KR100719501B1

KR100719501B1 - 씨에이알에이브이1 유전자 및 이를 이용한 식물병저항성탐색방법

Info

Publication number: KR100719501B1
Application number: KR1020040004270A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 손기훈
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2004-01-20
Filing date: 2004-01-20
Publication date: 2007-05-17
Also published as: KR20050076330A

Abstract

본 발명은, 고추세균성점무늬병에 대한 신규 저항성유전자인 CARAV1 유전자 및 이의 저항성 탐색에의 이용방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 애기장대의 것과 57%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것으로 밝혀진 CARAV1 코팅 유전자의 염기/아미노산 서열; 및 세균, 화학물질 또는 환경적 스트레스를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CARAV1 유전자 프로브와 반응시켜 CARAV1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물체 병저항성의 탐색방법에 관한 것이다.

Description

씨에이알에이브이1 유전자 및 이를 이용한 식물병저항성 탐색방법 {CARAV1 Gene and Screening Method of Plant Disease Using It}

제1도는 고추 한별품종 (Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 CARAV1 유전자의 염기 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 한별 품종에 병원성의 고추 세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)과 비병원성 고추 세균성점무늬병균을 접종 하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제3도는 에틸렌을 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제4도는 메틸 자스모네이트를 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제5도는 살리실산를 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제6도는 비티에이치을 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제7도는 β-아미노부티르산을 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제8도는 과산화수소를 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제9도는 상처를 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제10도는 염화나트륨을 처리한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제11도는 저온처리를 한 후 시간별로 CARAV1 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.

제12도는 CARAV1 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pCARAV1의 개열지도이고,

제13도는 CARAV1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 병발생관련 유전자들의 발현 유도 결과를 나타낸 것이고,

제14도는 CARAV1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 세균성 병원균인 수도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 균주에 대한 병저항성 검정 결과를 나타낸 것이고,

제15도는 CARAV1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 애기장대 식물의 종자의 염화나트륨과 마니톨에 대한 내성 검정 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 고추세균성점무늬병에 대한 저항성유전자인 CARAV1 유전자 및 이를 이용한 고추세균성점무늬병 저항성 탐색방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)으로부터 신규 저항성 관련 유전자인 CARAV1 유전자를 분리하여 해독(Sequencing)함으로써 그 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하고, 이 유전자를 이용하여 생물적/화학적/물리적 저항성 유도 처리시 유도저항성의 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오래전부터 향신료 또는 양념으로 사용되어온 대표적인 작물로서, 그에 대한 병으로는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 고루 다양하게 보고되어 있는데, 그중 치명적인 것으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성 점무늬병 등을 들 수 있다.

이중 고추세균성점무늬병은 고추의 잎, 줄기, 과실에 반점을 형성하여 낙엽을 유발하고 수확량을 감소시키는 병으로서, 통상 더뎅이병, 반점세균병 등으로 불리우며, 고추가 우리나라의 재배작물에서 차지하는 비중을 볼 때 그 피해는 심각한 수준이라고 할 수 있다.

이러한 고추세균성점무늬병을 방제하기 위해 지금까지는 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔는데, 그 독성으로 인하여 병원균뿐만 아니라 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양과 수질을 오염시키는 폐해가 있어 왔다.

따라서, 앞으로는, 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용함으로써 농약의 사용을 가능한 줄이는 방법을 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있으며, 더 바람직하게는 병에 대해 저항성을 가지고 있는 저항성 품종의 개량 및 육종 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 좋다고 할 수 있다.

사실, 그동안 농약을 사용하지 않고 병해충에 의한 피해를 감소시키기 위한 노력의 일환으로 고추를 비롯한 다양한 작물 및 병원균을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 꾸준히 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작에 대한 연구가 역시 고추를 비롯한 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어 왔다.

일단 식물 병에 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적반응과 불친화적반응으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.

불친화적반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 켈러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽의 비후화 등의 반응을 나타내며, 피토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류 의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병생성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불리우는 방어단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.

이러한 방어 기작들은 병원균이 침입하는 경우뿐만 아니라, 에틸렌이나 메틸자스모네이트 등 인위적인 화학적 자극에 의해서도 나타나며, 물리적 상처나 염도, 온도 등의 환경적 스트레스에 의해서도 나타난다고 보고되고 있다.

이렇게 인위적인 생물학적/물리적/환경적 스트레스를 줌으로써 유도되는 저항성을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이러한 저항성 유도 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다.

이것은, 이와 같은 유도저항성이 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있으며 실용적인 가치가 있을 뿐만 아니라, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하도록 작동하는 식물보호 화학물질을 개발하는 데에 이용될 수 있기 때문이다.

근래, 이러한 유도저항성 연구는 유전공학적 기술의 개입에 의해 훨씬 더 그 발전 속도가 빨라졌는데, 종래에는 저항성 유도 처리를 한 후 저항성 발현 여부를 확인하기 위해 식물을 재배하고 병을 접종한 후 저항성이 나타나는지의 여부를 확인해야 했던 반면, 지금은 유도하고자 하는 저항성 관련 단백질을 코딩하는 유전자를 밝혀내고 이를 이용하여 실험실 수준에서 저항성 발현 여부를 확인할 수 있게 됨으로써, 포장(Field)에서의 작물재배, 병 접종, 병반 출현 여부 확인 등의 절차 를 생략할 수 있게 되었기 때문이다.

이것은 전체적인 저항성 유도 시험의 주기를 단축함으로써 종래에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 시험을 할 수 있게 되었음을 의미하며, 결국 더 우수한 저항성 품종을 개발할 수 있게 되었음을 의미한다.

그러나, 이것은 유도하고자 하는 유전자 서열이 밝혀지고 이에 따라 해당 유전자의 클론이 확보되어 있다는 전제하에 가능한 것으로서, 이러한 의미에서, 식물 병에 저항성을 나타내는 다양한 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보를 축적함으로써, 이를 이용한 식물병 저항성 탐색을 촉진하고 나아가 식물병 저항성 품종의 개발을 촉진시키는 것은 시급한 당면 과제라고 할 수 있다.

본 발명은 이와 같은 종래기술 상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추세균성점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 CARAV1 단백질을 코딩하는 CARAV1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 고추세균성점무늬병에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다.

이를 위한 본 발명은, 애기장대의 RAV1 유전자와 57% 등의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것으로 밝혀진 CARAV1 단백질 코딩 유전자 CARAV1의 염기/아미노산 서열; 및 세균, 화학물질 또는 환경적 스트레스를 접종 또는 처리한 고추 식물체로 부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CARAV1 유전자 프로브와 반응시켜 CARAV1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물체 병저항성의 탐색방법을 제공하는 것으로 이루어진다.

본 발명은, 고추세균성점무늬병에 대한 저항성유전자인 CARAV1 유전자 및 이의 저항성 탐색에의 이용방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 가진 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 분리한 신규 저항성 관련 유전자 CARAV1의 유전자/아미노산 서열 및 이 유전자를 이용하여 저항성 유도 처리시 유도저항성의 발현 여부를 탐색하는 방법에 관한 것이다.

고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)의 CARAV1 유전자는 고추세균성점무늬병에 대한 방어기작을 가지는 병생성 관련 단백질(PR protein)의 일종인 CARAV1 단백질을 코딩하는 유전자로서, CARAV1 단백질은 고추세균성점무늬병 이외에도 여러 가지 병원균에 대하여 저항성을 지니게 하는 작용을 하는 것으로 알려진, 분자량 43.382 kD의 단백질이다.

이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추세균성점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 저항성 반응인 과민성 반응을 나타내는 한별고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물에서 얻은 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브(Probe)를 만들고, 이 cDNA와 프로브를 이용 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하여 병저항성에 관련될 것으로 추정되는 유전자를 선발하여 클론을 수득하고, 이 클론중 CARAV1 유전자로 확인된 유전자의 염기서열을 해독(Sequencing)함으로써, CARAV1로 명명된 고추 한별품종의 CARAV1 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하는 것에 관한 것이다.

다음에, 본 발명은, 병원성 균주 또는 비병원성 균주를 접종한 고추 개체에서 선정된 기관에 대해 상기 CARAV1 단백질 유전자를 프로브로 이용하여 CARAV1 단백질 발현 여부를 확인하는 것으로 이루어지는, 저항성 탐색방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 물리적 상처, 환경적 스트레스 등 병원성 세균이 아닌 비생물적 유도방법을 식물체에 적용하고, 이에 대하여 상기 저항성 탐색방법을 이용하여 CARAV1 단백질 발현 여부를 확인함으로써, 더 용이하고 시간을 절약할 수 있는 새로운 저항성 유도방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

이하, 실시예로써 본 발명을 더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것을 뿐, 본 발명의 범위를 이에 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] CARAV1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

고추세균성점무늬병에 대한 병생성 관련 단백질(PR protein)중 하나인 CARAV1 단백질 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 한별품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)에 고추세균성점무늬병원균의 비병원성균주인 BV5-4a (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain BV5-4a)를 접종하고 18시간 동안 습실처리한 후 저항성 병반인 과민성반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

다음에, 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 제조하여 나이트란막에 일정하게 흡착시킨 후, 각각 고추세균성점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 고추식물의 잎과 접종하지 않은 건전한 고추식물의 잎에서 추출한 총 mRNA를 디옥시제닌(digoxygenin)으로 표지하여 프로브를 만든 다음, 디퍼런셜 하이브리다이제이션(differential hybridization)을 수행하였다.

하이브리다이제이션 결과 비병원성 균주 접종된 식물체의 mRNA 프로브에 대해서만 집중적으로 증폭되어 나타난 유전자를 병저항성에 관련된 유전자로 추정하고 클론을 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 그 5'-말단 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 CARAV1 단 백질 코딩 유전자를 확인하고 CARAV1 유전자로 명명하였다.

이 유전자에서 유추한 아미노산 서열을 애기장대에서 발견된 RAV1 단백질의 아미노산 서열과 비교한 결과, 57%의 상동성을 나타냄으로써 신규한 것임을 알 수 있었다.

확인된 CARAV1 유전자의 서열과 그로부터 추론된 아미노산 서열을 도 1에 나타내고 서열목록으로 제출하였다.

[실시예 2] CADEF1 유전자의 발현 탐색 방법

상기 실시예 1에서 수득한 CARAV1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 하기와 같이 시험하였다.

저항성 탐색방법을 구체적으로 세팅하여 제시하기 위하여, 가장 확실하게 저항성을 유발할 수 있을 것으로 생각되는 고추세균성점무늬병의 병원성 균주 및 비병원성 균주를 이용, 하기와 같이 노던블러팅(Northern Blotting) 시험을 수행하였다.

우선, 고추 세균성 점무늬병균 중 식물체와 친화적 반응을 나타내는 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 4엽기 고추식물체 1, 2엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이션(Infiltration)하여 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리하였다.

접종 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간 후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CARAV1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염(Dextran Sulfate)]에서 65℃로 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이렇게 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이트란막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되며 이 나이트란막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로, 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였다.

이와 같이 고추세균성점무늬병균의 병원성균주 접종 후 나타나는 친화적반응과 비병원성균주 접종 후 나타나는 불친화적반응에서 CARAV1 유전자의 발현 양상을 도 2에 나타내었다.

이상과 같은 시험 결과, 고추세균성점무늬병에 대한 고추식물의 저항성 반응은 병원성 균주와 비병원성 균주에 대하여 약간 다르게 나타났는데, 병원성 균주와 고추 식물체의 친화적반응에서, CARAV1 유전자는 균 접종후 30분째부터 발현하여 2시간 째에 그 양이 가장 많이 관찰되었으며 그 이후로는 감소하였고, 비병원성 균 주와의 불친화적 반응에서는, 30분째부터 발현하여 6시간째까지 그 양이 증가되고 그 이후 감소하는 경향을 나타내었다.

[실시예 3] 화학적 유도체에 의한 CARAV1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CARAV1 유전자가 통상 저항성 유도에 사용되는 화학적 유도체에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

먼저, CARAV1 유전자의 발현 유도에 유용한 유도체를 탐색하기 위하여, 식물병 저항성 발현의 유도에 관여한다고 알려진 화학물질들 중 에틸렌, 메틸 자스모네이트, 살리실산, 비티에이치, β-아미노부티르산, 과산화수소 및 엽산을 사용하여 저항성 유도 시험을 실시하였다.

6엽기 고추식물 잎에 농도 100 μM의 메틸 자스모네이트, 5mM의 살리실산, 20 μM의 비티에이치 CGA245704, 20mM의 β-아미노부티르산을 분무기로 고추잎의 앞뒷면에 뿌려 처리하였고, 이중 메틸 자스모네이트를 처리한 식물체는 비닐백으로 밀봉하였다. 엽산은 100 μM의 엽산 수용액에 식물체의 뿌리를 담그고 같은 수용액을 고추잎에 스프레이하는 방법으로 처리하였으며, 과산화수소수는 10mM의 과산화수소를 고추잎에 배큠인필트레이션(vacuum-infiltration)하는 방법으로 처리하였고, 에틸렌은 농도 5㎕/L로 하여 기체상태로 식물체가 있는 밀폐된 유리 용기에 주입하는 방법으로 처리하였다.

처리 18시간 후 각각의 식물체에서 잎을 수거하였고, 대조구로 무처리한 식물체의 잎을 18시간째에 함께 수거한 후, 각각의 샘플에서 RNA를 추출하였고 추출된 RNA를 이용하여 다음과 같이 노던블러팅을 수행하였다.

먼저, 추출된 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 전이시켰다.

다음에, 실시예 1에서 수득된 CARAV1 유전자를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 ³²P로 표지한 후, 이를 반응액[0.25M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (Dextran Sulfate)]에 첨가하고 65℃에서 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이때 ³²P로 표지된 상기 DNA 프로브는 나이트란막에 붙어있는 상보적 mRNA에 붙게 되며 이 나이트란막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면 ³²P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시키므로 이것으로 발현 여부를 알아볼 수 있다.

시험 결과, 엽산을 제외한 모든 물질의 경우에서 CARAV1 유전자가 강하게 유도 발현되었다.

이러한 결과를 바탕으로, CADEF1 유전자의 발현을 강하게 유도했던 에틸렌, 메틸 자스모네이트, 살리실산, 비티에이치, β-아미노부티르산, 과산화수소에 대해서, CARAV1 유전자의 더 상세한 발현 양상을 알아보기 위해 각각의 유도물질을 처리하고 시간별로 유전자 발현 양상을 관찰하는 다음의 시험을 실시하였다.

각각의 시험에서 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였으며, 대조구로서 어떤 물질도 처리하지 않은 건전잎을 사용하였다.

[단계 2]

에틸렌 처리후 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 농도 10㎕/L로 하여 기체상태로 식물체가 있는 밀폐된 유리 용기에 주입하는 방법으로 에틸렌을 처리하고, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 에틸렌 처리후 CARAV1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

시험 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 30분부터 축적되기 시작하여 18시간에 가장 많이 발현하였고 24시간까지 발현량이 유지되었다.

[단계 3]

메틸 자스모네이트의 처리후 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물의 잎의 앞뒷면에 100 μM 농도의 메틸 자스모네이트를 분무기로 골고루 분무 처리하고 비닐백으로 밀봉한 다음, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 메틸 자스모네이트 처리후 CARAV1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

시험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 30분부터 축 적되기 시작하여 24시간까지 유지되었다.

[단계 4]

살리실산의 처리후 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물의 잎의 앞뒷면에 5mM 농도의 살리실산을 분무기로 골고루 분무 처리하고, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 살리실산 처리후 CARAV1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

시험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 1시간부터 축적되기 시작하여 24시간까지 유지되었다.

[단계 5]

비티에이치의 처리후 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물의 잎의 앞뒷면에 10 μM 농도의 비티에이치를 분무기로 골고루 분무 처리하고, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 비티에이치 처리후 CARAV1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

시험 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 30분부터 축적되기 시작하여 24시간까지 유지되었다.

[단계 6]

β-아미노부티르산의 처리후 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물의 잎의 앞뒷면에 20mM 농도의 β-아미노부티르산을 분무기로 골고루 분무 처리하고, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 비티에이치 처리후 CARAV1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

시험 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 30분부터 축적되기 시작하여 1시간 째에 가장 많이 축적되었고 24시간까지 유지되었다.

[단계 7]

과산화수소의 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 고추식물체의 잎에 10mM의 과산화수소를 배큠인필트레이션 방법으로 처리하고, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24시간 째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 과산화수소를 처리한 후 CARAV1의 시간별, 농도별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

시험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 30분부터 축적되기 시작하여 24시간까지 유지되었다.

[실시예 4] 환경적 스트레스에 의한 CARAV1 유전자의 유도 발현

본 발명의 CARAV1 유전자가 환경적 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알 아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

각각의 시험에서 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였으며, 대조구로서 어떤 스트레스도 처리하지 않은 건전잎을 사용하였다.

[단계 1]

본 발명의 CARAV1 유전자가 상처 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추식물에 상처 스트레스를 처리하기 위해 식물체의 잎을 바늘로 찔러 잎 전체에 걸쳐 상처를 낸 후 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간이 지나 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 상처 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CARAV1의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

시험 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 처리 후 30분부터 발현되기 시작하여 6시간까지 강하게 발현되었고 그 이후 현저하게 약하게 발현되었다.

[단계 2]

본 발명의 CARAV1 유전자가 염 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

염도처리후 시간별 CARAV1 저항성 유도효과를 알아보기 위하여, 200mM의 염 화나트륨 수용액에 고추식물체의 뿌리를 담그어 흡수시키는 방법으로 염을 처리하고, 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 염스트레스 처리후 CARAV1의 시간별 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

시험 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 잎에서 30분부터 발현하여 6시간까지 그 발현량이 유지되었다.

[단계 3]

본 발명의 CARAV1 유전자가 저온 스트레스에 의해 유도될 수 있는지를 알아보고 그 구체적 유도방법을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

저온처리를 위해 고추 식물체를 5℃로 유지되는 냉장실에 보관하면서 각각 0.5, 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간째에 잎을 수거하였다.

각각의 샘플에서 RNA를 추출한 후, 상기 실시예 3의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행함으로써, 저온 스트레스 처리 후 시간경과에 따른 CARAV1의 발현양상을 알아보았으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

시험 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, CARAV1 유전자는 잎에서 1시간대에 처음으로 발현하여 24시간까지 유지되는 경향을 나타내었다.

[실시예 5] CARAV1 유전자 과다발현에 의한 식물체의 저항성 유도

식물체에서의 CARAV1 유전자 과다발현시 다른 병발생관련 유전자들의 유도 여부, 세균성 병에 대한 저항성의 증가 여부 및 환경스트레스에 대한 내성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CARAV1 유전자를 stratagene에서 제공하는 pBIN35S 벡터에 도입시켜 재조합벡터 pCARAV1을 제조하고 그 개열지도를 도 12에 나타내었다.

이렇게 제조한 재조합벡터 pCARAV1를 애기장대에 도입함으로써 CARAV1 유전자를 과다발현시키고 하기와 같은 시험을 수행하였다.

[단계 1]

CARAV1 유전자가 과다발현된 식물체에서 다른 병발생관련 유전자가 유도되는지를 알아보기 위하여 상기 CARAV1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대의 잎을 수거한 다음, 기존의 알려진 병발생관련 유전자인 AtPR1a, AtPR2, AtPR5를 이용, 실시예 3의 단계 1에서와 동일한 방법으로 노던블러팅을 수행하였다.

각각의 시험에서 노던블러팅 수행시 리보솜 RNA의 양을 모니터링 함으로써 동일량의 RNA 시료가 로딩되었음을 확인하였으며, 대조구로는 재조합벡터를 도입하지 않은 야생형을 사용하였으며, 시험 결과는 도 13에 나타내었다. 여기서 #5, #10, #11은 시험에 사용된 식물의 샘플번호를 나타낸다.

시험 결과, AtPR1a, AtPR2, AtPR5 모두에서 병발생관련 유전자들이 유도되는 것으로 밝혀졌다.

[단계 2]

CARAV1 유전자가 과다발현된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성이 증가하 였는지의 여부를 알아보기 위하여 상기 CARAV1 유전자가 과다발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장대 식물체에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 균주를 접종하고 접종일과 3일 후에 잎을 수거하여 1그람당 세균수를 측정하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 여기서 #5, #10, #11은 시험에 사용된 식물의 샘플번호를 나타낸다.

시험 결과, 3일후 모든 샘플이 야생형에 비해 세균성 병에 대한 병저항성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

[단계 3]

CARAV1 유전자가 과다발현된 식물체에서 환경스트레스에 대한 내성의 증가하였는지 여부를 알아보기 위하여, CARAV1 유전자가 과다발현된 식물체와 야생형 식물체의 종자를 염화나트륨 또는 마니톨이 첨가된 고체 MS 배지에서 발아시켜 발아율을 측정하고 그 결과를 도 15에 나타내었다.

시험 결과, 본 발명의 CARAV1 유전자가 과다발현된 식물체는 염화나트륨과 마니톨에 대하여 내성을 가지는 것으로 나타났다.

이상과 같이 본 발명이 완성됨으로써, 애기장대의 RAV1 유전자와 57% 등의 상동성을 나타내는 신규 CARAV1 단백질 코딩 유전자 CARAV1의 염기/아미노산 서열; 및 세균, 화학물질 또는 환경적 스트레스를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 상기 CARAV1 유전자 프로브와 반응시켜 CARAV1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 것으로 구성되는 식물체 병저항성의 탐색방법이 제공될 수 있게 되었다.

본 발명이 완성됨으로써, 고추세균성점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병저항성 관련 유전자의 하나인 CARAV1 단백질을 코딩하는 CARAV1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 고추세균성점무늬병에 대한 저항성 존재 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공할 수 있게 된 것이다.

<110> KOREA CHUNGANG EDUCATIONAL FOUNDATION <120> CARAV1 Gene and Screening Method of Plant Disease Using It <130> 01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1453 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 1 catttctcat caaccaaaac aacacataca cacaccaatg gaaggaacta gtagcataga 60 tcaagagagc actactagtg actctctctc cattgctccg atgacgacga ccaagccgcc 120 ggagagtctt tgtaggatgg ggagtggaac aagtagtgtg ataattgatg gtgaaaatgg 180 tgttgaagct gaatcaagaa aactcccatc ttcaaaatac aaaggtgtgg tccctcaacc 240 aaatggacgt tggggtgcac aaatctatga aaagcatcaa agggtttggt taggcacatt 300 caacgaggag aatgaagccg ccagggcata tgacgtcgcg gcccagaggt tcaggggccg 360 cgacgctgtt actaatttca aacccttact tgagaatcaa gaaagtgatg atgatgtgga 420 aatcgctttc ttgaactcgc attccaaggc ggagattgtt gacatgttac gtaaacatac 480 gtatatcgat gagttagaac aaagtaagaa attatttgga tatactaaag atggtaccat 540 ggcaaaaaat aaagatggac ttattgatat aagttcattt tttggtggtg gtggtactat 600 tgataaagtc aacaacaaag ttcgtgaaca gttatttgaa aaagctgtta ccccaagtga 660 tgttggtaaa ttaaataggc ttgtgatacc aaaacaacat gctgaaaaac attttccatt 720 acaaaatgga aataactcga aaggggtttt gttgaatttc gaagatttaa atggtaaagt 780 ttggagattt agatattcgt attggaatag tagtcaaagt tatgttttaa ccaaaggatg 840 gagtcgtttc gtaaaagaaa aaaacttgaa ggccggtgat attgtgagtt ttcagcgatc 900 tacaagtgga gataagcaat tgtacatcga ttttaaggct aggaatatgg cccccacaaa 960 tccggtcgtt actaatcaag ttcaagctca ggttcaagtt ccgcgagtac aaatgatgag 1020 attattcgga gttaatatat gcaagatacc cgctacgata aataatgttg ttgataataa 1080 taacaacaac aacaataata tggctaattg tagtgggggc aaaaggatga tggagatgga 1140 attgttgaca tttgagtcat gtaggaagaa acaaagggtg attattgatg ccttgtaaca 1200 tgtagtagta gtaacttttc ccttttttgt ttttgtaata ttttttttta atgttttgta 1260 ccttttcatg tttttttttc ttactttaga agttgcaagt tgcaagttgc aaaaagactt 1320 tcatcaattg tatattagta ttagagaaga agaaatagct caaaagtgag ctatcttagg 1380 tgaaatgaaa acaaagatga aatgaaaaaa caagaaatgt gaatctcttc ttttcaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaa 1453 <210> 2 <211> 387 <212> PRT <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 2 Met Glu Gly Thr Ser Ser Ile Asp Gln Glu Ser Thr Thr Ser Asp Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ile Ala Pro Met Thr Thr Thr Lys Pro Pro Glu Ser Leu Cys 20 25 30 Arg Met Gly Ser Gly Thr Ser Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Asn Gly 35 40 45 Val Glu Ala Glu Ser Arg Lys Leu Pro Ser Ser Lys Tyr Lys Gly Val 50 55 60 Val Pro Gln Pro Asn Gly Arg Trp Gly Ala Gln Ile Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Gln Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Glu Glu Asn Glu Ala Ala Arg 85 90 95 Ala Tyr Asp Val Ala Ala Gln Arg Phe Arg Gly Arg Asp Ala Val Thr 100 105 110 Asn Phe Lys Pro Leu Leu Glu Asn Gln Glu Ser Asp Asp Asp Val Glu 115 120 125 Ile Ala Phe Leu Asn Ser His Ser Lys Ala Glu Ile Val Asp Met Leu 130 135 140 Arg Lys His Thr Tyr Ile Asp Glu Leu Glu Gln Ser Lys Lys Leu Phe 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Thr Met Ala Lys Asn Lys Asp Gly Leu Ile 165 170 175 Asp Ile Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Thr Ile Asp Lys Val Asn 180 185 190 Asn Lys Val Arg Glu Gln Leu Phe Glu Lys Ala Val Thr Pro Ser Asp 195 200 205 Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys 210 215 220 His Phe Pro Leu Gln Asn Gly Asn Asn Ser Lys Gly Val Leu Leu Asn 225 230 235 240 Phe Glu Asp Leu Asn Gly Lys Val Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp 245 250 255 Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Leu Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val 260 265 270 Lys Glu Lys Asn Leu Lys Ala Gly Asp Ile Val Ser Phe Gln Arg Ser 275 280 285 Thr Ser Gly Asp Lys Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Ala Arg Asn Met 290 295 300 Ala Pro Thr Asn Pro Val Val Thr Asn Gln Val Gln Ala Gln Val Gln 305 310 315 320 Val Pro Arg Val Gln Met Met Arg Leu Phe Gly Val Asn Ile Cys Lys 325 330 335 Ile Pro Ala Thr Ile Asn Asn Val Val Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn 340 345 350 Asn Asn Met Ala Asn Cys Ser Gly Gly Lys Arg Met Met Glu Met Glu 355 360 365 Leu Leu Thr Phe Glu Ser Cys Arg Lys Lys Gln Arg Val Ile Ile Asp 370 375 380 Ala Leu *** 385

Claims

서열번호1의 염기 서열을 가진 고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 CARAV1 단백질을 코딩하는 CARAV1 유전자.
제1항에 있어서,

고추 한별 품종(Capsicum annuum L. cv. Hanbyul) 유래 식물병 저항성 CARAV1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호2의 아미노산 서열을 가진 CARAV1 단백질.
제 1항 기재의 CARAV1 유전자를 pBIN35S에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 pCARAV1.
세균, 화학물질 및 환경스트레스중 어느 하나를 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막(Hybond N+)으로 전이시킨 후, ³²P를 처리한 제1항 기재의 CARAV1 유전자 프로브와 반응시켜 CARAV1 유전자의 차별적 발현을 확인함을 포함하여 구성되는,

식물체의 병저항성 탐색방법.
제4항에 있어서,

상기 세균은 고추세균성점무늬병의 병원성 세균 및 고추세균성점무늬병의 비병원성 세균 중 어느 하나임을 특징으로 하는,

식물체의 병저항성 탐색방법.
제 4항에 있어서,

상기 화학물질은 에틸렌, 메틸 자스모네이트, 살리실산, 비티에이치, β-아 미노부티르산, 과산화수소 중 어느 하나임을 특징으로 하는,

식물체의 병저항성 탐색방법.
제 4항에 있어서,

상기 환경적 스트레스는 상처스트레스, 염스트레스 및 저온스트레스 중 어느 하나임을 특징으로 하는,

식물체의 병저항성 탐색방법.