유전자가 억제된 식물체의 제작하고, CaXEGIP1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물을 제작하여 식물병 저항성 생성여부를 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 CaXEGIP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체에 병 저항성을 부여하는 방법도 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명은 바이러스 유도 유전자침묵(불능화)기술(virus-induced gene silencing (VIGS))에 이용되어지는 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaXEGIP1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌: Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2:109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaXEGIP1을 제작하였다. 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CaXEGIP1의 발현이 억제된 VIGS 식물체를 제조하여 식물이 생장이 빨라지고 병감수성이 증대되는 것을 확인할 수 있었다 (도 14 내지 16 참조).
나아가 본 발병에 의한 CaXEGIP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pBIN35S::CaXEGIP1)를 고추 식물에 아그로박테리움 매개 일시적 발현(Agrobacterium-mediated transient expression) 시키거나 본 발명에 의한 CaXEGIP1이 과발현된 형질전환 애기장대 식물을 제조하여 식물병 저항성의 증대를 확인할 수 있었다 (도 10 내지 도 13, 도 17 내지 도 22 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaXEGIP1의 기능을 불능화 시킨 고추 식물 및 CaXEGIP1을 과발현 시킨 애기장대 식물에 대한 식물병원균에 대한 저항성 검정평가를 수행하여 병저항성 발생여부를 알아 볼 수 있게 되었다.
상술한 바와 같이 본 발명에서 CaXEGIP1가 고추 식물의 병저항성 발현에 필수적이라는 것을 확인하고 CaXEGIP1의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질 (PR protein)의 유전자 정보를 축적할 수 있게 되어 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하는 데에 실용적으로 이용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 식물 세균병인 고추 세균성 점무늬병에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 관련 유전자인 신규한 고추 자일로글루칸 분해효소 억제 유전자 CaXEGIP1를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 식물체의 병저항성 탐색방법 및 식물생장 촉진 방법을 제공할 뿐 아니라 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체 제작에 기여하는 효과를 도모할 수 있게 되었다.
또한, 자일로글루칸은 식물에서 생성되는 주된 헤미셀룰로오스의 하나로 자일로글루칸 분해효소인 자일로글루카네이즈 활성을 억제하는 CaXEGIP1 단백질은 그 특성상 식물 생체 내에서 헤미셀룰로오스인 자일로글루칸의 함량을 조절하는데 직?간접적으로 활용될 수 있으며, 이를 통해 바이오에너지 산업, 식품산업, 섬유산업 등에서 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 식물체의 병저항성, 생장촉진 또는 자일로글루칸 함량 조절과 관련된 육종 재료를 제공할 수 있어 식물육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종 (Capsicum annnuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 CaXEGIP1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,
도 2는 고추 녹광 품종의 각 기관에서 CaXEGIP1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,
도 3은 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaXEGIP1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 4는 살리실산(Salicylic acid)을 처리한 후 시간별로 CaXEGIP1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 5는 토끼에서 제작된 CaXEGIP1 단백질의 항체를 ELISA test를 이용하여 항원-항체반응을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 6은 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 CaXEGIP1 단백질의 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 7은 그린 플루오레슨트 프로테인(Green Fluoresent Protein, GFP)이 태깅(tagging)된 CaXEGIP1 단백질을 양파 (Allium cepa)의 표피세포에서 과발현시킨 후 공초점현미경 [confocal laser scanning microscope (CLSM)]을 이용하여 CaXEGIP1 단백질이 식물 세포벽(cell wall)을 포함한 세포바깥쪽 (extracellular region)에 위치하고 있음 결과를 나타낸 도면이고,
도 8은 대장균 (Escherichia coli)에서 CaXEGIP1 유전자를 과발현하고 단백질을 순화하여 SDS-PAGE상에서 확인한 결과를 나타낸 도면이고 (Lane 1: CaXEGIP1을 발현하지 않는 E. coli의 단백질, Lane 2: CaXEGIP1을 과발현하는 E. coli의 단백질, Lane 3: 최종적으로 순화된 CaXEGIP1 단백질),
도 9는 순화된 CaXEGIP1 단백질을 이용하여 자이로글루칸 분해 효소 (xyloglucanase)를 억제하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이고,
도 10은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 고추 식물에서 CaXEGIP1 유전자를 일시적으로 과발현시킨 후 RT-PCR을 이용하여 유전자의 발현을 확인한 결과이고,
도 11은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 고추 식물에서 CaXEGIP1 유전자를 일시적으로 과발현시킨 후 CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 CaXEGIP1 단백질의 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 12는 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 고추 식물에서 CaXEGIP1 단백질을 과발현시킨 부위에서 과민성 세포사멸이 나타나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 13은 고추 식물에서 CaXEGIP1 단백질을 과발현시킨 부위에서 과민성 세포사멸을 일으키는 신호전달 물질인 활성산소가 축적되는 것을 DAB 염색(3,3'-diaminobenzidine staining)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 14는 VIGS를 통해 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추식물 (TRV:CaXEGIP1)이 대조구(TRV:00)에 비해 생장이 증가되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 15는 VIGS를 통해 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추식물 (TRV:CaXEGIP1)이 대조구(TRV:00)에 비해 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 접종 후 CaXEGIP1 유전자와 방어관련 CaBPR1 (Capsicum annuum basic pathogenesis-related 1) 및 CaDEF1 (Capsicum annuum defensin 1) 유전자의 발현이 억제되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 16은 VIGS를 통해 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추식물 (TRV:CaXEGIP1)이 대조구(TRV:00)에 비해 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 생장이 증가되어 감수성이 증진되는 결과를 나타낸 도면이고,
도 17은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합 벡터 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype Col-0) 식물을 제작한 뒤 데사메타손(dexamethasone, DEX) 처리에 의해 특이적으로 CaXEGIP1 유전자의 발현이 증가되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 18은 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 DEX 처리에 의해 CaXEGIP1 단백질의 유도되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 19는 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 세포사멸이 특이적으로 발생하는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 20은 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 뿌리의 생장이 변화되어 뿌리가 굽어지며 자라는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 21은 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 뿌리와 배축(hypocotyl)의 세포생장에 억제가 일어나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 22는 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 CaXEGIP1 단백질이 과량으로 축적될 경우 병원성 (Pst) 및 비병원성 [Pst (avrRpm1)] 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 [Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)]을 접종한 식물에서 세포사멸이 DEX를 처리하지 않은 대조구 식물에 비해 강하게 일어나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 23은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합 벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 담배 식물 (Nicotiana benthamiana)에서 CaXEGIP1 단백질을 과발현시킨 부위에서 과민성 세포사멸이 나타나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 고추 녹광 품종의 각 기관에서 CaXEGIP1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,
도 3은 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaXEGIP1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 4는 살리실산(Salicylic acid)을 처리한 후 시간별로 CaXEGIP1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 5는 토끼에서 제작된 CaXEGIP1 단백질의 항체를 ELISA test를 이용하여 항원-항체반응을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 6은 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 CaXEGIP1 단백질의 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 7은 그린 플루오레슨트 프로테인(Green Fluoresent Protein, GFP)이 태깅(tagging)된 CaXEGIP1 단백질을 양파 (Allium cepa)의 표피세포에서 과발현시킨 후 공초점현미경 [confocal laser scanning microscope (CLSM)]을 이용하여 CaXEGIP1 단백질이 식물 세포벽(cell wall)을 포함한 세포바깥쪽 (extracellular region)에 위치하고 있음 결과를 나타낸 도면이고,
도 8은 대장균 (Escherichia coli)에서 CaXEGIP1 유전자를 과발현하고 단백질을 순화하여 SDS-PAGE상에서 확인한 결과를 나타낸 도면이고 (Lane 1: CaXEGIP1을 발현하지 않는 E. coli의 단백질, Lane 2: CaXEGIP1을 과발현하는 E. coli의 단백질, Lane 3: 최종적으로 순화된 CaXEGIP1 단백질),
도 9는 순화된 CaXEGIP1 단백질을 이용하여 자이로글루칸 분해 효소 (xyloglucanase)를 억제하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이고,
도 10은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 고추 식물에서 CaXEGIP1 유전자를 일시적으로 과발현시킨 후 RT-PCR을 이용하여 유전자의 발현을 확인한 결과이고,
도 11은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 고추 식물에서 CaXEGIP1 유전자를 일시적으로 과발현시킨 후 CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 CaXEGIP1 단백질의 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 12는 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 고추 식물에서 CaXEGIP1 단백질을 과발현시킨 부위에서 과민성 세포사멸이 나타나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 13은 고추 식물에서 CaXEGIP1 단백질을 과발현시킨 부위에서 과민성 세포사멸을 일으키는 신호전달 물질인 활성산소가 축적되는 것을 DAB 염색(3,3'-diaminobenzidine staining)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 14는 VIGS를 통해 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추식물 (TRV:CaXEGIP1)이 대조구(TRV:00)에 비해 생장이 증가되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 15는 VIGS를 통해 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추식물 (TRV:CaXEGIP1)이 대조구(TRV:00)에 비해 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 접종 후 CaXEGIP1 유전자와 방어관련 CaBPR1 (Capsicum annuum basic pathogenesis-related 1) 및 CaDEF1 (Capsicum annuum defensin 1) 유전자의 발현이 억제되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 16은 VIGS를 통해 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추식물 (TRV:CaXEGIP1)이 대조구(TRV:00)에 비해 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 생장이 증가되어 감수성이 증진되는 결과를 나타낸 도면이고,
도 17은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합 벡터 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype Col-0) 식물을 제작한 뒤 데사메타손(dexamethasone, DEX) 처리에 의해 특이적으로 CaXEGIP1 유전자의 발현이 증가되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 18은 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 DEX 처리에 의해 CaXEGIP1 단백질의 유도되는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 19는 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 세포사멸이 특이적으로 발생하는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 20은 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 뿌리의 생장이 변화되어 뿌리가 굽어지며 자라는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 21은 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 뿌리와 배축(hypocotyl)의 세포생장에 억제가 일어나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 22는 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 식물 (DEX:CaXEGIP1)에서 DEX 처리에 의해 CaXEGIP1 단백질이 과량으로 축적될 경우 병원성 (Pst) 및 비병원성 [Pst (avrRpm1)] 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 [Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)]을 접종한 식물에서 세포사멸이 DEX를 처리하지 않은 대조구 식물에 비해 강하게 일어나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 23은 CaXEGIP1 유전자를 이용한 재조합 벡터 pBIN35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 담배 식물 (Nicotiana benthamiana)에서 CaXEGIP1 단백질을 과발현시킨 부위에서 과민성 세포사멸이 나타나는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
CaXEGIP1
유전자의 염기/아미노산 서열 결정
고추 세균성 점무늬병에 대한 병저항성 관련 단백질 중 하나인 자일로글루카네이즈 억제 단백질 CaXEGIP1 (Capsicum annuum xyloglucanase inhibitor protein 1) 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성(avirulent) 균주를 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성 세포사멸반응을 보이는 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.
다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 그리고 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 얻은 개개의 cDNA 클론들을 나이론막(Hybond N+)에 동일하게 흡착시킨 후, 각각 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.
하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주가 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.
수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 비교 분석함으로써 CaXEGIP1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 CaXEGIP1 유전자로 명명하였다. CaXEGIP1 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 N 말단 부위에 세포벽으로 단백질을 이동시키는 신호펩티드 (signal peptide) 부위를 가지는 것을 알 수 있었으며, 포도 (grape vine), 페추니아 (petunia), 당근 (carrot), 토마토 (tomato), 감자 (potato) 그리고 애기장대 (Arabidopsis)의 putative XEGIP 유전자(accession no. AK246240)와는 아미노산 수준에서 약 40 %의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 알 수 있었다. 확인된 CaXEGIP1의 유전자 염기서열(서열번호 1)과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 도 1에 나타내었다.
[실시예 2] 병원균 접종에 의한 고추식물에서의
CaXEGIP1
유전자의 발현 탐색방법
상기 실시예 1에서 수득한 CaXEGIP1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.
[단계 1]
먼저 저항성 탐색 방법을 구체적으로 제시하기 위하여, 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 YN(Yeast- Nutrient) 배지에서 배양한 후, 108 cfu/㎖의 농도로 4엽기의 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)의 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 침투시켜 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실 처리 하였다. 접종 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 추출하였다. 이렇게 추출한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.
다음으로 실시예 1에서 수득된 CaXEGIP1 유전자를 14-dCTP-biotin을 이용하여 표지한 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭 시킨 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 biotin이 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막(Hybond N+)에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 (Hybond N+) 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 biotin이 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.
상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA (rRNA)의 양을 모니터링 함으로써 동일 량의 RNA 시료가 로딩(loading) 되었음을 확인하였다. 이상의 실험결과를 도 3에 나타내었으며 실험의 결과 CaXEGIP1 유전자는 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬병 접종 후 빠른 시간에 모두 발현이 나타났으나 비병원성 균주를 접종하여 저항성 반응을 보이는 고추 식물에서 그 발현이 강하고 오랫동안 지속되었다. 즉, 친화적 반응에서는 CaXEGIP1 유전자의 발현이 1시간부터 25시간까지 매우 서서히 발현이 증가되었으나, 불친화적 반응에서는 접종 후 5시간에 발현량이 크게 증가되고, 15시간에 최고조에 이르렀으며 25시간까지 강한 발현이 유지되었다.
[실시예 3] 화학적 유도체에 의한
CaXEGIP1
유전자의 유도 발현
본 발명의 CaXEGIP1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.
[단계 1]
먼저, CaXEGIP1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 살리실산(salicylic acid), 메칠 자스몬산 (methyljasmoic acid), 엡시스산 (abscisic acid), 과산화수소수 (H2O2)를 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다. 모든 실험에 6엽기의 고추 잎이 이용되었다.
살리실산은 5 mM, 메칠자스몬산은 100 μM, 엡시스산은 100 μM, 과산화수소수는 10 mM의 농도로 고추 잎에 스프레이 하는 방법으로 처리하였으며 메칠자스몬산을 처리한 후에는 밀봉 처리하였다. 각각의 식물들은 1, 5, 10, 15, 20, 25시간 후에 잎을 수거하였고 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 이용하여 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다.
다음으로 실시예 1에서 수득된 CaXEGIP1 유전자를 14-dCTP-biotin을 이용하여 표지한 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 증폭 시킨 후 이를 반응액 [0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 biotin이 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막(Hybond N+)에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막(Hybond N+) 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 biotin이 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다. 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일 량의 RNA 시료가 로딩 되었음을 확인하였다.
실험의 결과 CaXEGIP1 유전자는 도 4 에서 보이는 것과 같이 살리실산 처리 후 25시간에 발현이 강하게 유도되었다. 그러나, 메칠자스몬산, 엡시스산, 과산화수소수를 처리한 후에는 발현이 관찰되지 않았다. 이는 CaXEGIP1 유전자의 발현이 살리실산에 특이적인 신호전달 경로를 통해서만 활성화 될 수 있다는 것을 시사한다.
[실시예 4] 병원균 접종 후 고추식물에서의 CaXEGIP1
단백질의 발현 탐색 방법
병원균 접종 후 발현이 증가되는 CaXEGIP1 유전자에 의해 암호화되는 CaXEGIP1 단백질의 발현량을 실험하기 위해 CaXEGIP1에 특이적으로 작동하는 항체를 제작하고 이를 이용하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.
[단계 1]
CaXEGIP1 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 항체(α-CaXEGIP1)를 제작하기 위해 219~231 번째의 아미노산서열(NIYNPKKIDISKD)을 항원(epitope)으로 이용하였다. 상기의 항원을 2주 간격으로 4회 토끼에 주사한 뒤 8주째 추출된 항체를 이용하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하고 항원-항체반응이 확인된 항체(α-CaXEGIP1)를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하였다. ELISA test 결과를 도 5에 나타내었다.
[단계 2]
고추 식물에서 병원균 접종 후 CaXEGIP1 단백질 발현을 확인하기 위해 실시예 2의 단계 1에서와 같이 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 108 cfu/㎖의 농도로 4엽기의 고추 녹광 품종 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이션(Infiltration)하여 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실 처리 하였다. 접종 5, 10, 20 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링 하여 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)상에서 전기영동한 후 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인(membrane)으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 PVDF 멤브레인(membrane)과 단계 1에서 준비된 CaXEGIP1의 항체(α-CaXEGIP1)를 이용하여 하이브리다이제이션(hybridization)을 실시하였으며, 이렇게 항체가 표지된 PVDF 멤브레인(membrane) 상의 CaXEGIP1 단백질은 알카라인 포스파다제-콘쥬게이티드 안티-래빗 이뮤노글로불린 G[Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit Immunoglobulin G (IgG)]를 이용하여 검출하였다. 웨스턴 블로팅 수행 시 각각의 레인(lane)에 로딩된 단백질의 양을 CBB 염색(Coomassie Brilliant Blue staining)을 통해 모니터링 함으로써 동일 량의 단백질 시료가 로딩 되었음을 확인하였다. 대조구로서 어떤 스트레스도 처리하지 않은 건전 잎과 병원균 없이 10 mM의 MgCl2 용액을 엽육주사(infiltration) 접종한 Mock 접종을 사용하였다. CaXEGIP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다.
[실시예 5] CaXEGIP1
단백질 세포내 위치 탐색 방법
식물 단백질의 세포내 위치는 그 기능과 매우 밀접한 연관이 있다. CaXEGIP1 단백질이 식물 세포에서 세포벽 부위에 위치하는지를 확인하기 위해 그린 플루오레슨트 프로테인(Green Fluoresent Protein, GFP)이 태깅(tagging)된 CaXEGIP1 단백질을 양파 (Allium cepa)의 표피세포에서 과발현 시킨 후 공초점현미경 [confocal laser scanning microscope (CLSM)]을 이용하여 CaXEGIP1 단백질의 세포내 위치를 관찰하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 관찰 결과 CaXEGIP1 단백질은 식물 세포벽을 포함한 세포바깥쪽 (extracellular region)에 위치하고 있음이 관찰되었다.
[실시예 6] CaXEGIP1 단백질을 이용한 자일로글루카네이즈 활성 억제 관찰
아미노산 서열에서 토마토 식물의 자일로글루카네이즈 억제 단백질(xyloglucase inhibitor)과 상동성을 보인 CaXEGIP1 단백질의 활성을 조사하기 위해 하기의 실험을 실시하였다.
[단계 1]
대장균 (Escherichia coli)에서 CaXEGIP1 유전자를 과발현하고 CaXEGIP1 단백질을 순화하기 위해 Invitrogen사에서 제공하는 pET22 벡터에 실시예 1에서 수득된 CaXEGIP1의 cDNA를 클로닝하고 대장균 (E. coli)에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 Luria-Bertani (LB: tryptone 10 g, yeat extract 5g, sodium chloride 10g/L) 배지에서 진탕배양 한 뒤 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 처리하여 CaXEGIP1 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 발현이 유도된 대장균을 수거하여 초음파 분해(sonication)을 통해 세균을 용해(lysis)시킨 후 단백질을 수거하여 순화에 이용하였다. Invitrogen사에서 제공하는 pET22 벡터가 CaXEGIP1 단백질에 히스티딘(histidine) 아미노산을 부가하여 주는 특성을 가지는 것을 이용하여, 히스티딘(histidine)에 특이적으로 결합할 수 있는 Ni-NTA 컬럼(column)을 이용하여 단백질을 순화하였고 순화된 단백질을 SDS-PAGE상에서 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.
[단계 2]
단계 1에서 순화된 CaXEGIP1 단백질과 NZYTech사에서 제공하는 클로스트리디움 데르모켈룸(Clostridium thermocellum) 유래 자이로글루카네이즈(xyloglucanase) 그리고 Megazyme사에서 제공하는 아조-글루칸(Azo-xyloglucan) 기질을 이용하여 억제 분석 (inhibitor assay) 테스트를 수행하였다. 클로스트리디움 데르모켈룸(Clostridium thermocellum) 유래 자이로글루카네이즈(xyloglucanase)가 아조-글루칸(Azo-xyloglucan)을 분해함으로써 증가되는 Azo-dye의 증가량을 분광광도계 (spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 이때 순화된 CaXEGIP1 단백질을 첨가하여 자이로글루카네이즈(xyloglucanase)의 활성이 억제되는 것을 측정한 결과를 도 9에 나타내었다. 실험결과 CaXEGIP1 단백질이 C. thermocellum 유래 자이로글루카네이즈(xyloglucanase)의 활성을 억제하는 것이 확인되었고 이는 CaXEGIP1 단백질이 실제로 자이로글루카네이즈 억제 단백질(xyloglucanase inhibitor, XEGIP)로 기능할 수 있음을 시사한다.
[실시예 7]
CaXEGIP1
유전자 과발현에 의한 고추 식물의 병저항성 반응 관찰
고추식물에서 CaXEGIP1 유전자가 과발현되었을 때 병저항성 관련 과민성 세포사멸 (hypersensitive cell death)을 유도할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 실시예 1에서 수득한 CaXEGIP1 유전자를 식물체 형질전환 벡터인 pBIN35S 벡터에 도입시켜 pBIN35S:CaXEGIP1 (35S:CaXEGIP1)을 제조한 후 이렇게 재조된 재조합 벡터인 pBIN35S:CaXEGIP1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 이를 고추 잎에 접종하여 CaXEGIP1을 과다 발현하는 고추식물의 병저항성 변화 여부를 관찰하였다.
[단계 1]
CaXEGIP1을 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaXEGIP1)와 CaXEGIP1을 과발현하지 않는 대조구 벡터 (35S:00)를 이용하여 형질전환 시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)를 Yeast-Peptone (YEP: yeat extract 10g, peptone 10g, sodium chloride 5g/L) 배지에서 진탕배양 한 뒤 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 균주현탁액농도를 흡광도 600(optical density 600, OD600) 에서 0.5로 맞추고 이를 고추 잎에 각각 접종한 뒤, 24시간과 48시간 후에 잎을 수거하였고 각각의 샘플에서 RNA와 단백질을 추출하였다. 추출된 RNA는 CaXEGIP1 유전자의 발현을 관찰하기 위해 RT-PCR에 이용되었고, 단백질은 웨스턴 블롯팅에 이용되었다. 그 결과 35S:CaXEGIP1로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)를 접종한 잎에서는 24시간부터 RNA와 단백질이 축적되었으며 대조구 (empty vector, 35S:00)로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)를 접종한 잎에서는 그 발현이 관찰되지 않았다. 그 결과를 도 10과 도 11에 각각 나타내었다.
[단계 2]
상기의 단계 1에서와 같이 CaXEGIP1을 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaXEGIP1)와 CaXEGIP1을 과발현하지 않는 대조구 벡터 (35S:00)를 이용하여 형질전환 시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)를 Yeast-Peptone (YEP: yeat extract 10g, peptone 10g, sodium chloride 5g/L) 배지에서 진탕배양 한 뒤 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 균주현탁액농도를 흡광도 600(optical density 600, OD600) 에서 1.0, 0.5, 0.2 로 맞추고 이를 고추 잎의 엽맥을 경계로 하여 각각 접종하고 그 결과를 도 12에 나타내었다. 접종 2일째, CaXEGIP1을 과발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종한 부위에서 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었으며 이때 주변부위에 페놀화합물(phenolic compound)의 집적이 일어나는 것을 자외선 램프(ultra violet lamp) 하에서 관찰할 수 있었다. 접종 후 2일째 병저항성의 신호전달 물질로 알려진 활성산소의 발생량을 알아보기 위해 DAB 염색(3,3'-diaminobenzidine staining)을 수행하였고 그 결과를 도 13에 나타내었다. 그 결과, CaXEGIP1을 과발현 하는 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주를 접종한 부위에서 활성산소의 축적이 강하게 일어나는 것을 관찰할 수 있었다.
[실시예 8]
CaXEGIP1
유전자 발현의 억제에 의한 병저항성의 변화
고추식물에서 분리된 CaXEGIP1 유전자의 과민성 세포사멸 형성 능력이 병저항성 발현과 연관되어있는지를 조사하기 위해, TRV 기반 바이러스 유도 유전자 침묵(tobacco rattle virus-based virus-induced gene silencing, VIGS)을 통한 CaXEGIP1 녹다운(knock-down) 고추 식물체를 제작하고 이를 이용하여 세균 생장률을 조사하였다 (참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113).
[단계 1]
고추식물에서 CaXEGIP1 유전자의 발현이 특이적으로 억제(silencing)되었을 때 병 발생과 관련 다른 유전자들의 유도 여부 및 병에 대한 저항성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaXEGIP1 유전자를 새롭게 개발된 바이러스 유도 유전자 침묵 (VIGS, virus-induced gene silencing)에서 이용되어지는 TRV (Tobacco Rattle Virus) 벡터 (pTRV2)를 이용하였다. 먼저 CaXEGIP1 유전자를 pTRV2 벡터에 도입시켜 재조합 벡터인 pTRV2:CaXEGIP1 을 제조하였다. 이렇게 제조한 재조합벡터 pTRV2:CaXEGIP1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)에 전기천공법 (electrophoration)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 고추 유묘 (seedling)의 떡잎에 주사기를 이용, 엽육주사(infiltration) 방법으로 접종하여 고추식물에 도입함으로써 CaXEGIP1 유전자의 발현의 억제를 유도시켰다. RT-PCR을 이용하여 성공적으로 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 것을 확인한 결과를 도 15에 나타내었다.
[단계 2]
CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 식물에서 식물의 생장의 변화를 관찰하여 CaXEGIP1 유전자가 식물의 생육에 영향을 미치는지를 조사하였다. 그 결과 도 14에서 보이는 바와 같이 CaXEGIP1의 발현이 억제된 고추 식물은 TRV2:00 벡터를 접종한 대조구 식물에 비해 생장이 빨라지는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 CaXEGIP1의 발현이 식물의 생장을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.
[단계 3]
CaXEGIP1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성의 변화를 알아보기 위하여, 상기의 CaXEGIP1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물 (TRV2:CaXEGIP1)과 대조구로서 TRV2:00 벡터를 접종한 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 5 x 104 cfu ml-1 로 접종하여 접종 후 0, 3일에 감염 식물조직에서의 세균 생장을 측정하였다 (도 16). 그리고 병원균을 107 cfu ml-1 로 접종하여 접종 이후 24시간 후에 실험구와 대조구의 감염 잎을 잎에서 RNA를 추출하여 알티-피시알 (RT-PCR)을 통해 CaXEGIP1 의 특이적인 유전자 억제 효과와 함께 병 접종시 대조구 식물과 비교하여 병저항성 관련 유전자의 발현 차이를 관찰하였다 (도 15).
[실시예 9]
CaXEGIP1
유전자의 과다발현에 의한 애기장대 식물의 병 저항성 변화
모델식물로 사용되는 애기장대 식물체에서 CaXEGIP1 유전자의 과다발현시 다른 병 발생과 관련된 유전자들의 유도여부 및 병에 대한 저항성의 증가 여부에 대하여 알아보기 위하여 실시예 1에서 수득한 CaXEGIP1 유전자를 pTA7002 벡터(Schena et al., (1991) A steroid-inducible gene expression system for plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421-10425)에 도입시켜 pTA7002:CaXEGIP1을 제조한 후 이렇게 제조된 재조합 벡터인 pTA7002:CaXEGIP1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 통하여 애기장대 식물에 형질전환 시켜서 데사메타손(dexamethasone, DEX) 처리에 의해 CaXEGIP1 유전자가 과다발현되는 형질전환 식물체를 제작한 뒤 하기와 같은 시험을 수행하였다.
[단계 1]
DEX 처리에 의해 CaXEGIP1 유전자가 과다 발현되는지를 확인하기 위해 형질전환 애기장대 식물체(DEX:CaXEGIP1)에 DEX를 30 μM의 농도로 스프레이를 이용하여 처리한 뒤 0, 12, 24, 48 시간에 식물 잎을 수거하여 RNA와 단백질을 추출하였다. 추출된 RNA는 CaXEGIP1 유전자의 발현을 관찰하기 위해 RT-PCR에 이용되었고, 단백질은 웨스턴 블롯팅에 이용되었다. 그 결과 일과 pTA7002:CaXEGIP1로 형질전환된 애기장대 잎에서 DEX처리 후(+) 24시간부터 CaXEGIP1 유전자와 단백질이 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, DEX를 처리하지 않은 잎(-)에서는 단백질 발현이 관찰되지 않았다. 그 결과를 도 17과 18에 각각 나타내었다.
[단계 2]
고추 식물에서 CaXEGIP1 유전자를 과발현한 결과 식물 병저항성 발현의 특징인 세포사멸이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다 (도 12). 애기장대 식물에서도 CaXEGIP1 단백질 발현에 의해 세포사멸이 발생하는지를 관찰하기 위해 DEX를 처리한 식물체를 먼저 눈으로 관찰하였다. 그 결과 도 19에서 보이는 것처럼 DEX를 처리한 형질전환 식물체의 잎 끝부분에 세포사멸이 나타나는 것을 눈으로 확인할 수 있었다. CaXEGIP1이 과다 발현된 식물의 세포사멸을 세포수준에서 관찰하기 위해 트리판 블루 염색 (trypan blue staining)을 수행하고 그 결과를 도 19에 나타내었다. 그 결과 DEX 처리에 의해 CaXEGIP1 유전자가 과발현된 식물에서 저항성 식물에서 관찰되는 세포사멸반응이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 DEX를 처리하지 않은 대조구(Mock)의 형질전환식물에서는 세포사멸반응이 일어나지 않는 것을 관찰할 수 있었다.
[단계 3]
DEX처리 후 과발현되는 CaXEGIP1 단백질의 식물생장에서 기능을 확인하기 위해 형질전환 식물체를 Murashige and Skoog (MS) 배지 상에서 발아하여 1주일간 키운 뒤 3 μM의 DEX를 포함하거나 포함하지 않는 MS배지로 이식하여 1주일간 더 키우며 식물의 생장을 관찰하였다. 그 결과 도 20에서 보이는 바와 같이 3 μM의 DEX를 포함하는 MS배지로 이식된 식물에서는 야생형(wild-type) 식물과는 다르게 뿌리가 꺾이면서 자라는 것으로 관찰되었다. 그러나 DEX를 포함하지 않는 MS배지에서는 식물의 생장이 야생형(wild-type)과 크게 다르지 않은 것으로 관찰되었다.
[단계 4]
DEX에 의해 유도되는 식물 생장의 변화의 원인을 관찰하기 위해 DEX가 처리되거나 처리되지 않은 야생형 그리고 DEX:CaXEGIP1 형질전환 식물체를 4 % agarose를 이용하여 고정하고 면도칼 (razor blade)를 이용하여 약 1 mm의 두께로 뿌리 (root) 와 배축 (hypocotyl)을 hand section하였다. 각각의 section은 식물의 세포벽을 특이적으로 염색하는 Calcofluor white (Sigma-aldrich사 제공)를 이용하여 염색(staining)한 뒤 UV 램프(UV lamp)를 장착한 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었다.
[단계 5]
DEX 처리에 의해 CaXEGIP1을 과발현하는 형질전환 식물체에서 병원균 접종에 의한 반응을 관찰하기 위해, 형질전환 식물체에 0μM 또는 30μM DEX를 처리하고 24시간 뒤 애기장대 식물에서 세균성 흑반병을 일으키는 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 [Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)]의 병원성 (Pst) 또는 비병원성 [Pst (avrRpm1)] 균주를 접종하고 식물체의 변화를 관찰하였다. 그 결과 도 22에서 보이는 바와 같이 30μM DEX를 처리하여 CaXEGIP1을 과발현하는 식물체에서 병 저항성 관련 과민성 세포사멸이 강하게 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 CaXEGIP1 단백질이 식물병 저항성 발현에서 과민성 세포사멸을 조절하는 조절자로 역할하고 있음을 시사한다.
[실시예 10]
CaXEGIP1
유전자의 과다발현에 의한 담배식물의 과민성세포사멸 반응
상기의 실시 예들에서 CaXEGIP1의 발현이 고추와 애기장대 식물의 세포사멸을 조장하는 것으로 나타났다. 따라서 CaXEGIP1이 식물 세포의 일반적인 세포사멸 조절자로써 역할을 할 수 있는지를 조사하기 위해 CaXEGIP1을 담배 (Nicotiana benthamiana) 식물에 과발현한 뒤 세포사멸을 눈으로 관찰하였다. 상기의 실시예 7의 단계 1에서와 같이 CaXEGIP1을 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaXEGIP1)와 CaXEGIP1을 과발현하지 않는 대조구 벡터 (35S:00)를 이용하여 형질전환 시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)를 Yeast-Peptone (YEP: yeat extract 10g, peptone 10g, sodium chloride 5g/L) 배지에서 진탕배양 한 뒤 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 균주현탁액농도를 흡광도 600(optical density 600, OD600) 에서 0.5 로 맞추고 이를 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에 엽육주사(infiltration)로 각각 접종하고 그 결과를 도 23에 나타내었다. 접종 7일째, CaXEGIP1을 과발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종한 부위에서 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었으며 이는 CaXEGIP1이 담배식물에서도 병저항성을 증진시키는 세포사멸 조절자로 역할 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (9)
- 식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질을 암호화하는 하기 (a) 또는 (b)의 분리된 유전자(CaXEGIP1):
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자;
(b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자. - 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaXEGIP1).
- 제1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pBIN35S:CaXEGIP1, pTA7002:CaXEGIP1, 또는 pTRV2:CaXEGIP1 인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
- 식물체로부터 mRNA 분리하여 제1항 기재의 CaXEGIP1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성 탐색방법.
- 고추 유래 자일로글루칸 분해효소 억제 단백질을 암호화하는 유전자 CaXEGIP1의 발현을 억제하여 식물체의 생장을 촉진하는 방법.
- 삭제
- 서열번호 2의 아미노산 서열 중 219~231 번째의 아미노산 서열(NIYNPKKIDISKD, 서열번호 3)을 항원(epitope)으로 이용하여 제작된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaXEGIP1)을 특이적으로 검출할 수 있는 항체(α-CaXEGIP1).
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