KR100436750B1

KR100436750B1 - 고추 한별 품종 유래의 ｃａｓａｒ 82ａ 단백질을코딩하는 유전자 염기서열 및 마커로의 이용

Info

Publication number: KR100436750B1
Application number: KR10-2002-0024444A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 이성철
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2004-06-22
Also published as: KR20030086078A

Abstract

본 발명은 고추식물의 세균병인 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별 품종으로부터 분리한 CASAR82A 유전자의 염기서열과 유전공학에 있어 마커로의 용도에 관한 것으로 이를 이용하면 식물체의 병원균에 대한 방어반응의 표지, 환경적 스트레스에 대한 분자적 표지 및 식물병저항성 작물의 분자육종을 위한 유전재료로 사용될 수 있는 뛰어난 효과를 제공한다.

Description

고추 한별 품종 유래의 ＣＡＳＡＲ 82Ａ 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열 및 마커로의 이용{Gene sequences of SASAR82A from Capsicum annuum. L. cv. Hanbyul and usage as marker thereof}

본 발명은 식물에 있어 병원성 균에 대해 저항성을 나타내는 유전자에 관한것으로 더욱 상세하게는 고추세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별 품종의 고추식물에서 클로닝한 CASAR82A 단백질의 유전자 염기서열 및 마커용으로의 용도에 관한 발명이다.

기주식물은 식물병에 대하여 여러 가지 세포내 대사를 작동시켜 방어기작을 작동시키게 된다. 이러한 방어기작에 의해 병원균의 감염초기에 병진전을 제한시킬 수 있는지의 여부에 의해 기주식물과 식물병원균간의 반응이 결정되어, 친화적반응과 불친화적반응으로 나뉘게 된다. 친화적반응에서 식물의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하면 이에 대한 반응으로 감염부위의 세포에 국부적 세포죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 칼로스(callose)의 축적, 리그닌(lignin)화에 의한 식물세포벽의 비후화, 파이토렉신(phytoalexin) 등의 여러 종류의 항균성물질의 생성, 병생성관련단백질[pathogenesis related(PR) protein] 생성 등이 일어난다고 보고되고 있다. 또한 이러한 방어기작은 병원균의 침입뿐만이 아니라 살리실산이나 아미노부티르산등에 의해서도 나타난다고 보고되었다. 이러한 반응을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다. 이 유도저항성은 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있지만 실용적인 가치가있다. 이러한 병원균에 대한 방어반응과 함께 냉해, 염, 건조등의 자연환경에 식물이 적응하기 위하여 다양한 생리·생화학적 변화를 동반하는데 지금까지 널리 알려진 바로는 생체내 당류 생성 증가, 세포벽의 강화 등이 알려져 있다. 이러한 환경스트레스에 대한 식물의 반응은 조기에 진단하는 것이 중요하다고 알려져 있다. 식물에서 나타나는 병저항성, 또는 환경변화에 대한 내성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써 병저항성, 환경내성이 증진되는 형질전환식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하여 작동하는 식물보호 화학물질 혹은 미생물제제을 개발할 수 있다.

이에 본 발명은 식물의 병방어반응을 보여줄 수 있는 CASAR82A 유전자를 분리하여 그 유전자 염기서열을 밝히고, 이를 마커로 이용하여 고추분자육종 프로그램에서 활용하게 하는데 그 목적이 있다.

상기 목적은 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별품종에서 CASAR82A 유전자를 분리하여 그 염기서열을 밝히고, 다양한 생물적 ·환경적 인자에 의한 발현을 확인함으로써 달성되었다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

도 1은 CASAR82A 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pCASAR82A의 개열지도이다.

도 2는 상기 도 1에서 CASAR82A 유전자가 삽입되는 부위에 대한 상세도이다.

도 3은 한별 품종에 병원성의 고추 세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)과 비병원성 고추 세균성점무늬병균을 접종 하였을 때 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 4는 한별 품종에 병원성의 고추 역병 (Phytophthora capsici)과 비병원성의 고추 역병을 접종 하였을 때 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 5는 한별 품종의 4엽기와 8엽기 식물에 각각 잎에 탄저병을 일으키는 병원균 (Colletotrichum coccodes)을 접종 하였을 때 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 6은 살리실산을 농도별, 시간별로 처리한 후 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 7은 비티에이치를 농도별, 시간별로 처리한 후 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 8은 β-아미노부티르산을 농도별, 시간별로 처리한 후 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 9는 메틸 자스모네이트를 농도별, 시간별로 처리한 후 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 10은 에틸렌을 농도별, 시간별로 처리한 후 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 11은 오옥신을 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 12는 엽산을 잎과 줄기에 처리한 후 농도별, 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 13은 과산화수소를 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 14는 염화나트륨을 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 15는 건조처리를 한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

도 16은 저온처리 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸다.

본 발명은 고추 한별 품종(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 유래한 CASAR82A 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 서열목록의 서열 1에 기재된 유전자 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 고추 식물체에 있어, 생물적, 환경적 스트레스에 대해 반응하는 CASAR82A 유전자를 함유하는 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커를 제공한다.

또한 본 발명은 제 1항의 유전자염기서열을 pBluescript SK(-) phagemid 벡터에 도입시켜 제조된 재조합 벡터 pCASAR82A를 제공한다.

또한 상기 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커를 숙주식물에 도입하여 상기 마커로부터 전사된 mRNA를 확인함으로써 숙주식물들이 생물적 ·환경적스트레스에 노출되어 있는지 여부를 진단하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

첫째, 고추 한별품종의 CASAR82A 유전자의 염기서열의 시퀀싱(sequencing), 재조합 벡터, 형질전환체에 대해 설명한다.

고추세균성점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)에 의해 저항성 병반인 과민성 반응이 나타난 고추 한별품종에서 mRNA를 분리하고 이로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. 병원균에 감염되지 않은 식물의 mRNA와 감염된 mRNA를³⁵S로 표지하여 디퍼렌셜 디스플레이(differential display)를 실시하고 라이브러리 스크리닝을 통하여 클론을 수득한다. 수득한 클론중 5'-말단의 염기서열을 통해 CASAR82A 유전자로 확인된 클론의 전체 염기서열을 결정한다. 그 결과 고추 한별 품종으로부터 유래된 CASAR82A유전자는 담배에서 발견된 SAR8.2 유전자와 43-50%의 비교적 낮은 상동성을 보였다.

한편 유전자 CASAR82A를 스트라진(statagene)에서 제공하는 pBluescript SK(-) phagemid 벡터에 도입시켜 재조합벡터 pCASAR82A를 구축하였다.

스트라타진(stratagene)에서 제공하는 균주인 XL-Blue MRF' 균주와 SOLR 균주를 30℃, LB 액체배지에서 하룻밤 진탕배양하여 여기에서 0.5 ml를 다시 50 ml LB액체배지에 넣고 37℃에서 2-3시간 동안 진탕배양을 했다(OD600=0.2-0.5). XL1-Blue MRF'을 원심분리(1,500×g)하여 10 mM MgSO₄로 OD600 값이 1.0이 되도록 희석했다. 상기 균주 200 μl, 스크리닝을 통해 얻어진 상기 파지스톡(phagestock) 250 μl, 엑스어시스트 헬퍼 파지(ExAssist helper phage) 1 μl를 50 ml 원추형(conical) 튜브에 넣고 37℃에서 15분 간 진탕배양 했다. 여기에 다시 3 ml의 LB 액체배지를 처리하고 37℃에서 2시간 동안 진탕배양하고 70℃에서 15분간 처리한 후 원심분리(4000×g)했다. 다시 새로운 튜브에 상등액 100 μl 와 OD600 값이 1.0으로 맞추어진 SOLR 균주를 넣고 37℃에서 15분간 배양하고 엠피실린(ampicillin)이 50 μg/ml 농도로 첨가된 LB 한천 배지에 10-50 μl를 깔고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하여 균총을 형성시킨다. 상기 균은 CASAR82A 유전자가 삽입된 것으로 이것을 5 mL LB 액체배지에서 15시간 배양하여 LB액체배지 812.5 μl 와 80% 글라이세롤 187.5 μl 넣고 -70℃에서 보관했다. 본 발명의 균주를E.coliCASAR82A라 명명하고, 2002년 4월 16일자로 기탁번호 KFCC 11304로 한국종균협회에 기탁하였다.

둘째, 세균성 병원균 및 진균성 병원균에 의한 고추식물에서의 CASAR82A 유전자의 유도 발현에 대해 상세히 설명한다.

병에 대하여 저항성인 식물체는 병원체의 침입 및 감염시 다양한 방어반응을 나타내는데, 여러 가지 세균성 병원균 및 진균성 병원균의 침입시 CASAR82A 유전자가 유도 발현된다. 이 CASAR82A 유전자의 유도와 발현은 감염된 부위에 나타나는 국부저항성 및 전신획득 저항성을 나타내어주는 분자적 표지로 볼 수 있다.

고추세균성점무늬병이 고추식물의 잎에 감염되었을 때 감염된 잎 뿐만 아니라 감염된 식물의 감염되지 않은 잎에서도 CASAR82A 유전자가 유도 발현된다. 또한 병원성균과 비병원성균에 대해 CASAR82A 유전자의 발현은 차별적으로 나타난다는 것을 알 수 있다. 병원성균이 감염된 잎에서는 접종 후 1시간째부터 발현하여 15시간에 그 양이 증가되어 20시간까지 유지됨을 보였고 비병원성균이 감염된 잎에서는 5시간째부터 발현하여 10시간까지 그 양이 증가되고 15시간이 되면 약간 떨어지는 경향을 나타낸다. 병원성 균이 접종된 식물의 접종되지 않은 잎에서는 그 발현이 1시간부터 발현하여 10시간부터는 그 양이 증가하는데 반하여 비병원성균이 감염된 식물의 감염되지 않은 잎에서는 3시간부터 발현하여 20시간에 그 양이 증가하는 것을 보여주고 있다.

CASAR82A 유전자는 고추 역병이 고추 줄기에 감염되었을 때 병원성균의 감염시 발현하는 수준이 2일째까지 증가하였다가 식물이 죽어가는 3일째부터 줄어들었고 비병원성균의 감염시 1일에서 3일까지 거의 일정한 수준으로 발현하는 것을 보여주고 있다.

고추 잎에 탄저병을 일으키는 병원균이 4엽기 식물과 8엽기 식물의 잎에 감염되었을 때, 4엽기 식물에서 CASAR82A 유전자는 12 시간부터 발현하여 48 시간에 최고 수준이 되어 72 시간에 줄어드는 경향을 보였다. 8엽기 식물에서는 12 시간부터 축적되어 36 시간에 최고 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. CASAR82A 유전자의 발현이 4엽기 식물보다는 8엽기 식물에서 강하게 발현되는 것은 8엽기식물의 성체저항성을 나타내는데 CASAR82A 유전자가 작용하는 것이라 생각할 수 있다.

셋째, 식물체의 비생물적 유도체에 의한 CASAR82A 유전자의 유도발현에 대해 상세히 설명한다.

식물병 저항성 유도 물질로 알려진 여러 가지 물질을 통하여 이 유전자가 어떠한 기작을 통하여 발현되어 병저항성을 유도하는지 확인하기 위하여 이 물질들을 식물체에 처리한 후 노던 블럿팅 (Northern blotting)을 실시하게 되면, 살리실산, 비티에이치, β-아미노부티르산, 메틸 자스모네이트, 에틸렌, 오옥신, 엽산, 과산화수소에서 강하게 발현이 유도됨을 알 수 있다. 즉, 이들 물질을 처리하면 이CASAR82A 유전자가 축적됨으로써 식물이 병에 대하여 저항성을 갖게 된다.

살리실산을 처리한 후 시간별, 농도별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간과 농도에 따라 어떻게 나타나는지 관찰면 CASAR82A 유전자는 처리 후 2시간부터 축적되기 시작하여 24시간까지 유지되었고 0.01 mM부터 발현하여 1, 2 mM에서 가장 많이 축적됨을 알 수 있다.

비티에이치 처리한 후 시간별, 농도별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간과 농도에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면 CASAR82A 유전자는 처리 후 2시간부터 축적되기 시작하여 24시간까지 유지되고 0.01 μM부터 발현하여 10 μM까지 그 축적양의 변함이 없다는 것을 알 수 있다.

β-아미노부티르산을 처리한 후 시간별, 농도별로 SAR8.2 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간과 농도에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면, CASAR82A 유전자는 처리 후 2시간부터 축적되기 시작하여 6시간에 가장 많이 축적되고 점점 줄어들어 24시간에는 거의 발현되지 않음을 알 수 있다.

메틸 자스모네이트를 처리한 후 시간별, 농도별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간과 농도에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면, CASAR82A 유전자는 처리 후 2시간부터 축적되기 시작하여 24시간까지 증가하였고 0.1 μM부터 발현하여 100 μM까지 그 발현량이 유지됨을 알 수 있다.

에틸렌을 처리한 후 시간별, 농도별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간과 농도에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면 CASAR82A 유전자는 처리 후 2시간부터 축적되기 시작하여 18시간에 가장 많이 발현하고 24시간까지 발현량이 유지됨을 알 수 있고 농도별 발현량은 0.01 μL/L부터 발현하여 10 μL/L까지 발현량이 유지됨을 알 수 있다.

오옥신을 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면 CASAR82A 유전자는 처리 후 1시간부터 축적되기 시작하여 18시간까지 그 발현량이 유지되다가 24시간에 발현량이 최대로 됨을 알 수 있다.

엽산을 잎과 줄기에 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면 CASAR82A 유전자는 잎과 줄기에서 공통적으로 1시간대부터 발현하여 24시간까지 그 발현량이 유지됨을 알 수 있다.

과산화수소를 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면, 과산화수소는 다른 화학물질과는 다르게 CASAR82A 유전자는 처리 후 18시간부터 축적하게 하여 24시간까지 그 발현량이 유지됨을 알 수 있다.

넷째, 식물체의 환경스트레스에 의한 CASAR82A 유전자의 유도발현에 대해 상세히 설명한다.

염화나트륨을 잎과 줄기에 처리한 후 농도별, 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 농도, 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면 CASAR82A 유전자는 잎과 줄기에서 공통적으로 1시간대부터 발현하여 24시간까지그 발현량이 유지되었고 농도별로는 대조구에서도 약간 발현하지만 농도의 증가에 따라 발현량도 증가함을 알 수 있다.

식물을 건조시켰을 경우 잎과 줄기에서 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면, CASAR82A 유전자는 잎에서 2시간대에 많이 발현하여 시간이 경과함에 따라 줄어드는 경향을 나타내고 줄기에서는 6시간대부터 발현하여 시간의 경과에 따라 줄어드는 경향을 보임을 알 수 있다.

식물을 저온처리 하였을 경우 잎과 줄기에서 시간별로 CASAR82A 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하면, CASAR82A 유전자는 잎에서 2시간대에 처음으로 발현하여 24시간까지 유지되는 경향을 나타내고 줄기에서는 1시간대부터 발현하여 시간의 경과에 따라 줄어드는 경향을 보임을 알 수 있다.

CASAR82A 유전자가 식물체내에서 어떤 역할을 하는지를 알기 위해서는 일반적으로 식물에서 사용되는 여러 가지 바이너리(binary) 벡터를 이용하게 된다. 유전자를 벡터에 집어넣고 이것을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하여 형질전환(trasformation) 시킨 후 다시 애기장대풀이나 담배, 토마토 등과 같은 식물체에 집어 넣게 된다. 이 벡터는 T(transfer)-DNA를 가지고 있어 식물체 내에 들어가면 식물의 핵으로 이동하게 되어 유전자가 식물체내에서 과발현(overexpression)된다. 이러한 형질 전환된 식물과 야생종의 식물에우리가 관심이 있는 여러 가지 처리를 하여 어떤 다른 표현형을 가지는지를 관찰하고 또한 여러 가지 다른 유전자를 가지고 유전자의 발현에는 어떤 역할을 하는지 알아 볼 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하고자 한다.

실시예 1 : CASAR82A 유전자 및 이의 염기서열 결정

고추 (Capsicum annuum) 한별 품종에 병원성이 약한 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실 처리하여 과민성 반응이 나타난 식물체에서 RNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

세균성점무늬병균에 감염된 고추잎의 순화된 총 RNA와 건전한 잎의 RNA를 역전사를 통하여 PCR로 증폭시키고 이것을 시퀀싱 겔에서 전기 영동했다. 여기에서 나타난 밴드간의 양적, 질적 차이를 확인하여 판별적으로 발현된 cDNA를 다시 PCR을 이용하여 증폭시킨후 cDNA 라이브러리 스크리닝을 통하여 CASAR82A 유전자를 선발하였다.

서열목록의 서열 1은 고추 한별 품종으로부터 클로닝한 CASAR82A 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.

실시예 2: CASAR82A를 포함하는 재조합 벡터의 구축 및 백터가 삽입된 형질전환체의 제조

상기 유전자 CASAR82A를 스트라진(statagene)에서 제공하는 pBluescript SK(-) phagemid 벡터에 도입시켜 재조합벡터 pCASAR82A를 구축하고 그 개열지도를 도 1에 나타내었고 CASAR82A가 삽입되는 부위에 대한 상세지도는 도 2에 나타내었다.

실시예 3: 세균성 병원균 및 진균성 병원균에 의한 고추식물에서의 CASAR82A 유전자의 유도 발현

첫째, 세균성점무늬병균 중 식물체와 친화적 반응을 나타내는 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 Bv5-4a를 배양하여 5X10⁸cfu/ml의 농도로 4엽기식물체 1엽 뒷면에 주사기를 이용하여 인필트레이션하여 접종하고 18시간 동안 습실처리를 하였다. 접종후 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20시간후에 각각 1, 2엽을 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 전이시켰다. 실시예 1에서 수득된 CASAR82A 유전자를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여³²P로 표지한 후, 반응액 (0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% dextran sulfate)에서 65。C에서 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 병이 접종된 1엽 뿐 아니라 2엽에서도 CASAR82A 유전자 시간대 별로 다르게 발현됨을 알 수 있었고 친화적 반응보다는 불친화적 반응에서 많이 발현됨을 알 수 있었다.

도 3은 고추 한별품종이 세균성점무늬병균에 의해 감염되었을 때 CASAR82A 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 건전은 병접종이 안된 식물체를 나타내고 대조구는 살균수를 인필트레이션 시킨 잎을 나타내며 1엽은 병원균이 직접 접종된 잎을 2엽은 접종된 식물의 접종되지 않은 잎을 나타낸다. 또한 숫자는시간대별로 발현되는 것을 나타낸다.

둘째, 고추역병균 중 식물에 친화적 반응을 나타내는 S197 균주와 불친화적 반응을 나타내는 CBS178.26 균주를 고추 줄기에 접종하고 날짜별로 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 옮겨준 후 32P로 표지된 CASAR82A 유전자와 상기 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 건전한 고추 줄기에서 항시 발현을 하였지만 친화적반응에서는 그 양이 증가하였다가 줄어들었고 불친화적 반응에서는 건전 줄기에서 발현하는 양과 거의 비슷하게 발현하였다.

도 4는 고추역병에 의해 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 건전은 병접종이 안된 식물체를 나타내고 숫자는 접종한 후 날짜별로 발현되는 것을 나타낸다.

셋째, 고추잎에 탄저병을 일으키는 병균 (Colletotrichum coccodes)을 식물의 잎에 접종하여 식물체내에서 CASAR82A 유전자의 발현을 알아보았다. 즉, 4엽기 고추와 8엽기 고추의 잎에 병원균을 접종하고 시간대별로 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 상기 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 4엽기 식물과 8엽기 식물에서 모두다 이 유전자가 발현되었는데 8엽기 식물에서 이 유전자의 발현이 4엽기 식물에서보다 강하게 나타났다.

도 5는 고추탄저병에 의해 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 건전은 병접종이 안된 식물체를 나타내고 숫자는 접종한 후 날짜별로 발현되는 것을 나타낸다.

실시예 4: 식물체의 비생물적 유도체에 의한 CASAR82A 유전자의 유도발현

첫째, 식물병 저항성을 유도한다고 알려진 살리실산을 처리한 후 시간별로 CASAR82A 유전자가 어떻게 축적되는지를 알기 위하여 고추잎에 살리실산을 처리하고 농도별, 시간대별로 샘플링하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 씨오닌 유전자와 상기 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 CASAR82A 유전자는 처리 후 12시간부터 축적되기 시작하여 18 시간에 계속하여 증가해 24시간에 최고 수준에 도달하였다.

도 6은 살리실산을 처리한 후 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 시간별 처리에서 살리실산은 5 mM로 처리되었고 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

둘째, CASAR82A 유전자의 발현에 비티에이치의 농도별, 시간별 영향을 알기위하여 고추에 비티에이치를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옮겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 상기 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 비티에이치는 농도와 시간에 의존적으로 CASAR82A 유전자의 발현에 영향을 미친다는 사실을 알 수 있었다.

도 7은 비티에이치를 처리한 후 농도별, 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 농도별로 처리한 식물은 24 시간을 처리하였으며 시간대별로 처리한 식물은 10 μM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

셋째, CASAR82A 유전자의 발현에 β-아미노부티르산의 농도별, 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 β-아미노부티르산를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 상기 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 β-아미노부티르산은 농도나 시간에 의존적으로 CASAR82A 유전자의 발현에 영향을 미침을 알 수 있었다.

도 8은 β-아미노부티르산을 처리한 후 농도별, 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 농도별로 처리한 식물은 24 시간 처리하였으며 시간대별로 처리한 식물은 20 mM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

넷째, CASAR82A 유전자의 발현에 메틸 자스모네이트의 농도별, 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 메틸 자스모네이트를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 상기 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 메틸 자스모네이트는 시간에 의존적으로 CASAR82A 유전자의 발현에 영향을 미침을 알 수 있었다.

도 9는 메틸 자스모네이트를 처리한 후 농도별, 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 농도별로 처리한 식물은 24 시간을 처리하였으며 시간대별로 처리한 식물은 100 μM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

다섯째, CASAR82A 유전자의 발현에 에틸렌의 농도별, 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 에틸렌을 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 상기 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 에틸렌은 시간에 의존적으로 SAR8.2 유전자의 발현에영향을 미침을 알 수 있었다.

도 10은 에틸렌을 처리한 후 농도별, 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 농도별로 처리한 식물은 24 시간을 처리하였으며 시간대별로 처리한 식물은 10 μL/L로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

여섯째, CASAR82A 유전자의 발현에 오옥신의 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 오옥신을 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 오옥신은 1시간부터 24시간 까지는 비의존적으로 CASAR82A 유전자의 발현에 영향을 미치나 24시간째에는 시간에 의존적으로 영향을 미친다고 알 수 있었다.

도 11은 오옥신을 처리한 후 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 시간대별로 처리한 식물은 IAA 100μM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

일곱째, CASAR82A 유전자의 발현에 엽산의 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 엽산을 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 엽산은 시간에 비의존적으로 CASAR82A 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

도 12는 엽산을 처리한 후 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 시간대별로 처리한 식물은 엽산 100μM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

여덟째, CASAR82A 유전자의 발현에 과산화수소의 농도별, 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 과산화수소를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 과산화수소는 18시간까지는 CASAR82A의 발현에 영향을 미치지 않고, 18시간 이후 부터는 시간에 비의존적으로 CASAR82A의 발현에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

도 13은 과산화수소를 처리한 후 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 시간대별로 처리한 식물은 과산화수소 100μM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

실시예 5 : 식물체의 환경스트레스에 의한 CASAR82A 유전자의 유도발현

첫째, CASAR82A 유전자의 발현에 염화나트륨의 농도별, 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 염화나트륨을 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 염화나트륨은 농도와 시간에 의존적으로 CASAR82A 유전자의 발현에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

도 14는 염화나트륨을 처리한 후 농도별, 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 시간대별로 처리한 식물은 염화나트륨 200 mM로 처리하였다. 무처리는 어떤 물질도 처리하지 않은 잎이다.

둘째, CASAR82A 유전자의 발현에 건조처리의 잎과 줄기에 대한 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 건조처리를 하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 건조처리는 잎과 줄기에 있어서 시간의존적으로 CASAR82A 유전자의 발현이 줄어듬을 알 수 있었다.

도 15는 건조처리를 한 후 잎과 줄기에 대해 시간대별로 CASAR82A 유전자의발현 결과를 나타낸 것이다. 시간대별로 처리한 식물은 식물을 땅에서 뽑아 처리하였다.

셋째, CASAR82A 유전자의 발현에 저온처리의 잎과 줄기에 대한 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 저온처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N⁺)으로 옳겨준 후³²P로 표지된 CASAR82A 유전자와 실시예 3의 첫째와 같은 방법을 사용하여 16-24시간 동안 배양했다. 그 결과 저온처리는 잎에 있어서는 시간에 비의존적으로 CASAR82A의 발현에 영향을 주고, 줄기에 있어서는 시간에 의존적으로 CASAR82A의 발현이 줄어듬을 알 수 있었다.

도 16은 저온처리한 후 잎과 줄기에 대해 시간대별로 CASAR82A 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 시간대별로 처리한 식물을 4℃로 처리하였다. 무처리는 식물을 28℃로 처리하였다.

이상 상기 발명의 상세한 설명에 기재되어 있으며, 고추유래로서 저항성 반응인 과민성 반응에서 발현이 유도되고 여러 가지 생물적, 환경적 스트레스에 대하여 발현되는 CASAR82A 유전자는 식물체의 병원균에 대한 방어반응의 표지, 환경적 스트레스에 대한 분자적 표지 및 식물병저항성 작물의 분자육종을 위한 유전재료로사용될 수 있는 뛰어난 효과를 제공하므로 식물육종 산업 및 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> KOREA CHUNGANG EDUCATIONAL FOUNDATION <120> Gene sequences of CASAR82A from Capsicum annuum. L. cv. Hanbyul and usage as marker thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 258 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <220> <221> CDS <222> (1)..(258) <400> 1 atg gtt tcc aaa agt agt att ttt att tgc ctt tct ttg att att cta 48 Met Val Ser Lys Ser Ser Ile Phe Ile Cys Leu Ser Leu Ile Ile Leu 1 5 10 15 gtg ata atg tcc aca cag att gtt gcc agg gag atg act tct gag gca 96 Val Ile Met Ser Thr Gln Ile Val Ala Arg Glu Met Thr Ser Glu Ala 20 25 30 tct gct tcg ctg acc caa gcg atg aat gga aat aac att agt gag act 144 Ser Ala Ser Leu Thr Gln Ala Met Asn Gly Asn Asn Ile Ser Glu Thr 35 40 45 aag aaa gtt gga cgc cat tta gtg aaa ggt ctt gat aaa atc ttc aaa 192 Lys Lys Val Gly Arg His Leu Val Lys Gly Leu Asp Lys Ile Phe Lys 50 55 60 gct ggc aaa gtt ata tat tgt aaa act tgc aaa act tgt cat ggc cgt 240 Ala Gly Lys Val Ile Tyr Cys Lys Thr Cys Lys Thr Cys His Gly Arg 65 70 75 80 tgt gac tat tgt tgt gcc 258 Cys Asp Tyr Cys Cys Ala 85 <210> 2 <211> 86 <212> PRT <213> Capsicum annuum L. cv. Hanbyul <400> 2 Met Val Ser Lys Ser Ser Ile Phe Ile Cys Leu Ser Leu Ile Ile Leu 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Thr Gln Ile Val Ala Arg Glu Met Thr Ser Glu Ala 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Thr Gln Ala Met Asn Gly Asn Asn Ile Ser Glu Thr 35 40 45 Lys Lys Val Gly Arg His Leu Val Lys Gly Leu Asp Lys Ile Phe Lys 50 55 60 Ala Gly Lys Val Ile Tyr Cys Lys Thr Cys Lys Thr Cys His Gly Arg 65 70 75 80 Cys Asp Tyr Cys Cys Ala 85

Claims

고추 한별 품종(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 유래하는 식물병 저항성 단백질 CASAR82A을 코딩하는 서열목록의 서열 1에 기재된 유전자 CASAR82A의 염기서열.
생물적, 환경적 스트레스에 대해 반응하는 제 1항 기재의 CASAR82A 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커.
제 1항의 유전자염기서열을 pBluescript SK(-) phagemid 벡터에 도입시켜 제조된 재조합 벡터 pCASAR82A.
제 2항 기재의 생물적 ·환경적 스트레스 진단용 마커를 숙주식물에 도입하여 상기 마커로부터 전사된 mRNA를 확인함으로써 숙주식물들이 생물적 ·환경적스트레스에 노출되어 있는지 여부를 진단하는 방법.