KR101202135B1

KR101202135B1 - 병저항성 관련 고추 파타틴 유사 포스포라이페이즈 유전자 ＣａＰＬＰ１ 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색 및 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR101202135B1
Application number: KR1020100059271A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 김대성
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2012-11-15
Also published as: KR20110139032A

Abstract

본 발명은 신규한 병 저항성 관련 고추 파타틴 유사 포스포라이페이즈 유전자 CaPLP1(Capsicum annuum Patatin-Like Phospholipase 1, 서열번호 1)과 CaPLP2(Capsicum annuum Patatin-Like Phospholipase 2, 서열번호 3) 및 이를 이용한 병저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 식물체의 병 및 화학물질 저항성 탐색방법도 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체 병원균의 방어 반응의 탐색 및 병저항성 식물체의 분자적 육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있는 이점이 있다.

Description

병저항성 관련 고추 파타틴 유사 포스포라이페이즈 유전자 ＣａＰＬＰ１ 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색 및 형질전환 식물체{Disease resistance-related pepper patatin-like phospholipase gene CaPLP1, screening of plant disease resistance and transgenic plants using the same}

본 발명은 고추 (Capsicum annuum L.) 식물로부터 분리된 식물병 저항성에 관련된 신규 유전자인 고추 파타틴 유사 포스포라이페이즈 유전자 (CaPLP1: C apsicum a nnuum P atatin- L ike P hospholipase 1), 및 이를 이용한 식물체의 저항성 탐색방법과 병저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되는 식물병 저항성 관련 신규 유전자인 CaPLP1 유전자의 염기서열 및 그에 따른 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용하여 생물적(biotic) 또는 비생물적 (abiotic) 처리 시 저항성 관련 유전자 CaPLP1의 차별적인 발현여부를 확인하는 식물체의 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 억제(VIGS, Virus-Induced Gene Silencing) 기술을 이용하여 상기 CaPLP1 유전자의 발현을 억제시키거나, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 식물에 이 유전자를 도입, 과발현 (overexpression)하여 CaPLP1 유전자의 식물체 병저항성 증대효과를 확인하여, 이를 통한 식물병 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것에 관한 것이다.

식물의 병 저항성반응 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 신호전달 기작을 규명하는 과학적 가치를 지닌다. 또한 식물병 방어관련 유전자의 정보는 작물의 병저항성 증대를 위한 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공 되어질 수 있는 장점을 지니고 있다.

환경친화적 식량생산을 증산하기 위하여 병방어 관련 다양한 유전자를 이용한 작물 육종은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초, 그리고 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관되어진 다양한 산업의 활성화에 기여한다.

우리나라에서 집약적으로 재배되고 주요 경제 작물로써 고추 (Capsicum annuum L.)의 식물병 방제는 그 중요성이 지대하고, 또한 식물병에 대한 방어의 신호전달경로를 연구하기 위한 훌륭한 실험시스템을 제공해 주고 있다. 고추 세균성점무늬병원균과 고추와의 상호작용에서 방어반응에 관여하는 유전자의 분리와 기능 분석은 고추의 병방어 반응 경로뿐 아니라 모델 식물인 애기장대에서의 과발현을 통해 식물 병방어 반응에 대한 과학적 이해를 증진시키고, 저항성관련 유전자를 고추식물에서 발현시킨 병저항성 형질전환식물의 개발을 위한 유전자원의 토대가 된다.

식물이 병원균에 감염되면, 기주식물은 이에 대항하기 위한 다양한 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 활성화한다. 이러한 방어기작은 병원체에 대한 기주세포의 인식을 시작으로, 세포내 Ca²⁺, 활성산소의 증가, 칼로스 집적 (Callose deposition), 페놀 관련 항균성 물질인 2차 대사산물의 생성, 국부적 세포 사멸과 같은 과민성 반응, 그리고 다양한 병방어 관련 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.

이러한 일련의 저항성 반응을 나타내기 위한 신호전달의 과정은 인지질분해효소에 의해 세포막에 위치한 인지질의 분해와 분해산물의 인식을 통해 하위 단계의 신호를 전달하게 된다. 이 과정에서 일어나는 인지질 (Phospholipid) 분해는 지질 아실 분해 효소 (Lipid Acyl Hydrolase [LAH]) 활성을 갖는 포스포라이페이즈(phospholipase)라 명명된 효소가 세포내 각종 막을 형성하는 인지질이중막 (phospholipd bilayer) 구조의 인지질 아실 결합 (acyl bond)을 가수분해하여 아키도닉 산 (archiconic acid)과 라이소인지질 (lysophospholipid)로 분해하는 작용이다. 이 과정에서 분해된 산물이 신호전달 물질로 역할하고, 또한 하위단계의 신호전달을 통해 식물 호르몬은 자스몬산 (jasmonic acid)뿐 아니라 항균활성을 지니는 각종 2차 대사산물의 생성을 가능하게 한다.

최근에 개개의 LAH 활성을 갖는 포스포라이페이즈의 생리적 기능과 역할의 역할의 중요성이 식물의 생장과 방어반응에서 부각되고 있다. 특히, 최초 감자의 괴경에서 영양소의 저장장소로 알려진 파타틴 (Patatin) 단백질이 LAH 활성을 갖는 포스포라이페이즈임이 밝혀지고, 다양한 작물에서 보존된 파타틴 유사 포스포라이페이즈가 식물 병원균에 의해 유도되고 식물의 과민성 세포사멸 반응에서 주요한 역할을 한다는 보고가 속속 발표되고 있다. 뿐만 아니라 모델 식물인 애기장대에서 외부 자극에 의한 LAH 활성 증가를 통해 식물 면역 신호전달의 중추인 Mitogen-associated protein kinase (MAP kinase) 신호전달체계가 활성화 된다고 보고되었다. 그렇기 때문에 이를 이용하여 분자적으로 식물의 지질 대사과정의 변형을 통한 식물 면역 반응의 증진에 관한 연구가 진행 중이다. 현재, 고추 식물에서 이러한 파타틴 유사 포스포라이페이즈에 대한 기능 연구와 병 저항성에서의 역할에 대해서는 보고된 바 없다. 세포내에서 지질 대사 과정에서 중요한 역할을 통해 식물 생장뿐 아니라 외부 스트레스에 대한 식물 면역반응에 관여하는 파타틴 유사 포스포라이페이즈에 관한 연구는 그 중요성이 크기 때문에, 이에 대한 연구와 이 기능을 밝혀내는 것은 고추식물의 병저항성 기작을 이해하는데 필요하고, 나아가 병저항성 형질전환 식물체 제작을 위한 주요한 유전자원으로 이용될 수 있을 것이다.

본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 관련 유전자의 하나인 파타틴 유사 포스포라이페이즈 (CaPLP1: C apsicum a nnuum P atatin- L ike P hospholipase 1) 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 CaPLP1 유전자를 이용하여 식물병 또는 화학물질에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 식물체의 병저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.

더 나아가, 본 발명은 상기 CaPLP1 유전자를 식물체에 도입하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 상기 목적은, 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain Bv5-4a)을 접종한 후, 과민성 세포사멸을 일으킨 녹광 고추 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)으로부터 분리한 신규 저항성 관련 유전자 CaPLP1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, 이를 이용하여 생물적/화학적 처리를 통하여 CaPLP1의 발현 여부를 조사하고, VIGS를 통한 CaPLP1의 유전자가 억제된 고추식물과 이 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 CaPLP1 유전자의 식물병 저항성 유도 기능을 확인하여 달성하였다. 또한, 본 발명자들은 CaPLP1 유전자의 얼터너티브 스플라이싱 (alternative splicing) 형태의 유전자인 CaPLP2의 존재를 확인하였다.

따라서 본 발명은 식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 파타틴 유사 포스포라이페이즈를 코딩하는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 (b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자(CaPLP1)를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 파타틴 유사 포스포라이페이즈를 코딩하는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 (b) 서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자(CaPLP2)를 제공한다.

나아가, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 분리된 파타틴 유사 포스포라이페이즈 단백질 CaPLP1 및 CaPLP2를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 상기 재조합 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 pBIN35S:CaPLP1, 또는 pTRV2:CaPLP1이다.

나아가, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

또한, 본 발명은 식물체로부터 mRNA 분리하여 CaPLP1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 Bv5-4a 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광 고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용한 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization) 과정을 수행하여 병저항성과 관련이 있을 것으로 예상되는 클론을 선발하여, 유전자의 염기서열을 해독하여, CaPLP1 또는 CaPLP2로 명명된 고추 녹광 품종의 파타틴 유사 포스포라이페이즈 코딩 유전자 염기서열(서열번호 1, 서열번호 3) 및 그에 따른 아미노산 서열(서열번호 2, 서열번호 4)을 제공한다(도 1 및 도 2 참조).

본 발명의 CaPLP1 및 CaPLP2 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 CaPLP1 과 CaPLP2 의 두 단백질 모두에서 식물의 파타틴 유사 포스포라이페이즈 (Patatin-like phospholipase)에서 전형적으로 나타나는 파타틴 유사 포스포라이페이즈 도메인과 아미노산 서열의 N-말단에 시그널 펩타이드를 가지고 있었고, 고추 지놈을 분리하여, CaPLP1의 엑손(Exon)과 인트론(Intron)을 분석한 결과, CaPLP2는 1번 엑손의 일부분이 잘려나간 형태인 것으로 확인되었다.

본 발명의 CaPLP1과 CaPLP2 의 병원균에 대한 유도발현을 분석한 결과, CaPLP2의 발현은 CaPLP1에 비하여 상대적으로 미미함이 밝혀졌다. 이로써 식물 방어반응에서 주요한 역할은 CaPLP1이 기능함을 알 수 있었다. CaPLP1 cDNA의 코딩 리전(coding region, ORF)은 413 개의 아미노산을 암호화하는 1242 개의 염기서열로 이루어져 있고, CaPLP1 단백질의 파타틴 유사 포스포라이페이즈 도메인에는 세린 하이드롤레이즈 모티프(Serine hydrolase motif)와 함께 catalytic dyad를 이루는 아스파트산(aspartic acid)이 보존되어 있는 것이 확인되었다. 확인된 CaPLP1의 유전자 염기서열과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1 및 도 2에 나타내고, CaPLP1과 CaPLP2의 아미노산 서열차이와 발현차이를 도 2에 나타냈다. 또한 CaPLP1 단백질의 보존된 모티프와 기존에 보고된 다른 식물의 파타틴 유사 포스포라이페이즈와의 관계를 계통도 제작을 통해 비교하여 도 3에 나타내었다.

다음에, 본 발명은 생물적/화학적 처리를 한 식물체로부터 RNA 분리하여 CaPLP1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병저항성을 탐색하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 상기 생물적 처리는 고추 세균성 점무늬병의 병원성 또는 비병원성 세균 등 병원균을 예로 들 수 있다. 상기 화학적 처리는 식물 호르몬인 살리실산(salicylic acid)을 예로 들 수 있다. 상기 CaPLP1 유전자 발현 여부 확인은 노던 블럿, 실시간 RT-PCR, 마이크로어레이법 외에도 mRNA의 발현을 측정할 수 있는 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자가 식물 병원균 또는 식물 호르몬 처리에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 4b 내지 도 4d 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자는 식물체의 병 또는 화학물질 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 CaPLP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 고추식물에서 특이적으로 CaPLP1 유전자가 억제된 식물체를 제작하고 병 저항성이 감소되는 것을 확인하고, CaPLP1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물의 식물병 저항성 생성여부를 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 CaPLP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체에 병 저항성을 부여하는 방법도 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명은 바이러스 유도 유전자 억제(불능화)기술(virus-induced gene silencing (VIGS))에 이용되어지는 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaPLP1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌: Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2:109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaPLP1을 제작하였다. 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CaPLP1의 발현이 억제된 VIGS 식물체를 제조하여 저항성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5a 내지 7 참조).

나아가 본 발병에 의한 CaPLP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pBIN35S::CaPLP1)와 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여, 애기장대 식물에서의 형질전환 발현(transgenic expression)을 통한 CaPLP1 유전자의 식물체 병저항성 활성화 기능을 확인하고(도 8 내지 도 9c 참조) 이를 통한 병 저항성 형질전환 식물체를 제공한다.

상술한 바와 같이 본 발명에서 CaPLP1이 고추 식물의 병저항성 발현에 필수적이라는 것을 확인하고 CaPLP1의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질 (PR protein)의 유전자 정보를 축적할 수 있게 되어 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하는 데에 실용적으로 이용될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 식물 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 관련 유전자인 파타틴 유사 포스포라이페이즈 CaPLP1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 식물병 저항성 탐색방법을 제공할 뿐 아니라 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체 제작에 기여하는 효과를 도모할 수 있게 되었다.

아울러 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자 억제를 통한 저항성 감소를 확인하고, 유전자를 애기장대에 과발현시켜 식물병 저항성을 확인함으로써 본 발명에 의한 CaPLP1은 병 저항성 식물체의 육종을 위한 재료로서 제공되어 질 수 있다.

이러한 본 발명은 저항성 품종 개발을 촉진할 수 있는 효과가 있으므로 식물육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종 (Capsicum annnuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 CaPLP1 유전자의 염기서열을 나타낸 도면이고,
도 2a는 본 발명에 의한 CaPLP1과 CaPLP2의 엑손과 인트론 분석결과를 나타내고,
도 2b는 본 발명에 의한 CaPLP1과 CaPLP2의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내고,
도 2c는 병원성, 비병원성 병원균을 접종한 이후 본 발명에 의한 CaPLP1과 CaPLP2의 발현 비교를 위한 RT-PCR 분석결과를 나타내고,
도 3은 본 발명에 의한 고추 CaPLP1과 CaPLP2의 아미노산 서열과 모델식물인 애기장대와 기존에 보고된 다른 작물의 파타틴 유사 포스포라이페이즈와의 관계를 나타낸 계통도와 LAH 활성에 중요한 보존된 catalytic dyad motif 의 분석을 나타낸 것이고,
도 4a는 고추 녹광 품종의 각 기관에서 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현결과를 나타낸 것이고,
도 4b 및 도 4c는 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때, 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaPLP1 유전자의 발현과 병원균 접종 이후 CaPLP1 단백질 발현차이를 나타낸 도면이고,
도 4d는 살리실산(Salicylic acid)을 처리한 후 시간별로 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,
도 5a는 바이러스 유도 유전자 억제(virus-induced gene silencing; VIGS)의 방법을 사용하여 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 것을 확인한 도면이고,
도 5b는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 병 저항성이 붕괴되어 병징이 확대되고, 저항성 반응인 세포사멸은 줄어든 것을 나타낸 도면이고,
도 5c는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 식물 내 세균생장이 증가됨을 나타낸 도면이고,
도 5d는 CaPLP1 단백질의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 CaPLP1 단백질 유도 결과를 대조구와 비교한 결과를 나타낸 도면이고,
도 6a는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 감염 고추 잎 조직에서의 H₂O₂의 변화를 댑(DAB) 염색(3,3'-diaminobenzidine staining)과 정량을 통해 나타낸 도면이고,
도 6b는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 감염 고추 잎 조직에서의 세포사멸을 트리판(Trypan) 염색과 이온전도도의 측정을 통해 정량화한 도면이고,
도 7은 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, CaPLP1 의 발현 억제와 저항성 관련 유전자의 발현 차이를 나타낸 결과를 보인 도면이고,
도 8은 재조합벡터 pBIN35S:CaPLP1과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 CaPLP1 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 CaPLP1 유전자가 과다발현 되고, 이로 인해 애기장대의 병저항성 관련 유전자인 AtPDF1 유전자의 발현이 증가된 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,
도 9a는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 노균병 (Hyaloperonospora parasitica)에 대한 병저항성이 나타난 사진이고,
도 9b는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 노균병 (Hyaloperonospora parasitica) 접종 후 과민성 세포사멸이 발생하는 것을 트리판 블루 염색(trypan blue staining)을 통해 살펴본 결과를 나타낸 도면이고,
도 9c는 본 발명에 의한 CaPLP1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 노균병 (Hyaloperonospora parasitica)에 대한 병저항성이 증가된 것을 포자경수 및 포자수를 측정함으로써 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] CaPLP1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

고추 세균성 점무늬병에 대한 병저항성 관련 단백질 중 하나인 파타틴 유사 포스포라이페이즈(CaPLP1: C apsicum a nnuum P atatin- L ike P hospholipase 1 ) 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성세포사멸반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이론막(Hybond N+)에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CaPLP1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 고추 파타틴 유사 포스포라이페이즈 (CaPLP1) 유전자로 명명하였다. cDNA 라이브러리로부터 CaPLP1 cDNA 클론을 제작하는 과정에서, CaPLP1 보다 132개의 염기서열을 덜 갖는 CaPLP2가 함께 발견되었고, 고추의 지놈 분석을 통해 CaPLP2는 CaPLP1의 얼터너티브 스플라이싱 형태임을 밝혀냈다. CaPLP1 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 식물의 LAH 활성을 갖는 파타틴 유사 포스포라이페이즈 그룹에 속함을 알 수 있었다(도 3 참조). 확인된 CaPLP1 및 CaPLP2의 유전자 염기서열(서열번호 1 및 서열번호 3)과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2 및 서열번호 4)을 도 1 및 도 2에 나타내었다.

[실시예 2] 병원균 접종에 의한 고추식물에서의 CaPLP1 유전자의 발현 탐색

상기 실시예 1에서 수득한 CaPLP1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.

[단계 1]

먼저 저항성 탐색 방법을 구체적으로 제시하기 위하여, 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 YN(Yeast- Nutrient) 배지에서 배양한 후, 10⁸cfu/㎖의 농도로 6엽기의 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)의 5, 6엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 침투시켜 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실 처리 하였다. 접종 후 시간대별로 잎을 샘플링하여 RNA와 단백질을 분리하고, 각각 포름알데하이드 겔과 에스디에스 페이지 (SDS-PAGE) 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N AND P)으로 전이시켰다.

다음으로 실시예 1에서 수득된 CaPLP1 유전자에 클레나우 효소(Klenow enzyme)를 이용하여 동위원소가 붙은 α-³²P[dCTP] 을 표지한 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 24 시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 동위원소가 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막(Hybond N+)에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 (Hybond N+) 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 동위원소가 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 발현 유무와 정도를 알아볼 수 있게 하였다.

또한 토끼를 이용한 CaPLP1의 특이적 항체를 제작하고, 이를 이용하여 CaPLP1의 단백질 발현도 함께 조사하였다. 추출한 단백질이 전이된 나일론 막에 CaPLP1 항체가 포함된 5 % milky를 이용하여 하이브리드한 이후에, 호스래디쉬 퍼록시데이즈 (Horseradish peroxidase)가 결합된 이뮤노글루빈 쥐 (IgG) 항체를 이용하는 방법을 통해 CaPLP1 단백질 발현을 확인하였다(도 4c).

이상의 실험결과를 도 4a ~ 도 4c에 나타내었으며 실험의 결과 CaPLP1 유전자는 비병원성 고추 세균성 점무늬병 접종 후 10시간 이후에 강하게 발현하였다(도 4b).

[실시예 3] 식물 호르몬에 의한 CaPLP1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CaPLP1 유전자가 통상 세균성 병원균에 대해 저항성 유도에 사용되는 식물 호르몬인 살리실산에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

[단계 1]

먼저, CaPLP1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 살리실산(salicylic acid)을 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다. 모든 실험에 6엽기의 고추 잎이 이용되었다.

살리실산은 5 mM의 농도로 고추 잎에 스프레이 하는 방법으로 처리하였으며, 각각의 식물들은 처리 1, 5, 10, 15, 20, 25시간 후에 잎을 수거하였고 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시킨 후 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다. 시험방법은 실시예 2에 기술한 것과 동일하다.

실험의 결과 CaPLP1 유전자는 도 4d에서 보이는 것과 같이 살리실산을 처리한 후 발현이 10시간부터 유도되어 25시간까지 발현이 강하게 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.

[실시예 4] CaPLP1 유전자 발현의 억제에 의한 병 저항성의 변화

고추식물에서 CaPLP1 유전자의 발현이 특이적으로 억제되었을 때 병 발생과 관련 다른 유전자들의 유도 여부 및 병에 대한 저항성의 붕괴 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaPLP1 유전자를 바이러스 유도 유전자 억제(VIGS, virus-induced gene silencing)에서 이용되어지는 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaPLP1 유전자를 TRV2 벡터에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2:CaPLP1을 제조하였다 (참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113).

이렇게 제조한 재조합벡터 TRV2:CaPLP1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법 (electrophoration)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 고추 유묘 (seedling)의 떡잎에 주사기를 이용, 엽육주사 (infiltration) 방법으로 접종하여 고추식물에 도입함으로써 CaPLP1 유전자의 발현의 억제를 유도시켰고, 유전자 발현 억제의 효과는 역전사효소 피씨알 (RT-PCR) 및 실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR)을 통하여 확인하고, 웨스턴 블롯을 통해 단백질 수준에서도 발현이 감소함을 확인하였다 (도 5a 참조).

[단계 1]

CaPLP1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성의 변화를 알아보기 위하여, 상기의 CaPLP1의 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 대조구로서 TRV2:00 벡터를 접종한 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 10⁷ 과 10⁸cfu ml^-1 의 농도로 접종한 후 접종 잎의 병징을 관찰하였고, 5 x 10⁴ cfu ml^-1로 접종하여 접종 후 0, 3일에 감염 식물조직에서의 세균 생장을 측정하였다(도 5b 및 도 5c).

그리고 병원균 10⁷ cfu ml^-1로 접종하여 접종 이후 시간대 별로 식물저항성 신호전달 관련 물질인 H₂O₂를 정량하고, 저항성 반응의 표현인 식물조직의 세포사멸을 이온전도도 측정을 통해 정량화하였다 (도 6a 및 도 6b).

또한, 병원균 10⁷cfu ml^-1농도로 접종 후 18, 36시간 후에 실험구와 대조구의 감염 잎에서 RNA를 추출하여 실시간 알티-피시알 (real-time RT-PCR)을 통해 CaPLP1 의 특이적인 유전자 억제 효과와 함께 병 접종 시 대조구 식물과 비교하여 병저항성 관련 유전자의 발현 차이를 관찰하였다 (도 7).

도 5b에 나타난 바와 같이 실험결과 VIGS로 CaPLP1의 발현이 억제된 식물에서 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 접종 후 병징을 관찰한 결과, 병원성 균주 접종시 대조구에 비하여 접종 후 7일 이후에 빠른 황화와 괴저 현상이 진전되는 것이 관찰되었고, 비병원성 균주 접종시 대조구 식물에서 2일째 국부적 저항성 반응으로 세포사멸이 나타나지만 CaPLP1의 발현이 억제된 식물에서는 국부적 세포사멸반응이 늦추어 짐을 확인하였다.

그리고 도 5c에서와 같이 감염조직에서 병원성 균과 비병원성 균의 세균 생장을 측정한 결과 대조구에 비교하여 CaPLP1의 발현이 억제된 식물에서 더 많은 세균생장을 나타냈다.

도 6a 및 6b와 같이 대조구 식물에 비해 CaPLP1이 억제된 식물에서 H₂O₂의 축적이 병원성, 비병원성 균주 모두에 대해 감소함을 알 수 있었고, 특히 비병원성 균주에 대하여 이온전도도가 적게 나타남을 알 수 있었다.

또한 실시간 알티-피시알 시험 결과 도 7과 같이, CaPLP1이 억제된 식물에서 효과적으로 CaPLP1 유전자의 억제가 나타나는 것이 관찰되었고, 비병원성 균주 접종시 살리실산에 의존적인 대표적 저항성 관련 유전자인 CaBPR1 유전자(Choi et al. (2007) Hydrogen peroxide generation by the pepper extracellular peroxidase CaPO2 activates local and systemic cell death and defense response to bacterial pathogens)의 발현이 줄어든 것을 확인하였다.

[실시예 5] CaPLP1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaPLP1 유전자의 과다발현에 의한 애기장대 식물의 병 저항성 변화

모델식물로 사용되는 애기장대 식물체에서 CaPLP1 유전자의 과다발현시 다른 병 발생과 관련된 유전자들의 유도여부 및 병에 대한 저항성의 증가 여부에 대하여 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaPLP1 유전자를 pBIN35S 벡터에 도입시켜 pBIN35S:CaPLP1을 제조한 후 이렇게 제조된 재조합 벡터인 pBIN35S:CaPLP1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법 (electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 통하여 애기장대 식물에 도입함으로써 CaPLP1 유전자의 과다발현을 유도시킨 형질전환 애기장대를 제작하고 아래와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

CaPLP1 유전자가 과다 발현된 식물체에서 순활물 병원균(biotrophic pathogen)에 대한 저항성이 증가하였는지의 여부를 알아보기 위하여, 상기 CaPLP1 유전자가 과다 발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에서 CaPLP1과 애기장대 식물의 저항성 관련 유전자인 AtPR1 (참고문헌 Huffaker and Ryan..(2007) Endogenous peptide defense signals in Arabidopsis differentially amplify signaling for the innate immune response) 및 AtPDF1 (Huffaker and Ryan..(2007) Endogenous peptide defense signals in Arabidopsis differentially amplify signaling for the innate immune response) 유전자의 발현을 관찰하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 # 1, # 2, # 3 는 사용된 형질전환 식물의 계통번호를 나타내고, 실험결과 CaPLP1 유전자가 과다 발현된 형질전환 애기장대 식물에서 CaPLP1 유전자가 효과적으로 과발현되고, AtPDF1 유전자가 대조구에 비해 발현량이 많은 것을 확인할 수 있었다.

[단계 2]

CaPLP1이 과다 발현된 식물에, 애기장대에서 노균병을 일으키는 순활물 기생체인 하이알로페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Hyaloperonospora parasitica Noco 2)를 접종한 후 병저항성의 변화를 관찰하였다. CaPLP1이 과발현된 식물과 과발현하지 않는 야생형 대조구 식물의 떡잎시기에 하이알로페로노스포라 파라시티카 Noco2를 5 x 10⁴포자 ml^-1의 농도로 스프레이접종 하였다. 접종 후 17℃의 온도에서 습실 처리하였다.

그 결과 CaPLP1을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물에서 저항성이 증가되어 노균병원균의 균사생장이 억제되는 것을 관찰할 수 있었고 그 결과를 도 9a 내지 도 9d에 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 파타틴 유사 포스포라이페이즈를 코딩하며, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자(CaPLP1).
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaPLP1).
식물병 저항성 관련 유전자로서 고추 유래 파타틴 유사 포스포라이페이즈를 코딩하는 하기 (a) 또는 (b)의 분리된 유전자(CaPLP2):
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자;
(b) 서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자.
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaPLP2).
제1항 또는 제3항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제5항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
식물체로부터 mRNA 분리하여 제1항 또는 제3항 기재의 유전자(CaPLP1, CaPL2)의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제7항에 있어서, 상기 식물체는 고추 세균성 점무늬병의 병원성 또는 비병원성 세균을 접종한 식물체인 것을 특징으로 하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제7항에 있어서, 상기 식물체는 살리실산 (salicylic acid) 처리한 식물체인 것을 특징으로 하는 식물체의 저항성 탐색방법.