KR101043877B1

KR101043877B1 - 고추의 방어 관련, 만노스바인딩렉틴１ 유전자 （ＣａＭＢＬ１）및 이를 이용한 병저항성 식물체

Info

Publication number: KR101043877B1
Application number: KR1020090065917A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 황인선
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-07-20
Filing date: 2009-07-20
Publication date: 2011-06-22
Also published as: KR20110008530A

Abstract

본 발명은 고추의 방어 관련, 만노스바인딩렉틴1 유전자 (Pepper mannose-binding lectin1; CaMBL1, 서열번호 1) 및 이를 이용한 병 저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 식물체의 저항성 탐색방법도 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체 병원균의 방어반응의 표지 및 병저항성 식물체의 분자적 육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있고, 식물병 저항성 등의 탐색을 촉진할 수 있다.

고추, 식물병, 방어 관련, 저항성, 세균성 점무늬병, 만노스바인딩렉틴, 단백질, 유전자

Description

고추의 방어 관련, 만노스바인딩렉틴１ 유전자 （ＣａＭＢＬ１）및 이를 이용한 병저항성 식물체{Pepper defense-related, mannose-binding lectin (CaMBL1) gene and disease resistant plants using the same}

본 발명은 식물병 방어 관련된 신규 유전자인 고추 만노스바인딩렉틴1 유전자 (Pepper mannose-binding lectin1, CaMBL1), 이를 이용한 병저항성 형질전환 식물체 및 그 개발방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 균주와 비병원성 균주에 감염될 때 저항성 반응에서 강하게 발현되는 식물병 방어 관련 신규 유전자인 CaMBL1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용하여 생물적/화학적/물리적 저항성 유도 처리 시 저항성 관련 유전자 CaMBL1의 차별적인 발현여부 및 CaMBL1의 펩타이드를 사용하여 제작된 항체를 이용한 면역반응으로 CaMBL1의 단백질 수준의 발현 여부를 탐색하는 식물체의 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS, virus-induced gene silencing) 현상을 통해 상기 CaMBL1 유전의 발현을 불능화(knock down) 시켜 병저항성에 대한 만노스바인딩렉틴1 유전자의 기능을 확인하고, 그리고 상기 CaMBL1 유전자를 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 형질전환을 통해 도입, 과발 현(overexpression)시켜 CaMBL1 유전자의 식물체 병저항성 증대효과를 확인하여, 이를 통한 식물병 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것에 관한 것이다.

식물의 병의 발생은 작물의 생산 및 품질의 저하를 가져와 경제적으로 큰 피해를 일으키게 되는데, 이러한 병에 의한 작물생산 피해를 최소화하기 위하여 고추를 비롯한 다양한 경제작물의 병 저항성 품종의 육종에 대한 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 실제적 응용을 위해 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구를 고추식물을 모델로서 수행하고 있다.

병에 감염된 기주 식물은 여러 가지 세포내 대사 경로에서 방어기작을 작동시키게 되며, 기주식물과 식물병원균간의 상호작용에서 병원균 감염초기에 친화적, 불친화적 반응으로 나뉘어 결정이 된다. 이러한 상호작용에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는 저항성(방어)반응의 여부가 결정되게 된다.

불친화적 상호작용에서, 감염된 식물은 병원균의 침입을 인식(recognition)하고, 인식에 대한 반응으로 감염된 부위의 국부적 세포죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive response), 캘러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 피토알렉신(phytoalexin)과 같은 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 병생성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불리는 방어관련 단백질을 생성하여 저항성 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다.

이러한 식물들의 방어기작들은 병원균의 침입에서 뿐만 아니라, 살리실산, 메틸자스모네이트 등의 식물호르몬 자극에 의해서도 나타날 수 있으며, 물리적인 상처, 염도, 온도 등의 환경적 스트레스에 의해서도 나타나는 것으로 보고되고 있다.

이러한 생물학적/물리적/환경적 스트레스에 대한 식물의 방어 반응 중에서 특히 식물이 병원체에 대하여 방어반응을 일으키는 데 중요한 역할을 하는 것은 식물과 병원균의 상호작용에 의한 식물의 병저항성의 발현과 이에 관련된 신호전달경로이다. 이러한 식물의 병 방어 기작 및 저항성 반응에 관련된 유전자가 어떻게 병원균을 인식하고, 어떠한 전달경로를 통하여 식물 전체에 반응하게 되는지 중요하게 연구되어져 왔으며, 이와 관련하여 생물학/생화학/세포생물학적인 방법을 이용한 병 방어(저항성) 유전자의 기능에 대한 연구가 이루어져 왔다.

병 방어(저항성) 유전자의 기능에 대한 생물학/생화학/세포생물학적인 연구는 식물의 생리 및 저항성에 관련된 기작을 연구하는데, 높은 가치를 가지게 되는 것은 물론, 작물의 분자육종을 통한 저항성 품종의 개발에 기여할 수 있다. 작물의 분자육종기술에서 유전공학적 기술의 개입은 근래 활발하게 이루어지고 있으며, 병 방어(저항성) 유전자를 통한 작물의 분자육종은 타 식물종의 외래 유전자를 사용할 수 있으며, 기존의 게놈단위로 가능하던 육종기술을 유전자 수준에서 가능하도록 하여 보다 효과적인 육종 효과를 보이며 현재의 육종의 기술을 극대화 시킬 수 있다는 장점이 있다.

한편, 만노스바인딩렉틴은 많은 식물들이 함유하고 있으며 탄수화물 결합단백질로 알려져 있고 최근에 발견된 식물 렉틴의 한 종류이다. 최근 연구에서 만노 스바인딩렉틴이 저항성 발현에 관여되어져 있다고 알려져 있으며, 여러 가지 탄수화물을 병특이적으로 인식하여 세포와 세포간, 기주와 병원균간의 상호작용과 같은 다양한 생리적 작용에 관여한다고 알려져 있다. 이러한 발견은 만노스바인딩렉틴의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보의 축적이 가능해져서 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하거나 식물의 병저항성 유전자 재료로서 분자육종에 실용적으로 이용될 수 있을 것이다.

나아가 가지과에 속한 고추 식물은 원산지인 남미의 여러 나라를 비롯하여 전 세계적으로 재배되고 있는 작물로, 우리 식생활에서는 가장 많이 사용되는 조미 채소류로서 양념류, 김치류, 고추장 등의 가공식품에 널리 사용되고 있으며 국내 채소 종자 중 단일 품목으로는 가장 큰 규모를 자랑할 정도로 많은 재배량을 보이고 있는 대표적인 경제작물이다. 국내의 연간 소비량은 일인당 건고추 기준으로 3.5kg이며 소비량은 20만 톤 규모로 시장규모는 1조원에 이르는 것으로 추정되고 있다. 국내의 고추 재배면적은 점차 줄어들고 있는 추세이기는 하나 국내의 고추 재배면적은 2006년 53,097ha에서 116,915M/T의 건고추가 생산되어 10a당 평균수량은 220kg에 이를 만큼 많은 농가가 고추 생산에 의존하고 있어 쌀 다음으로 주요한 작물이라고 할 수 있다. 그러나 선진국에서는 고추의 중요도가 상대적으로 낮아 연구가 취약하고 본격적인 투자와 연구가 이루어지지 않은 상태이다. 또한 이러한 고추에는 세균병, 진균병, 바이러스병이 다양하게 보고되고 있으며 난균류에 의한 역 병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성점무늬병에 대한 피해가 가장 심각하게 보고되고 있다. 이러한 병원균들의 피해는 고추의 수확량 감소 및 질적 저하를 가져오고 있어 이러한 문제들을 해결하기 위하여 안정적인 생산, 농약과 노동력 절감에 따른 생산비의 절감 및 환경을 고려한 고추의 내병성 품종의 육종이 중요한 목표로 인식되어지고 있다. 또한 우리나라는 고추 종자생산에 일대 잡종기술을 사용하는 유일한 국가로 분자유전학적 육종기술을 작물의 육종에 도입하여 기존의 육종기술과 접목한다면 보다 좋은 고추 품종의 육종이 가능한 기반이 되어져 있다. 이러한 우량 품종의 육종은 국내 종자시장에서 국내 유전자원을 보호하는 것은 물론 부가가치가 높은 유전자원의 개발로 이어질 것이다.

본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 방어 관련 유전자의 하나인 고추 만노스바인딘렉팅을 코딩하는 CaMBL1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 CaMBL1 유전자를 이용하여 식물병 또는 화학물질에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 식물체의 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.

더 나아가, 본 발명은 상기 CaMBL1 유전자를 식물체에 도입하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 상기 목적은, 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광 고추 품종으로부터 분리한 신규 방어 관련 유전자 CaMBL1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, 이를 이용하여 생물적/화학적 처리를 통하여 CaMBL1의 발현 여부를 조사하고, 고추식물과 이 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 CaMBL1 유전자의 식물병 저항성 유도 기능을 확인하여 달성하였다.

따라서 본 발명은 식물병 방어 관련 유전자로서 고추 유래 만노스바인딩렉틴을 코딩하는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 (b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자(CaMBL1)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 만노스바인딩렉틴 단백질(CaMBL1)을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터 및 형질전환 식물체를 제공한다.

나아가 본 발명은 식물체로부터 RNA 분리하여 CaMBL1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계 또는 상기 CaMBL1 단백질의 항체를 프로브로 이용하여 CaMBL1 단백질 발현여부를 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥 시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병 방어(저항성)에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 수득하고, 이 클론 중 만노스바인딩렉틴(CaMBL1) 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(Sequencing)함으로써, CaMBL1로 명명된 고추 녹광 품종의 CaMBL1 단백질 코딩 유전자 염기서열(서열번호 1) 및 그로부터 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).

본 발명에 의한 상기 수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트(Blast) 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CaMBL1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 만노스바인딩렉틴1(CaMBL1) 유전자로 명명하였다. CaMBL1 단백질은 아미노산 서열의 비교결과 사탕무우(Beta vulgaris)에서 만노스바인딩렉틴과 55%의 상동성을 나타내었고 애기장대의 단백질 아미노산 서열과 비교한 결과 48%의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 알 수 있었다. 이 유전자는 고추 세균성점무늬병 이외에도 여러 가지 병원균에 대하여도 저항성 작용을 갖는 35kDa의 분자량을 지닌 단백질이다. 확인된 CaMBL1 유전자 염기서열과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

또한 상기 CaMBL1 단백질의 항체를 프로브로 이용하여 CaMBL1 단백질 발현여부를 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다(도 2 내지 4 참조). 상기 CaMBL1 단백질의 항체를 제작하는 방법 및 CaMBL1 단백질 발현여부를 확인하는 방법은 본원발명이 속하는 당업계에서 공지된 다양한 기술을 이 용할 수 있다(참고문헌 : Andon, N. L., Eckert, D., Yates, J. R. and Haynes, P. A. 2003. High-throughput functional affinity purification of mannose binding proteins from Oryzasativa. Proteomics 3: 1270-1278).

또한, 본 발명은, 식물 호르몬성 화학물질인 살리실산, 또는 메틸자스모네이트 등 병원성 세균이 아닌 비생물적 유도방법을 식물체에 처리하고, 이에 대하여 상기 저항성 탐색방법을 이용하여 CaMBL1 단백질 발현 여부를 확인함으로써, 더 용이하고 시간을 절약할 수 있는 새로운 저항성 유도방법을 제공한다.

다음에, 본 발명은 생물적/화학적 처리를 한 식물체로부터 RNA 분리하여 CaMBL1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 상기 생물적 처리는 고추 세균성 점무늬병의 병원성 또는 비병원성 세균 등 병원균을 예로 들 수 있다. 상기 화학적 유도체는 살리실산 (Salicylic acid) 및 메틸자스모네이트 (Methyl jasmonate) 등을 예로 들 수 있다. 상기 CaMBL1 유전자 발현 여부 확인은 노던 블럿, 실시간 RT-PCR, 마이크로어레이법 외에도 mRNA의 발현을 측정할 수 있는 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 CaMBL1 유전자가 식물병원균, 식물 호르몬 또는 화학적 유도체에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaMBL1 유전자는 식물체의 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 CaMBL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 고추식물에서 특이적으로 CaMBL1 유전자가 억제된 식물체의 제작, CaMBL1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물의 식물병 저항성 생성여부를 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명은 또한 새롭게 개발된 바이러스 유도 유전자침묵(불능화)기술(virus-induced gene silencing (VIGS))에 이용되어지는 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaMBL1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌: Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2:109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaMBL1을 제공한다. 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CaMBL1의 발현이 억제된 VIGS 식물체를 제조하여 병감수성이 증대되는 것을 확인할 수 있었다 (도 13 및 도 17 참조).

나아가 본 발명에 의한 CaMBL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pBIN35S::CaMBL1)를 식물체에 도입하여 본 발명에 의한 CaMBL1이 과발현된 형질전환 애기장대 식물을 제조하여 식물병 저항성의 증대를 확인할 수 있었다 (도 18 내지 도 23 참조).

본 발명에 의한 고추 만노스바인딩렉틴의 기능을 불능화 시킨 고추 식물 및 만노스바인딩렉틴을 과발현 시킨 애기장대 식물을 통하여 식물병원균에 대한 저항성 검정평가를 수행하여 병 저항성 발생여부를 알아 볼 수 있게 되었다. 이러한 본 발명으로 만노스바인딩렉틴의 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질 (PR protein)의 유전자 정보를 축적할 수 있게 되어 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 생명공학적 식물을 개발하는 데에 실용적으로 이용될 수 있을 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 식물 세균병인 고추 세균성 점무늬병에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 방어 관련 유전자인 신규한 만노스바인딩렉틴 단백질을 코딩하는 CaMBL1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자 및 단백질의 항체를 이용하여 식물체의 저항성 탐색방법을 제공할 뿐 아니라 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체 제작에 기여하는 효과를 도모할 수 있게 되었다.

따라서 본 발명은 저항성 품종 개발을 촉진할 수 있는 효과가 있으므로 식물육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] CaMBL1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

고추세균성점무늬병에 대한 병생성 관련 단백질(PR protein) 중 하나인 만노 스바인딩렉틴(CaMBL1) 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 그리고 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로 부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이론막(Hybond N+)에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추세균성점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병 방어(저항성)에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트(Blast) 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CaMBL1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 만노스바인딩렉틴1(CaMBL1) 유전자로 명명하였다. CaMBL1 단백질은 아미노산 서열의 비교결과 사탕무우(Beta vulgaris)에서 만노스바인딩렉틴과 55%의 상동성을 나타내었고 애기장대의 단백질 아미노산 서열과 비교한 결과 48%의 상동성을 나타냄으로서 신규임을 알 수 있었다. 이 유전자는 고추 세균성점무늬병 이외에도 여러 가지 병원균에 대하여도 저항성 작용을 갖는 35kDa의 분자량을 지닌 단백질이다. 확인된 CaMBL1의 유전자 염기서열과 상기염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

[실시예 2] 병원균 접종에 의한 고추식물에서의 CaMBL1 유전자의 발현 탐색방법

상기 실시예 1에서 수득한 CaMBL1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.

[단계 1]

먼저 저항성 탐색방법을 구체적으로 제시하기 위하여, 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)중 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 4엽기의 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)의 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이션(Infiltration)하여 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리 하였다. 접종 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으 로 전이시켰다.

다음으로 실시예 1에서 수득된 CaMBL1 유전자를 14-dCTP-비오틴(14-dCTP-biotin)을 이용하여 표지한 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭 시킨 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 비오틴(biotin)이 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 비오틴(biotin)이 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩 (loading) 되었음을 확인하였다. 이상의 실험결과를 도 2에 나타내었으며 실험의 결과 CaMBL1 유전자는 고추 세균성점무늬병에 대한 고추식물의 저항성 반응은 병원성 균주와 비병원성 균주에 대하여 모두 발현이 나타났다. 보다 구체적으로 병원성 균주 즉, 친화적 반응에서는 CaMBL1 유전자의 발현이 5시간 이후에 발현이 증가하여 20시간에 최고의 발현양을 나타낸 후 25시간까지 발현이 관찰되었다. 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주에서는 5시간에서 가장 강하게 발현되고 그 이후에도 증가된 발현양이 25시간째까지 유지되었으며 친화적 반응보다 CaMBL1 유전자 발현이 매우 더 강하였다.

[실시예 3] 화학적 유도체에 의한 CaMBL1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CaMBL1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

먼저, CaMBL1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 살리실산 및 메틸자스모네이트를 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다. 모든 실험에 6엽기의 고추잎이 이용되었다. 5 mM의 살리실산, 100 μM의 메틸자스모네이트는 분무기를 이용하여 고추잎의 앞뒷면에 뿌려 처리하였다.

각각의 식물들은 1,5,10,15,20,25시간 후에 잎을 수거하였고 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 이용하여 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다.

다음으로 실시예 1에서 수득된 CaMBL1 유전자를 14-dCTP-비오틴 (14-dCTP-biotin)을 이용하여 표지한 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 증폭 시킨 후 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다. 이렇게 비오틴(biotin)이 표지된 상기의 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 비오틴(biotin)이 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 노던블러팅 수행 시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다. 이상의 실험결과를 도 3 및 4에 나타내었으며 실험의 결과 CaMBL1 유전자는 살리실산의 처리 후에는 5시간 이후에 축적이 됨이 관찰되었다(도 3). 또한, 도 4에서 관찰되는 것과 같이 메틸자스모네이트의 처리 후에는 5시간에서만 축적이 되었고 20시간까지 축적이 관찰되었다.

[실시예 4] 병원균 접종 및 화학적 유도체에 의한 고추식물에서의 CaMBL1 단백질의 발현 탐색방법

상기 실시예 2 및 3과 같은 방법으로 처리되어진 식물을 샘플링하여 단백질을 분리하여 실험을 수행하였다. 다음으로 실시예 1에서 수득된 CaMBL1 유전자를 펩티드 합성을 이용하여 토끼에서 항체를 제작하여 CaMBL1의 단백질 발현을 확인하였다. 상기 항체는 항체 전문 제작업체(AbFRONTIER, Korea)에 의뢰하여 제작하였고, 이를 이용하여 실험을 수행하였다.

먼저 저항성 탐색방법을 구체적으로 제시하기 위하여, 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 중 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 4엽기의 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)의 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이션(Infiltration)하여 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리 하였다. 접종 5, 15, 25, 35 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 단백질을 추출하였고, 추출한 단백질을 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용 전기영동 한 후 나이론막 (Hybond P+)으로 전이 시켰다. 전이 시킨 후 1:5,000의 희석비율의 항체 (α-CaMBL1)를 이용하여 발현을 확인 하였다. 단백질 발현의 실험의 수행 시 단백질양을 정량함으로서 동일량의 단백질이 로딩되었음을 확인하였다. 이상의 실험결과를 도 2, 3 및 4에 나타내었다.

도 2의 하단에 나타난 바와 같이 실험의 결과 CaMBL1 유전자는 세균성 점무늬병에 대한 고추식물의 저항성 반응은 병원성 균주와 비병원성 균주에 대하여 모두 발현이 나타났으나 병원성 균주 즉, 친화적 반응에서는 CaMBL1 유전자의 발현이 35시간 이후에 발현이 확인되었고, 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주에서는 15시간에서 가장 강하게 발현되었다. 도 3 및 도 4의 하단에 나타난 바와 같이, 살리실산은 12시간에 발현이 증가되어 24시간에 가장 강하게 발현되었으며 메틸 자스모네이트의 단백질 수준의 발현은 관찰되어지지 않았다.

[실시예 5] CaMBL1 단백질 생산과 만노스바인딩 활성의 탐색방법

대장균에서의 CaMBL1 유전자를 과다발현 시킨 후 발현 산물인 CaMBL1의 단백질 기능을 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaMBL1 유전자와 CaMBL1의 신호펩티드(signal peptide)를 제거한 His-CaMBL1-1, CaMBL1의 도메인만을 포함하는 His-CaMBL1-2, CaMBL1의 c-터미널(c-terminal) 부분만을 포함하고 있는 His-CaMBL1-3을 pET28a 벡터(참고문헌 : Andon, N. L., Eckert, D., Yates, J. R. and Haynes, P. A. 2003. High-throughput functional affinity purification of mannose binding proteins from Oryzasativa. Proteomics 3: 1270-1278)에 도입시켜 재조합벡터를 제조하고 도 5에 나타내었다.

이렇게 재조합벡터를 대장균(Escherichia coli strain BL21)에 형질전환시키고 이 재조합벡터가 들어가 있는 대장균을 배양하여 얻어진 단백질을 다음 실험에 이용하였다.

[단계 1]

만노스바인딩어세이를 위한 버퍼 (50 mM Tris, pH 7.5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂)를 이용하여 CaMBL1 단백질을 초음파처리(sonication) 해준 후 D-만노스-아가로즈 컬럼(D-mannose-agarose column)를 이용하여 만노스바인딩어세이를 수행하였다. 이 후 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동 법을 이용하여 확인하였다. 이 재조합 단백질을 1xSDS 샘플버퍼(sample buffer)에 녹이고 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-polyacrylamide gel)에 전기영동하였다. 단백질의 정확한 크기를 알기 위하여 단백질 마커를 이용하여 검정하였고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

[단계 2]

이렇게 바인딩된 CaMBL1, His-CaMBL1-1, His-CaMBL1-2, His-CaMBL1-3 단백질은 전기영동 후 나이론막 (Hybond-P)으로 전이시킨 후 anti-His antibody를 이용하여 발현여부를 관찰하였다. 도 5의 하단의 결과와 같이 CaMBL1의 도메인을 포함하 고 있는 His-CaMBL1-1, His-CaMBL1-2만이 발현되는 것이 관찰되었다.

[실시예 6] 녹색형광 단백질을 이용한 CaMBL1의 위치 탐색방법

CaMBL1 유전자를 녹색형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)이 표지되어 있는 재조합 벡터를 이용하여 식물 내에서 CaMBL1의 발현위치를 탐색하기 위하여 CaMBL1 유전자를 326GFP 벡터에 도입시켜 재조합 벡터인 smGFP::CaMBL1을 제조하였다. 또한 CaMBL1 유전자 중 만노스바인딩렉틴의 도메인만을 도입한 smGFP::MBL 도메인(domain)을 이용하여 입자탄이용 DNA 전이술(particle bombardment)에 의해 양파식물로 도입시켜 CaMBL1의 위치를 공초점현미경(confocal laser scanning microscope (CLSM))을 이용하여 탐색하였다.

[단계 1]

CaMBL1이 식물에서 발현되는 위치를 알아보기 위하여 입자탄이용 DNA 전이술을 이용하여 양파식물에 녹색형광 단백질이 표지되어 있는 CaMBL1을 도입시켜서 공초점현미경을 이용하여 관찰하였다. 도 6은 그 결과를 나타내고 있다. 그 결과 CaMBL1과 만노스바인딩렉틴의 도메인만을 도입한 양파식물에서는 벡터만을 도입한 대조구와는 달리 원형질막(plasma membrane)으로 형광녹색단백질이 발현이 되는 결과를 나타내고 있다.

[실시예 7] 아그로박테리움 매개 일시 발현(Agrobacterium-mediated transient expression) 방법을 통한 CaMBL1 유전자 발현이 식물에 미치는 영향

고추식물에서 CaMBL1 유전자를 아그로박테리움 매개 일시적 발현(Agrobacterium-mediated transient expression) 방법을 통하여 과발현을 시켰을 때 고추식물의 변화를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaMBL1 유전자를 Stratagene에서 제공하는 pBIN3S 벡터에 도입시켜 pBIN35S::CaMBL1을 제조한 후 이렇게 제조된 재조합 벡터인 pBIN35S::CaMBL1을 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 식물에 농도별로 주사기를 사용하여 인필트레이션(infiltration) 방법을 이용하여 고추식물에 도입함으로써 CaMBL1 유전자의 과발현을 유도시켰다.

[단계 1]

도 7, 9 및 10에서와 같이 CaMBL1이 과다로 발현된 식물에서는 CaMBL1이 도입되지 않은 대조구와 비교하여 식물의 세포사멸이 관찰되었으며 특히 높은 농도에서 빠르게 관찰되었다. 또한 이들 식물에서 저항성 반응의 결과를 알아보기 위하여 트리판블루 염색(trypan blue staining)과 이온전도도를 수행하였다. 도 9에서와 같이 CaMBL1이 과발현된 식물이 대조구에 비하여 트리판블루의 염색결과 세포사멸이 증가되는 것을 관찰할 수 있었고, 도 10에 나타난 바와 같이 이온전도도 또한 CaMBL1이 과발현된 식물에서 더 증가됨을 알 수 있었다.

[단계 2]

CaMBL1의 과발현이 식물에서 미치는 영향을 알기 위하여 다른 병방어 관련 유전자의 발현을 양적 리얼타임피씨알(quantitative RT-PCR)을 이용하여 관찰하였 다. 고추 식물의 병방어 관련 유전자로 알려져 있는 CaBPR1 및 CaDEF1은 CaMBL1이 과발현된 식물에서 더 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 11 참조).

[단계 3]

CaMBL1의 과발현이 식물에서 살리실산의 생성에 미치는 영향을 알기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 살리실산을 정량하였다. 도 12와 같이 접종 24, 48시간 후의 식물을 수거하여 정량한 결과 유리 살리실산과 총 살리실산 모두 CaMBL1의 과발현 식물에서 증가하는 것이 관찰되었다.

[실시예 8] CaMBL1 유전자 발현의 억제에 의한 병 감수성 증가

고추식물에서 CaMBL1 유전자의 발현이 억제되었을 때 병 발생과 관련 다른 유전자들의 유도 여부 및 병에 대한 감수성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaMBL1 유전자를 새롭게 개발된 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS, virus-induced gene silencing)에서 이용되어지는 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaMBL1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109 - 113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaMBL1을 제조하였다. 이렇게 제조한 재조합벡터 TRV2::CaMBL1을 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 고추의 떡잎 생육 기에 떡잎에 주사기를 사용하여 인필트레이션(infiltration) 방법을 이용하여 고추식물에 도입함으로써 CaMBL1 유전자의 발현의 억제를 유도시켰다.

[단계 1]

CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병에 대해 감수성이 증가되는지를 알아보기 위하여, 상기의 CaMBL1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 건전한 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양하고 접종한 후 각각의 식물에서 15시간에 식물을 수거하여 RNA를 추출하여 양적 리얼타임피씨알(quantitative RT-PCR)을 통하여 관찰하였다.

도 13-17은 VIGS로 CaMBL1의 발현이 불활성화된 고추식물에 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 접종 후 결과를 나타냈다.

[단계 2]

CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에서 감수성 반응의 결과를 알아보기 위하여, 트리판블루 염색(trypan blue staining), 댑 염색(DAB staining)을 수행하였다. 도 13에서와 같이 CaMBL1의 발현이 억제된 식물에서는 고추 세균성점무늬병의 병원성균주 Ds1을 접종한 후 병의 발생이 더 심해져서 병감수성이 증대됨을 알 수 있으며, 비병원성 균주인 Bv5-4a를 접종한 후에는 건전식물에 비하여 트리판블루 염색 결과 과민성 세포사멸이 감소되었고 댑 염색결과 활성산소가 감소되는 것이 관찰되었다.

[단계 3]

CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에서 병저항성 검정을 위하여 건전식물과 CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에 고추 세균성 점무늬병의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주인 Bv5-4a를 접종한 후, 0일, 3일에 잎을 수거하여 식물잎의 1 cm²세균수를 측정한 후 그 결과를 도 14에 나타내었다.

실험결과 CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에서 건전식물에 비하여 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주인 Bv5-4a 모두에서 감수성이 증대되고 있고, 특히 병저항성 관련 유전자의 발현이 줄어들어 CaMBL1 유전자가 병저항성에 관여함을 알 수 있었다(도 15 참조).

[단계 4]

CaMBL1의 발현 억제가 식물체에서 살리실산의 생성에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 살리실산을 정량하였다. 도 17과 같이 건전식물과 CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에 고추 세균성 점무늬병의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주인 Bv5-4a를 접종한 후, 접종 24, 48시간 후의 식물을 수거하여 정량하였다. 정량 결과 유리 살리실산과 총 살리실산 모두 CaMBL1의 발현이 억제된 식물체에서 건전식물에 비하여 유리살리실산과 총살리실산 모두 감소하는 것을 관찰하였고 이를 통하여 CaMBL1 유전자가 병저항성에 관여함을 알 수 있었다.

[실시예 9] CaMBL1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaMBL1 유전 자의 과다발현에 의한 병 저항성의 증가

식물체에서 CaMBL1 유전자의 과다발현 시 다른 병 발생과 관련된 유전자들의 유도여부 및 병에 대한 저항성의 증가 여부에 대하여 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaMBL1 유전자를 Stratagene에서 제공하는 pBIN3S 벡터에 도입시켜 pBIN35S::CaMBL1을 제조한 후 이렇게 재조된 재조합 벡터인 pBIN35S::CaMBL1를 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 통하여 애기장대 식물에 도입함으로써 형질전환 시켜서 CaMBL1 유전자의 과다발현을 유도시킨 후 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

CaMBL1 유전자가 과다발현된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 증가하였는지의 여부를 알아보기 위하여, 먼저 상기 CaMBL1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에서 CaMBL1의 발현을 관찰하였으며 그 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에서 #2, #4, #5는 사용된 형질전환 식물의 계통번호를 나타내고 실험결과 애기장대 식물에서 CaMBL1이 과발현됨을 관찰할 수 있었다.

[단계 2]

상기와 같이 CaMBL1이 과다발현된 식물에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알 피엠원)균주를 10⁵ cfu/ml 농도로 접종하고 식물체의 변화를 관찰하였다(도 19). 또한 CaMBL1 유전자가 과다발현된 식물체에서 저항성 반응이 나타나는 이유를 알아보기 위해 트리판블루 염색(trypan blue staining), 댑 염색(DAB staining)을 수행하였다. 그 결과 도 20 및 도 21에 나타난 바와 같이 CaMBL1이 과다발현된 식물체에서 야생형에 비하여 세균성 병에 대하여 저항성 증가를 나타내고 있음이 관찰되었고, 특히 도 21에서는 트리판 블루 염색결과와 댑염색 결과를 통하여 CaMBL1 유전자가 과다발현된 식물에서 저항성 식물에서 관찰되는 세포사멸반응과 퍼옥시데이즈 활성에 의한 활성 산소가 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.

[단계 3]

CaMBL1이 과다발현된 식물에 슈도모나스 시링게 페소바 토마토 DC3000과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원) 균주를 접종하고 식물체의 저항성의 검정을 수행하였다. 접종 후 0일과 3일에 잎을 수거하여 식물잎의 1 cm²세균수를 측정한 후 그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20에서와 같이 병원성 균주와 비병원성 균주 모두에서 CaMBL1 유전자가 과다발현된 식물에서 야생형 식물과 비교해서 병원세균의 생장이 유의성 있게 감소하여 병 저항성을 가지고 있는 것으로 관찰되었다.

[실시예 10] 알타나리아 브라시시콜라 ( Alternaria brassicicola )를 접종한 후 에 CaMBL1 유전자의 과다발현된 식물 및 gp1-1과 gp1-2 식물에서 병 저항성의 변화

CaMBL1이 과발현된 애기장대 식물체와 CaMBL1 오솔로그(orthologs)인 애기장대 At1g 78830 유전자의 발현이 불능화(knock out)되어 있는 식물(gp1-1과 gp1-2 계통)인 애기장대에 알타나리아 브라시시콜라 (Alternaria brassicicola)를 접종한 후 시험을 수행하였다. 보다 상세하게는 CaMBL1이 과발현된 식물과 gp1-1과 gp1-2 식물에 알타나리아 브라시시콜라 (Alternaria brassicicola)를 5×10⁴mL^-1의 농도로 애기장대의 잎에 10μｌ씩 적하(dropping)해 주었다. 접종한 식물은 24℃에서 습실처리하였다.

[단계 1]

각각의 식물체에서 알타나리아 브라시시콜라 (Alternaria brassicicola)에 대한 저항성의 여부를 관찰하기 위하여 접종 후 병반관찰 및 트리판 블루 염색 및 댑 염색을 수행하였다. 도 22와 같이 접종 후 5일 째 잎을 관찰하였을 때 CaMBL1이 과다발현된 식물에서 야생형에 비하여 병반의 크기는 큰 차이는 없었으나 gp1-1과 gp1-2 식물에서는 감수성이 나타남을 알 수 있었다. 또한 이를 트리판 블루 염색을 수행해 본 결과, 도 22와 같이 gp1-1 식물에서 활발한 균사 생장이 관찰되었다.

[단계 2]

각각의 식물체에서 알타나리아 브라시시콜라 (Alternaria brassicicola) 접종 후 병 저항성을 검정하기 위하여 접종 후 병반의 크기를 측정하였다.

도 23에서의 결과와 같이 CaMBL1이 과다발현된 식물에서는 병반의 크기에서 뚜렷한 저항성반응을 보이고 있으나 gp1-1 식물에서는 병반의 크기가 증가되는 것이 관찰되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종(Capsicum annuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 만노스바인딩렉틴1(CaMBL1) 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.

도 2는 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a을 접종하였을 때 접종되지 않은 고추잎과 접종된 고추잎에서의 CaMBL1 유전자 및 단백질의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다.

도 3은 고추 녹광 품종에 살리실산(Salicylic acid)을 처리한 후 시간의 경과에 따른 CaMBL1 유전자 및 단백질의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다.

도 4는 고추 녹광 품종에 메틸자스모네이트 (methyl jasmonate)를 처리한 후 시간의 경과에 따른 CaMBL1 유전자 및 단백질의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다.

도 5는 CaMBL1 단백질 순화 후의 만노스바인딩어세이의 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 CaMBL1의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein)을 이용한 양파식물에서의 세포내 위치확인(subcellular localization) 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 고추 녹광 품종에 CaMBL1의 일시적 발현(transient assay)을 수행한 후의 세포사멸 결과를 나타낸 사진이다.

도 8은 고추 녹광 품종에 CaMBL1의 일시적 발현(transient assay)을 수행한 후 CaMBL1의 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 9는 고추 녹광 품종에 CaMBL1의 일시적 발현(transient assay)을 수행한 후 과민성세포사멸(트리판블루염색)에 대한 결과를 나타낸 사진이다.

도 10은 고추 녹광 품종에 CaMBL1의 일시적 발현(transient assay)을 수행한 후 CaMBL1의 전해질 전도도(이온유출)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

도 11은 고추 녹광 품종에 CaMBL1의 일시적 발현(transient assay)을 수행한 후 병 방어(저항성) 관련 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 12는 고추 녹광 품종에 CaMBL1의 일시적 발현(transient assay)을 수행한 후 살리실산의 변화 결과를 나타낸 도면이다.

도 13은 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)의 방법을 이용하여 CaMBL1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, 병 감수성이 증대되어 감수성 병징 확대, 활성산소감소(DAB 염색), 과민성세포사멸(트리판블루 염색) 감소에 대한 결과를 나타낸 사진이다.

도 14는 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)의 방법을 이용하여 CaMBL1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 세균생장증대에 대한 검정결과를 나타낸 도면이다.

도 15는 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 이용하여 CaMBL1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 고추병 방어(저항성) 관련 유전자 발현의 변화 패턴에 대한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16은 고추 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)의 방법을 이용하여 CaMBL1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 CaMBL1의 발현 감소를 단백질 수준에서 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.

도 17은 고추 바이러스-유도 유전자침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)의 방법을 이용하여 CaMBL1 유전자 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때 살리실산의 감소 결과를 나타낸 도면이다.

도 18은 고추 CaMBL1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 CaMBL1 유전자의 과다발현에 대한 결과 및 애기장대의 저항성 관련 유전자의 발현에 대한 결과를 나타낸 도면이다.

도 19는 고추 CaMBL1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 이 병에 대해 저항성을 보이고 있는 애기장대 잎의 사진이다.

도 20은 고추 CaMBL1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 세균생장 감소로 병저항성 발현결과를 나타낸 도면이다.

도 21은 고추 CaMBL1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 세균성 병원균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)과 비병원성 균주인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (에이브이알알피엠원)을 접종하였을 때 병저항성을 보이는 식물세포에서 활성 산소(DAB 염색) 및 과민성 세포사멸(트리판 블루 염색)의 증가에 대한 결과를 나타낸 사진이다.

도 22는 CaMBL1이 과발현된 애기장대 식물체와 CaMBL1 오솔로그(orthologs)인 애기장대 At1g 78830 유전자의 발현이 불능화(knock out)되어 있는 식물(gp1-1과 gp1-2 계통)인 애기장대 돌연변이 식물체에 병원진균인 알타나리아 브라시시콜라 (Alternaria brassicicola)를 접종한 후 병든 식물잎의 병반사진과 트리판블루염색에 대한 결과를 나타낸 사진이다.

도 23은 CaMBL1이 과발현된 애기장대 식물체와 CaMBL1 오솔로그(orthologs) 인 애기장대 At1g 78830 유전자의 발현이 불능화(knock out)되어 있는 식물(gp1-1과 gp1-2 계통)인 애기장대 돌연변이 식물체에 병원진균인 알타나리아 브라시시콜라 (Alternaria brassicicola)를 접종한 후 병반크기의 변화 결과를 나타낸 도면이다.

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Pepper defense-related, mannose-binding lectin (CaMBL1) gene and disease resistant plants using the same <130> P11-090630-01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1160 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. cv. Nockwang <400> 1 gaaacatgtc tccttcatgg actactacac tttttgtctc tctatttctt ttctcccaaa 60 tattttcttg cattgcccaa gttccagctg aaaacacctt caaattcgtc aacgaaggcg 120 aattaggacc ttatattgtc gaatacagcg ctgattatcg cgttcttcgt atcgccacta 180 ctccgtttca gctctgtttc tacaacacaa cacctaacgc atggacacta gcgttgcgaa 240 tgggcaccgt ccgttctgaa tcactcatgc gttgggtgtg ggaagctaac aggggaaacc 300 ccgttaaaga aaacgccact ttcactttcg ggacagatgg aaatctcgta ttggctgatg 360 ccgacggtcg aattgcatgg caaacaaaca cggccaataa gggcgtgaca gggttcaagt 420 tgttgcctaa tggtaacatg gtgctacatg actccaaggg aaaattcctc tggcagagtt 480 tcaactatcc cacggatact ttactagtgg gccaaacact acgtttgtcc agcccgaata 540 agctcgtgag ccgggcttcg gtgaaaaaca atgcgaacgg gccttatagc ttggtggtgc 600 agccaagatt gtttggtgtc tacaagggga ctaagctaga cgtcgaatta gcttggttca 660 attatggtaa tagcactttg gaatcagtaa aattgaatgc tgggaatcaa aggctgaaat 720 tggattatag attggcaaaa tcaacaacga gaagttcaca tgttatggct tttgtcaatt 780 acaacacaac attgacatat cttagactag aaattgatgg aaatctcaag gcctacactt 840 ttgttcgaga tgaagaagca gatgaattcc gttggaaggt aacttacagc aggatttaaa 900 aaatgttttt cgttaaaagt ttgtgtacac actattatct cagactccga cgttacacga 960 acatgttatt gttgtaagga ttagtgtcca gtataataag tggataaagc gagtgggtcc 1020 acagctagtc caataaatta gttgtaattc ctattttatc ttctgttttc taaagttgta 1080 ttttggttga attaagaatg tattttattt tgatattacc agcattattt ttggattgaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1160 <210> 2 <211> 297 <212> PRT <213> Capsicum annuum L. cv. Nockwang <400> 2 Met Ser Pro Ser Trp Thr Thr Thr Leu Phe Val Ser Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Ser Gln Ile Phe Ser Cys Ile Ala Gln Val Pro Ala Glu Asn Thr Phe 20 25 30 Lys Phe Val Asn Glu Gly Glu Leu Gly Pro Tyr Ile Val Glu Tyr Ser 35 40 45 Ala Asp Tyr Arg Val Leu Arg Ile Ala Thr Thr Pro Phe Gln Leu Cys 50 55 60 Phe Tyr Asn Thr Thr Pro Asn Ala Trp Thr Leu Ala Leu Arg Met Gly 65 70 75 80 Thr Val Arg Ser Glu Ser Leu Met Arg Trp Val Trp Glu Ala Asn Arg 85 90 95 Gly Asn Pro Val Lys Glu Asn Ala Thr Phe Thr Phe Gly Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Leu Val Leu Ala Asp Ala Asp Gly Arg Ile Ala Trp Gln Thr Asn 115 120 125 Thr Ala Asn Lys Gly Val Thr Gly Phe Lys Leu Leu Pro Asn Gly Asn 130 135 140 Met Val Leu His Asp Ser Lys Gly Lys Phe Leu Trp Gln Ser Phe Asn 145 150 155 160 Tyr Pro Thr Asp Thr Leu Leu Val Gly Gln Thr Leu Arg Leu Ser Ser 165 170 175 Pro Asn Lys Leu Val Ser Arg Ala Ser Val Lys Asn Asn Ala Asn Gly 180 185 190 Pro Tyr Ser Leu Val Val Gln Pro Arg Leu Phe Gly Val Tyr Lys Gly 195 200 205 Thr Lys Leu Asp Val Glu Leu Ala Trp Phe Asn Tyr Gly Asn Ser Thr 210 215 220 Leu Glu Ser Val Lys Leu Asn Ala Gly Asn Gln Arg Leu Lys Leu Asp 225 230 235 240 Tyr Arg Leu Ala Lys Ser Thr Thr Arg Ser Ser His Val Met Ala Phe 245 250 255 Val Asn Tyr Asn Thr Thr Leu Thr Tyr Leu Arg Leu Glu Ile Asp Gly 260 265 270 Asn Leu Lys Ala Tyr Thr Phe Val Arg Asp Glu Glu Ala Asp Glu Phe 275 280 285 Arg Trp Lys Val Thr Tyr Ser Arg Ile 290 295

Claims

식물병 방어 관련 유전자로서 고추 유래 만노스바인딩렉틴을 코딩하는 하기 (a) 또는 (b)의 분리된 유전자(CaMBL1):

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자;

(b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaMBL1).
제1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제1항 기재의 유전자를 pBIN35S에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 pBIN35S::CaMBL1.
제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
식물체로부터 mRNA 분리하여 제1항 기재의 CaMBL1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제6항에 있어서, 상기 식물체는 고추 세균성 점무늬병의 병원성 또는 비병원성 세균을 접종한 식물체인 것을 특징으로 하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제6항에 있어서, 상기 식물체는 살리실산 (Salicylic acid) 또는 메틸자스모네이트 (Methyl jasmonate)를 처리한 식물체인 것을 특징으로 하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제2항 기재의 CaMBL1 단백질의 항체를 프로브로 이용하여 CaMBL1 단백질 발현여부를 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제1항 기재의 CaMBL1 유전자를 바이러스-유도 유전자 침묵(virus-induced gene silencing, VIGS)을 위한 벡터인 TRV2(Tobacco Rattle Virus 2) 벡터에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 TRV2:: CaMBL1.