KR101999006B1 - 세균성 벼흰잎마름병균의 OprXBo 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

세균성 벼흰잎마름병균의 OprXBo 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)의 외막 단백질인 OprBXo의 용도를 밝힌 것으로, 본 발명에 따르면 잔토모나스 오리재에서 OprBXo 유전자를 넉아웃(knock-out) 시킴으로써 잔토모나스 오리재의 환경 스트레스에 대한 저항성을 감퇴시킬 수 있다. 또한, 잔토모나스 오리재에서 OprBXo 유전자를 과발현 시킴으로써 잔토모나스 오리재의 병독성, 운동성, 생체막(biofilm) 형성을 감소/억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 OprBXo 유전자 발현을 조절함으로써 잔토모나스 오리재 감염에 의해 발병하는 벼흰잎마름병의 병징을 억제하고, 잔토모나스 오리재의 전염(transmission)을 억제하여, 궁극적으로 벼흰잎마름병을 방제할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세균성 벼흰잎마름병균의 OprXBo 단백질 및 이의 용도{OprXBo protein in Xanthomonas oryzae pv. Oryzae and the use thereof}
OprBXo(outer membrane protein B in Xoo) 유전자를 과발현시킴으로써 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병 방제하는 방법 등에 관한 것이다.
잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)는 벼흰잎마름병을 야기하는 그람 음성 박테리아로, Xoo에 희해 발생되는 세균성 도관병인 벼흰잎마름병은 벼의 3대 병해로 특히 동남 아시아에서 그 피해가 매우 심각하다. 벼흰잎마름병에 의해 쌀 수확량이 최대 50%까지 감소할 수 있으며, 이는 경제적으로 큰 손실을 야기한다. 국내에서는 1930년도 전라도 해남군에서 처음 발병 보고된 이래 1960년까지 남부 일부 지역에 제한적인 발생을 보였으나, 이병성 품종인 금남풍의 재배 확대로 전국적인 발생을 나타내었으며, 이후 다수계 품종 재배에 의해 피해가 증가되고 있는 실정이다.
잔토모나스 오리재는 바람이 많이 불고 비가 오는 조건에서 감염된 식물에서 새로운 숙주에게 쉽게 전파되며 숙주 잎의 표면에 부착하여 잎 끝 주변의 상처를 통해 숙주로 들어 와서 확산되며, 감염된 식물의 잎에 마른 점괴를 야기한다. 잔토모나스 오리재 감염 후 수일이 경과하면 잎이 흰색이나 회색으로 바뀌면서 시들어가는 병징을 나타낸다. 감염 중에 잔토모나스 오리재는 세포 외 효소, exopolysaccharide(EPS) 및 생체막(biofilm)을 형성하여 병독성(virulence)을 나타내고 병징을 확대시킨다.
현재, 벼흰잎마름병 방제를 위하여 잔토모나스 오리재의 발생 조건을 최소화 하는 방법으로 작물재식 전 논뚝 및 수로의 기주 잡초 제거, 배수로 정비 등 포장 관리를 하여 전염원을 없애고, 매년 벼흰잎마름병이 발생하는 상습발생지 또는 발생이 우려되는 지역에서는 이병성 품종의 재배를 회피하고 저항성 품종을 심는 방법이 수행되고 있으나, 이는 그 효과가 미미하며 벼흰잎마름병의 간접적 방제 방법에 그치고 있는 바, 원천적으로 병원균인 잔토모나스 오리재의 생물학적 기전을 이용한 벼흰잎마름병 병징 억제 방법 및 전염 억제 방법에 대한 연구가 필요한 실정이었다.
한국공개특허공보 제10-2014-0113555호
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서 OprBXo를 과발현 시키는 단계를 포함하는 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병(bacterial leaf blight of rice) 방제 방법과 OprBXo 유전자를 Marker Exchange Mutagenesis에 의해 넉아웃(knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 오리재의 환경 스트레스 저항성을 감소시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 OprBXo를 과발현 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 과발현은 상기 잔토모나스 오리재에 상기 OprBXo 유전자를 포함하는 벡터를 도입시킴으로서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 벼흰잎마름병 방제는 잔토모나스 오리재의 운동성을 감소시킴으로써 달성되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 벼흰잎마름병 방제는 잔토모나스 오리재의 생체막(biofilm) 생성을 감소시킴으로써 달성되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 벼흰잎마름병 방제는 잔토모나스 오리재에 감염된 식물체의 병변의 확대를 억제함으로써 달성되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 OprBXo 유전자를 넉아웃(knock-out) 시키는 단계를 포함하는 잔토모나스 오리재의 환경 스트레스 저항성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 넉아웃은 Marker Exchange Mutagenesis에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예로서, 상기 환경 스트레스는 산화 스트레스 또는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 스트레스일 수 있다.
또한, 본 발명은 OprBXo 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계 및 상기 벡터를 잔토모나스 오리재에 도입시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 오리재의 생체막 생성 억제 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 OprBXo 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계 및 상기 벡터를 잔토모나스 오리재에 도입시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 오리재 감염에 의한 병반 확대 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)의 외막 단백질인 OprBXo의 용도를 밝힌 것으로, 본 발명에 따르면 잔토모나스 오리재에서 OprBXo 유전자를 넉아웃(knock-out) 시킴으로써 잔토모나스 오리재의 환경 스트레스에 대한 저항성을 감퇴시킬 수 있다. 또한, 잔토모나스 오리재에서 OprBXo 유전자를 과발현 시킴으로써 잔토모나스 오리재의 병독성, 운동성, 생체막(biofilm) 형성을 감소/억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 OprBXo 유전자 발현을 조절함으로써 잔토모나스 오리재 감염에 의해 발병하는 벼흰잎마름병의 병징을 억제하고, 잔토모나스 오리재의 전염(transmission)을 억제하여, 궁극적으로 벼흰잎마름병을 방제할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 I-TASSER server을 이용하여 획득한 OprBXo의 아미노산 서열을 표시한 도면이다.
도 1b는 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 Xanthomonas citri subsp.의 OprBXo, Xcc OprB의 서열. citri 및 Pseudomonas putida F1의 F1OprB1의 서열을 비교한 도면이다.
도 1c는 PyMOL 프로그램을 이용하여 OprBXo의 3D 구조를 예측한 도면이다.
도 2는 Xoo (EV), Xoo (OprBXo), XooΔoprBXo (EV) 및 XooΔoprBXo (OprBXo)의 병독성을 비교확인한 것으로서, 각각의 균주를 접종 후 15일째 잎의 병변의 사진(A), 15일 동안 변변이 확대된 길이를 측정한 그래프(B), 및 I ~ V 구역의 잎에 박테리아 개체 수(C)를 비교한 그래프이다.
도 3은 OprBXo에 의해 조절되는 단백질의 cluster of orthologous group COGs를 나타낸 것으로, Xoo(EV)와 Xoo(OprBXo)의 발현 단백질(A) 및 Xoo와 XooΔoprBXo의 단백질(B)을 각각 비교 확인한 도면이다.
도 4는 Xoo (EV), Xoo (OprBXo), XooΔoprBXo (EV) 및 XooΔoprBXo (OprBXo)의 연축 운동성 (A) 및 집단 운동성(B 및 C)을 비교 확인한 도면이다.
도 5는 는 Xoo (EV), Xoo (OprBXo), XooΔoprBXo (EV) 및 XooΔoprBXo (OprBXo)의 EPS 생산량(A) 및 생체막 생산량(B)을 정량화 하여 비교 확인한 도면이다.
도 6은 Xoo (EV), Xoo (OprBXo), XooΔoprBXo (EV) 및 XooΔoprBXo (OprBXo)이 24시간 동안 물, 자일로오스, 또는 글루코오스를 포함하는 디스크로 이동한 거리(A)와 그 모습(B)을 비교 확인한 도면이다.
도 7은 Xoo (EV), Xoo (OprBXo), XooΔoprBXo (EV) 및 XooΔoprBXo (OprBXo)가 SDS(A) 및 과산화수소(B)에 대해 민감한 정도를 비교 확인한 도면이다.
본 발명자들은 벼흰잎마름병을 야기하는 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)의 외막 단백질인 OprBXo(outer membrane protein B in Xoo)의 기능을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다. 구체적으로, Xoo에서 OprBXo 유전자를 넉아웃(knock-out) 또는 과발현 시킴으로써 Xoo의 환경 스트레스에 대한 저항성을 조절하고, Xoo의 병독성, 운동성, 생체막(biofilm) 형성을 감소/억제하는 방법을 제공할 수 있다.
그람 음성 박테리아(gram-negative bacteria)의 포린 단백질 (porin protein)은 외막(outer membrane)에 위치하여 소분자 흡수, 막 안정성, 운동성, 생체막 형성, 독성 및 단백질 / 유전자 발현과 같은 다양한 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 그람 음성 박테리아인 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)의 외막에 위치하는 OprBXo의 기능을 규명하고자 OprBXo의 아미노산 서열을 확인하고 3D 구조를 예측하였다(실시예 1 참조). 포린 단백질은 일반적으로 16개의 β-strand과 외부 루프(extraplasmic loop)를 가진 삼량체 구조를 형성하고, β-strand은 고도로 보존되어 잇으나, 기질을 인식하는 외부 루프 영역은 다양한 변화가 있는 것으로 알려져 있다. 탄수화물 포린(carbohydrate porins)으로 알려진 OprB 계통(family)의 포린의 L2 루프 영역은 고도로 보존되어 있으며, L2 루프 영역의 Arg88, Gln105, Glu106, 및 Gly109 잔기는 특정 기질과 상호작용에 필수적인 것으로 알려져 있다. OprBXo의 아미노산 서열 및 3D 구조를 예측한 결과, OprBXo에서의 L2 루프 영역의 Arg88, Gln105, Glu106, 및 Gly109 잔기는 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 OprBXo가 당(sugar) 운송(transportation)을 촉진하는 기능을 수행하는 것으로 이해될 수 있었으며, 이를 확인하기 위하여 OprBXo을 과발현하는 돌연변이 균주[Xoo (OprBXo)]와 넉아웃 돌연변이 균주[XooΔoprBXo] 및 OprBXo가 보완된 균주[XooΔoprBXo(OprBXo)]를 제작하였으며(실시예 2 참조), 상기 3개의 돌연변이 균주와 야생형(wildtype) 균주의 글루코오스(glucose) 및 자일로오스(xylose)에 대한 주화성(chemotaxis)을 비교확인하였다(실시예 8 참조). 그 결과 OprBXo의 과발현은 세균의 주활성 활성을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
또한, OprB 계통의 포린 단백질은 세균의 병독성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, OprB가 결핍된 Xcc 균주는 병독성을 현저하게 감소시켰지만, EPS 생성을 증가시킴이 알려져 있는데, 본 발명자들은 Xoo 균주에서 OprB 포린 단백질이 병독성에 미치는 영향을 확인하고자, Xoo(OprBXo), XooΔoprBXo, XooΔoprBXo(OprBXo), 또는 야생형 균주에 감염된 잎이 시간이 지남에 따라 병변이 확산되는 길이를 측정하여 세균의 병독성을 평가하였다(실시예 3 참조). 그 결과, Xcc와 달리, Xoo 에서 OprB의 결핍은 병독성 감소에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 오히려 OprB의 과발현에 의해 병변의 확산이 억제됨을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 OprBXo의 과발현에 의한 변병 확산의 억제가 세균의 운동성과 관련이 있는지 운동성 평가를 통해 확인하였다(실시예 6 참조). 그 결과, OprBXo의 과발현에 의해 Xoo의 운동성이 감소되었으며, OprBXo 유전자의 넉아웃은 Xoo의 운동성에 미치는 영향이 미미함을 확인할 수 있었다. 이는 OprBXo가 당 운송을 촉진하는 기능을 수행함에 따라 OprBXo의 과발현은 주어진 조건에서 당의 섭취를 향상시킬 수 있으므로, Xoo (OprBXo)는 화학 유인 물질에 대해 적극적으로 이동할 필요가 없기 때문에 야생형에 비해 운동성이 감소하는 것으로 이해된다.
또한, 세균의 EPS와 생체막 생성은 병의 확대에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명의 일 실시예에서는 Xoo에서 OprB 유전자의 돌연변이가 EPS와 생체막 형성에 미치는 영향을 확인하였다(실시예 7 참조). 그 결과, OprB의 과발현은 EPS 및 생체막 형성의 감소를 유도하였으나, OprB의 넉아웃은 오히려 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 Xoo에서 OprBXo의 과발현 또는 넉아웃이 Xoo의 외부 환경 스트레스에 대한 저항성에 미치는 영향을 평가하였다(실시예 9 참조). 그 결과, OprBXo가 과발현되는 Xoo(OprBXo) 균주는 SDS와 H2O2에 대해 저항성이 증진되었으나 OprBXo가 넉아웃된 XooΔoprBXo 균주는 SDS와 H2O2에 굉장히 민감함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 Xoo에서 OprBXo의 기능을 규명함에 따라, OprBXo 유전자를 포함하는 벡터를 Xoo 균주에 형질도입하여 OprBXo 과발현 시킴으로써, 박테리아의 EPS 및 생체막 형성 억제, 운동성 감소 및 병변의 확대를 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 OprBXo 유전자를 넉아웃 시킴으로써 외부 환경 스트레스에 보다 민감한 Xoo 균주를 제공할 수 있다. 이때 상기 유전자의 넉아웃은 Marker Exchange Mutagenesis에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 “벼흰잎마름병(bacterial leaf blight of rice)”이란 잔토모나스(Xanthomonas) 속 세균에 의해 발생되는 세균감염성 질환을 의미하며, 잔토모나스 속 세균의 비제한적인 예로는, 잔토모나스 알빌리네안스 (Xanthomonas albilineans), 잔토모나스 암펠리나 (Xanthomonas ampelina), 잔토모나스 아크쏘노포디스 (Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 잔토모나스 프라가리아이 (Xanthomonas fragariae), 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 등이 있을 수 있으며, 바람직하게는 잔토모나스 오리재에 의해 발병하는 식물병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 OprBXo 유전자를 과발현 시키는 단계를 포함하는, 잔토모 나스 속 (Xanthomonas spp.)에 의한 생체막(biofilm) 형성 방지 또는 억제 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "방지" 및 "억제"는 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp.)의 유전자 조작을 통하여, 생물막의 형성을 지연키거나 생성된 생체막을 분해시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 "생체막(biofilm)"은 미생물이 분비한 세포외 다량체 기질 (Extracellular Polymeric Matrix)과 증식한 박테리아로 구성된 입체적 구조물로서, 생물체의 조직 표면을 포함하는 모는 고체 표면에 형성될 수 있다. 생체막이 형성되면, 박테리아는 가혹한 환경에서도 잘 견디는 것은 물론, 항생제및 면역세포에 대하여 강한 저항력을 가지기 때문에 제거가 매우 어려워 만성 염증 질환의 원인이 되기도 한다.
최근 보고에 의하면, 전체 감염성 질환의 65% 정도가 생체막 형성이 주요인으로 알려져 있다. 따라서, 병원성 박테리아에 의한 감염의 방지/치료 또는 질환의 예방/치료에 있어서, 생체막 형성의 제어는 중요하다.
본 명세서에서 "넉아웃 (knock-out)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절 (down-regulation)을 의미하며, 본 발명에 따른 OmpBXo 유전자를 넉아웃 시키는 단계는 Marker Exchange Mutagenesis에 의하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 “과발현”이란 보통 상태에서 세포 내 해당 유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환 및/또는 형질도입시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.
본 명세서에서 "벡터 (vector)"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
본 명세서에서 "형질전환" 또는 “형질도입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 도입된 DNA의 발현 가능하게 되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 “방제"는 농작물을 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice)으로부터 예방하거나 구제하는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 방제의 대상인 벼흰잎마름병은 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 발병하는 세균병으로서, 보통 출수기 전후에 나타나지만, 상습발생지나 다발생 발생지에서는 본답 초기에 발병한다. 주로 잎에 발생되며, 광합성 부족에 의한 임실률 및 등숙률 저하에 의한 수량 감소 및 품질 저하를 초래하는 질병으로서, 농가에 큰 피해를 초래하는 질병 중 하나로서, 이에 대한 방제가 필요한 실정이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공한다.
상기 방제 방법은 통상적인 식물 병원균의 방제 방법이라면 한정되지 않고 적용할 수 있으나. 상기 조성물을 벼흰잎마름병이 발생된 병반 또는 발생이 예상되는 부위에 살포하거나 도포하여 방제하는 방법일 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. In silico modeling을 이용한 OprBXo의 3D 구조 예측
I-TASSER server (Roy et al., 2010)를 사용하여 432 아미노산 길이의 OprBXo 서열을 확인하여 PDB파일을 획득하였다. 상기 획득된 OprBXo의 아미노산 서열은 도 1a에 나타내었고, β-strands로 추정되는 부분은 파란색으로 표시하고, 신호 펩타이드로 추정되는 부분은 노란색으로 표시하였다.
이어서, CLUSTALW 프로그램을 사용하여 상기 획득된 OprBXo의 아미노산 서열을 Xanthomonas citri subsp.의 Xcc OprB의 서열. citri 및 Pseudomonas putida F1의 F1OprB1의 서열과 비교하여 도 1b에 나타었다. 도 1b에서 '*', ':'및 '.'는 각각 동일한 잔기, 보존된 치환, 및 반-보존된 치환을 나타내고, 빨간색 상자로 표시된 부분은 L2 루프 영역으로 추정되는 영역을 나타낸다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, OprBXo는 탄수화물 선택성 포린(porin)으로 알려진 Xcc 균주의 OprB 및 P. putida F1의 OprB와 높은 상동성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (van den Berg, 2012, Ficarra et al., 2016). OprBXo의 아미노산 서열은 Xcc OprB와 85 % (361/423) 동일성을 나타내며, P. putida F1 OprB (F1-OprB)와 OprBXo는 30 % (126/423) 상동성을 갖음을 확인할 수 있었다. 기질 특이성을 조절하고 기공을 형성하는 루프 L2는 OprB 계에 고유한 것으로 알려져 있는데, OprBXo의 L2는 Xcc OprB의 L2 영역과 동일하고 P. putida의 OprB의 L2와 65 %의 상동성을 갖음을 확인할 수 있었으며, 상기 결과는 OprBXo가, OprB와 같이, 탄수화물 선택성 포린임을 시사한다.
이어서, 상기 획득된 OprBXo의 아미노산 서열을 PyMOL program (Molecular graphics system, San Carlos, CA, USA)에 입력하여 OprBXo의 3D 구조를 예측하고, 그 구조를 도 1c에 나타내었다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, OprBXo는 Xcc의 OprB 및 P. putida F1의 OprB와 유사한 16 개의 β-sheets로 구성된 β-barrel 구조를 포함함을 확인할 수 있었다. 또한, 통상적으로 포린은 외부 막에 위치하기 위하여 N- 말단에 신호 펩타이드를 포함하는데, OprBXo는 N- 말단에 신호 펩타이드를 가지고 있는 것으로 추정되며, 상기 결과는 OprBXo가 Xoo의 외막에 위치하는 것을 의미한다.
실시예 2. 실험준비 및 실험방법
2-1. 박테리아 균주 및 그 배양
본 실시예에서 X. oryzae pv. oryzae (Xoo) 균주 PXO99A은 야생형(wildtype)으로 사용하였으며, Xoo 균주는 28℃에서 PS(peptone-sucrose) 배지 (peptone: 10 g/L, sucrose: 10 g/L, L-glutamic acid: 1 g/L) 또는 XOM2 배지 (670 μM D,L-methionine, 10 mM sodium L(+)-glutamate, 14.7 mM KH2PO4, 40 μM MnSO4, 240 μM Fe(III)-EDTA, 0.18% D-xylose, and 5 mM MgCl2; pH 6.5)에서 배양하였다. Escherichia coli 균주는 37℃의 LB (Luria-Bertani) 배지에서 배양하였다. 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 세파렉신(cephalexin), 및 엠피실린(ampicillin)의 항생제는 각각 최종적으로 10 μg/㎖, 50 μg/㎖, 30 μg/㎖, 및 100 μg/㎖의 농도로 첨가하였다.
2-2. Xoo 돌연변이 균주의 제작
oprBXo 유전자를 넉아웃(knock-out)한 돌연변이 균주 (XooΔoprBXo)를 제작하기 위하여 카마이신 저항성 카세트 (kanamycin-resistance cassette)를 이용하여 marker-exchange mutagenesis를 수행하였다. 구체적으로, oprB 영역을 포함하는 1,492-bp DNA 단편을 유전자 특이적인 프라이머 5'-tcacgaaggcgatgttgtcc-3'(서열번호 1) 및 5'-caaccggcttcttgagcagg-3'(서열번호 2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 DNA 단편을 pGEM-T easy에 클로닝하여 pGem-oprBXo를 생성하고, 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)으로 검증하였다. 이어서, pUC4K로부터 절단된 카나마이신 카세트를 BalI로 절단된 pGem-oprBxo에서 oprB 유전자의 중간 부분에 삽입하여 pGem-oprBXo :: Km을 제작시켰다. 상기 제작된 구조물을 Bio Rad MicropulserTM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 전기천공법(electroporation)으로 야생형 균주에 도입하고, 상기 균주를 28 ℃에서 6 시간 동안 배양한 후, 카나마이신이 포함하는 PSA 플레이트에 도말하였다. 상기 균주(XooΔoprBXo)에 삽입 돌연변이 유발 여부는 PCR을 이용하여 확인하였다.
XooΔoprBXo균주에 상보적인 균주(complemented strain)을 제작하기 위하여 oprBXo 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF; 1278 bp)을 프라이머 5'-ctcgagatgaccgccctcgccccccgc-3 '(서열번호 3) 및 5'-cctgcggatcgactggaatctgcaccaccaccaccaccgagaagctt-3'(서열번호 4)을 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭된 DNA 를 pGem-T easy에 삽입하여 pGem-OprBXoOE을 생성하고, 염기서열 분석(DNA sequencing)을 통해 확인하였다. 상기 pGem-OprBXoOE 단편은 BamHI 및 XhoI에 의해 절단되어 플라스미드 벡터인 pBBR1-MCS5에 다시 클로닝하여 pBBR1OprBXo를 생성하였다. 상기 pBBR1OprBXo 플라스미드 벡터를 전기천공법을 사용하여 XooΔoprBXo에 도입하고, 상기 균주를 카나마이신과 젠타마이신을 포함하는 PSA 배지에 배양하여 OprBXo가 보완된 균주(complemented mutant) [XooΔoprBXo(OprBXo)]를 선별하였다.
또한, 상기 pBBR1OprBXo 플라스미드 벡터는 야생형 균주에 삽입되어 OprBXo 유전자를 과발현하는 균주(OprBXo-overexpressing strain: Xoo(OprBXo))를 생성하였으며, 상기 형질전환된 Xoo(OprBXo) 균주는 PCR 및 6 × His 항체를 사용한 웨스턴 브롯 분석(western blot analysis)을 통해 확인하였다.
실시예 3. 병독성 평가 (Virulence assay)
Xoo strain의 병독성은 "scissors clipping"방법으로 평가하였다. 구체적으로, Oryza sativa L. 품종 Kitaake (Kim et al., 2013) 식물을 4 주 동안 온실에서 재배하였으며, 박테리아 접종물(bacterial inoculum)은 Xoo 균주를 PSA 배지에서 48 시간 동안 배양하여 수득하고, 광학 밀도(optical density) 0.6 (OD600nm)에 도달할때까지 10mM MgCl2에 현탁시켜 제조하였다. 이어서, 상기 박테리아 현탁액에 가위를 담근 후 상기 가위로 가장 어리고 충분하게 팽창된 세개의 잎의 끝(tip)으로부터 3cm 위를 가볍게 쳐서 잘라내어 접종하였다. 병변의 길이는 접종 후 0, 3, 6, 9, 12, 15 일에 측정 하였다 (DAI). 접종 후 15일이 지난 병든 잎에서 박테리아 개체 수를 측정하기 위하여, 상기 잎을 I (0 ~ 5cm), II (6 ~ 10), III (11 ~ 15), IV (16 ~ 20), V (> 21cm)의 다섯 구획으로 나누고, 각 구획을 작은 조각으로 얇게 썰어 부드럽게 흔들어 주면서 2 시간 동안 10 mM MgCl2에 담가 박테리아 현탁액을 얻었다. 상기 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석한 후 적절한 항생제를 포함하는 PSA 플레이트에 도말하여 박테리아 집단을 나열하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, OprBXo 과발현 균주인 Xoo(OprBXo)는 병변의 길이가 유의하게 감소하였으나, XooΔoprBXo(EV) 및 XooΔoprBXo(OprBXo)은 야생형과 유사한 병징을 나타내었다(A 및 B 참조). 그러나 감염된 잎의 Xoo(OprBXo) 개체 수는 야생형과 유사하였다. 또한, 5 개의 각 섹션 (I ~ V)에서 박테리아의 개체수 조사한 결과, Xoo(OprBXo) 균주의 수는 섹션 I에서 다른 세 종의 박테리아 수보다 유의하게 높았다 (> 100 배). 섹션 II 및 III에서의 박테리아 개체 수 또한 섹션 I의 세균 수 패턴과 유사함을 확인할 수 있었다. 그러나, Xoo(OprBXo) 균주는 섹션 IV와 V에서 다른 균주에 비해 훨씬 낮았으며, 이는 Xoo(OprBXo)가 주로 감염된 잎의 상부에 서식함을 의미한다(C 참조). 상기 결과는 OprBXo가 감염된 잎에서 Xoo의 이동(운동성)에 관여하며, 박테리아가 숙주안에서 최적의 병독성(optimal virulence)을 갖도록 함에 기여할 수 있음을 시사한다.
실시예 4. 단백질 추출 및 펩타이드의 준비 (label-free shotgun proteomics)
Xoo에서 독성 및 기타 생물학적 과정에 관여하는 OprBXo의 기능을 규명하고자 proteomic analysis를 수행하였다. 상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, OprBXo는 박테리아의 optimal virulence 에 기여함이 명백하므로 합성(syntheic), 최소(minimal), 식물 모방(plant-mimic) 배지인 XOM2 배양배지를 사용하였다. 박테리아 세포를 PSB에서 배양하고, 광학 밀도 0.6 (OD600㎚)에 도달할때까지 희석하고 XOM2 배지로 옮긴 다음 다시 16 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 50 mM Tris-HCl (pH 7.8)로 2 회 세척한 후. 세척 된 세포를 용해 완충액 (6M Guanidine-HCl, 10 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 7.8)에 재현탁시키고, 상기 현탁액을 Ultrasonic Processor (Cole Parmer, Vernon Hills, IL, USA)로 10 회(10초 켜짐 / 60초 꺼짐) 흔든 후 그 상청액을 수득하여 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)로 단백질 농도를 측정하였다. 구체적으로, 추출된 단백질에 100 mM iodoacetamide를 1시간 동안 처리하여 알킬화(Alkylation)을 수행하였고, 상기 혼합물은 20 mM DDT을 처리하여 1시간 동안 재배양하였다. 상기 알킬화된 단백질은 trichloroacetic acid을 이용하여 침전시키고, 50 mM ammonium bicarbonate (pH 7.8)에 재현탁하였다. 상기 단백질을 분해하기 위하여 총 200㎍ 단백질에 5㎍의 트립신(trypsin)을 처리하고 37℃에서 24시간 동안 반응하도록 한 후, Sep-Pak Vac 1cc tC18 cartridge (Waters)를 이용하여 세척하였다. 상기 트립신에 의해 분해된 단백질(tryptic-digested proteins)은 BCA 단백질 분석 키트를 이용하여 정량하였다.
실시예 5. 단백질/펩타이드 확인 및 정량화 (Mass spectrometry analysis)
Nanospray 이온 모드를 통해 LTQ Velos Pro instrument (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)에 연결된 Split-free nano LC system (EASY-nLC II; Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)을 사용하여 상기 실시예 4에 트립신에 의해 분해된 단백질(tryptic-digested proteins) 2㎍을 분석하였다. 구체적으로, 상기 분해된 단백질 시료는 각 2㎍씩 MAGIG C18AQ 200A (5 μm) material (Michrom BioResources, Auburn, CA, USA) 7cm를 이용하여 in-house packed column에 분리되었으며, 상기 분리된 시료는 420분 동안 유속 300nL/min의 물/ACN 용매(Solvent A, water with 0.1% formic acid; Solvent B, 100% acetonitrile with 0.1% formic acid)을 이용하여 용리되었다. 상기 용리는 7% B 용매로 5분, 35% B용매로 380분, 80% B용매로 10분, 마지막으로 7% B용매로 25분 동안 전개하는 것으로 수행되었다. 전체 질량 스펙트럼은 m / z 300-2000 질량 범위에 대한 MS / MS 스캔으로부터 유도된 6 개의 데이터에서 얻어졌다. 전하는 2+ 및 3+ 이온을 선택할 수 있으며, 1회 반복, 0.5 분 지속, 및 3 분 제외가 허용되었다. 각각의 전체 질량 스캔에서, 6 개의 가장 강한 이온을 단편화를 위해 순차적으로 선택하고 선형 이온 트랩내에서 중심 모드(centroid mode)로 조사하였다. 상기 각 시료는 세개의 생물학적 복제물(biological replicates)이 사용되었으며, 획득된 MS/MS 스펙트럼은 Thermo Proteome Discoverer 1.3 (ver. 1.3.0.399) 및 SEQUEST search algorithm을 이용하여 해석하였다. 각 스펙트럼은 Xoo 균주 PXO99A의 데이터베이스(National Center for Biotechnology Information)에 의해 조사되었고, target-decoy strategy를 이용하여 구체화하였다. 효소로는 트립신을 선택하였고, 두번의 의도되지 않은 절단은 허용되었다. 획득된 모든 Xoo 펩타이드의 전구체 질량 정확도는 100ppm이고, 검색된 데이터베이스를 반대로 한 결과 오류 확률은 0.01 이었다. 모든 펩타이드의 확률 점수는> 20이고, 산화된 메티오닌(methionine)의 가능성은 열어두었다. 최소 두개의 특정 펩타이드와 매치되는 단백질은 시료 내에 존재하는 것으로 간주되었으며, 상기 확인된 단백질 데이터는 Scaffold 4 (Proteome software)에 입력되어 상기 세 가지 생물학적 복제물에서 모두 검출된 단백질을 비교에 사용되었다. 비교값을 위하여 Peptide spectrum matches (PSMs)를 사용하였다. 각 단백질의 PSM은 모든 단백질의 총 PSM에 의해 표준화되었으며, 3개의 생물학적 복제물의 PSM 평균값을 비교 매개 변수로 하여 [Xoo vs. XooΔoprBXo 및 Xoo(EV) 대 Xoo(OprBXo)] 단백질(>2배)을 확인하였다. 통계 분석은 t-test를 이용하였으며, 각각의 단백질은 orthologous group analysis (Tatusov et al., 2000)을 이용하여 분류하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, LC-MS / MS 실험에서 검출된 단백질 중 1291과 1126 개의 단백질을 각각 Xoo(EV)와 Xoo(OprBXo)의 3 복제물에 공유하고 단백질을 비교에 사용했다. Xoo(EV)와 Xoo(OprBXo)에서 각각 388 개와 139 개 단백질이 더 풍부했다 (2배 이상). 그룹 P (무기 이온 수송 및 대사)를 제외하고, Xoo(EV)에서 검출된 단백질의 수는 COG(Clusters of orthologous groups)의 대부분 카테고리에서 Xoo(OprBXo)의 것보다 높았다. E (에너지 생산 및 전환), G (탄수화물 대사 및 수송), M (세포 벽 / 세포 막 / 엔벨로프) 및 T (신호 전달)에 속하는 풍부한 단백질은 OprBXo의 영향을 크게 받는 것을 확인할 수 있었다. XopF1, XopK, XopQ, XopR, XopW, XopV, XopX, Hpa3, PthXo1, TalC3a, Tal5b 등 11 종의 type effector가 야생형 균주에서는 풍부하였으나 Xoo(OprBXo)에서는 검출되지 않았다. 또한 EPS 생산과 관련된 8 개의 Gum 단백질 (GumB, GumC, GumH, GumI, GumJ, GumK, GumM, GumN)과 6 개의 CRISPR / CAS 단백질 (Cas1, Cas3, Cas4, Cas5, Csd1 및 Csd2)는 야생형 균주에서 높게 나타났다(A 참조).
또한, Xoo와 XooΔoprBXo에서 각각 높게 발현 (2 배 이상)된 총 181 개와 80 개의 단백질을 COG 분석에 사용한 결과, N 그룹에 속하는 단백질 (운동성)은 야생형과 비교하여 XooΔoprBXo에서 매우 풍부함을 확인할 수 있었다. N (운동성)과 T (신호 전달) 그룹으로 주로 분류되는 11 개의 주화성 관련 단백질이 XooΔoprBXo에서 높게 발현되었지만, Xoo에서는 하나의 단백질만을 확인할 수 있었다. 또한 야생형과 비교하여 XooΔoprBXo에는 4 종의 III 형 효과기 (Hpa1, TalC2a, TalC4 및 TalC9e)가 더 많음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, OprBXo는 Gum 단백질의 발현에 관련이 있음을 알 수 있다(B 참조).
실시예 6. 운동성 평가
상기 실시예 3 내지 4로부터 Xoo(OprBXo)는 숙주 내에서 이동이 감소되었으며, proteomic 분석결과 XooΔoprBXo에서 운동성과 관련된 단백질 발현이 높음을 확인할 수 있었는바, 균주의 운동성에 OprBXo의 역할을 규명하기 위하여 각 균주의 운동성을 평가하였다. 구체적으로, 연축 운동성 (Twitching motility)은 Xoo 균주를 광학밀도 0.6 (OD600㎚)이 되도록 조절한 현탁액 3 ㎕를 플레이트에 떨어뜨려 28℃에서 3일간 배양하고 광학현미경 (Olympus SZX10)을 이용하여 관찰하였다. 또한, 집단 운동성 (Sarming motility)은 광학밀도 1.0 (OD600㎚)이 되도록 조절한 Xoo 균주 현탁액 3㎕를 0.3% 한천(agar)를 포함하는 XOM2 플레이트 중앙에 두어 28℃에서 7일간 배양한 후 팽창된 콜로니 직경을 측정하여 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형의 움직임은 많은 수직선과 미세선을 나타내지만 Xoo(OprBXo)의 가장자리에는 선이 표시되지 않고 심하게 떨어져 나왔으며, XooΔoprBXo (EV)도 순차적인 미세 선이 없는 매우 불규칙한 비정상적인 모양을 나타내었다. Compelmeted strain인 XooΔoprBXo (OprBXo)는 야생형과 유사한 양상을 나타내었다(A 참조). 집단 운동성에 있어서 Xoo(OprBXo)의 경우 그 운동성이 떨어지나, XooΔoprBXo (EV)와 Xoo(EV) 사이에 유의적 차이가 관찰되지 않았다(B 및 C 참조). 상기 결과는 OprBXo가 Xoo에서 최적의 운동성을 위해 필수적임을 의미한다.
실시예 7. EPS 생성 및 생체막(biofilm) 형성 평가
박테리아 세포가 표면에 부착되면 EPS를 생성하고, 스스로 응집하여, 생체막을 형성한다. 따라서 EPS 생산은 생체막 형성과 밀접한 관련이 있다. Xoo 균주를 5㎖ PSB에서 5일간 배양하고, 원심분리를 이용하여 그 상등액을 수득한 후 EPS를 추출하여 정량화하였다. 생체막 PVC(polyvinyl chloride) 마이크로 플레이트 방법 (Park et al., 2014a)을 수행하여 평가하였다. 구체적으로, 상기 균주를 PSB에서 배양한 후 3회 세척하고 광학밀도 0.3 (OD600㎚)이 되도록 조절한 후, 각 균주의 현탁액 100㎕를 XOM2 배지(broth) 10㎖에 희석하고 96-well PVC 플레이트에 접종하여 28℃에서 7일간 배양하였다. 이어서 상기 배양 상층액을 제거하고, 부착된 박테리아 세포를 0.1% crystal violetm로 염색한 후, 95% 에탄올을 이용하여 가용화하여, microplate reader (Spectramax 190; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 590㎚로 검출하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Xoo(OprBXo)의 EPS 생산량은 1.5 배 감소했지만, XooΔoprBXo (EV) 에서는 야생형보다 EPS 생산량이 1.9 배 증가됨을 확인할 수 잇었다. complemented strain 는 야생형과 비슷한 양상을 나타내었다(A 참조). 또한, OprBXo가 생체막 형성에 관여 하는지를 평가하기 위해, 96- 웰 PVC 플레이트 부착 분석을 수행한 결과, 4 개의 계통에서 생체막 형성의 패턴은 EPS 생산과 유사함을 확인할 수 있었다(B 참조). 구체적으로, Xoo(OprBXo)에 의한 생체막 형성은 야생형에 비해 1.6 배 감소하였으나, XooΔoprBXo에 의한 생체막 형성은 4.1배 증가하였다. EPS 생산과 마찬가지로 complemented strain은 야생형과 비슷한 양상을 나타내었다. 상기 결과에 의해, OprBXo가 EPS 생산 및 생체막 형성에 중추적인 역할을 수행함을 명백하게 알 수 있었다.
실시예 8. 화학주성(Chemotaxis) 평가
상기 실시예 5에 따라 Proteomic 분석 결과 다양한 주화성(chemotaxis) 관련 단백질의 발현이 OprBXo의 영향을 받음을 알 수 있었는바, 이어서 OprBxo가 Xoo의 주화성에 관여하는지 여부를 디스크 분석법을 통해 확인하였다. 구체적으로, Xoo 균주의 주화성(Chemotaxis)은 탄소원 공급 없이 hypromellose (Sigma-Aldrich, , St Louis, MO, USA)를 이용하여 평가하였다. 종이 디스크를 2 % 자일로오스(xylose), 200 mM 글루코오스(glucose), 또는 물에 담그고, 상기 디스크를 1% hypromellose를 포함하는 플레이트의 중앙에 올려놓았다. 109 CFU/㎖의 밀도의 Xoo 균주 현탁액을 상기 디스크에서 1cm 떨어진 곳에 떨어뜨리고, 24시간 후에 플래이트의 사진을 찍어(B 참조) 상기 디스크로 향한 Xoo 균주의 이동 거리를 측정하여 비교하였다(A 참조).
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 균주는 물로 이동하지 않았다. XooΔoprBXo (EV)는 야생형과 비교하여 글루코오스와 자일로오스에 끌리지 않았으며, XooΔoprBXo (OprBXo)의 주화성은 야생형 균주의 수준으로 유사하였다. 상기 결과에 따라, OprBXo는 탄수화물 선택적인 porin임을 알 수 있다. OprBXo를 과발현하는 균주에서 주화성 활성이 약간 감소됨을 확인할 수 있었으며, 이는 Xoo(OprBXo)의 운동성 감소가 주화성 활성의 감소를 야기하는 것을 의미한다.
실시예 9. 스트레스 저항성 (Stress tolerance) 평가
상기 실시예 5에 따라 Proteomic 분석 결과 세포 벽(cell wall), 세포 막(membrane), 및 엔벨로프(envelope)와 관련된 단백질의 발현이 OprBXo의 영향을 받음을 알 수 있었으며, 세포 벽, 세포 막, 및 엔벨로프는 다양한 환경 스트레스로부터 세포는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는바, Xoo 균주의 산화 스트레스 및 SDS(sodium dodecyl sulfate) 스트레스 하에서 생존 능력을 테스트하여 스트레스 저항성을 평가하였다. 구체적으로, 광학 밀도 0.3 (OD600㎚)의 Xoo 균주 현탁액을 0.05mM H2O2,0.001% SDS, 또는 물을 포함하는 PSB 배지에서 배양하였다. 28℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니를 계수하였다. 생존율은 H2O2 또는 SDS 처리한 세포와 물을 처리한 대조군을 비교하여 결정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Xoo(OprBXo)는 SDS와 H2O2 모두에 내성 이었지만 XooΔoprBXo (EV)는 야생형에 비해 SDS와 H2O2에 훨씬 더 민감함을 확인할 수 있었다. 또한, XooΔoprBXo (OprBXo)는 야생형과 유사한 양상을 나타냄을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 OprBXo가 실제로 세포막 / 엔벨로프 형성에 관여함을 시사한다.
실시예 10. 통계 분석
정량 분석의 비교를 위해, 독립 생물학적 복제물은 SPSS 12.0K를 사용하여 Tukey’s multiple comparison와 결합된 one-way ANOVA 을 수행하였으며, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> OprXBo protein in Xanthomonas oryzae pv. Oryzae and the use thereof <130> MP17-333 <150> KR 1020170116111 <151> 2017-09-11 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oprB_primer_F <400> 1 tcacgaaggc gatgttgtcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oprB_primer_R <400> 2 caaccggctt cttgagcagg 20 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oprBXo_primer_F <400> 3 ctcgagatga ccgccctcgc cccccgc 27 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oprBXo_primer_R <400> 4 cctgcggatc gactggaatc tgcaccacca ccaccaccga gaagctt 47 <210> 5 <211> 425 <212> PRT <213> OprXBo <400> 5 Met Thr Ala Leu Ala Pro Arg Arg Ala Arg Thr Arg Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ala Leu Thr Pro Leu Ala His Ala Gln Asp Ala Thr 20 25 30 Asp Ala Phe Lys Leu Lys Leu Gly Tyr Thr Gly Glu Ala Ala Ser Met 35 40 45 Ile Asp Gly Gly Arg Lys Ser Gly Asp Ala Tyr Ala Gly Gln Leu Met 50 55 60 Val Gly Thr Asp Val Asp Met Asp Arg Leu Phe Gly Trp Asn Gly Ala 65 70 75 80 Thr Val Lys Leu Tyr Val Thr Asn Arg His Gly Thr Asn Leu Ala Asn 85 90 95 Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ser Val Gln Glu Ile Tyr Gly Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Arg Leu Thr Asn Phe Thr Leu Leu Gln Lys Leu Phe Asn Asp 115 120 125 Arg Leu Glu Leu Glu Ala Gly Arg Ser Val Ala Asn Ile His Phe Leu 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Cys Gln Tyr Phe Gln Gly Asn Ser Ala Cys Gly Asn 145 150 155 160 Pro Thr Phe Val Phe Arg Thr Ser Asn Phe Thr Tyr Trp Pro Val Ser 165 170 175 Ser Trp Ala Ala Asp Ala Thr Ala Trp Val Thr Pro Lys Val Tyr Val 180 185 190 His Val Gly Ala Tyr Glu Val Asn Pro Val Gln Ala Gln Asp Gly Gln 195 200 205 His Gly Leu Asn Trp Ser Thr Asn Asp Thr Thr Gly Val Val Val Pro 210 215 220 Tyr Ala Val Gly Tyr Lys Asn Lys Gly Gly Asp Gly Ser Met Ala Ala 225 230 235 240 Met Tyr Glu Leu Gly Gly Trp Gln Asp Asn Ser Asp Tyr Thr Asp Pro 245 250 255 Leu Arg Asp Arg Asn Gly Asn Pro Ala Val Leu Ser Gly Leu Pro Tyr 260 265 270 Gly Asn Lys Gln Gly Arg Ser Gly Leu Phe Ala Arg Phe Glu Gln Gln 275 280 285 Val Thr Asn Pro Asp Pro Ser Ser Thr Arg Gly Leu Thr Val Phe Gly 290 295 300 Ala Ile Leu Gln Ser Thr Ser Gly Gln Ala Ile Glu Asp His Phe Val 305 310 315 320 Gln Leu Gly Leu Val Gln Lys Gly Thr Phe Ala Ser Arg Pro Gln Asp 325 330 335 Asn Ile Ala Phe Val Ile Thr Gln Gln Lys Tyr Ser Asp Gln Ala Ile 340 345 350 Glu Asn Leu Arg Leu Ala Arg Ala Ser Ala Gly Gly Thr Gly Thr Pro 355 360 365 Ala Asp Asn Gln Ile Met Met Glu Leu Ser Tyr Gly Ile Gln Val Thr 370 375 380 Lys Gln Leu Arg Ile Ala Pro Asn Leu His Tyr Val Ile Asn Pro Asp 385 390 395 400 Gln Phe Asn Glu Pro Thr Arg Thr Asn Asp Leu Lys Asn Ala Leu Ile 405 410 415 Ala Gly Leu Arg Ile Asp Trp Asn Leu 420 425

Claims (7)

  1. 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 OprBXo(outer membrane protein B in Xoo)를 과발현 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)에 의한 벼흰잎마름병(bacterial leaf blight of rice) 방제 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 과발현은 상기 잔토모나스 오리재에 상기 OprBXo 유전자를 포함하는 플라스미드를 도입시킴으로써 수행되는 것인, 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병 방제 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 벼흰잎마름병 방제는 잔토모나스 오리재의 운동성을 감소시킴으로써 달성되는 것인, 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병 방제 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 벼흰잎마름병 방제는 잔토모나스 오리재의 생체막(biofilm) 생성을 감소시킴으로써 달성되는 것인, 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병 방제 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 벼흰잎마름병 방제는 잔토모나스 오리재에 감염된 식물체의 병변의 확대를 억제함으로써 달성되는 것인, 잔토모나스 오리재에 의한 벼흰잎마름병 방제 방법.
  6. 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 OprBXo(outer membrane protein B in Xoo)를 코딩하는 유전자를 Marker Exchange Mutagenesis에 의해 넉아웃(knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)의 환경 스트레스 저항성을 감소시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 환경 스트레스는 산화 스트레스 또는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 스트레스인 것을 특징으로 하는, 잔토모나스 오리재의 환경 스트레스 저항성을 감소시키는 방법.
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