KR101621155B1

KR101621155B1 - Omp1X 유전자를 이용하는 바이오필름 형성 억제 또는 방지 방법

Info

Publication number: KR101621155B1
Application number: KR1020140100410A
Authority: KR
Inventors: 한상욱; 박혜지
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2014-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-05-16
Also published as: KR20160017347A

Abstract

본 발명은 Omp1X (outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 바이오필름 (biofilm) 형성 억제 또는 방지 방법에 관한 것이다. 상기 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δ omp1X)에서 운동성 감소 및 바이오필름 형성 억제 효과를 확인하였는바, 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice)의 효과적인 방제방법으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

Omp1X 유전자를 이용하는 바이오필름 형성 억제 또는 방지 방법 {Method for inhibiting or preventing formation of biofilm using Omp1X gene}

본 발명은 잔토모나스 속(Xanthomonas spp .)의 바이오필름 (biofilm) 형성 억제 또는 방지방법으로서, 보다 구체적으로는 Omp1X(outer membrane protein 1 X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 속(Xanthomonas spp.)에 의한 바이오필름 형성 억제방법에 관한 것이다.

벼흰잎마름병은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pathovar . oryzae)이 월동기간 동안 기주식물로 알려진 겨풀, 나도겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚, 벼 그루터기에 잠복해 있다가 관개수에 의해 논으로 이동한 후, 벼 잎의 물구멍과 공기구멍 부위, 절단된 뿌리 등에 침입하여 벼에 감염되고, 감염된 벼에서 증식하여 2차로 전염되는 것에 의해 7월초~수확기, 특히 7월 상순~8월 중순에 발병하는 병해이다. 상기 병원균에 감염된 경우 벼가 말라 죽게 되어 수확량의 감소를 초래하는 바, 벼흰잎마름병원균은 농가에 큰 피해를 초래하는 병원균으로 알려져 있다.

종래에는 벼흰잎마름병원균을 방제하기 위하여 저수지나 관개수로에 있는 병원균의 기주식물을 제거하는 방법, 질소질 비료의 사용량을 조절하는 방법, 벼가 물에 잠기지 않도록 하고, 만약 잠기게 되면 최대한 빨리 물을 빼주어 침수시간을 짧게 하여 병원균과의 접촉을 차단하여 병의 전염을 방지하는 방법 및 약제를 사용한 방법 등을 사용하여 왔다. 그러나 상기한 방법들은 그 효과가 매우 미비한 실정이다. 특히 약제 방제법은 환경오염의 우려가 있고 다른 유익한 균주의 사멸을 초래하는 등의 문제점이 지적되었다. 따라서, 벼흰잎마름병원균을 자연 친화적이며 특이적으로 방제하여 농가의 피해를 최소화할 수 있는 새로운 방제방법의 개발이 절실히 필요한 상황이다.

한편, Xanthomonas oryzae pv . oryzae (Xoo)는 그람음성세균으로서, 다른 병원성 세균과 마찬가지로, 생물 군락 및 이들이 생성시키는 세포외 매트릭스를 포함하는 3차원적인 미생물 성장 형태인 바이오필름(biofilm)을 형성한다. 상기 바이오필름이 형성됨에 따라, 전단력, 열 등의 물리적 스트레스에 대한 보호 작용을 미생물에 부여하며, pH, 항생제, 과산화수소, 하이포클로라이트(hyphochlorite)와 같은 미생물을 사멸시키는 화합물의 전달을 방해하여 바이오필름 내부에 존재하는 미생물을 보호하며, 바이오필름 안에서 생장하는 미생물은 자체의 생리가 변하여 일반적인 미생물보다 다양한 스트레스에 대한 내성을 보유하므로 바이오필름을 형성한 미생물은 제거하기가 어렵게 된다. 따라서, 이러한 바이오필름의 형성은 벼흰잎마름병과 같은 세균성 감염 질환에 대한 항생제등의 치료를 무력화시킬 뿐만 아니라, Xanthomonas oryzae pv . oryzae (Xoo)와 같은 병원균을 퍼트리는 역할을 한다.

따라서, 벼흰잎마름병원균과 같은 세균성 감염의 방제 수단으로서, 바이오필름 형성의 억제가 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2013-0063887), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 Omp1X(outer membrane protein 1 X) 유전자의 넉아웃 (knock-out)을 일으킨 군(Xoo Δ omp1X)에서 벼흰잎마름병균의 운동성 감소 및 바이오필름 (biofilm) 형성 억제 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 Omp1X(outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp .)에 의한 바이오필름 (biofilm) 형성 방지 또는 억제방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 Omp1X(outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice) 방제방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Omp1X(outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp .)에 의한 바이오필름 (biofilm) 형성 방지 또는 억제방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계는 Marker Exchange Mutagenesis에 의하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp .)은 잔토모나스 알빌리네안스 (Xanthomonas albilineans), 잔토모나스 암펠리나 (Xanthomonas ampelina), 잔토모나스 아크쏘노포디스 (Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 잔토모나스 프라가리아이 (Xanthomonas fragariae), 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv . oryzae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 Omp1X(outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice) 방제방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 Omp1X (outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하며, 상기 유전자를 넉아웃시킨 군(XooΔomp1X)에서 운동성 감소 및 바이오필름 (biofilm) 형성 억제 효과를 확인하였는바, 바이오필름 (biofilm) 형성 억제에 의한 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice)의 방제방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, Omp1X 유전자의 기능을 저하시킬 수 있는 천연 물질을 이용한다면 방제방법에 효과적으로 대체할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 Omp1X (outer membrane protein 1 in Xoo) 단백질의 3차원적 구조를 PyMOL molecular graphics system을 통하여 확인한 결과이다 (빨간색: α-Helices 구조, 노란색: β-strands구조).
도 2는 Omp1X 단백질을 구성하는 아미노산 서열을 나타낸 결과이다 (빨간색: α-Helices 구조, 노란색: β-strands 구조).
도 3은 3개의 Biological replicates로부터 야생형 (Xoo)과 Omp1X 유전자를 넉아웃 시킨 군 (XooΔomp1X)의 단백질 발현 양상을 비교한 모식도이다.
도 4는 야생형 (Xoo)에서만 발현 또는 과발현되는 단백질의 종류와 수를 나타낸 결과이다.
도 5는 Omp1X 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δ omp1X)에서만 발현 또는 과발현되는 단백질의 종류 와 수를 나타낸 결과이다.
도 6은 (a) Motiliy assay에서 Colony의 직경을 측정한 결과 및 (b) 사진이다 (1: 야생형 (Xoo), 2: 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δ omp1X), 3: complement strain 군 (Xoo Δ omp1X ( Omp1X )).
도 7은 polyvinyl chloride plate assay에서 바이오필름 형성을 590 nm optical density에서 측정한 결과이다 (1: 야생형 (Xoo), 2: 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δ omp1X), 3: Complement strain 군 (Xoo Δ omp1X ( Omp1X )).

본 발명자들은, Omp1X (Outer membrane protein 1 in Xanthomonas oryzae pv . oryzae) 단백질의 3차원적 구조를 확인하고, Omp1X 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δomp1X)에서 야생형 (Xoo)과 비교할 때, 세포 이동성과 관련된 단백질의 감소, 운동성 감소 및 바이오필름 (biofilm) 형성 억제를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Omp1X (outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp.)에 의한 바이오필름 (biofilm) 형성 방지 또는 억제방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "방지" 및 "억제"는 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp .)의 유전자 조작을 통하여, 생물막의 형성을 지연키거나 생성된 바이오필름을 분해시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "바이오필름 (biofilm)"은 미생물이 분비한 세포외 다량체 기질 (Extracellular Polymeric Matrix)과 증식한 박테리아로 구성된 입체적 구조물로서, 생물체의 조직 표면을 포함하는 모는 고체표면에 형성될 수 있다. 바이오필름이 형성되면, 박테리아는 가혹한 환경에서도 잘 견디는 것은 물론, 항생제 및 면역세포에 대하여 강한 저항력을 가지기 때문에 제거가 매우 어려워 만성 염증 질환의 원인이 되기도 한다. 최근 보고에 의하면, 전체 감염성 질환의 65% 정도가 바이오필름 형성이 주요인으로 알려져 있다. 따라서, 병원성 박테리아에 의한 감염의 방지/치료 또는 질환의 예방/치료에 있어서, 바이오필름 형성의 제어는 중요하다.

본 발명에 따른 바이오필름 (biofilm) 형성 방지 또는 억제의 대상인 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp .)은 잔토모나스 알빌리네안스 (Xanthomonas albilineans), 잔토모나스 암펠리나 (Xanthomonas ampelina), 잔토모나스 아크쏘노포디스 (Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 잔토모나스 프라가리아이 (Xanthomonas fragariae)일 수 있으며, 바람직하게는 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv . oryzae)일 수 있으나, 이에, 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃(knock-out)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절 (down-regulation)을 의미하며, 본 발명에 따른 Omp1X (outer membrane protein 1X) 유전자를 넉아웃 시키는 단계는 Marker Exchange Mutagenesis에 의하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 넉아웃 시키는 유전자인 OMP1X (outer membrane protein 1) 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 이루어져 있거나, 코딩되는 OMP1X 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 PyMOL molecular graphics system을 통하여, Omp1X (Outer membrane protein 1 in Xanthomonas oryzae pv . oryzae) 단백질의 3차원적 구조를 예측하여, Omp1X 단백질은 porin 유사 단백질로서, 외막에 존재한다는 점을 밝혔으며 (실시예 1 참조), 단백체 분석 (proteomic analysis)을 통하여, Omp1X 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δ omp1X)에서 야생형 (Xoo)과 비교할 때, 세포의 이동성과 관련된 단백질 발현의 감소를 확인하였다 (실시예 2 참조). 또한, Omp1X 유전자를 넉아웃 시킨 군 (Xoo Δ omp1X)에서, motility assay를 통하여 운동성 감소(실시예 3 참조) 및 polyvinyl chloride plate assay를 통하여 우수한 바이오필름 (biofilm) 형성 억제효과를 확인하였는바, 벼흰잎마름병 방제를 위한 방법으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.(실시예 4 참조).

이에, 본 발명은 Omp1X (outer membrane protein 1) 유전자를 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice) 방제방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "방제"는 농작물을 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice)으로부터 예방하거나 구제하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 방제의 대상인 벼흰잎마름병 (bacterial leaf blight of rice)은 잔토모나스 오리재 (Xanthomonasoryzae pv . oryzae)에 의해 발병하는 세균병으로서, 보통 출수기 전후에 나타나지만, 상습발생지나 다발생 발생지에서는 본답 초기에 발병한다. 주로 잎에 발생되며, 광합성 부족에 의한 임실률 및 등숙률 저하에 의한 수량 감소 및 품질 저하를 초래하는 질병으로서, 농가에 큰 피해를 초래하는 질병 중 하나로서, 이에 대한 방제가 필요한 실정이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Omp1X 단백질의 3차원적 구조 예측

Omp1X (Outer membrane protein 1 in Xanthomonas oryzae pv . oryzae) 단백질의 구조에 근거하는 기능을 예측하기 위하여, 유사체 기반 예측 (homolog-based prediction)으로서, I-TASSER server와 PyMOL molecular graphics system을 이용하여 단백질의 3차원적 구조를 예측하였다

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, Omp1X 단백질 구조는 Klebsiella pneumonia (KpOmpA)로부터 유래된 외막 단백질 A와 높은 상동성을 나타냈다. 구조간 유사성을 측정할 수 있는 template modeling (TM)-score는 KpOmpA와 Omp1X간에 0.68822를 나타내었다. 이는 0.5 TM-scores 이상은 동일한 SCOP/CATH fold를 공유하는 구조로 판단하는 점에 비추어 상기 예측 구조는 정확한 토폴로지 (correct topology)를 가지고 있음을 의미한다.

Omp1X 단백질은 10개의 β-strands을 갖는 β-barrel domain으로 이루어져 있으며, 상기 β-barrel domain은 일반적인 Gram-negative 세균의 porin과 Outer membrain protein (Omp)에 존재하는 구조이다. 다만, 14, 16, 18의 β-strands으로 이루어진 전형적인 porin과 비교할 때, 10개의 β-strands을 갖는다는 점에서 상대적으로 작은 구조이다.

또한, Omp1X 단백질은 N-terminal에 α-helix 형태의 단일 펩타이드를 가지고 있다. SignalP 4.1 server를 통한 구조 예측에서 N-terminal의 20개 아미노산 및 단일 펩티드를 포함하는 단백질은 절단 (cleaved) 될 수 있다는 점을 확인하였으며, 이는 mature protein은 Xoo의 외막에 위치한다는 점을 나타낸다.

실시예 2. Omp1X 의 단백체 분석 ( proteomic analysis )

Omp1X 단백질의 기능을 조사하기 위하여, Omp1X가 발현의 영향을 미치는 단백질을 proteomic analysis를 통하여 확인하였다.

2-1. 벼흰잎마름병원균의 배양

본 실시예에서, Xanthomonas oryzae pv . oryzae (Xoo)의 strain PXO99A는 야생형 strain으로 이용되었으며, Xanthomonas strain은 peptone sucrose (PS) 배지(peptone10g/L, sucrose 10g/L, L-glutamic acids 1g/L) 또는 tryptic soy (TS) 배지 (Tryptic Soy Broth Soybean-Casein Digested 30g/L)에서 28℃ 조건으로 배양되었다. Escherichia coli DH5α는 벡터에 대한 숙주세포로서, Luria Bertani (LB) 배지에서 37 ℃ 조건으로 배양되었다.

2-2. OMP1X 넉아웃 ( knock - out ) 돌연변이체의 제작

본 실시예에서, 돌연변이체 제작을 위한 유전자 조작은 Sambrook et al (Sambrook, et al., 1989)에 기재되어 있는 표준 프로토콜에 따라 실시하였으며, 돌연변이 선별을 위한 항생물질은 cephalexin (20μg/mL), kanamycin (50μg/mL), gentamicin (10μg/mL) and ampicillin (100μg/mL)을 이용하였다. pUC4K로부터 유래한 kanamycin 저항성 카세트(cassette)와 sucide 벡터인 pGEM-T easy (Promega)를 이용하여 marker exchange mutagenesis에 의해 Omp1X gene을 knockout 시켰다. homologous recombination을 위한 Omp1X DNA 단편은 유전자 특이적 프라이머 (Forward: 5'-gagagagtcgccttgcagtt-3' (서열번호 3), Reverse: 5'-agcgctagagcgtcacattt-3' (서열번호 4))를 이용하여 증폭시켰다.

유전자를 증폭하기 위하여 서열번호 1로 이루어지는 Omp1X 유전자의 염기서열 (NCBI 유전자 은행 등록번호, KJ818481)을 사용하였으며, 플라스미드에서 상기 증폭된 단편 및 kanamycin 저항성 카세트가 도입된 위치를 SpoI로 절단 (digest)하였으며, 변이된 유전자를 가지고 있는 상기 구조물은 Bio-Rad Micropulser™ (2.5kV)에 의하여 전기 천공법 (electroporation)을 통하여 야생형 세포안으로 도입되었다. 이 후, 28 ℃에서 3시간 동안 배양되었고, 50 μg/ml의 kanamycin을 포함하는 PS agar 플레이트에 도말평판 (spread plate)하였다. 상기 플레이트에서 성장하는 집락은 이중교차 (double cross-over)에 대한 선별을 위하여 다시 50 μg/ml의 kanamycin과 50 μg/ml의 kanamycin/ampicillin을 포함하는 PS agar에 plate시켰다. kanamycin만 존재하는 플레이트에서 성장하는 반면, kanamycin/ampicillin에서는 자라지 않은 집락을 채취하였으며, 증폭에 이용된 동일한 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 변이 (insertional mutants) 여부를 확인하였다.

XooΔomp1X strain의 상보성(Complemetation)을 위한 플라스미드를 제작하기 위하여 프로모터 (promotor)로 예측되는 region과 Omp1X 유전자의 open reading frame (ORF) length를 두 세트의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 두 세트의 프라이머는 각각 Forward: 5'-ctgcagccatggtcgacgatgcagctccatccgtgtg-3' (서열번호 5), Reverse:5'-ctcgaggtttcagcagcggaggccgcaacggca-3'(서열번호 6), Forward:5'-gtcgacttaccagctgaagcgcgggc-3'(서열번호 7), Reverse:5'-ctcgagcatcatcatcatcatcatgctgaaaacctctcctacaac-3' (서열번호 8)로 이루어져 있으며, 6x-His tag로 표지된 21bp (base pair) 크기를 갖는다. 두 단편을 pML122 vector에 삽입하였으며, 전기천공법에 의하여, Xoo Δ omp1X에 도입되었다. 3시간 동안 PS broth 배지에서 배양시킨 후, 상기세포는 10 μg/ml의 gentamycin과 50 μg/ml의 kanamycin 이 포함된 PS agar 플레이트에 도말평판(spread plate)하였다. 전기천공법에 의한 strain은 PCR을 통하여 Omp1X유전자를 가지고 있음을 확인하였으며, 재조합 Omp1X 단백질의 발현은 His-tag 항체 및 Omp1X 항체를 이용한 western blot을 통하여 확인하였다.

2-3. 단백질의 추출 및 정제

야생형 (Xoo)과 Xoo Δ omp1X세포는 OD600에서 0.6으로 성장시켰으며, 원심분리 (15 min, 7,300 x g, 28 ℃)를 통해 수득하였다. 수득된 세포 (0.5 g of wet weight) 는 50mM Tris-HCl의 1 ml 용액 (pH7.8)에서 재부유시켰다. 두 번의 세척 후, 수득한 펠렛(pellets)을 lysis buffer (6 M Guanidine-HCl, 10mM DTT, and 50 mM Tris-HCl, pH 7.8) 1ml에 용해시켰다. 재부유된 세포는 Ultrasonic Processor (Cole Parmer)을 이용하여 초음파 분해 (sonication) 시켰다. 상층액을 수거한 후, BCA protein assay kit (ThermoFisher)로 단백질의 농도를 측정하였다. 추출된 단백질 (1,000 μg)은 60℃에서 1시간 동안 배양되었으며, 1시간 동안 100mM의 iodoacetamide로 알킬화 시켰다. 이 후, 1시간 동안 20 mM의 DDT (final concentration)로 다시 배양시켰다. 단백질을 침전시키기 위하여, 0.3 volumes의 ice-cold trichloroacetic acid (TCA)를 추가하고 12시간 동안 4℃에서 배양하였다. 원심분리 (30 min, 15,700 x g, 4℃) 후, 수득한 펠렛은 다시 1 m의 acetone (Sigma)에서 다시 용해시켰으며, 원심분리 후, 펠렛은 건조시켰으며, 다시 50 mM의 ammonium bicarbonate (pH 7.8)에 용해시켰다.

tryptic digestion을 위하여, 5 μg의 trypsin (Promega)을 200 μg의 추출된 단백질에 추가하였으며, 이후, 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 트립신(Trypsin)이 처리된 단백질은 trifluoroacetic acid (TFA, Sigma)를 통하여 산성화되었으며, 불필요한 단백질을 제거하기 위하여, Sep-Pak Vac 1cc tC18 cartridges (Waters)에 load하였다. 0.1% TFA로 카트리지를 세척한 후, 샘플은 1 ml 의 elution buffers (0.1% TFA, 50% acetonitrile)로 처리되었으며, 용리(elution)된 샘플은 Speed Vac concentrator (Vision)에 의하여 건조되었다. 건조된 샘플은 30μl의 0.4% acetic acid를 재부유시키고, bicinchoninic acid protein assay kit (ThermoFisher)을 이용하여 정량화하였다.

2-4. 단백질 발현의 확인

각각의 샘플 (Xoo , Xoo Δ omp1X)로부터 트립신이 처리된 단백질을 분석하기 위하여, LTQ Velos Pro instrument (ThermoFisher)가 연결된 Split free nano LC (EASY-nLC II, ThermoFisher)를 이용하였으며, water/ACN gradient (Solvent A, Water with 0.1% Formic Acid; Solvent B, 100% Acetonitrile with 0.1% Formic Acid)로 녹여서 분리시켰다. 모든 샘플(XOO , Xoo Δ omp1X)에 대해 3개의 biological replicates을 수득하였다.

결과의 해석을 위하여, SEQUEST search algorithm과 Thermo Proteome Discoverer 1.3 (ver. 1.3.0.399)이 이용되었다. 절단 효소로서, Trypsin을 이용하였으며, 2개의 missed cleavage, 0.01 false discovery rate로 설정하였으며, 야생형 (Xoo)과 Xoo Δ omp1X 세포의 단백질 발현을 비교하기 위하여 peptide spectra count (PSM)가 이용되었다. PSMs은 protein으로 동정된 peptide sequence의 전체 수를 의미한다. 본 실시예에서는 샘플의 모든 단백질로부터 얻은 PSM의 전체 개수에 대하여 각 단백질로부터 얻은 PSM의 개수를 정규화하였고, 3개의 biological replicates에서 모두 발현되는 단백질을 선별하여 야생형(Xoo)와 Xoo Δ omp1X strains의 단백질 발현을 비교하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

[표 1]

표 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 biological replicates을 수득하였으며, 야생형 (Xoo)에서는 각각 20,204, 13,889 및 17,375개의 peptide spectral matches (PSMs)로부터 708, 601 및 656개의 단백질을 확인하였다. 또한, Xoo Δ omp1X strain에서는 18,085, 16,422, 및 18,858개의 PSMs로부터 656, 655 및 662개의 단백질을 확인하였다. 상기 단백질에서 세 번의 복제에서 모두 확인된 단백질은 야생형(Xoo)의 경우, 540개, Xoo Δ omp1X strain의 경우 554개로 확인되었으며, 이들은 단백질 발현 패턴을 분석하는데 이용하였다.

도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, Omp1X와 연관된 106개의 단백질을 COG analysis을 통하여 분류하였으며, 이들 중, Xoo Δ omp1X strain에서 48개의 단백질이 과발현되었으며. 야생형(Xoo)에서는 58개의 단백질이 과발현되었다. 보다 구체적으로 야생형(Xoo)은 Xoo Δ omp1X와 비교하여, 세포의 이동성과 관련된 단백질(N)의 과발현을 확인하였다.

참고로, 도 4 및 도 5에 기재되어 있는 C 내지 V는 하기의 기능을 하는 단백질을 의미한다(C: Energy production and conversion, D: Cell cycle control and mitosis, E: Amino Acid metabolism and transport. F: Nucleotide metabolism and transport, G: Carbohydrate metabolism and transport, H: Coenzyme metabolism, I: Lipid metabolism, J: Translation; K: Transcription, L: Replication and repair, M: Cell wall/membrane/envelop biogenesis, N: Cell motility, O: Post-translational modification and protein turnover and chaperone functions, P: Inorganic ion transport and metabolism, Q: Secondary Structure, R: General Functional Prediction only, S: Function Unknown, T: Signal Transduction, U: Intracellular trafficking and secretion, V: Defense mechanisms).

실시예 3. 세포 운동성 평가

세포 운동성에 대한 Omp1X 단백질의 기능을 관찰하기 위하여, semi-solid media (0.3% agar)를 이용하여 motility assay를 실시하였다. 모든 Xoo strains (야생형(Xoo), Xoo Δ omp1X , Xoo Δ omp1X ( Omp1X ))은 TSA plates에서 성장, 수득되었으며, 5 x 108 CFU/mL에서 재부유시킨 후, 3 μl 농도의 배양물은 assay plate (TSA plates containing 0.3% agar)의 중앙에 drop시켰고, 7일 동안 28℃에서 배양시킨 후, Colony의 직경을 측정하였으며, 4 번의 반복실험을 통하여 평균 value값을 산출하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, Xoo Δ omp1X strain의 경우, 야생형 strain과 비교하여, Colony의 직경의 감소를 (2.3배) 확인하였으며, complement strain인 Xoo Δomp1X(Omp1X)는 야생형 (Xoo)과 유사한 크기의 Colony 직경을 확인하였다.

실시예 4. 바이오필름( biofilm )의 형성 평가

바이오필름 (biofilm)의 형성에 대한 Omp1X 단백질의 기능을 관찰하기 위하여, 6-well polyvinyl chloride plate를 이용하여 polyvinyl chloride plate assay를 실시하였다. 모든 Xoo strains (야생형 (Xoo), Xoo Δ omp1X , Xoo Δ omp1X ( Omp1X ))은 PS-agar plates에서 2일 동안 성장, 수득하였으며, 이후 minimal media에서 concentration 105 CFU/mL로 희석시켰다. 96-well PVC microplates (COSTAR)에서 6일 동안 배양시킨 후, 피펫을 통하여 플레이트 내의 planktonic cells을 제거하였다. 남은 세포는 30분 동안 0.1%의 crystal violet으로 염색하였으며, 여분의 crystal violet을 제거하였다. 세포에 부착되어 있는 염색된 착색제는 95% EtOH을 통하여 용해시킨 후, optical density는 590 nm에서 측정하였으며, 세 번의 반복실험을 통하여 평균 value값을 산출하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, Xoo Δ omp1X strain의 경우, 야생형 strain 및 complement strain인 Xoo Δ omp1X ( Omp1X )과 비교하여, 유의적인 바이오필름 형성의 감소를 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for inhibiting or preventing formation of biofilm using Omp1X gene <130> CAU20141489KR_PB14-12081 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Omp1X gene <400> 1 atgaagactt ctttgctggc cctcggcctt ctcgcagcgc tgccgtttgc ggcctccgct 60 gctgaaaacc tctcctacaa cttcgtcgaa ggcgactacg tgcgcacgcc gaccgacggc 120 cgcgatgcgg acggctgggg cgtgaaggca tcttatgctg ttgctccgaa cttccacgtg 180 ttcggcgagt acagcaagca gaacgctgac gacaacaaaa acctgttcaa gaacaccaac 240 tccgacttcc agcagtgggg cgttggcgtg ggcttcaacc acgaaatcgc caccagcacg 300 gacttcgttg cccgcgttgc gtaccgcagg ctggacctgg acagcccgaa catcaacttc 360 gacggctaca gcgttgaagc cggtctgcgt aacgccttcg gtgagcactt cgaagtctac 420 gcactggctg gttacgaaga ctactccaag aagcgtggca tcgacgccgg taacgacttc 480 tacggccgcc ttggcgccca ggtgaagttg aaccagaact ggggcatcaa cggcgacatc 540 cgtatggatg gcgacggcaa caaggaatgg tcggtcggcc cgcgcttcag ctggtaa 597 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Omp1X amino acid <400> 2 Met Lys Thr Ser Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Leu Pro Phe 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Ala Glu Asn Leu Ser Tyr Asn Phe Val Glu Gly Asp 20 25 30 Tyr Val Arg Thr Pro Thr Asp Gly Arg Asp Ala Asp Gly Trp Gly Val 35 40 45 Lys Ala Ser Tyr Ala Val Ala Pro Asn Phe His Val Phe Gly Glu Tyr 50 55 60 Ser Lys Gln Asn Ala Asp Asp Asn Lys Asn Leu Phe Lys Asn Thr Asn 65 70 75 80 Ser Asp Phe Gln Gln Trp Gly Val Gly Val Gly Phe Asn His Glu Ile 85 90 95 Ala Thr Ser Thr Asp Phe Val Ala Arg Val Ala Tyr Arg Arg Leu Asp 100 105 110 Leu Asp Ser Pro Asn Ile Asn Phe Asp Gly Tyr Ser Val Glu Ala Gly 115 120 125 Leu Arg Asn Ala Phe Gly Glu His Phe Glu Val Tyr Ala Leu Ala Gly 130 135 140 Tyr Glu Asp Tyr Ser Lys Lys Arg Gly Ile Asp Ala Gly Asn Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Leu Gly Ala Gln Val Lys Leu Asn Gln Asn Trp Gly Ile 165 170 175 Asn Gly Asp Ile Arg Met Asp Gly Asp Gly Asn Lys Glu Trp Ser Val 180 185 190 Gly Pro Arg Phe Ser Trp 195 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Omp1X-KO-F <400> 3 gagagagtcg ccttgcagtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Omp1X-KO-R <400> 4 gagagagtcg ccttgcagtt 20 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pOmp1X-F <400> 5 ctgcagccat ggtcgacgat gcagctccat ccgtgtg 37 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pOmp1X-R <400> 6 ctcgaggttt cagcagcgga ggccgcaacg gca 33 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-omp1X-F <400> 7 gtcgacttac cagctgaagc gcgggc 26 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-Omp1X-R <400> 8 ctcgagcatc atcatcatca tcatgctgaa aacctctcct acaac 45

Claims

Omp1X (outer membrane protein 1X) 유전자를 Marker Exchange Mutagenesis에 의해 넉아웃 (knock-out) 시키는 단계를 포함하는, 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp.)에 의한 바이오필름 (biofilm) 형성 방지 또는 억제방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp .)은 잔토모나스 알빌리네안스 (Xanthomonas albilineans), 잔토모나스 암펠리나 ( Xanthomonas ampelina), 잔토모나스 아크쏘노포디스 (Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 잔토모나스 프라가리아이 (Xanthomonas fragariae), 잔토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae pv . oryzae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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