KR102409330B1

KR102409330B1 - 수박 과실썩음병균의 CmpAc 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102409330B1
Application number: KR1020200098590A
Authority: KR
Inventors: 한상욱; 김민영
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2022-06-15
Also published as: KR20220018281A

Abstract

본 발명은 식물체에서 과실썩음병을 일으키는 병원균인 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)에 존재하는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase; CmpAc)에 관한 것으로, 상기 병원균의 병독성에 관여하는 CmpAc의 기능 규명에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CmpAc 유전자의 발현 또는 단백질의 활성 억제제는 과실썩음병을 일으키는 엑시도보락스 시트룰리의 병독성에 영향을 미치는 CmpAc의 발현 또는 활성을 억제함으로써 과실썩음병에 대한 우수한 방제 효과를 나타내므로, 과실썩음병 방제용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

수박 과실썩음병균의 CmpAc 단백질 및 이의 용도 {CmpAc protein in Acidovorax citrulli and uses thereof}

본 발명은 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)의 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 과실썩음병(bacterial fruit blotch) 방제용 조성물 및 이를 이용한 과실썩음병 방제 방법 등에 관한 것이다.

엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli; 이전에는 A. avenae subsp. citrulli로 알려짐, 이하 “Ac”라 함)는 그람음성, 막대 모양의 종자 전염성(seed-borne) 박테리아이다. Ac는 수박, 멜론 및 기타 박과 작물에서 과실썩음병(bacterial fruit blotch; BFB)의 원인 물질이다. Ac에 감염된 모종(seedling)은 초기 증상으로서 떡잎에 수침상 병변(water-soaked lesion)이 나타나고, 최근에 만들어진 식물이 붕괴되면서 결국 모종이 위축되고 죽게 된다. 과일의 경우, 감염된 수박은 어둡고 올리브 같은 병변을 보인다. 병기가 진행되면 수침상 병변은 점점 확산되고 종국에는 과육의 부패 및 붕괴가 일어난다. 수박의 생산에 있어서 질병은 중요한 요소 중 하나임에도 불구하고, Ac에 대한 내성을 갖는 수박 계통(line) 또는 품종(cultivar)은 확인된바 없다. 따라서 과실썩음병의 효율적인 관리에는 한계가 있으며, 이러한 이유로 과실썩음병은 여전히 전 세계 박과 작물 산업에 중대한 위협 요소로 남아있다.

Ac는 두 가지 균주(strain)로 분류된다: 그룹 I 균주는 일반적으로 수박을 제외한 멜론에 병독성(virulence)이 있으며, 그룹 II 균주는 주로 수박에 대한 병독성이 있고 다른 박과(Cucurbitaceae)에는 중간 정도의 병독성이 있다. 이전의 연구에 따르면, 손상된 트위칭 운동성(twitching mobility) 및 바이오필름 형성을 나타내는 돌연변이체는 멜론에 대한 병독성이 덜하였으며, Ac의 IV형 선모(pili) 또한 표면 부착 및 병독성에 관여하는 것으로 나타났다. Ac의 바이오필름 형성은 열 및 삼투 스트레스(osmotic stress)에 대한 내성과 pH 변화에서 중요한 역할을 하며, 극편모(polar flagellum)는 멜론에 대한 완전한 병독성과 관계되어 있다고 보고된바 있다. Ac 또한 다른 그람음성 식물 병원성 박테리아와 마찬가지로 III형 분비 시스템(type III secretion system; T3SS), HrpG 및 HrpX에 대한 조절 단백질이 병독성을 나타내는데 필수적으로 요구된다. 최근에는 Ac에서 다양한 III형 이펙터(type III effector)가 특징지어진바 있다. 즉, Ac의 병독성에 대해 트위칭 운동성, 바이오필름 형성 및 T3SS와 관련된 메커니즘은 활발한 연구가 이루어지고 있다. 그러나, Ac의 다른 병독성 인자 및 이의 메커니즘에 대해서는 여전히 이해가 부족한 실정이다. 게다가, 대부분의 연구는 그룹 II가 아닌 그룹 I에 속하는 Ac 균주에 초점이 맞춰져 있다.

한편, 코리스메이트 뮤테이스(chorismate mutase)는 방향족 아미노산의 합성을 담당하는 쉬키메이트 경로(shikimate pathway)에서 매우 중요한 효소 중 하나이다. 이 효소는 코리스메이트를 촉매하여 페닐알라닌 및 티로신의 생합성 과정에서 중간 분자인 프리페네이트(prephenate)를 생성한다. 특히, 다수의 세균성 코리스메이트 뮤테이스는 이작용성 단백질(bifunctional protein)로서, 코리스메이트 뮤테이스 및 프리페네이트 탈수효소(dehydratase)에 대한 2개의 촉매 능력을 가진다. 이들 이작용성 단백질은 티로신보다는 페닐알라닌 생산에 없어서는 안 되는 요소인데, 이는 프리페네이트 탈수효소가 티로신의 생합성에는 관여하지 않지만 페닐알라닌의 생합성에는 관여하기 때문이다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 코리스메이트 뮤테이스는 결핵의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된바 있다. 또한, 쉬키메이트 경로와 관련된 유전자가 톡소플라빈(toxoflavin)의 생산에 관여하는 것으로 보고되었는데, 이는 벼알마름병균(Burkholderia glumae)에서 주요 병독성 인자 및 UV에 대한 내성 중 하나로 알려져 있다. 그러나, Ac에서 병독성 또는 다른 메커니즘과 관련된 코리스메이트 뮤테이스의 기능은 보고된 바가 없다.

KR

10-1608413

B1

본 발명자들은 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)의 추정 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(putative bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase)가 과실썩음병(bacterial fruit blotch)에서 병독성을 일으키는 핵심 인자임을 새롭게 발견하고, 상기 효소가 결핍된 균주의 경우 병원성이 없음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 엑시도보락스 시트룰리의 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 과실썩음병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 과실썩음병 방제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 과실썩음병 방제용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)의 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 과실썩음병(bacterial fruit blotch) 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엑시도보락스 시트룰리는 KACC17005 균주(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 유전자의 발현을 억제하는 제제는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질의 활성을 억제하는 제제는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드, 항체, 앱타머 및 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 과실썩음병은 수박(watermelon) 또는 멜론(melon)에서 발병되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 엑시도보락스 시트룰리의 병독성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 엑시도보락스 시트룰리의 트위칭 운동성(twitching motility) 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성을 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 과실썩음병의 치료를 필요로 하는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는, 과실썩음병의 방제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli) 균주에 후보 물질을 처리하느 단계; (b) 상기 균주에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 단백질의 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 감소한 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 과실썩음병 방제용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 식물체에서 과실썩음병(bacterial fruit blotch)을 일으키는 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli) 균주의 병독성에 핵심적인 역할을 하는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase)의 발현 또는 활성을 억제함으로써 과실썩음병을 방제할 수 있는 효과가 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 엑시도보락스 시트룰리의 트위칭 운동성과 외부 스트레스에 대한 저항성을 감소시키고 이에 따라 병독성이 현저히 약화되는 효과가 있으므로, 과실썩음병균에 대한 방제용 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있으며, 이를 통해 과실의 품질을 향상시키고 수확량을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 및 도 1b는 Ac의 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(CmpAc)의 추론된 아미노산 서열 분석 결과를 나타낸 도이다:
도 1a는 CmpAc의 예측 도메인으로서, 빨간색 및 파란색 상자는 각각 코리스메이트 뮤테이스 타입 II 패밀리 및 프리페네이트 탈수효소 패밀리 도메인을 나타낸다;
도 1b는 CmpAc(ATG94418), Ac 균주 AAC00-1의 프리페네이트 탈수효소(ABM33842), 버크홀데이라(Burkholderiales) 박테리아의 코리스메이트 뮤테이스(OGA85719) 및 노카르디오이데스 종(Nocardioides sp. SLBN-35)의 프리페네이트 탈수효소(TQK66165)의 서열을 비교한 도이다('*'. ':' 및 '.'는 각각 동일한 잔기, 보존 치환 및 반보존 치환을 나타냄).
도 2a 내지 도 2e는 수박에 종자 발아 및 침투 접종법을 사용하여 Ac(EV), AcΔcmpAc(EV) 및 AcΔcmpAc(CmpAc)에 대한 병원성 분석 결과를 나타낸 도이다:
도 2a는 수박 모종에 발아 종자 접종법 시행 후 7일째에 찍은 사진이다;
도 2b는 접종 7일 후 감염된 잎의 주맥(midrib)을 입체현미경으로 관찰한 사진이다;
도 2c는 접종 후 7일 동안 접종된 모종의 질병지수(disease index; 수식 1)의 변동을 나타낸 그래프이다;
도 2d는 접종 후 8일까지 감염된 잎에서의 박테리아 개체수를 콜로니 카운팅법으로 측정한 결과를 나타낸 도이다[그래프에서 오차 막대의 다른 문자는 분산분석(ANOVA; p < 0.05) 및 Tukey HSD^ab에 의한 통계적 유의성을 나타냄];
도 2e는 각 균주에 감염된 후 8일이 경과한 시점에서의 수박 본엽 사진으로서, 천공된 잎 디스크 부분은 접종된 지역이었다.
도 3a 내지 도 3d는 TSB, M9, 티로신을 함유한 M9 및 페닐알라닌을 함유한 M9 배지를 사용한 영양요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다[오차 막대는 평균의 표준오차를, 다른 문자는 Tukey HSD^ab (P < 0.05)의 분산분석에 의한 통계적 차이를 나타냄]:
도 3a는 TSB 배지에서의 박테리아 생장을 12시간 간격으로 96시간 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 3b는 아미노산이 결여된 M9 배지에서의 박테리아 생장을 24시간 간격으로 7일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 3c는 1 mM 티로신이 함유된 M9 배지에서의 박테리아 생장을 24시간 간격으로 7일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 3d는 1 mM 페닐알라닌이 함유된 M9 배지에서의 박테리아 생장을 24시간 간격으로 7일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 Ac 및 AcΔcmpAc에서의 비교 단백체 분석 결과를 나타낸 도이다:
도 4a는 Ac 및 AcΔcmpAc에서 각각 더 풍부한 71개 단백질 및 80개 단백질을 나타낸 벤다이어그램이다;
도 4b는 단백체 분석에서 차별적으로 풍부한(> 2배) 단백질의 COGs 분류를 나타낸 도이다(약어: C, 에너지 생산 및 전환; D, 세포주기 조절 및 유사분열; E, 아미노산 대사 및 수송; F, 뉴클레오티드 대사 및 수송; G, 탄수화물 대사 및 수송; H, 코엔자임 대사; I, 지질 대사; J, 번역; K, 전사; L, 복제 및 복구; M, 세포벽/세포막/외피 생물발생; N, 세포 운동성; O, 번역 후 변형, 단백질 회전율, 샤페론 기능; P, 무기이온 수송 및 대사; Q, 이차 구조; S, 알려지지 않은 기능; T, 신호전달; U, 세포 내 트래피킹 및 분비; V, 방어 메커니즘).
도 5a 및 도 5b는 Ac(EV), AcΔcmpAc(EV) 및 AcΔcmpAc(CmpAc)의 트위칭 운동성 헤일로 생성을 보여주는 도이다[오차 막대는 평균의 표준오차를, 다른 문자는 Tukey HSD^ab (P < 0.05)의 분산분석에 의한 통계적 차이를 나타냄]:
도 5a는 생성된 콜로니 및 헤일로의 직경을 측정한 그래프로서, 검은색 막대 그래프는 콜로니의 직경을, 흰색 막대 그래프는 트위칭 헤일로의 직경을 나타낸다;
도 5b는 입체현미경을 이용한 콜로니 및 트위칭 헤일로 생성을 관찰한 사진이다(검은선, 헤일로의 직경; size bar, 2 mm).
도 6은 삼투 스트레스에 대한 저항성을 분석한 도로서, 2.5% 염화나트륨을 10분 동안 처리한 후 회수된 박테리아의 수를 콜로니 카운팅법에 의해 계수하여 그래프로 나타낸 것이다[오차 막대는 평균의 표준오차를, 다른 문자는 Tukey HSD^ab (P < 0.05)의 분산분석에 의한 통계적 차이를 나타냄].

Ac는 박과 작물에서 과실썩음병을 일으키는 식물 병원성 박테리아로서 그 중요성에도 불구하고 Ac의 병독성 인자(virulence factor) 및 이의 메커니즘은 거의 연구된바 없었다. 본 발명자들은 단백체 분석(proteomic analysis) 및 표현형 분석을 통해 CmpAc의 기능을 규명하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 CmpAc가 결여된 Ac 균주인 AcΔ(EV)는 발아 종자 접종(germinated-seed inoculation) 및 잎 침윤(infiltration)에서 수박에 대한 병독성이 현저히 적었다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 서열 분석을 통해 CmpAc는 2개의 별개의 도메인, 코리스메이트 뮤테이스 및 프리페네이트 탈수효소를 보유하고 있음을 발견하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 영양요구성 분석(auxotrophic assay)에 의해 AcΔ(EV)는 페닐알라닌의 존재 하에서는 생장한 반면, 티로신 존재 하에서는 생장하지 않음을 확인하여, 페닐알라닌의 생합성에는 CmpAc가 필요하지만 티로신은 그렇지 않음을 보여주었다(실시예 3 참조).

나아가, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 비교 단백체 분석을 통해 CmpAc는 주로 세포벽, 세포막 및 외피(envelope)의 생합성에 관여 함을 증명하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 결과에 기초하여, 다양한 표현형 분석을 수행하였다. AcΔ(EV)는 트위칭 헤일로(twitching halo)의 생성이 감소되었고, 더 낮은 삼투 스트레스에 대한 저항성을 나타냈다(실시예 5 참조).

따라서 본 발명은, 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli; 이하 “Ac”) 내에 존재하는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase; 이하 “CmpAc”유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 과실썩음병(bacterial fruit blotch) 방제용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 제제는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 CmpAc의 유전자 서열, 상기 유전자 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 miRNA(microRNA), siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CmpAc 단백질에 특이적으로 결합하여 CmpAc의 활성을 억제하는 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 압타머(aptamer) 및 화합물 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 siRNA는 CmpAc를 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것으로, 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 또한, 상기 펩티드 미메틱스는 CmpAc의 결합 도메인을 억제하여 CmpAc 단백질의 활성을 억제하는 것으로, 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있으며, 구조적으로 강제된(conformationally constrained) 펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 펩티드 미메틱스는 CmpAc의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자다. 상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법 또는 파아지 항체 라이브러리 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 앱타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있으며, 표적에 특이적으로 결합하여 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

본 발명의 세균성 점무늬병 방제용 조성물은 용액제, 유제, 현탁액, 분산성 산제, 수용성 산제, 과립제, 펠렛제, 페이스트 및 농축액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 에어로졸 형태의 분산성 산제(스프레이)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어, “엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)”는 그람음성, 막대 모양의 종자 전염성 박테리아로서, 수박, 멜론 및 기타 박과 작물에서 과실썩음병을 일으키는 주요 원인이다. 상기 엑시도보락스 시트룰리는 “A. avenae subsp. citrulli” 또는 “과실썩음병균”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “과실썩음병(Bacterial fruit blotch, BFB)”은 과일에 짙은 암갈색 얼룩무늬의 전형적인 병징을 나타내는 병을 의미하는 것으로서, 초기에는 과실에 직경 3-5 mm 정도 원형의 오목한 암록색 반점이 생겨나고, 이것이 점차 커지면서 진전되어 7-10일 만에 과실 전체를 덮는다. 초기 병반은 더욱 오목해져 결국 과피에 구멍을 내게 된다. 그러면 과실 내부가 부패되어 내용물이 새어 나오게 된다. 병반이 과피를 뚫지 않고 치료되는 경우는 병반부는 말라 구열(龜裂)하게된다. 잎에는 처음 수침상의 작은 반점이 형성되고, 이것이 불규칙적으로 점차 확대되면서 병반의 중심부는 조직이 용해되어 투명한 유침상(由浸狀)의 점무늬를 형성하게 된다. 유묘에서는 떡잎의 안쪽에 수침상의 병반을 형성한다.

본 발명에 있어서, 상기 과실썩음병은 수박(watermelon) 또는 멜론(melon)에서 발병되는 것일 수 있으며, 특히 상기 엑시도보락스 시트룰리가 KACC17005 균주(strain)인 경우에는 주로 수박에서 과실썩음병을 일으킨다고 보고되어 있다.

또한, 본 발명에 따른 과실썩음병 방제용 조성물은 엑시도보락스 시트룰리의 병독성을 감소시키는 것을 특징으로 한다. 상기 병독성 감소는 엑시도보락스 시트룰리의 트위칭 운동성(twitching motility) 감소 또는 외부 스트레스, 예를 들어 삼투 스트레스, 항생제에 대한 스트레스 등에 대한 저항성 감소가 원인이 되어 나타나는 것일 수 있다.

상기로부터 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 과실썩음병의 치료를 필요로 하는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는 과실썩음병의 방제 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 식물(체)는, 바람직하게는 수박 또는 멜론이나, 이에 한정되지 않고 엑시도보락스 시트룰리에 감염되어 과실썩음병을 나타내는 식물(체)을 모두 포함한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 엑시도보락스 시트룰리의 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 유전자를 넉아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 엑시도보락스 시트룰리의 병독성 저해 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 과실썩음병 방제용 물질의 스크리닝 방법 또는 엑시도보락스 시트룰리의 병독성 저해제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 상기 스크리닝 방법은 (a) 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli) 균주에 후보 물질을 처리하느 단계; (b) 상기 균주에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 단백질의 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 감소한 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 (b)의 발현 수준을 측정하는 것은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학분석법(immunohistochemical analysis), RealTime-PCR, qRT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting), 노던 블롯(Northern Blotting) 또는 유세포 분석법(FACS) 중 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 전사체(물) 또는 그로부터 암호화된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험 재료 및 방법

1. 균주 및 생장 조건

그룹 II에 속하는 엑시도보락스 시트룰리(이하 “Ac”) 균주 KACC17005를 야생형 균주로 사용하였다. Ac 균주는 28℃ TSB(Tryptic Soy Broth Soybean-Casein Digested, 30 g/L)에서 생장시켰다. 유전자 클로닝 및 작제물 생성에는 대장균(Escherichia coli) 균주 DH5α가 사용되었다. Tn5를 함유하는 플라스미드를 클로닝하기 위해, 특이적 복제 프로모터를 갖는 대장균 균주 EC100D를 사용하였다. 대장균 균주는 적절한 항생제를 사용하여 LB(Luria Bertani; 1% tryptone, 0.5% yeast extract 및 1% NaCl) 배지에서 37℃로 배양하였다. 선별 및 연구를 위해, 항생제를 다음의 농도로 배지에 첨가하였다: 카나마이신, 50 μg/mL; 리팜피신, 50 μg/mL; 젠타마이신, 10 μg/mL; 및 암피실린, 100 μg /mL.

2. AcΔcmpAc 의 선택 및 보완된 균주(complemented strain)의 생성

Ac의 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프레페네이트 탈수효소(이하 “CmpAc”에 대한 넉아웃 돌연변이체는 EZ-Tn5™ <R6Kγ삽입 키트(Lucigen, 미국)로 생성된 Tn5 삽입 라이브러리를 스크리닝하여 확인하였다. 선택된 돌연변이체로부터 유전체(genomic) DNA를 추출한 후, 제조사(Lucigen)의 프로토콜을 사용하여 Tn-5에 의해 중단된 DNA 단편을 클로닝하였다. 중단된 영역은 하기 2개의 프라이머를 사용하여 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)에 의해 확인되었다:

KAN-2F, 5'-acctacaacaaagctctcatcaacc-3' (서열번호 3); 및

R6KAN-2R, 5'-ctaccctgtggaacacctactct-3' (서열번호 4).

동정된 돌연변이체는 AcΔcmpAc로 명명되었다. 보완성 균주에 대한 작제물을 생성하기 위해, 하기의 cmpAc 특이적 프라이머를 사용하여 cmpAc의 ORF(open reading frame)를 증폭하였다:

5'-aagcttatgtcccaatcccc-3', (서열번호 5); 및

5'-ggatcctcagtggtggtggtggtggtgcggcgccaccg-3' (서열번호 6).

앰플리콘(amplicon)은 pGem-t easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하여 pGem-CmpAc를 생성하였고, 이를 생어 시퀀싱에 의해 확인하였다. 확인된 pGem-CmpAc 플라스미드를 HindIII 및 BamHI으로 분해하고, 분해된 CmpAc 작제물을 다시 LacZ 프로모터를 함유하는 넓은 숙주 범위 벡터인 pBBR1-MCS5로 클로닝하여 pBBR1-CmpAc를 생성하였다. 이렇게 만든 pBBR1-CmpAc 플라스미드는 전기천공법(electroporation)에 의해 AcΔcmpAc 세포에 도입되었다. 형질전환체를 적절한 항생제를 사용한 TSA에서 선별하고, 상기 cmpAc 앰플리콘의 클로닝에 사용되었던 cmpAc 특이적 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 6)를 사용하여 PCR에 의해 확인하여, 보완성 균주 AcΔcmpAc(CmpAc)를 생성하였다. pBBR1-MCS5 벡터에 의해 야기되는 부작용을 최소화하기 위해, 상기 벡터를 Ac 및 AcΔcmpAc에 도입하여 각각 Ac(EV) 및 AcΔ(EV)를 생성 하였다. 형질전환체는 적절한 항생제를 사용한 TSA에서 선별하고, 하기의 pBBR1-MCS5 특이적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다:

5'-cagggttttcccagtcacga-3' (서열번호 7); 및

5'-atgcttccggctcgtatgtt-3' (서열번호 8).

3. 병원성 검사(pathogenicity test)

파트너종묘 사(대한민국)에서 제공하는 시트룰러스 라나투스 var. 불가리스(Citrullus lanatus var. vulgaris) 라인 SBA를 접종에 사용하였다. 병원성 분석을 위해, 두 가지 접종 방법(발아 종자 접종 및 침윤)을 수행하였다. 발아 종자 접종의 경우, 기존에 알려진 프로토콜[Bahar O et al. (2009) Type IV Pili Are Required for Virulence, Twitching Motility, and Biofilm Formation of Acidovorax avenae subsp citrulli. Mol Plant Microbe In 22 (8):909-920.]을 약간 수정하여 사용하였다. 침투 속도를 개선하기 위해, 종자를 보습 여과지에서 2일 동안 발아시켰다. Ac 균주를 28℃의 TSA 상에서 생장시키고, OD_600nm 값이 0.3이 되도록 10 mM MgCl₂에 현탁시킨 후, 동일한 버퍼를 사용하여 대략 10⁶ CFU(colony forming unit)/mL이 되도록 희석(10^-2)하였다. 발아 종자 10개를 20 mL의 박테리아 현탁액이 담긴 코니컬 튜브에 넣고 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 접종된 종자는 멸균된 토양이 분주된 50 팟 트레이(pot tray)에 뿌려 7일 동안 생장 챔버에서 생장시켰다. 접종된 수박의 질병 중증도는 7일 동안 평가하였다. 질병의 중증도는 0-2 척도를 기준으로 하기 수식 1에 의해 계산되었다(0, 증상 없음; 1, 수침상 지역; 2, 시들음).

[수식 1]

상기 분석을 위해, 10개의 생물학적 복제물이 수행되었다. 침윤을 위해, 발아된 종자를 2주 동안 생장 챔버에서 본엽 4매 단계까지 생장시켰다. Ac 균주는 TSA 플레이트에서 생장시키고, OD_600nm 값이 0.3이 되도록 10 mM MgCl₂에 현탁시킨 후, 10 mM MgCl₂로 희석(10^-3)하였다. 박테리아 현탁액을 3 mL의 바늘 없는 주사기를 사용하여 제1 및 제2 본엽에 침투시켰다. 박테리아 세포 수의 계산을 위해, 침윤된 잎을 콜크 보러(cork-borer; 직경 0.4 cm)로 펀칭하고, 2개의 잎 디스크를 200 μL 멸균수에 넣고 조직 분쇄기를 사용하여 분쇄하였다. 추출된 Ac 세포를 연속적으로 희석하고 항생제를 함유하는 TSA 상에 점 형태로 찍어준 후 28℃ 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 상기 분석에서는 3개의 생물학적 복제물을 사용하였다.

4. 영양요구성 분석(auxotrophic assay)

영양요구성 분석을 위해, 4가지 다른 조건(TSB, M9, 1mM 티로신을 함유한 M9, 및 1mM 페닐알라닌을 함유한 M9)에서 Ac(EV), AcΔcmpAc(EV) 및 AcΔcmpAc(CmpAc)의 박테리아 생장을 평가하였다. Ac 균주는 적절한 항생제를 포함한 TSA 상에서 생장시켰다. 배양된 박테리아 세포를 수확하고 멸균수를 사용하여 2회 세척하였다. 세척 후, 박테리아 세포를 OD_600nm 값이 0.3이 되도록 조정하고, TSB로 희석(10^-3)한 다음, 28℃에서 셰이킹 인큐베이터로 생장시켰다. 박테리아의 생장은 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 OD_600nm에서 12시간 간격으로 5일 동안 측정하였다. M9의 경우, 박테리아 현탁액을 OD_600nm 값이 0.05가 되도록 조정하고, 24시간 간격으로 7일 동안 관찰하였다. 상기 분석을 위해, 각각의 균주에 대하여 3개의 생물학적 복제물을 사용하였다.

5. 단백체 분석(proteomic analysis)

단백체 분석을 위해, Ac 및 AcΔcmpAc가 사용되었고, 기존에 보고된 프로토콜[Park HJ et al. (2020) Profiling Differentially Abundant Proteins by Overexpression of Three Putative Methyltransferases in Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Proteomics 20 (1).]을 사용하여 레이블-프리 샷건 비교 단백체 분석(label-free shotgun comparative proteomic approach)을 수행하였다. 보다 구체적으로, Ac 균주를 TSB에서 생장시키고 OD₆₀₀ 값이 0.5가 되었을 때 원심분리를 하여 수확하였다. 수확된 세포는 초음파 프로세서(Colo Parmer, 미국)에 의해 파괴되었다. 총 단백질은 TCA(trichloroacetic acid) 침전을 사용하여 제조하고, 트립신으로 분해하였다. Sep-Pak Vac 1cc tC18 카트리지(Waters, 미국)를 사용하여 트립신-분해 단백질을 세척한 후, BCA 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 사용하여 펩티드의 농도를 측정하였다. 각각의 샘플 1 μg (3개의 생물학적 복제물을 갖는 2개의 균주)을 LTQ Velos Pro 기기(Thermo Fisher Scientific)에 결합된 스플릿-프리 나노 LC(EASY-nLC II; Thermo Fisher Scientific)에 나노스프레이 이온 모드(nonospray ion mode)로 주입하였다. 트립신으로 분해된 펩티드는 버퍼 A(0.1% 포름산을 함유한 물), 버퍼 B(0.1% 포름산을 함유한 100% 아세토니트릴)를 사용한 물/아세토니트릴 구배하에서 300 nL/min의 유속으로 420분 동안 7.5 cm의 MAGIC C18AQ 200A (5 μm bead size; Michrom BioResources, 미국) 컬럼에 로딩하였다. 질량 스펙트럼의 경우, m/z 300-2000 질량 범위의 6가지 데이터 의존적 MS/MS 스캔이 사용되었다. 동적 배제(dynamic exclusion)는 1회 반복, 0.5분 지속 및 3분 배제하에 허용되었다. 이온 충전 상태 선택은 2⁺ 및 3⁺로 허용되었다. 전체 질량 스캔으로부터, 가장 강한 6개의 이온을 선택하였다.

단백질과 펩티드에 대한 확인 및 정량화 절차는 데이터베이스를 제외하고 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다[Park HJ et al. (2020) Profiling Differentially Abundant Proteins by Overexpression of Three Putative Methyltransferases in Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Proteomics 20 (1).]. MS/MS 스펙트럼은 SEQUEST 탐색 알고리즘과 함께 Thermo proteome discoverer(버전 1.3.0.399)를 사용하여 확인하였다. NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Ac 균주 KACC17005의 유전체 정보가 사용되었다. 신뢰성을 높이기 위해, 타겟-디코이 전략(Target-decoy strategy)을 사용하였다. 2개의 잘못된 절단이 허용되었고, 오발견률(false discovery rate)은 0.01 이었다. 질량 정확도를 위해 100 ppm 전구체를 설정하였고, 확률 점수(probability score)는 최소한 20 이상이었다. Thermo proteome discoverer에 의해 확인된 단백질은 Scaffold 4 (Proteome Software, 미국)로 다시 불러와 비교에 사용되었다. 펩티드 스팩트럼 매치(PSMs)는 비교 분석에 사용되었다. 단백질의 PSM은 샘플의 총 단백질에 대해 정규화하였다. 이 분석에서, 상기 단백질은 3개의 모든 복제물에서의 존재와 비교를 위해 사용되었다. 복제물로부터 정규화된 PSM의 평균을 각각의 단백질에 대해 계산하고, Ac와 비교하여 AcΔcmpAc에서 차등적으로 풍부한(2배 초과) 단백질과 비교하였다. 통계 분석은 student's t-test (P < 0.05)를 사용하여 수행하였다. COG(clustering the orthologous group) 분석은 확인된 단백질의 분류를 위해 사용되었다.

6. 트위칭 운동성 분석(twitching motility assay)

트위칭(연축) 운동성 분석은 기존에 보고된 방법을 약간 변형하여 수행하였다[Turnbull L, Whitchurch CB (2014) Motility assay: twitching motility. Methods Mol Biol 1149:73-86.]. 구체적으로, 박테리아 현탁액을 OD_600nm 값이 0.3이 되도록 조정하고 멸균수로 희석(10^-2)하였다. 5 μL의 박테리아 현탁액을 0.5%의 한천(agar)이 함유된 TSA 배지 상에 점 형태로 찍어준 후, 28℃에서 2일 동안 배양하였다. 트위칭 헤일로(twitching halo) 및 콜로니 직경은 LEICA M205C 입체현미경(stereoscopic microscope; LEICA, 독일)을 이용하여 평가하였다. 상기 분석을 위해, 각각의 균주에 대하여 5개의 생물학적 복제물을 사용하였다.

7. 삼투 스트레스에 대한 내성 평가

삼투 스트레스 조건에서 CmpAc의 영향을 조사하기 위해, 염화나트륨(NaCl) 스트레스 조건에서 분석을 수행하였다. 삼투 스트레스는 박테리아 세포를 OD_600nm 값이 0.3이 되도록 준비하고 2.5% 염화나트륨의 존재하에 10분 동안 배양한 후 연속적으로 희석하여 적절한 항생제를 함유하는 TSA 상에 점 형태로 찍어주었다. 음성 대조군으로는 물을 사용하였다. 생존성(survivability)은 물(음성 대조군)의 박테리아 수에 대한 삼투 스트레스 조건의 박테리아 수의 비율로 계산하였다. 본 스트레스 시험에는 3개의 생물학적 복제물이 분석에 사용되었다.

실시예 1. AcΔcmpAc 균주 확인 및 CmpAc 단백질 서열 분석

그룹 II에 속하는 Ac 균주 KACC17005의 백그라운드 내 Tn5-삽입 라이브러리를 스크리닝하여 Ac의 병독성에 관여하는 유전자를 확인하였다. 본 발명자들은 수박에서 질병을 일으키지 않는 하나의 돌연변이체를 발견하고, 코리스메이트 뮤테이스(accession no. ATG94418)로 주석이 달린 유전자가 Tn5에 의해 파괴되었음을 확인하였다. ATG94418의 추정된 아미노산은 단백질이 2개의 도메인을 보유함을 나타냈다(도 1a): 코리메이트 뮤테이스 타입 II 패밀리(15-91 aa) 및 프리페네이트 탈수효소 패밀리(92-366 aa). 이는 ATG94418이 추정 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프레페네이트 탈수효소 단백질을 암호화함을 나타낸다.

본 발명자들의 예측과 일치되게, 대장균에서도 P-단백질의 N-말단 및 C-말단, 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프레페네이트 탈수효소 단백질은 각각 코리스메이트 뮤테이스 및 프리페네이트 탈수효소의 활성에 필요함이 보고된바 있다. 또한, CmpAc는 다른 그람음성 박테리아의 추정 코리스메이트 뮤테이스 또는 프리페네이트 탈수효소와 높은 상동성을 나타냈다(도 1b). ATG94418은 Ac 균주 AAC00-1의 추정 프리페네이트 탈수효소(accession no. ABM33842)와 100% 유사성을 보였고, 버크홀데리아(Burkholderiales) GWA2_64_37의 추정 코리스메이트 효소(accession no. OGA85719)와 93%의 유사도를, 노카르디오이데스 종(Nocardioides sp.) SLBN-35의 추정 프리페네이트 탈수효소(accession no. TQK66165)와 92% 유사도를 나타내었다. 상기와 같은 결과들은 CmpAc가 다른 박테리아뿐만 아니라 속(genus)에서도 보존되어 있음을 시사하는 것이다. 따라서 ATG94418은 CmpAc (bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase in Ac )로 명명하였다.

실시예 2. Ac 의 병독성에 CmpAc가 필수적임을 확인

CmpAc가 Ac의 독성에 관여하는지 여부를 확인하기 위해 발아 종자 접종 및 침윤(실험예 3 참조)을 수행하였다. 빈 벡터를 갖는 Ac 및 AcΔ 균주인 Ac(EV) 및 AcΔcmpAc(EV)를 각각의 분석에 사용하였다. 또한, pBBR1-MCS5 벡터상에 CmpAc 유전자를 보유하는 보완성 균주 AcΔcmpAc(CmpAc)의 병독성을 시험하였다.

그 결과 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, AcΔcmpAc(EV)에 의해 감염된 종자는 어떠한 증상도 나타나지 않았다. 그러나 Ac(EV)에 감염된 경우에는 전형적인 시들음 증상을 나타내었고, 보완성 균주 AcΔcmpAc(CmpAc)에 감염된 개체는 대부분 반점과 일부 시들음이 유발되었다. 또한 도 2c에 나타낸 바와 같이, AcΔcmpAc(EV)에 의한 질병 중증도는 0 이었지만, 접종 후 7 일째에 Ac(EV)에 의한 질병 중증도는 2였다. AcΔcmpAc(CmpAc)에 의한 질병 중증도는 Ac(EV)의 중증도 단계인 1.4 수준으로 부분 회복되었다. 수박 잎에 침윤시킨 경우도 위 발아 종자 방법과 비교하여 유사한 패턴을 나타냈다(도 2d 및 도 2e). Ac(EV)가 침윤된 잎은 어두워지고 시들었다. 그러나 돌연변이체, AcΔcmpAc(EV)가 침윤된 잎은 어떠한 증상도 나타내지 않았다. AcΔcmpAc(CmpAc)는 Ac(EV)와 유사한 증상을 나타냈다. 감염된 잎에서 AcΔcmpAc(EV)의 박테리아 개체수는 접종 후 2, 4, 6 및 8 일 모두에서 Ac(EV) 및 AcΔcmpAc(CmpAc)의 박테리아 개체수보다 현저히 낮았다. 이러한 결과는 CmpAc가 Ac의 병독성에 필요하다는 것을 시사하는 것이다.

실시예 3. CmpAc 돌연변이체의 영양요구성 확인

코리스메이트 뮤테이스 및 프리페네이트 탈수효소는 페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 아미노산의 합성을 위한 쉬키메이트 경로(shikimate pathway)에서 핵심 효소인 것으로 잘 알려져 있다. 쉬키메이트 경로에서, 코리스메이트 뮤테이스는 페닐알라닌 및 티로신 모두의 합성을 담당한다. 프리페네이트 탈수효소는 페닐알라닌 합성에 필수적이지만, 티로신의 경우는 그렇지 않다. 이에 본 발명자들은 페닐알라닌 또는 티로신의 존재하에 Ac 균주의 생장을 조사하였다.

먼저, 영양 배지(rich medium)에서 3가지 균주의 생장을 조사하였고, 도 3a에 나타난 바와 같이 3가지 균주 모두 유사한 생장 패턴을 보였으며, 이는 CmpAc가 Ac의 증식(multiplication)에 관여하지 않음을 나타내는 것이다. 아미노산이 없는 M9 배지의 경우, AcΔcmpAc(EV)는 생장하지 않았다(도 3b). 이에 반해, Ac(EV) 및 AcΔcmpAc(CmpAc)는 잘 생장하였다. M9 배지에 티로신을 첨가한 경우, 세 가지 균주의 성장 패턴은 M9 배지의 경우와 비슷했다(도 3c). 놀랍게도, 페닐알라닌에 존재하는 M9 배지에서 AcΔcmpAc(EV)의 생장은 Ac(EV) 수준으로 회복되었다(도 3d). 이러한 결과는 AcΔcmpAc(EV)가 페닐알라닌에 대한 영양요구체이지만, 티로신에 대한 영양요구체는 아님을 입증한 것이다.

실시예 4. 단백체 분석(proteomic analysis)

CmpAc가 페닐알라닌의 생합성뿐만 아니라 병독성과 관련이 있음은 상기 실시예 2 및 실시예 3을 통해 명백해졌다. 이에 따라, 본 발명자들은 어떠한 생물학적 또는 세포학적 과정이 CmpAc에 의해 영향을 받는지 예측하기 위해, AcΔcmpAc 균주를 사용하여 COGs(clusters of orthologous groups) 분류를 조합한 비교 단백체 분석(comparative proteomic analysis)을 수행하였다. LC-MS/MS를 통해 일반적으로 913개 및 872개의 단백질이 각각 Ac 및 AcΔcmpAc의 3개의 생물학적 복제물에서 검출되었으며, 이들 단백질을 비교 단백체 분석에 적용하였다. 그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이, 총 53개 및 63개의 단백질만이 검출되었고, 18개 및 17개의 단백질은 각각 Ac 및 AcΔcmpAc에서 보다 풍부(2배 초과)하였다.

상기 차등적으로 풍부한 단백질을 COGs 분석을 사용하여 분류하였다. 먼저, 그룹 E(아미노산 대사 및 수송), I(지방 대사) 및 J(번역)에 속하는 단백질은 AcΔcmpAc와 비교하여 Ac에서 더 풍부하게 검출되었다(도 4b). 또한, 그룹 C(에너지 생산 및 전환), M(세포벽/세포막/외피 생물발생), T(신호전달) 및 U(세포 내 트래피킹 및 분비)로 분류된 단백질은 AcΔcmpAc에서 높게 발견되었다(도 4b). COGs의 모든 범주 중 그룹 M에서 가장 많은 수의 차등적으로 풍부한 단백질이 나타났고, 이는 CmpAc가 세포막/세포벽의 무결성과 관련될 수 있음을 시사하는 결과이다.

실시예 5. AcΔcmpAc (EV)의 트위칭 헤일로(twitching halo) 감소 확인

트위칭 운동성(twitching motility)는 IV형 선모(pili)에 의해 매개되며, Ac를 포함한 박테리아에서 중요한 병독성 인자로 알려져 있다. 또한, 상기 실시예 4의 비교 단백체 분석을 통해 선모의 기능과 관련된 단백질이 발견되었다. 이에 본 발명자들은 0.5% 한천이 함유된 TSA에서 트위칭 운동성 분석을 수행하였으며, 박테리아 콜로니의 직경 및 트위칭 헤일로를 측정하였다.

그 결과 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, Ac(EV), AcΔcmpAc(EV) 및 AcΔcmpAc(CmpAc)의 콜로니 직경은 각각 6.9 mm, 6.5 mm 및 6.9 mm로 나타났으며, 이는 세 가지 균주에서 콜로니의 팽창이 다르지 않았음을 나타낸다. 세 균주의 콜로니 가장자리 변의 모양도 유사하였다. 흥미롭게도, AcΔcmpAc(EV)의 트위칭 헤일로는 Ac(EV)(15 mm)와 비교하여 감소(12.9 mm)된 것으로 확인되었다. AcΔcmpAc(CmpAc)에서 트위칭 헤일로의 직경은 Ac(EV)의 것과 비슷하였다. 이러한 결과는 CmpAc가 병독성과 관련된 트위칭 운동성 및 트위칭 헤일로 형성과 관련이 있음을 증명하는 것이다.

실시예 6. CmpAc와 스트레스 저항성 사이의 연관성 확인

상기 실시예 4의 비교 단백체 분석에서, 세포벽/세포막/외피의 생합성과 관련된 단백질의 풍부도가 대부분 영향을 받았음을 확인하였다. 이는 CmpAc가 세포막/벽의 무결성에 관여한다고 가정할 수 있다. 따라서 다양한 외부 스트레스에 대한 AcΔcmpAc(EV)의 저항성을 시험하였다. 염화나트륨(NaCl)이 삼투 스트레스 유발을 위한 작용제로서 사용되었다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 2.5% 염화나트륨의 존재하에서 Ac(EV)는 10.9% 생존율을 보였인 반면, AcΔcmpAc(EV)는 생존율이 2.9%에 불과했다. 한편, AcΔcmpAc(CmpAc)의 생존성은 Ac(EV) 수준까지 회복되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 CmpAc가 외부 환경적 스트레스에 대한 저항성과 연관되어 있음을 보여주는 것이다.

본 발명자들은 상술한 실시예 2 내지 6을 통해 Ac의 추정 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소, 'CmpAc'가 병독성에 필수적으로 요구되는 것임을 두 가지 상이한 접종 분석법을 사용하여 보여주었다. 또한, 영양 배지에서는 세 가지 Ac 균주 모두에서 생장의 차이가 나타나지 않았으며, 이는 병독성의 감소가 박테리아의 증식 또는 번식에 의한 것이 아님을 확인한 것이다. 실시예 1에서의 서열분석은 Ac에서의 코리스메이트 뮤테이스가 2개의 추정 도메인, 코리스메이트 뮤테이스 및 프리페네이트 탈수효소를 포함하고 있음을 보여주었다. 본 발명자들은 추가로 영양요구성 분석에서 CmpAc가 티로신이 아닌 페닐알라닌의 생합성에 필수적이라는 것을 입증했다. 흥미롭게도, 본 발명에서 연구된 Ac 균주 KACC17005는 코리스메이트 뮤테이스 도메인만을 함유하는 또 다른 추정 코리스메이트 뮤테이스(ATG95797)를 보유하고 있다.

단백체 분석에 의해 세포벽, 세포막 및 외피의 생물발생에 관여하는 단백질의 풍부도가 변화하였음이 드러났다. 특히 그룹 U(세포 내 트래피킹 및 분비)로 분류된 단백질은 오직 AcΔcmpAc에서만 검출되었다. 이러한 결과는 Ac의 손상된 CmpAc가 세포막의 완전성 및/또는 분비 시스템을 변경시킬 수 있음을 의미한다. 따라서 비정상적인 세포막이 약화되고 단백질 추출 단계 동안 쉽게 파괴될 수 있기 때문에 세포벽/세포막/외피의 생물발생과 세포 내 트래피킹 및 분비 관련 단백질이 AcΔcmpAc에서 더 풍부하게 발견되었다고 추정할 수 있다. 또한, 돌연변이체는 Ac(EV)와 비교하여 삼투 스트레스에 대해 감소된 내성을 보였다. 단백체 분석 결과에 더하여, 이들 결과는 CmpAc가 Ac에서 세포막/세포벽/외피 생합성과 관련되어 있음을 지지하는 것이다.

그룹 II에 속하는 Ac 균주에서는 편모-의존적 운동성(flagella-dependent motility) 보다는 트위칭 운동성이 박테리아의 운동에 있어서 더 중요한 메커니즘으로 알려져 있다. 또한, Ac에서 최적의 병독성을 나타내기 위해서는 트위칭 운동성이 요구된다는 사실도 알려져 있다. 마찬가지로, 본 발명자들은 그룹 II에 속하는 Ac 균주 KACC17005의 독성에 기여할 수 있는 트위칭 헤일로의 생성이 AcΔcmpAc(EV)에서 유의하게 감소되었음을 보여주었다.

종합하면, 본 발명자들은 CmpAc가 페닐알라닌의 생합성, 트위칭 운동성 및 트위칭 헤일로, 삼투 스트레스에 대한 저항성과 관련이 있으며, 결국 CmpAc는 Ac의 병독성에 직접적으로 영향을 주는 인자로서 기능한다는 사실을 실험적으로 증명하였다. 따라서 본 발명은 특성화되지 않은 독성 인자에 대한 귀중한 정보를 제공하며, 이는 CmpAc가 과실썩음병(BFB)을 제어하기 위한 항-병독성 시약의 유력한 표적임을 개시한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> CmpAc protein in Acidovorax citrulli and uses thereof <130> MP20-088 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 366 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Acidovorax citrulli <220> <221> DOMAIN <222> (15)..(91) <223> Chorismate mutase type II <220> <221> DOMAIN <222> (92)..(366) <223> Prephenate dehydratase <400> 1 Met Ser Gln Ser Pro Gln Ala Ser Pro Asp Leu Ala Ser Leu Arg Val 1 5 10 15 Gln Ile Asp Asn Ile Asp Gln Gln Leu Leu Thr Leu Leu Asn Gln Arg 20 25 30 Ala Leu Val Ala Glu Arg Val Gly Glu Val Lys Lys Arg Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Pro Asp Arg Val Ala Gln Val Ile Asp Lys Val Gln 50 55 60 His Ala Asn Pro Gly Pro Leu Lys Gly Ala His Val Ala Ala Ile Trp 65 70 75 80 Arg Glu Ile Met Ser Ala Cys Leu Ala Leu Glu Ser Pro Gln Arg Val 85 90 95 Ala Val Leu Gly Pro Ala Gly Thr Phe Cys Glu Gln Ala Ala Val Glu 100 105 110 Phe Phe Gly Gly Ala Ala Asp Leu Met Tyr Cys Ala Asn Phe Asp Glu 115 120 125 Val Phe His Ala Thr Ala Ala Gly Ser Ala Gln Tyr Gly Val Val Gly 130 135 140 Val Glu Asn Ser Val Glu Gly Val Val Thr Arg Ser Leu Asp Leu Phe 145 150 155 160 Leu His Thr Pro Cys His Val Val Gly Glu Val Ser Leu Leu Val Arg 165 170 175 His Asn Leu Leu Arg Leu Ser Asn Ser Leu Asp Gly Ile Glu Val Val 180 185 190 Leu Ala His Pro Gln Ala Leu Ala Gln Cys Gln Ala Trp Leu Ser Lys 195 200 205 His Leu Pro His Ala Glu Arg Arg Pro Val Ser Ser Asn Ala Glu Gly 210 215 220 Ala Arg Leu Ala Ala Gly Asn Pro Ala Trp Ala Gly Ile Ala Ser Glu 225 230 235 240 Arg Ala Gly Ala Gln Phe Gly Leu His Leu Val Ser His Ala Ile Gln 245 250 255 Asp Asp Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Phe Ala Val Ile Cys Leu Pro His 260 265 270 Thr Leu Gln Met Pro Pro Ala Ser Gly Lys Asp Cys Thr Ser Leu Val 275 280 285 Val Ser Val Pro Asn Arg Pro Gly Ala Val His Asp Leu Leu Val Pro 290 295 300 Leu Lys Thr His Gly Val Ser Met Thr Arg Phe Glu Ser Arg Pro Ala 305 310 315 320 Arg Thr Gly Gln Trp Glu Tyr Tyr Phe Tyr Ile Asp Leu Asp Gly His 325 330 335 Pro Ser Gln Pro His Val Ala Lys Ala Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu 340 345 350 Cys Ala Phe Tyr Lys Val Leu Gly Ala Tyr Pro Val Ala Pro 355 360 365 <210> 2 <211> 1101 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Acidovorax citrulli <400> 2 atgtcccaat cccctcaagc gtcccccgat ctcgccagcc tgcgggtgca gatcgacaac 60 atcgaccagc agttgctgac cctcctgaac cagcgcgcgc tggtggccga gcgcgtcggc 120 gaggtcaaga aacgcgaagg caccccgttc tttcgcccgg accgcgtcgc ccaggtcatc 180 gacaaggtgc agcacgccaa tccgggaccg ctcaagggcg cccacgtcgc agcgatctgg 240 cgcgagatca tgtcggcatg cctggccctc gagtcgcccc agcgcgtggc ggtgctcggc 300 ccggccggca cattctgcga gcaggcggcc gtggagttct tcggcggcgc cgcggacctc 360 atgtactgcg ccaacttcga cgaggtgttc catgccacgg cggccggcag cgcacagtac 420 ggcgtggtcg gtgtcgagaa ctcggtggaa ggcgtggtga cacgctcgct cgacctgttc 480 ctgcacaccc cctgccacgt ggtgggtgaa gtgagcctgc tggtgcgcca caacctgctg 540 cgcctgtcca actccctgga cggcatcgag gtggtactgg cccatcccca ggcgttggcc 600 cagtgccagg cctggttgtc caagcacctg ccgcacgcgg agcgccgtcc ggtctccagc 660 aatgccgagg gcgcgcggct ggcggcaggg aaccctgcgt gggcgggcat cgcgagcgag 720 cgcgccggcg cgcagttcgg cctgcatctg gtgtcgcacg ccatccagga cgatgcctac 780 aaccgcacgc gcttcgccgt catctgcctg ccgcacacgc tgcagatgcc gccggcttcc 840 ggcaaggact gcaccagcct cgtggtgtcg gtgcccaacc gcccgggcgc ggtgcacgac 900 ctgctggtgc cgctcaaaac gcacggtgtt tccatgaccc gcttcgagtc gcgccccgcg 960 cgcacgggcc agtgggaata ctatttctac atcgacctcg acggccaccc cagccagccc 1020 cacgtggcca aggccctgga ggagctgcgt tcgctctgcg cgttctacaa ggtgctcggc 1080 gcctatccgg tggcgccgtg a 1101 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer, KAN-2F <400> 3 acctacaaca aagctctcat caacc 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer, R6KAN-2R <400> 4 ctaccctgtg gaacacctac tct 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer, cmpAc ORF <400> 5 aagcttatgt cccaatcccc 20 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer, cmpAc ORF <400> 6 ggatcctcag tggtggtggt ggtggtgcgg cgccaccg 38 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer, pBBR1-MCS5 <400> 7 cagggttttc ccagtcacga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer, pBBR1-MCS5 <400> 8 atgcttccgg ctcgtatgtt 20

Claims

엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)의 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소(bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 과실썩음병(bacterial fruit blotch) 방제용 조성물로서,
상기 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑시도보락스 시트룰리는 KACC17005 균주인 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 유전자의 발현을 억제하는 제제는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질의 활성을 억제하는 제제는 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드, 항체, 앱타머 및 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 과실썩음병은 수박(watermelon) 또는 멜론(melon)에서 발병되는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 엑시도보락스 시트룰리의 병독성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 엑시도보락스 시트룰리의 트위칭 운동성(twitching motility) 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 조성물.
제1항의 조성물을 과실썩음병의 치료를 필요로 하는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는, 과실썩음병 방제 방법.
(a) 엑시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli) 균주에 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 균주에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 단백질의 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 감소한 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 과실썩음병 방제용 물질의 스크리닝 방법으로서,
상기 과실썩음병 방제용 물질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 이작용성 코리스메이트 뮤테이스/프리페네이트 탈수효소 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드, 항체, 앱타머 및 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 과실썩음병 방제용 물질의 스크리닝 방법.