KR100834252B1 - 고추 저항성 관련 유전자 씨에이엠엔알１ 및 이를 이용한형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 세균성 점무늬병에 대한 신규 저항성 유전자인 고추 CaMNR1 유전자, 및 상기 유전자를 이용한 병원균 및 환경스트레스 저항성 형질전환식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 식물병저항성과 환경스트레스 저항성 탐색방법도 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체병원균의 방어반응의 표지 및 환경 스트레스 내성 식물의 분자육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있고, 식물병 저항성 등의 탐색을 촉진시킬 수 있다.

고추, 식물병, 저항성, 세균성 점무늬병, CaMNR1

Description

고추 저항성 관련 유전자 씨에이엠엔알１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Pepper Pathogenesis-related Gene CaMNR1 and transgenic plants using the same}

도 1은 고추 한별품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,

도 2는 고추 한별품종의 각 기관에서 CaMNR1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,

도 3은 고추 한별품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaMNR1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 4는 살리실산(Salicylic acid)을 처리한 후 시간별로 CaMNR1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 5는 에틸렌을 처리한 후 시간별로 CaMNR1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 6은 엡시스산(abscisic acid)을 처리한 후 시간별로 CaMNR1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 7은 자스몬산(Jasmonic acid)을 처리한 후 시간별로 CaMNR1 유전자의 발 현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 8은 건조스트레스를 처리한 후 시간별로 CaMNR1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고,

도 9는 고추 식물에서 바이러스 벡터 유래 유전자 침묵(virus-induced gene silencing; 이하, 'VIGS'라고 함)을 수행하기 위해 CaMNR1 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pTRV::CaMNR1의 배열지도이고,

도 10은 VIGS를 통해 CaMNR1 유전자의 발현이 저해된 고추 식물에서 병원성의 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 접종 후 감수성이 증진된 표현형을 관찰한 결과를 나타낸 사진이고,

도 11은 VIGS를 통해 CaMNR1 유전자의 발현이 저해된 고추 식물에서 병원성 세균성 점무늬병균의 생장을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 12는 VIGS를 통해 CaMNR1 유전자의 발현이 저해된 고추 식물에서 비병원성의 고추 세균성 점무늬병균 접종 후 감수성이 증진된 식물의 표현형을 24시간 후 관찰한 결과를 나타낸 사진이고,

도 13은 VIGS를 통해 CaMNR1 유전자의 발현이 저해된 고추 식물에서 비병원성 세균성 점무늬병균의 생장을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 14는 VIGS를 통해 CaMNR1 유전자의 발현이 저해된 고추 식물에서 병원성 또는 비병원성 세균성 점무늬병균 접종 후 병방어관련 유전자들의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이고(H: healthy, 건전; C: compatible, 병원성 균주접종; I: incompatible, 비병원성 균주접종; CABPR1: Capsicum annuum basic pathogenesis-related protein 1; CAPR4: Capsicum annuum pathogenesis-related protein 4; CAPR10: Capsicum annuum pathogenesis-related protein 10; CAPOA1: Capsicum annuum ascorbate peroxidase 1; CADEF1: Capsicum annuum defensin-like protein 1; CAOSM1: Capsicum annuum osmotin-like protein 1; CASAR82: Capsicum annuum SAR8.2 protein),

도 15는 CaMNR1 유전자를 과발현(overexpression)하는 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 식물체를 만들기 위한 재조합 벡터 pBIN35S::CaMNR1의 배열지도이고,

도 16은 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 CaMNR1 유전자가 과다발현 되고, 이로 인해 애기장대의 병저항성 관련 유전자인 AtPR1 (Arabidopsis thaliana pathogenesis-realted protein 1) 및 AtPDF1.2 (Arabidopsis thaliana defensin-liken protein) 유전자의 발현이 증가된 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이고,

도 17은 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 흑반병원균인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000) 균주에 대한 병저항성이 나타난 식물체의 사진이고,

도 18은 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 흑반병원균인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000의 병원성 균주에 대한 병원균 생장을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 19는 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 흑반병원균인 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000의 비병원성 균주의 생장을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 20은 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 노균병 (downy mildew, Hyaloperonospora parasitica)에 대한 병저항성이 나타난 식물체의 사진이고,

도 21은 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 노균병의 균사가 식물체 내에서 생장하는 것을 트리판블루(trypan blue) 염색하여 병저항성을 확인한 사진이고,

도 22는 CaMNR1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 노균병에 대한 병저항성 검정 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 분리된 신규 저항성 관련 유전자인 CaMNR1 유전자, 이를 이용한 식물에서의 생물적 (biotic) 그리고 비생물적 (abiotic) 스트레스 탐색방법과 병원균 및 환경스트레스 저항성 형질전환 식물체 제작에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 고추 한별 품종으로부터 신규 저항성 관련 유전자인 CaMNR1 유전자를 분리하여 해독(Sequencing)하고, 여기에서 얻어진 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제공함으로써, 생물 적/화학적/물리적 저항성 유도 처리 시 유도저항성의 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하며, 더 나아가 이를 이용한 병원균에 대해 저항성을 갖는 형질전환 식물체 제작에 관한 것이다.

담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리 식생활에 가장 많이 사용되는 조미 채소류로서 양념류, 김치류, 고추장 등의 가공식품에 널리 사용되고 있으며 연간 소비량은 20만톤 규모이며 시장규모는 1조원으로 추정되고 있고, 전체농가의 65%인 90만호가 고추생산을 통한 농가소득에 의존하고 있어 미곡다음으로 주요한 경제작물이다.

고추 식물에서 발생하여 심각한 피해를 일으키는 병으로는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 다양하게 보고되어 있는데, 그중 치명적인 것으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성 점무늬병 등을 들 수 있다. 이중 고추 세균성 점무늬병은 고추의 잎, 줄기, 과실에 반점을 형성하여 낙엽을 유발하고 수확량을 감소시키는 병으로서, 통상 더뎅이병, 반점세균병 등으로 불리우며, 우리나라에서는 전국적으로 발생하고 때때로 생육기에 비가 많이 오고 다습한 날이 계속될 경우 다발생하여 큰 피해를 가져오는 것으로 보고되어있다.

이러한 고추 세균성 점무늬병을 방제하기 위해 지금까지는 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔는데, 농약의 과다한 사용은 그 독성으로 인한 생태계의 파괴와 토양·수질 오염을 일으켜 인류의 생존을 위협하기까지 이르렀다. 이러한 이유에서 전 세계적으로 농약사용의 규제가 증가되고 있으며, 특히 우리나라는 1996년 OECD에 가입한 이후로 농약 사용의 규제와 관리에 대한 관심이 지속적 으로 증가되고 있는 상황이다.

따라서 앞으로는, 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용함으로써 농약의 사용을 줄이는 방법을 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있으며, 이를 위해 병에 대해 저항성을 가지고 있는 저항성 품종의 개량 및 육종 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 바람직하다 하겠다. 이미 미국, 유럽, 일본을 포함한 여러 선진 국가에서는 저항성 형질전환 식물 개발 등을 통한 식물병 방제법 개발에 주력하고 있으며, 멀지 않은 미래에 이를 통한 식량난의 해결이 가능할 것으로 예측되고 있다.

사실, 그동안 농약을 사용하지 않고 병해충에 의한 피해를 감소시키기 위한 노력의 일환으로 고추를 비롯한 다양한 작물 및 병원균을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구가 역시 고추를 비롯한 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어 왔다.

일단 식물 병에 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적 반응과 불친화적 반응으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.

불친화적 반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 캘러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 피토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병생성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불리는 방어단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.

이러한 방어 기작들은 병원균이 침입하는 경우뿐만 아니라, 살리실산, 에틸렌, 엡시스산이나 자스몬산 등 인위적인 화학적 자극에 의해서도 나타나며, 물리적 상처나 염도, 온도 등의 환경적 스트레스에 의해서도 나타난다고 보고되고 있다.

이렇게 인위적인 생물학적/물리적/환경적 스트레스를 줌으로써 유도되는 저항성을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이러한 저항성 유도 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다.

이것은, 이와 같은 유도저항성이 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있으며 실용적인 가치가 있을 뿐만 아니라, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하도록 작동하는 식물보호 화학물질을 개발하는 데에 이용될 수 있기 때문이다.

근래, 이러한 유도저항성 연구는 유전공학적 기술의 개입에 의해 훨씬 더 그 발전 속도가 빨라졌는데, 종래에는 저항성 유도 처리를 한 후 저항성 발현 여부를 확인하기 위해 식물을 재배하고 병을 접종한 후 저항성이 나타나는지의 여부를 확인해야 했던 반면, 지금은 유도하고자 하는 저항성 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 밝혀내고 이를 이용하여 실험실 수준에서 저항성 발현 여부를 확인할 수 있게 됨으로써, 포장(Field)에서의 작물재배, 병 접종, 병반 출현 여부 확인 등의 절차를 생략할 수 있게 되었기 때문이다.

이것은 전체적인 저항성 유도 시험의 주기를 단축함으로써 종래에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 시험을 할 수 있게 되었음을 의미하며, 결국 더 우수한 저항성 품종을 개발할 수 있게 되었음을 의미한다.

그러나 이것은 유도하고자 하는 유전자 서열이 밝혀지고 이에 따라 해당 유전자의 클론이 확보되어 있다는 전제 하에 가능한 것으로서, 이러한 의미에서, 식물 병에 저항성을 나타내는 다양한 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보를 축적함으로써, 이를 이용한 식물병 저항성 탐색을 촉진하고 나아가 식물병 저항성 품종의 개발을 촉진시키는 것은 시급한 당면 과제라고 할 수 있다.

나아가 벼, 애기장대 등 몇몇 식물의 경우, 게놈 지도가 완성됨에 따라서 병 및 환경스트레스 저항성에 관련된 유전자 정보가 증가되는 추세에 있지만, 고추 식물에서는 아직 저항성 관련 유전자와 이들의 기능에 대한 정보가 미비한 실정이다.

본 발명은 이와 같은 종래기술 상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 CaMNR1 단백질을 코딩하는 CaMNR1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 CaMNR1 유전자를 이용하여 병저항성 및 환경스트레스 저항성 존재 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다. 더 나아가, 이 유전자를 이용하여 식물병 또는 환경스트레스 저항성 형질전환 식물체를 제작하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은, 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 mRNA를 분리한 다음 cDNA 라이브러리를 제조한 후 이를 스크린하여 신규 저항성 관련 유전자 CaMNR1의 유전자를 선발한 후 그 염기서열을 결정하고, 고추에 병원균 또는 화학물질을 접종 또는 처리하여 상기 CaMNR1 유전자의 발현 여부를 조사함으로써 달성하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 식물병 저항성 단백질 CaMNR1 코딩 유전자 CaMNR1 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 식물병 저항성 단백질 CaMNR1을 제공한다. 또한, 본 발명은 이 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터 및 형질전환 식물을 제공한다.

나아가 본 발명은 병원균, 화학물질 및 환경스트레스 중 어느 하나를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이론막(Hybond N+)으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 제1항 기재의 CaMNR1 유전자 프로브와 반응시켜 CaMNR1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 또는 CaMNR1 유전자의 발현이 억제된 고 추 식물에서 병 저항성이 감소된 것을 확인함을 포함하여 구성되는, 식물체의 병저항성 및 환경스트레스 탐색방법을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 저항성 반응인 과민성 반응을 나타내는 한별고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병저항성에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 수득하고, 이 클론 중 CaMNR1 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(Sequencing)함으로써, CaMNR1로 명명하고 서열번호 1을 부여하였다(도 1 참조). 또한 본 발명은 본 발명에 의한 상기 CaMNR1 유전자의 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).

고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)의 CaMNR1 유전자는 고추 세균성 점무늬병에 대한 방어기작을 가지는 병생성 관련 단백질(PR protein)의 일종인 CaMNR1 단백질을 코딩하는 유전자로써, 고추 식물에서 세균성 점무늬병에 대한 저항성 반응 동안 특이적으로 그 발현량이 급격히 증가되어 유지되는 것을 관찰 할 수 있었고 이는 고추 식물에서 처음으로 발견된 것이다.

본 발명에 의한 CaMNR1 유전자는 박하 (Mentha piperita) 식물에서 네오멘톨(neomenthol)과 멘톨(menthol)을 생성하는데 관련된 유전자인 멘톤:(+)-(3S)-네오멘톨 리덕타제(menthone:(+)-(3S)-neomenthol reductase; MNR) 유전자와 56%의 상동성을 나타냄으로써 신규인 것으로 밝혀졌다.

다음에, 본 발명은, 병원성 균주 또는 비병원성 균주를 접종한 고추 개체에서 선정된 기관에 대해 상기 CaMNR1 단백질 유전자를 프로브로 이용하여 CaMNR1 단백질 발현 여부를 확인하는 것으로 이루어지는, 식물병 및 환경스트레스 저항성 탐색방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

본 발명에 의한 CaMNR1 유전자가 다양한 식물병원균, 화학물질 또는 환경스트레스에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 내지 도 8 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자는 식물체의 저항성 탐색방법에 이용할 수 있다.

보다 구체적으로는 본 발명에 의한 식물체 병저항성 및 환경스트레스 탐색방법은 병원균, 화학물질 또는 환경스트레스 등을 접종 또는 처리한 식물체로부터 RNA를 분리하고 전기영동시키고 나일론막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CaMNR1 유전자 프로브와 반응시켜 CaMNR1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성된다.

또한, 본 발명은, 화학물질, 물리적 상처, 환경적 스트레스 등 병원성 세균 이 아닌 비생물적 유도방법을 식물체에 적용하고, 이에 대하여 상기 저항성 탐색방법을 이용하여 CaMNR1 단백질 발현 여부를 확인함으로써, 더 용이하고 시간을 절약할 수 있는 새로운 저항성 유도방법을 제공할 수도 있다.

본 발병의 새로운 저항성 관련 유전자인 씨에이엠엔알1의 경우 고추 식물에서 바이러스 벡터 유도 유전자 침묵(Virus-induced gene silencing; VIGS; 참고문헌 : Liu et al., 2002 Plant Journal 31: 777-786) 실험을 통해 CaMNR1 유전자의 발현을 특이적으로 억제한 결과 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬 병원균에 대한 저항성이 감소되고 감수성이 증가되는 것을 확인하고, 이 과정 중에 고추의 저항성 관련 유전자인 CABPR1(참고문헌: Kim and Hwang, 2000. Physiologia Plantarum 108: 51-56), CAPR4(참고문헌: Shin et al., 2001. Plant Science 161: 727-737), CAPR10(참고문헌: Shin et al., 2001. Plant Science 161: 727-737), CADEF1(참고문헌: Do et al., 2004. Plant Science 166: 1297-1305), CASAR8.2(참고문헌: Lee and Hwang, 2003. Planta 216: 387-396)의 발현이 감소되어 있는 것을 확인함으로써 CaMNR1 유전자의 발현이 고추식물의 세균성 점무늬병에 대한 저항성 유도에 필수적임을 확인할 수 있었다(도 9 내지 도 14 참조).

또한, 본 발명은 상기와 같이 염기서열이 제공된 CaMNR1 유전자를 이용하여 재조합 벡터를 제조하여(도 15 참조) 식물체를 형질전환시켜, 병방어반응 및 환경스트레스 내성 증가를 통해 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다.

보다 구체적으로는 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자를 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 식물에 전이시켜 CaMNR1 과다발현 형질전환식물을 제조하여 식물병 저항성 생성여부를 확인함으로써(도 16 내지 도 22 참조), 새로운 저항성 형질전환 식물체의 제작에 기초가 될 것이다.

특히 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자의 과발현만으로 식물체 내에서 저항성 관련 유전자인 AtPR1(NCBI accession number: At2g14610) 및 AtPDF1.2(NCBI accession number: At5g44420)의 발현을 유도하여 식물체의 병저항성을 증진시킬 수 있었으며(도 16 참조), 나아가 세균성 병원균인 슈도모나스 시링게 (Pseudomonas syringae)뿐 아니라 난균류인 하이알로페로노스포라 파라시티카 (Hyaloperonospora parasitica)에 대한 저항성을 확인할 수 있었다(도 20 내지 도 22 참조).

이하, 실시예들을 통해 본 발명을 더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

고추 세균성 점무늬병에 대한 병생성 관련 단백질(PR protein) 중 하나인 CaMNR1 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 한별품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)에 고추 세균성 점무늬병원균의 비병원성균주인 BV5-4a (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain BV5-4a)) 를 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 수거된 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction)증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

다음에, 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이론막에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 그 기능이 밝혀지지 않은 유전자임을 확인하고 CaMNR1 유전자로 명명하였다.

이 유전자에서 유추한 아미노산 서열을 기능이 밝혀져 있지 않은 단백질의 아미노산 서열과 비교한 결과, 박하 (Mentha piperita) 식물에서 네오멘톨(neomenthol)과 멘톨(menthol)을 생성하는데 관련된 유전자인 menthone:(+)-(3S)-neomenthol reductase (MNR) 유전자와 56%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것임을 알 수 있었다.

확인된 CaMNR1 유전자의 서열과 그로부터 추론된 아미노산 서열을 도 1에 나타내고, 각각 염기서열 1 및 염기서열 2로 표시하여 서열목록으로 제출하였다.

[ 실시예 2] 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자의 발현 탐색 방법

상기 실시예 1에서 수득한 CaMNR1 유전자를 이용하여 식물체의 저항성을 탐색하기 위해 다음과 같이 시험하였다.

[실험예 1]

먼저 건전한 식물체에서 CaMNR1 유전자의 발현을 살펴보기 위해 4엽기 고추식물체의 건전한 기관 (잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 푸른열매, 붉은열매)로부터 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CaMNR1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이렇게 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

이상의 실험결과를 도 2에 나타내었으며 CaMNR1 유전자는 꽃과 붉은열매에서 약한 발현을 보일뿐, 건전한 잎, 줄기, 뿌리, 푸른열매에서는 발현을 살펴볼 수 없었다.

[실험예 2]

고추 세균성 점무늬병균 중 식물체와 친화적 반응을 나타내는 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 4엽기 고추식물체 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이션(Infiltration)하여 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리 하였다.

접종 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CaMNR1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이렇게 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이론막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

이와 같이 고추 세균성 점무늬병균의 병원성균주 접종 후 나타나는 친화적 반응과 비병원성균주 접종 후 나타나는 불친화적 반응에서 CaMNR1 유전자의 발현 양상을 도 3에 나타내었다. 도 3에서 숫자는 접종한 후 고추잎 채취시까지의 경과시간을 나타낸다.

이상과 같은 시험 결과, 고추 세균성 점무늬병에 대한 고추식물의 저항성 반응은 병원성 균주와 비병원성 균주에 대하여 서로 대조적인 양상을 나타냈으며, 병원성 균주 즉, 친화적 반응에서는 CaMNR1 유전자의 발현이 매우 약하게 관찰되었고, 비병원성 균주 즉, 불친화적 반응에서는, 5시간부터 발현하여 25시간째까지 그 발현양이 증가 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.

[ 실시예 3] 화학적 유도체에 의한 본 발명에 의한 CaMNR1 유전자의 유도 발현

본 발명에 의한 CaMNR1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[실험예 1]

먼저, CaMNR1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 살리실산(Salicylic acid), 에틸렌(ethylene), 자스몬산(Jasmonic acid) 및 엡시스산(Abscisic acid)을 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다.

6엽기 고추식물 잎에 농도 5 mM의 살리실산, 100 μM의 자스몬산, 100 μM의 앱시스산 분무기로 고추잎의 앞뒷면에 뿌려 처리하였고, 이중 메틸 자스모네이트를 처리한 식물체는 비닐백으로 밀봉하였다. 에틸렌은 농도 5 μl/L로 하여 기체상태로 식물체가 있는 밀폐된 유리 용기에 주입하는 방법으로 처리하였다.

처리 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후 각각의 식물체에서 잎을 수거하였고, 대조구로 무처리한 식물체의 잎을 1, 20시간째에 함께 수거한 후, 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 이용하여 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다.

먼저, 추출된 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CaMNR1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (Dextran Sulfate)]에 첨가하고 65℃에서 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이때 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이트란막에 붙어있는 상보적 mRNA에 붙게 되며 이 나이론막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있다.

각각의 시험에서 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였으며, 대조구로서 어떤 물질도 처리하지 않은 건전잎을 사용하였다.

이상의 실험결과를 도 4, 5, 6, 7에 나타내었으며 CaMNR1 유전자는 살리실산, 에칠렌, 엡시스산에 의해 그 발현이 강하게 유도되었으며, 자스몬산을 처리한 경우는 10시간과 15시간에서 약하게 발현이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] 환경적 스트레스에 의한 CaMNR1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CaMNR1 유전자가 환경적 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

시험에서 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였으며, 대조구로서 어떤 스트레스도 처리하지 않은 건전잎을 사용하였다.

본 발명의 CaMNR1 유전자가 건조 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

건조 처리후 시간별 CaMNR1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물체 의 뿌리에서 흙을 제거하고, 각각 1, 5, 10, 15, 20, 25시간째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 실험예 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 건조 스트레스 처리 후 CaMNR1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

시험 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, CaMNR1 유전자는 잎에서 1시간부터 발현하여 25시간까지 그 발현량이 증가, 유지되었다.

[ 실시예 5] CaMNR1 유전자의 발현이 억제된 고추식물에서 병저항성의 감소

고추 식물에서 병 저항성 과정 중, CaMNR1 유전자의 기능을 분석하기 위해 유전자의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 방법인 VIGS(Liu et al., 2002 Plant Journal 31: 777-786)를 이용하여 CaMNR1 유전자의 발현을 억제시킴으로써 식물병 저항성 과정 중 그 기능을 분석하였다.

식물체에서의 CaMNR1 유전자 발현억제시 다른 병발생관련 유전자들의 유도 여부, 세균성 병에 대한 저항성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaMNR1 유전자를 pTRV 벡터(S.P. Dinesh-Kumar (Yale University) provided the pTRV1 and pTRV2 vector, 참고문헌: Liu et al., 2002 Plant Journal 31: 777-786)에 도입시켜 재조합벡터 pTRV::CaMNR1을 제조하고 그 배열지도를 도 9에 나타내었다.

이렇게 제조한 재조합벡터 pTRV::CaMNR1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101균주를 어린 고추 식물의 떡잎에 인필트레이션 (infiltration) 방법을 통해 접종한 뒤 4∼5주간 온실에서 키우며 CaMNR1 유전자 발현 억제를 유도하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

[실험예 1]

CaMNR1 유전자의 발현이 억제된 고추 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 감소하였는지의 여부를 알아보기 위하여, 상기 CaMNR1 유전자의 발현이 억제된 고추식물과 대조구로서 CaMNR1 유전자의 발현이 억제되지 않은 고추 식물체에 병원성 및 비병원성 고추 세균성 점무늬병원균을 접종하고 접종일과 1, 3, 5일 후에 잎을 수거하여 1그람당 세균수를 측정하여 그 결과를 도 10, 11, 12, 13에 나타내었다.

시험 결과, 0, 1, 3, 5일후 모든 샘플이 야생형에 비해 세균성 병에 대한 병저항성이 감소되는 것으로 나타났으며, 이는 CaMNR1 유전자의 발현이 고추 식물의 저항성 발현에 중요한 역할을 하고 있는 것을 나타낸다.

[실험예 2]

이때 고추 식물에서 저항성 관련 유전자로 알려진 CABPR1, CAPR4, CAPR10, CAPOA1, CADEF1, CAOSM1, CASAR8.2 유전자의 발현 정도를 알티-피시알(RT-PCR)을 통해 살펴본 결과를 도 14에 나타내었다. 이때 CaMNR1 유전자의 발현이 억제된 식물체에서 병원성 또는 비병원성 세균성 점무늬 병원균을 접종한 뒤 CABPR1, CAPR4, CAPR10, CADEF1, CASAR8.2 유전자의 발현 발현이 감소되는 것을 관찰하였고, 이는 CaMNR1 유전자의 발현 감소가 다른 저항성 관련 유전자들의 발현 감소로 이어지는 것을 나타낸다.

[ 실시예 6] CaMNR1 유전자 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaMNR1 유전자 과다 발현에 의한 식물체의 저항성 유도

식물체에서의 CaMNR1 유전자 과다발현시 다른 병발생 관련 유전자들의 유도 여부, 세균성 병에 대한 저항성의 증가 여부 및 환경스트레스에 대한 내성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaMNR1 유전자를 Stratagene에서 제공하는 pBIN35S 벡터에 도입시켜 재조합벡터 pBIN35S::CaMNR1을 제조하고 그 배열지도를 도 15에 나타내었다.

이렇게 제조한 재조합벡터 pBIN35S::CaMNR1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101균주를 꽃침지(floral dipping; Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journal) 방법을 이용하여 애기장대에 도입함으로써 CaMNR1 유전자를 과다발현시키고 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[실험예 1]

식물체에서의 CaMNR1 유전자 과다발현시 다른 병발생 관련 유전자의 발현 정도를 알티-피시알(RT-PCR)을 통해 살펴본 결과를 도 16에 나타내었다. CaMNR1 유전자가 과발현된 애기장대 식물에서는 저항성 관련 유전자인 AtPR1과 AtPDF1.2의 발현이 상당히 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]

CaMNR1 유전자가 과다발현된 형질전환식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 증가하였는지의 여부를 알아보기 위하여 상기 CaMNR1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에 병원성과 비병원성의 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 균주를 접종하고 접종일과 3일 후에 잎을 수거하여 1그람당 세균수를 측정하여 그 결과를 도 17, 18, 19에 나타내었다. 여기서 # 1, # 2, # 3은 시험에 사용된 형질전환식물의 샘플번호를 나타낸다.

시험 결과, 0, 1, 3, 5일후 모든 형질전환샘플이 야생형에 비해 세균성 병에 대한 병저항성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

[실험예 3]

CaMNR1 유전자가 과다발현된 형질전환식물체에서 또 다른 병원균인 하이알로페로노스포라 파라시티카 (Hyaloperonospora parasitica)에 대한 저항성 여부를 확인하기 위해, CaMNR1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에 병원성의 하이알로페로노스포라 파라시티카를 접종하고 7일후에 병반의 모습과 병발생수율을 도 20 및 도 22에 나타내었다.

시험결과 CaMNR1 유전자를 과발현시킨 모든 형질전환식물체가 야생형에 비해 노균병 (downy mildew) 대한 병저항성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

[실험예 4]

CaMNR1 유전자가 과다발현된 형질전환식물체에서 노균병에 대해 저항성 반응이 나타나는 이유를 알아보기 위해, 트리판블루 염색(trypan blue staining)을 수행하였다. 도 21에 나타난 것처럼 트리판블루 염색결과 CaMNR1 유전자가 과다발현된 형질전환식물체에서 노균병의 균사생장이 억제되어 있는 것을 관찰하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인, CaMNR1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 식물병저항성과 환경스트레스저항성 탐색방법을 제공할 뿐 아니라 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체 제작에 기여할 수 있게 된 것이다. 따라서 본 발명은 저항성 품종 개발을 촉진시킬 수 있는 효과가 있으므로 식물육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 분리된 서열번호 1의 염기서열을 갖는 식물병 저항성 단백질 유전자(CaMNR1).
2. 제1항 기재의 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 식물병 저항성 단백질(CaMNR1).
3. 제1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제1항 기재의 CaMNR1 유전자를 pBIN35S에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 pBIN35S::CaMNR1.
5. 제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 애기장대.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

Images