HU228699B1 - Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének - Google Patents

Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének Download PDF

Info

Publication number
HU228699B1
HU228699B1 HU0302523A HUP0302523A HU228699B1 HU 228699 B1 HU228699 B1 HU 228699B1 HU 0302523 A HU0302523 A HU 0302523A HU P0302523 A HUP0302523 A HU P0302523A HU 228699 B1 HU228699 B1 HU 228699B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
sequence
polypeptide
nucleotide sequence
variant
Prior art date
Application number
HU0302523A
Other languages
English (en)
Inventor
Andre R Abad
Nicholas B Duck
Xiang Feng
Ronald D Flannagan
Theodore W Kahn
Lynne E Sims
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of HUP0302523A2 publication Critical patent/HUP0302523A2/hu
Publication of HUP0302523A3 publication Critical patent/HUP0302523A3/hu
Publication of HU228699B1 publication Critical patent/HU228699B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Fedelesszámyúak elleni pesztieid aktivitású fehérjéket kódoló gének
A találmány tárgyát természetbe» előforduló és rekombináns nukleifisavak képezik, amelyek í?ac>;ö«· /«msbgfem'A OyA-szerú génekből származnak és a tedeiesszárnyoak rendjébe tartozó kártevők elleni pesztieid aktivitású S-endotoxlnokat kódolnak. A találmány szerinti készítmények és eljárások a feltárt auklernsavakat és; az azok által kódolt pesztieid aktivitású polipeptideket alkalmazzák növényi kártevők ellenőrzés alatt tartására.
A rovarkártevők a világ mezőgazdasági termésveszteségének a fő okozói. Egyedid a kukoricabogár miatti rovarkártevőkkel kapcsolatos termésveszteség elérte az évi egymuliárá dollárt. Például a kukorieabogár táplálkozása gazdaságilag elsöprő hatású lehet a mezőgazdasági termelők számára. Az amerikai kuRorícabogár a kukorica lő rovarkártevője a világ számos részében, kiig sem annyira fontos rovarkártevő, mint az amerikai kukoricabogár, a déli kukorieabogár alkalomadtán szignifikáns gazdasági kárt okozhat kukoricában. Az amerikai és déli kukorieabogár megnövekedet; dőlést, csökkent szárazságtőrést és végső soron a terméshozam csökkenését okozhatja.
Hagyományosan a Rukoricabogár-popniációk befolyásolásának elsődleges eljárásai a vetésforgó és szélesspektrumú kémiai rovarirtó szerek alkalmazása. Sajnálatos módon a kártevők bizonyos fajai rezisztenciát alakítottak ki a kémiai rovarirtó szerek ellen. Ezenfelül a fogyasztók és az állami szabályalkotók egyformán fokozottan aggódnak a. szintetikus kémiai pesztfoídek előállításával és alkalmazásával kapcsolatos környezeti veszélyek miatt. Az ilyen aggályok miatt a szabályalkotók megtiltották vagy korlátozták a veszélyesebb peszíioidek némelyikének az alkalmazását, ily módon jelentős érdeklődés alakult ki alternatív pesztfoídek iránt.
A mezőgazdasági jelentőségű rovarkárte vők biológiai féken tartása, mikrobiológia ágens, mint példáid gombák, baktériumok vagy más rovarfajok alkalmazásával környezetbarát és kereskedelmileg vonzó alternatív jelent. Általánosságban szólva a bíopesztieidek alkalmazása alacsonyabb szennyezési kockázatot és környezeti veszélyt jelent, és nagyobb eélspeeiíiíást biztosítanak, mint ami a hagyományos széles-spektrumú kémiai rovarirtó szerek tulajdonsága. Ezenfelül a bíopesztieidek gyakran olcsóbban előáll írhatók, és ily módon javítják termények széles körének gazdasági hozamát,
A nemzetségbe tartozó bizonyos fajok ismert módon pesztieid aktivitásnak rovarkártevők széles körével szentben, matt például őepícfoprirö, Otpriro, Cvleeptera, /fe???pí<?rss és mások elleti. A Zte/Zfc túmvkgfemízs és Sacitfus pepíl/ie® mittdeddig a legsikeresebb biológia szabályozó ágensek közé tartoznak. Rovarok elleni patogenitást tulajdonítottak az alábbi fajok törzseinek is: £t. /arvae, & fenííworőus, & papidőm,
S. spóimricíis, & íWmgü’mús [„Bacíllus’k 386. old... szerk.: flarwook, kiad.: Plenum Press (1989)] és & cereas»· (WO 96/10083. számú nemzetközi közzétételi irat). A pesztieid aktivitás látszólag a parasporálls kristályos iehérjezárványokban koncentrálódik, és az ezeket a pesztieid aktivitású fehérjéket kódoló számos gént izoláltak és jellemeztek (lásd például az 5 366 892, szánts amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot).
A mikrobiáiis rovarirtó szerek, különösen a Sactfíus törzsekből előállítottak fontos szerepet játszottak a mezőgazdaságban a kártevők kémiai féken tartásának alternatíváiként. Napjainkban a mezőgazdasági kutatók rovarok elleni fokozott ellenálló-képességű növényeket fejlesztettek ki duc/fotó'-ból származó pesztieid aktivitású fehérjék íennénynövényekbe történő génsebészeti beépítésével (lásd az S 554 534. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot és a WO 93/15206. számú nemzetközi közzétételi iratot a Scarabaeidae családba tartozó kártevők elleni alkalmazás vonatkozásában). A S. íőurfegfonsA törzseiből izolált ......§40 endoioxinokként vagy C'ry-toxinokként ismert......pesztieid aktivitású fehérjék előállítására génsebészeti úton * ♦ φ «φ otódositott kukorica és gyapot növényeket széles körben sdkalmaznak Amerikában a mezőgazdaságban, és a teaerek számára környezetbarát alternatívát biztosítanak a hagyományos rovarszabályoző eljárásokkal szemben. Ezenfelül peszticid aktivitásé üry-íoxinokaí tartalmazó, génsebészeti ütőn módosított burgonyát is eladtak az amerikai tenereknek. Azonban.....míg kereskedelmileg nagyon sikeresnek bizonyultak — ezek a génsebészed úton módosított, rovaroknak ellenálló terménynóvenyek csak a gazdaságilag fontos rovarkártevők szűk körével szemben rezisziensek. Bizonyos rovarok, mint példán! az amerikai kukoricabogár nehezen kezelbetűnek bizonyait, és a Bt-toxin rezisztencia mértéke növekszik bizonyos fontos rovarkártevők korábban érzékeny populációkban.
Habár több kutató megkísérelte javított rovarirtó aktivitású, mutáns endotoxin fehérjék előáll kásái,
Iö csak kevesen jártak sikerrel. Csakugyan, a szakirodalomban ismerteted, génsebészeti úton módosított & rfeirú?gfejKÁ toxinok többségének az endotoxin aktivitása nem jobb, mini a vad típusú fehérjéé, és sok esetben az aktivitás csökkent vagy teljesem tönkrement. Ily utódon igény van megváltoztatott speciftíású és/vagy javított poszátád aktivitású .mikrobiálís rovarirtó szerekre a kárte vő-kezelési stratégiákban.
A találmány tárgyát készítmények és éli árasok képezik növényi kártevők, különösen tódéi esszárnyú rovarkártevők befolyásolására. Közelebbről a találmány tárgyát eljárások képezik rovarok befolyásolására oendotoxin génekből származó nukleinsavak alkalmazásával, transzformált mikroorganizmusokat és növényeket előállítva, amelyek találmány szerinti· pesztlcld aktivitásó polipepiídeket expresszálnak. A találmány szerinti készít menyek és alj árasok a mezőgazdaság alkalmazhatók tónnénynővények kártevőinek féken tartására.
A találmány tárgyát nukleinsavak,. és azok fragmensei és variánsai képezik, amelyek ífedefosszárnyúak rendjébe tartozó kártevők elleni peszticid aktivitású pollpeptideket kódolnak. A találmány szerinti vad típusú (példán! természetben előforduló) nukleottd-szekvemúák, amelyeket a Saei/fos· .ómrúígtoníA törzseiből állítottunk elő, CnA-szorű ó-endotoxhiokat kódotok.
A találmány 'tárgyát képezik továbbá Czyö-szerű nukieotld-szekvenciák fragmensei és variánsai, amelyek biológiailag aktív (például peszticid aktivitássá) polipepddekeí kódolnak. Előnyős megvalósítás! módok szerint a feltárt, nukleotíd-szekvenciák olyan polípeptláekei kódolnak, amelyek gesztjeid aktivitásnak a fedelesszárnyúak rendjébe tartozó legalább egy rovarral szemben (például kotorádóbogár, déli kukoricabogár és amerikai kukoricabogár),
A találmány más megvalósítási módjainak a tárgya olyan, Cryő endotoxin csonkolt verzióit kódoló nukleinsav, amelynek pesztlcld aktivitása vagy ekvivalens, vagy javított a megfelelő teljes hosszúságú endotoxin aktivitásához viszonyítva. A találmány szerinti csonkolt nukleinsavak némelyikét íragmensnek vagy var!ánssok nevezhetjük. Előnyös megvalósítási módok szerint a találmány szerinti ntrkielnsav-fragmensek.·variánsok némelyike a vad típusú kódoló szekvencia 3’ végén csonkolt: alternatív megvalósítási módok szerbit találmány szerinti más nukleinsavak nukleínssv-olőalláncok folyamatos szekvenciáját tartalmazzák, amely találmány szerinti másik kódoló szekvenciából származik, amely mind az 5’, mind a 3' végen csonkolt.
A találmány tárgyát képezik rekombináns Czy5-szertí nukleinsavak is, amelyek & íőttróíg/mri
Citóoloxínokaí kódoló mutagenízáít nukleinsav szekvencia-variánsokat tartalmaznak, amelyek génsebészeti úton módosítva lettek javított és/vagy megváltoztatott peszticid aktivitásra. Közelebbről a találmány tárgyát peszócid aktivitású polipsplideket kódoló muíagenizált nukleinsavak képezik, amelyek egy további, vagy alternatív proteáztórzékeny helyet tartalmaznák a polipeptid-variáns I. doménjában egy olyan régióban, amely a kódolt polipeptid 3, és 4, s-hélíxe közöd helyezkedik el.
-3A mint a leírásban demonstráljuk, egy további éa/vagy alternatív protsáz-érzékeny hely jelenléte a kódolt polipeptid amlnosav-szekvenetájában javíthatja a találmány szerinti nttkfeinsav-variáns által kódolt varíáns-pohpeptsd pesztleid aktivitását és/vagy speeifííúsát. Ennek megfelelően a találmány szerinti öy#ntdcleottá-szekvenciát rekombináns, génsebészed tett módosíthatjuk vagy manipulálhatjuk, javított vagy megváltozott aktivitású és/vagy speeiíitású eadtexmofcat előállítva, összehasonlítva a módosítatlan vad típusú ő-endotoxíttnal, .Például egy adott típusa, találmány szettel variáns nnkleínsav (például mutagenízáli CryŐ-szerü nukleotid-szekvencía) további mutánsokat biztosit, amelyek hozzáadott kodonokat tartalmaznak, amelyek Íripsztee érzékeny amisöov-szekveacte (a. természetben előforduló tripxzln-hély mellett) építenek be a kódolt polipén10 tidfee. Egy találmány szerinti «heraatív aádfoiős variáns hozzáadott kódosukat tartalma?., amelyek kimotripsztnre érzékeny hely beépítésére vannak tervezve közvetlenül 5’ irányban a természetben előforduló tripszlh helytől.
Egy második alternatív típusú találmány szerinti nnkleiasav-variáns szúbsztítúciós mutánsokat biztosít, amelyekben a természetben előforduló pretesz-érzékeny helyet kódoló ankleinsav- legalább egy kodonja tönkre vau téve, és alternatív kodonokat építünk be a variáns nukleinsav-szekveneiába annak érdekében, hogy egy eltérő (például helyettesítő) profoáz-érzékesy helyet áplísttek be a helyére. Ezen variáns polinukleotid egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya helyettesítő mutáns, amelyben a kódolt polipeptldfeen a természetben -előforduló trlpszrn hasítási hely tőnkre vas téve, és kimotrípszín hasítást hely lett a helyére beépítve.
Nyilvánvaló, hogy bármelyik feltárt mutációt bármelyik találmány szerinti polírinkSeoiid-szekveneíába beépíthetjük, amely tartalmazza a módosításra célzott tópszín hasítási helyet biztosító ammosav-oídalíáncokat. Érmek megfelelően a teljes hosszúságú endoíoxinokat vagy azok fragmenseít módosíthatjuk, hogy további vagy alternatív hasítási helyeket tartalmazzanak,
A találmány szerinti nuklsmsavakat alkalmazhatjuk expressriós kazetták, létrehozására, amelyeket a találmány 'szerinti noklemsavai tartalmazó trasszlórmáit mikroorganizmusok előáliisására alkalmazhatunk. A kapott tenstermánsokat alkalmazhatjuk olyan pesztícíd aktivitású készítmények előállítására, amelyek transzformált mikroorgmlteúst tartalmaznak, vagy pesztleid aktivitású fehérjék előállítására és izolálására. Ily módos a találmány tárgyát képezik továbbá pesztícíd aktivitású készítmények, amelyek pesztlcid aktivitású polipeptiáeket vagy tmnszfertnáh mikroorg&afemasokat tealmaznsk, és eljárások ilyen készítmények előállítására. Á találmány szerinti pesztfeld. aktivitású készítmények alkalmazhatók mezőgazdasági eljárásokban kártevők befolyásolására. Példán! a készítményeket olyan eljárásban alkalmazhatjuk, amely szerint a poszttól aktivitású készítmény hatásos mennyiségét elhelyezzük a kártevő környezetébe permetezés, porzás, szórás vagy magbevonás bármelyikével.
A találmány tárgyát képezik továbbá izolált pesztíeld aktivitású (például rovarirtó aktivitású) polipeptidek, amelyeket találmány szerinti, természetben előforduló vagy módosított -(például mutagenízáh vagy manipulált) nukleinsavak; kódolnák. Előnyös példák szerint a találmány szerinti, pesztlcid aktivitású fehérjék teljes hosszúságú Ő-emfotoxm fehérjéket, teljes hosszúságú S-endotoxís -ftagmenseft. és olyan variáns polipeptiáeket tsriateazaak, amelyeket adott ammosav-szekvencíáknak a találmány szerinti polipeptiáekbe történő beépítésére tervezett muíagemzált nufcieinsavakrói állíttmk elő. Előnyős megvalósítási módok szerint a találmány szerinti polipepbd-fragmenseknek és pollpeptíá-variánsoknak. -fokozott, pesztíeíd aktivitása van ahhoz
4Ő a természetben előforduló S-ettdofoxínhoz viszonyítva, amelyből származnak, A találmány szerinti
-4polipepödeifet vagy loirás szerinti nükteinsavakről, vagy szokásos molekuláris. biológia módszerek alkalmazásával állíthatjuk elő, Például találmány szerinti csonkolt fehérjéi találmány szerinti rekombináns nukle insavstak megfelelő gazdasejtben történő expresszálíaíásával, vagy más megoldásképpen ex vó-’o eljárások, mint Példán? proteázos emésztés és tisztítás kombinációjával állíthatunk «16.
A találmány szerint? nuklefosavskat alkalntazhaduk transzgeníkus (például transzformált) növények előállítására is, amelyeknek a genomja legalább egy olyas, stabilan beépült rtukleotid-koustrukclót tartalmaz, amely találmány szerinti kódoló szekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva a kódolt peszticid aktivitású polipeptíd expresszíőját irányító promóterhez. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik transzformált növényi sejtek, növényi szövetek, növények és magok is.
lö Egy előnyős megvalósítási mód szerbit a találmány szerinti transzformált növényt olyan nukleinsav alkalmazásával áilíthatjnk elő, amely optimalizálva lett gazdasejtben történő tnegnövekedett expresszfora. Például találmány szerinti peszticid aktivitású polipeptidek egyiké; vissza-transzlálhatjuk olyan nukleinsav előállítására, amely egy adott gazdában, történő expresszáitaiásra, közelebbről 2e« íkoví növényben történő expresszáltatásra optimalizált kódosokat tartalmaz. Kódoló szekvencia expresszáltatása ilyen transzformált növény (például egyszikű vagy kétszikű növény) által peszticid aktivitású polipeptíd termelését eredményezhet!, és tnegnövekedett rezisztenciát ruházhat a növényre. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát peszticid akdvstásű polipeptideket expresszáló transzgenikus növények képezik, amelyek kolorádöbogarat, amerikai kukorioabogarat és déli kukericabognrst befolyásoló eljárásokban alkalmazhatók.
A találmány tárgyát kártevők, különösen növényi kártevők, közelebbről a fedeiesszámyöak rendjébe tartozó kártevők befolyásolására szolgáló készítmények és eljárások képezik. Közelebbről a találmány szerinti izolált nukleinsavak és azok fragmensét és variánsai gesztjeid aktivitású polipeptideket (például fehérjéket) kódoló nuklsötíd-szekvencíákaí tartalmaznak. A feltárt peszticid aktivitású fehérjék biológiailag aktívak (például peszticid aktiviíásűak) rovarkártevők ellen, különösen kolorádóbogár <£ept«w»arara décenrfrneoío), amerikai.
kakörícabogáfrBhforoöba' vfoejforö v/rgifod} és déli knkorícabogár (öfobroí.’co jmdeclmjpw/ícíaía fonVirrmj ellen.
Ennek megfelelően a találmány tárgya izolált nítklentsav, amely az alábbi, amerikai fcukoricabogár elleni peszticid aktivitású poiipeptíőet kódoló nukleotid-szekvenciák bártnelyikéí tartalmazza:
(a) az I,, 3., 5„ 7,,p,, 15. vagy 17. szoítosstöszámS szekvencia szerinti nukleotid-szekvencia:
(b) a 2., 4„ 6., £,, ló. 'vagy IS. azonosítószámú szekvencia szerintii atninosav-szekveneiá; kódoló oukleoííd-szekveneís;
í c) az (a) pontban megadott sukleotid-szekvenelávnl legalább '88%-bao azonos szekvenciájú. nukleotidszekvencia; vagy íd) a (b) pontban megadott anrinosav-szekveoc iával legalább-85%~ban azonos szekvenciájú aminosav35 szekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló· nukleotid-szekvencia; vagy.
A találmány iátgya továbbá izolált, amerikai kukoricabogár ellen peszticid aktivitású -polipeptíd, amely az alábbiak bármelyike:
(a) a 2., 4., 6., ló. vagy' 18·. azonosítószámú szekvencia szerinti atninosav-szekvenciál tartalmazó polipeptíd; vagy
-5 (b) az (ai pontban megadott aminosav-szekvenciával legalább 85%-baH azonos szekvenciája polipepiid.
A találmány tárgyát képezi íovábbáteaoszfofmáit növény, amely a genomjában legalább egy stabilan beépült míkiöodd-konstmkciöt tartalmaz, amely kódoló szekvenciái: tartalmaz «löködóképesen kapcsolva olyan promóterhez, amely olyan polipeptíd expressziólát irányítja, amely peszticid aktivitású amerikai kakoneabogárral szemben, és a kódoló szekvencia az alábbiak bármelyiket (a) : az L, 3., 5., 7.,9,, 15, vagy 1:7. azonosítószámú szekvencia szerinti nukfcotid-szekvencía;
(b) a 2,, 4., 6., 8., 16. vagy 18. azonoskőszánrá szekvencia, szerinti aminosav-szekvenciát kódoló nakleotid-szskveacia;
(«): az (a) pontban megadott imkleotid-szekveuciával legalább 88% azonos szekvenciájú nukíeotidszekvencia;
(d) a (b) pontban: megadott amroosav-szekvenoiával legalább 85%-ban azonos szekvenciájú aminosavszekvencíál tartalmazó fehérjét kódoló nukleotid-szekveneiá; vagy (e) : az ís)-(d) pontok bármelyike szerinti mkteotid-szekvencia, amely növényben történő expresszi15 taiásra optimalizált kodonokat tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi transzformált mikroorganizmus is, amely az alábbi, amerikai kukoricabogár elleni peszticid aktivitású poiipeptideí kódoló nnkleotid-szekveneiák bármelyikét tartalmazza:
(a) az 1... 3., 5., 7,, 9., 15., 17,, 27. vagy 28, azonosítószámú szekvencia szerinti rtukleotid-szekvencia;
(b) a 2., 4.,. 6,, §., 16, vagy 18. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát kódoló nukle20 orid-szekvencis;
(c) az fa) pontban megadott nakleotid-szekveneiával legalább 88% azonos: szekvenciájú nukieotídszekveneia; vagy (d) a <b) pontban megadott amioosav-szekvenciával legalább 85%-ban azonos szekvenciájú aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló nökleotki-szekvencta.
A találmány tárgya továbbá eljárás növényi kártevő befolyásolására, azzal jetlemezve, hogy a növénybe vagy annak sejtjébe legalább egy olyan naklectid-konstrakciót juttatunk be, amely kódoló- szekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva olyan promótorbez, amely gesztijeid aktivitású polipeptíd expresszióját· irányítja növényi sejtekben, ahol a polipeptíd amerikai kakorlcabogár elleni peszticid aktivitású és a kódoló szekvencia, az alábbiak bármelyike:
(a) az 1., .3.. 5., 7... 9., 15, vagy 17. azonosítószámú szekvencia szerinti míkleotid-szekvencia;
(b) a 2., 4,, 6., 8., 16. vagy 18. azonosítőszámó szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát kódoló nukleotíd-szekvencia;
(c) az (a): pontban megadott nukleotid-szekveneiával legalább .88% azonos szekvenciájú nukleotidszekvencia; vagy (d) a (b) pontban megadott aminosav-szekvenciával legalább 85%-ban azonos szekvenciájú aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló nukleoíid-szekvencia.
A találmány tárgyát képezi tovább a. 19. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleinsav variánsa, amely olyan nukleotid-szekveneiáí tartalmaz, amelyben legalább egy, a 19. azonosítószámú szekvencia szerinti nnkieoiidS2ekvenciábsn: jelen nem lévő további kodon található, és a legalább egv további kodon egy további proteáz-érzékeny helyet épít be a kódolt polipeptíd 1. doménjának a 3. ás 4, aiía-hélixe között: hurokrégióba, és * ♦ * « ♦ ezenfelül a variáns által kódolt polipeptidnek javítóit peszhcíd aktivitása vas a fedelesszárnyúak rendjébe tartozó kártevővel szemben a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti poiipeptid akti vitáshoz viszonyítva.
A találmány tárgya tovább izolált mikleinsav, amely az alábbi nukleotid-szekvönciák bármelyikét tartalmazza:
(a) az 5., 31., 15., 21., 23,, 39, vagy 43, azonosítószámú szekvencia bármelyike szerinti nukleoíldszekvencia;
(b) a 6., 12., 16,, 22., 24., 40. vagy 44. azonosítószámú szekvencia szerinti amíriosav-szekveöeia bárme ly ikét kódoló nukleotid-szekvencia;
(c) a 16, azonosítöszámb szekvencia szerinti poiipeptíd variánst kódoló nukleoiid-szekvencia, amely í Ö poiipeptid egy további proteáz-érzékeny hasítási helyet tartalmaz a 16. azonosítószámú szekvencia 164, és 165.
amlnosav-oídallánca közé inzertálva;
(d) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti poiipeptid variánst kódoló nukleotid-szekvencia, amely poiipeptid variáns egy további, trípszín hasítási helynek a 16. azonosítószámú szekvencia 164. és 165. ammosav-oldallánoa közé történő beépítésére tervezett atninosav-szekvenciát tartalmaz;
(e) a lő. azonosítószámú szekvencia: szerinti poiipeptid variánst kódoló nukleotid-szekvencia, amely poiipeptid egy további, kímoíripszm hasítási 'helynek a 16. azonosítószámú szekvencia 160. és 161. aminosavoidailánca közé történő beépítésére tervezett ammosav-szekveneiát tartalmas; vagy (l) 16. azonosítószámú szekvencia szerinti poiipeptid variánst kódoló nnkieoíid-szekvencns, amely pölipeptíd olyan ammosav-szekveneiát tartalmaz, amelyben a 16. azonosítószámú szekvencia 161-163.
pozícióinak megfelelő oldalláncok el vannak távolává, és további, kimotripszin hasítási helyet tartalmazó ammosavak vannak a helyükre beépítve.
A találmány tárgyát képezi továbbá a 15. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleinsav variánsa, amely olyan nukleotíd-szekvenoiát tartalmaz, amelyben legalább egy olyan további, kodon található, amely egy' további proteáz-árzékeny helyet épít be a variáns nnklelnsav által kódolt poiipeptid 1. domóajáo&k a 3. és 4, aíiá-hélíxe közötti hnrokrégiöba, és a kódolt oolipeptídnékjavítóit peszticid aktivitása van a fedelesszárnyúak rendjébe tartozó kártevővel szemben a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti poiipeptid aktivitáshoz viszonyítva,
A találmány tárgya expressziós kazetta is, amely találmány szerinti nukleinsavat tartalmaz, amelyben a nukleotid-szekvencia működőképesen kapcsolva van expressziét mikroorganizmusban vagy növényi sejtbe» irányító promóterhez.
A találmány tárgya továbbá izolált nukleinsav, amely az alábbi nukieinsav-szekvenciák bármelyikét tartalmazza:
(a) a 19,, 29., 31., 33., 41. vagy 45. azonosítószámú szekvencia szerinti nnkieotíd-szckvencia;
(b) a.20-, 3Ö., 32., 34., 42. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát kódoló
5 nukleotid-szekvencia;
(c) a 19. azonosítószámú. szekvencia variánsát tartalmazó nukleotid-szekvencia, amely variám a 20. azonosítószámú szekvencia 114. amirtosavától közvetlen 5’ irányban beinzertált további proteáz-érzékeny hasítási helyet tartalmaz;
»*00 0 0 0·»* « <d)a 19, azonosítószámú,szekvencia szerinti: variánst nukleotid-szekvencia, amely variáns egy további, íripszin hasítási helynek a 20. azonosítószámú szekvencia 113. és 114. ammosav-oldallánca közé történ» beépítésére tervezett aminosav-szekvenclát tartalmazó pölípepíideí kódol;
(e) a 19. azonosítószámú szekvencia szerinti variánst aekleotid-szekveacia, amely variáns egy további, 5 kimoíripszln hasítási helynek a 2ö, azonosítószámú, szekvencia 113. és 1 M. aminosav-oídailánea közé történőbeépítésére tervezett aminasav-szekvesosái tartalmazó pol ipeptiáct kódok vagy fi) a 19. azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó nukleotid-szekvenola, amely variáns olyan polipepddet kódol, amelyben a 20. azonosítószámú szekvencia 114-ϊ 16. pozícióinak megfelelő: oldaHáneok el vannak távoiiiva, es további, kimottípszm hasítási helyet tartalmazó amínosavak vannak a helyükre beépítve,
IÖ A találmány tárgyát képezi továbbá 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variánsa, amely olyan amlnosav-szekvencíát tartalmaz, amelyben legalább egy olyan további anunosav-oldai'láne található, amely egy további proteáz-érzékeny helyet épít be a kódolt polípeptid 1. doménjának a 3. és 4. alfa-hélíxe közötti insrakrégiófea, és «zeniétől a variáns által kódolt polípepíidnek javított peszticld aktivitása van a ferfelesszámyűak rendjébe tartozó kártevővel szemben a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid aktivitáshoz viszonyítva.
A találmány tárgya továbbá izolált peszticld aktivitású polípeptid, amely 6., 1.2., 16.,20., 22.,24., 30., 32., 34., 40.., 42., 44. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti ammosav-szekvenciát tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi íranszihrmált növény, amely a genomjában legalább egy stabilait beépült nukleotid-köastFukeíői tartalmaz, amely kódoló szekvenciát tartalmaz működőképese» kapcsolva olyan promö2Ö terhez, amely pesstttód aktivitású polípeptid expresszióját irányítja transzformált növény sejtjeibe», ahol a poiipepíid amerikai knkoricabogár elleni peszticld aktivitású és: a kódoló szekvencia az alábbiak bármelyike:
(a) a 11., 19,, 21., 23., 29., 31., 33., 39., 41., 43. vagy 45. azonosítószámú szekvencia szerinti rtnk íeodd-szekvenci a;
(b) a 12., 2ö., 22., 24., 30., 32..,. 34,, 40., 42,. 44, vagy 46. azonos kószám ú szekvencia szerinti
2$ asúnosav-szekvenciáí kódoló nnkleoíld-szekvenela;
(c) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variánst kódoló mtkieotíd-szekveneia, amely variáns egy további proteáz-érzékeny hasítási helyet tartalmaz a ló, azonosítószámú szekvencia 164. és 165.. aminosav-oldaliánca közé inzertálva;
(d) a ló. azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variánst kódoló nnkleotid-szekvencla, amely 30 variáns egy további, íripszin hasítási helynek a ló. azonosítószámú szekvencia 164. és 165, aminosavoídaiíáaca közé történő beépítésére tervezed anúnosav-szekveneíáí tartalmaz;
(e) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variáns! kódoló twkleotkl-szekvencía, amely variáns· egy további, kimotrlpszío hasítási helysek: a ló. azonosítószámú szekvencia 160. és 161. aminosavoldalíánca közé történő beépítésére tervezeti aminosav-szekvenclát tartalmaz;
3S (1) a 16, azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variánsát kódoló nnkleotid-szekvencia, amelyben a 16. azonosítószámú szekvencia 161-163, •pozícióinak megfelelő aminosav-oídalláncok ei vannak távoiiiva, és további, kimotripszm hasítási helyei tartalmazó aminosavak vannak a helyűkre beépítve;
tg) a 19, azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó nnkleotid-szekvencia, amely variáns a 20. azonosítószámú szekvencia 114. amí:sosavától közvetlen 5’ irányban beínzertálí további proteáz-érzékeny hasítási helyet tartalmaz;
~s~ {hj a 19. azonosítószámú szekvencia, variánsát tartalmazó mácfestíd-szekvenctá, amely variáns egy további, tripsrin hasítási helynek a 20. azonosítószámú szekvencia 114. atninosavátóí közvetlen 5’ irányban történő beépítésére tervezett antinosav-sz.ekveneiát tartalmazó polípeptidet kódol;
í) a 19. azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó- naktóotid-szekvencia, amely variáns 5 kimotripszin hasítási helynek a 20. azortostíószámű szekvencia i.13. és 114. miaosav~ol<la.tláaea közé történő beépítésére tervezett további núkfeípsav-oláalláneokat tartalmaz;
j) a 20, azonosítószámú szekvencia polipeptid variánsát kódoló tmkieotíd-szekvencia, amelyben a 28.
azonosítószámú szekvencia 114-1 ló, pozícióiban található ammosav-oídatíáncok el vannak távolitva, és további, kímottipszin helyet tartalmazó amínosavak vannak a helyükre beépítve; vagy
k) az .pontok bármelyike szerinti míklsőtid-szekveneia, amely növényben történő expresszáltatásra optimalizált kodonokat tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi továbbá transzformált mag ís. amely találmány szerinti növény magja.
A találmány tárgya továbbá transzformált mikroorganizmus, amely az alábbi nnkleínsavak bármelyikét tartalmazza:
(a) a 13., 19., 21., 23., 29., 31., 33., 39., 41., 43. vagy 45. azonosítószámú szekvencia szerinti nokteotid-szekveisda;
(b) a 12., .20., 22., 24., 30,, 32., 34., 4Ö., 42., 44. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti annnosav-szekvenciát kódoló: nokieotid-szekvencia;
(c) a 19. azeenositőszámú szekvencia variánsát kódoló nokleotid-szekvencia, amely variáns további 20 proteáz-érz-ékeny helynek a 20, azonos8ószáma szekvencia. 117. és 118. amiaasav-oidaliá&ea, közé történő beépítésére tervezett nnkleinsav-iazertet tartalmaz; vagy (d) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptid variánst kódoló nukíeotid-szekvencia, amely variáns egy további proteáz-érzékeny helyet tartalmaz, a ló. azonosítószámú szekvencia 164. és 165. aminosavoldaílásca közé tartóivá; vagy (c) a 20. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptid variánst kódoló nukleőftd-szekvencia, amely variáns egy további proteáz-érzékeny helyet sartafenaz. a 21). azonosítószámú szekvencia 117, és i 18. aminosavo-ldallánca közé tasrtálva.
A találmány szerinti késziímények peszticid aktivitású poiipepíídeket kódoló izolált nnkieinsavakat, és azok fragmenseít és variánsait, találmány szerinti nnkíeotid-szekvenciákai tartalmazó expresszíós kazettákat, izolált peszticid aktivitású fehérjéket és peszticid akii vitás» készítményeket tartalmaznak, Bizonyos megvalósítást módok szerint a találmány tárgyát módosított Qyó?-szerii §-endetoxm fehérjék képezik, amelyeknek javított rovarirtó aktivitása van fedelesszámyúak ellen a megfelelő vad típusú szülői fehérjéhez viszonyítva, A találmány tárgyát képezik továbbá az ezekkel a nokleinsavakkaí transzformált növények és mikröosgxnízimisek, és az ilyen nukteinsavak alkalmazását magában foglaló eljárások, peszticid aktivitású készítmények és transzforniátt organizmusok rovarkártevők befolyásolására,
A következó leírásban számos kifejezést kiterjedt körben alkalmazunk. Az alábbi definíciókat a találmány megértésének elősegítésére biztosítjuk..
A leírás szerinti értelemben „nnkíeínsav” alatt dszoxírihonfodeotid vagy ríbonakleotid polimert értünk, akár egyszátú, akár kétszáiú formában, és amennyiben másképpen nem korlátozzak, magában foglalja az ismert
3.,
-9amlögokal (például peptíd-wklewawfeitK amelyeteek lényegében megegyezik a természete a természetes nukieoíídokévai annyiban, hogy hasonló módos hibridizáinak a természetben előforduló nukleotidokkal az egyszátú cukiéin savakhoz.
A leírás szerinti értelemben a „kódoló” vagy „kódok” kifejezések alatt egy meghatározott nuklein5 sawal kapcsolatban azt értjük, hogy a nukleinsav tartalmazza a nukleoííd-szekvenciá.nak egy meghatározott fehérjévé történő közvetlen transzlációjához szükséges információt. A fehérjét kódoló információ kodonok alkalmazásával van -«ragfeatározva. Egy fehérjéi kódoló nukleinsav tartalmazhat nem transziáit szekvenciákat (például mtronokat) a nukleinsav transziáit régióján belől, vagy hiányozhatnak befele az ilyen nem transziáit közbenső szekvenciák (például mist a cDNS-hen),
A leírás szerinti értelemben „teljes hosszúságú szekvencia” kifejezés alatt egy specifikus polínukleorid vagy az általa kódolt fehérje vonatkozásában azt értjük, hogy az egy natív (nem szintetikus) endogén szekvencia teljes nukfeínsav-szekveneiáia vágj' teljes aminosav-szekvenciája. Egv teljes hosszúságú pollmikleofid a meghatározott fehérje teljes hosszúságú, katalitikusán aktív formáját kódolja.
A leírás szerinti értelemben „antiszensz” kifejezés alatt egy nokleotid-szekveíKsa feáityhoítságával fcap15 csolatban azt értjük, hogy az olyan duplex polfoukleotid-szekvencia, amely működőképesei· kapcsolva van egy promöterhez. olyan irányítottságban, hogy az antíszensz szál Íródik át. Az antíszensz szál elegendően kompiémentet egy endogén transzkripciós termékkel ahhoz, hogy az endogén termék transzlációja gyakran gátolt legyen.
A „poiipepíisf', „pepiid” és „fehérje” kifejezéseket a leírás szerint: felcserélhető módon alkalmazzuk
2Ö amfoosav-oldaliáocok polímerjeinek. megnevezésére. A kifejezés olyan aminosav-poiimerekre vonatkozik, amelyekben egy vagy több amfoosav-oidaliánc a. megfelelő természetben előforduló amlnosav mesterséges kémiai analógja, valamint természetben előforduló aminosav-poiimerekre is.
Az „oidalláne” vagy „aminosav-oldallánc” vagy „ammosav” kifejezéseket a leírásban felcserélhető módon alkalmazzak olyan ammosav megnevezésére, amely be wb építve fehérjébe, polipeptidbe vagy pepiidbe (összefoglaló náven „fehérjébe”). Az amlnosav lehet természetben előforduló amlnosav, és amennyiben másképpen sem korlátozzuk, magában foglalja a természetben előforduló aminosavak ismert analógjait, amelyek hasonló módon képesek fonkcionálnl, mint a természetben előforduló aminosavak.
A leírás szerinti értelemben az. „izolált” és „tisztított” kifejezéseket felcserélhető módon alkalmazzuk olyan nukleinsavak, polipeptidek vagy azok biológiailag aktív részleteinek a megnevezésére, amelyek
3b lényegében vagy esszenciálisán mentesek azoktól a komponensektől, amelyek normálisan együtt fordulnak elő vagy kölcsönhatásban állnak a neklelnsavval vagy poiipeptíddek amikor az a természetes környezetében fordul elő. ily módon egy feolálí vagy tisztított nukleinsav vagy polípeptid lényegében mentes más sejtbeh anyagtól vagy tápközegiöh amikor rekombmáns módszerrel állítjuk elő, vagy lényegében mentes kémiai prc-kurzoroktól vagy más vegyszerektől, amikor kémiai úton szintetizáljuk,
A leírás szerinti értelembe® a „rovarkártevők befolyásolása” kifejezés alatt a rovar táplálkozásában, növekedésében és/vagy viselkedésében való változások kiváltását értjük a. fejlődés bármely szakaszában, nem korlátozó példaként a rovar megölését, növekedésének késleltetését, a szaporodóképességének a megakadályozását és hasonlókat.
A leírás szerinti értelemben a ,.peszticid: aktivitás” és „rovarirtó aktivitás” kifejezéseket, szinonimaként alkalmazzuk egy organizmus vagy anyag, mint például fehérje megnevezésére, amely nem korlátozó példaként a kártevő mortalitásával, a kártevő tömegvesztésével, a kártevő vonzerejével, a kártevő visszataszítóságávaí és más viselkedésbeli vagy fizikai változásával mérhető- megfelelő hosszá időn keresztül történő fogyasztás és expozíció .után. Például „peszficld aktivitási! fehétje” olyan fébétje, amely pesztieid aktivitást mutat önmagában vagy más fehérjékkel kombinálva.
A „hatásos pesztieid mennyiség” kifejezés jelentése magában foglalja anyag vagy organizmus olyan mennyiségét, amelynek posztód aktivitása van, -amikor a kártevő környezetében jelen van. Minden egyes anyagra vagy organizmusra a hatásos pesztieid mennyiséget tapasztalatilag határozzuk meg egy specifikus környezethet· .lévő kártevő esetébem Hasonlóképpen, a „hatásos rovarirtó mennyiség” kifejezést a „hatásos pesztieid mennyiség” megjelölésére is alkafomhatjúk, amikor a kártevő rovarkártevő.
lö A leírás szerinti érteiemben a „rekombináns úton módosított”· kifejezés jelentése magában foglalja
-rekombináns DNS módszer alkalmazását a fehérje szerkezetében lévő változtatás beépítésére (például génsebészeti úton történő- módosításéra), a fehérje hatásmechanizmusa és a beépítésre, deletálásra. vagy szuhszfifisálásra kerülő amínosavak megfontolása alapján.
A leírás szerinti értelemben a „mutagemzált nufcíeotid-szekvencia” kifejezés jelentése magában foglal15 olyan nukleoiid-szekveneiát, amely mutageuizálva vagy változtatva lett úgy, hogy egy vagy több olyan nnkleotiá-oidaliánooí (például bázispárt) tartalmazzon, amely nincs jelen 8 megfelelő vad típusú szekvenciában, és amely javított rovarirtó aktivitásé mutáns -S-esdotoxist kódol.
A leírás szerinti értelemben. a .javított rovarirtó aktivitás” kifejezés olyan, találmány szerinti Sendötoxint jelöl, amelynek fokozott fedelesszárttyúak elleni aktivitása van a megfelelő vad típusú fehérjéhez viszonyítva, és/vagy olyan endotosln, amely hatásos rovarok szélesebb köre ellen, vagy olyan rovar elleni specifitása lesz, amely nem érzékeny a vad típusé fehérje toxieításám. Fokozod pesztieid aktivitás felismerésének a feltétele legalább 30%-kal megnövekedőd toxicitás demonstrálása a célzód rovar ellen, és előnyösebben 35%-kal, 40%-kal, 45%-kal vagy 5ő’%-kal megpővekedeh aktivitás a vad típusé eodotoxin rovarirtó aktivitásához viszonyítva ugyanazon rovtsr elles meghatározva.
Az egységeket, előtagokat és szimbólumokat az SÍ által elfogadott formájukban, alkahnazltstjtsk.
Hacsak másképpen nem jelezzük, a nukieinsavakat halról jobbra 5’ -3’ irányban Írjuk, és az amihosavszekveneiákat balról jobbra az amíno-karboxil: iráoyban írjak. A számtartományok magukban foglalják a tartomány megadó számokat. Az anfinossvafcaí a leírásban vagy a közismert hárombetűs szimbólumokkal, vagy a /DPzíC’-füS BíochsmÍcíá Nvixíwílabto? Cwmíssia® által javasolt egybetös szimbólumokkal jelöljük..
Hasonlóképpen a nukíéotíáokai. is az általánosan elfogadott egybetös kódjukkal jelöljük. A fent definiált kifejezéseket részletesebben definiálva vannak az egész leírás figyelembevételével.
A találmány szerinti nokleotid-szekveneláteít bármilyen organizmus- transzformálására alkalmazhatjuk a kódolt pesztieid aktivitású fehérjék előállítására. A találmány tárgyát képezik olyan eljárások, amelyek ilyen fraaszformálf organizmusok alkalmazását foglalják magukban növényi kártevők befolyásolására vagy féken újítására. .A találmány tárgyat képezik továbbá olyast, természetben előforduló kódoló -szekvenciák és azok feagmenseinek és variánsainak az azonosítása, amelyek biológiailag aktív pesztieid aktivitású fehérjéket kódolnak. Az összes találmány szerinti nükleotld-szekvencía közvetlenül alkubnazhatö kártevők, előnyösen rovarkártevők, előnyösebben a fedeíesszámyúak rendjébe tartozó kártevők, köztük például kolorádöbogar, amerikai knkorioabogár és déli kishorlcabogár befolyásolására szolgáló eljárásokban. Ennek megfelelően a
4Ö újfálujány tárgyát áj megközelítési módok képezik rovarkártevők befolyásolására, amelyek nem függenek
-11hagyományos, .szintetikus kémiai rovarirtó szerek alkalmazásától. A találmány tárgyát képezi természetbes elelbrdttló, bíodegradálhalő peszticidek és az azokat kódoló gének felfedezése.
A találmány tárgyát képezik továbbá íermészeiben előforduló kódoló nökleohá-szekvenciák feagntenset. és variánsai, amelyek biológiailag; aktív (például peszticid afeiviiásó) poiipeptldeket is kódolnak. A talál5 mány szerinti nuklelusavak olyan miklelusav-szekvenc iákat foglalónk magukban, amelyeket optimalizáltunk egy adott organizmus sejtjei általi expresszióra, például olyan nakíeínsav-szekvencták, amelyek vissza leltek tmisszlálva növényekben előnyős kodonok alkalmazásával a fefrozoit pesziiold aktivitású polipepód aminosavszekvenelájának: az .alkalmazásával.
A találmány szériád sukleofíd-szekveneiákat a BaclBus rfemfeofens» baktérium törzseiből izoláltuk, •10 Felismerték, hogy a törzsek tenyészeteiből előállított nyers ilzátumoknak pesztícid aktivitása vas kolo:rádóbo~ gár, amerikai· kukoricabogár és déli kukorieabogár elles. Kristály fehérjéket Izoláltunk a törzsek tenyészeteiből. Az izolált kristályfehérjekeí teszteltük pesztieid aktivitásra tovartáplálási vizsgálati eljárásokban. A vizsgálati eljárások eredmérsye feltárta, hogy az izolált krisíályfebérjék pesziíoid sktlviíásúak fedelesszámyúak ellen. Arra vállalkoztok, hogy azonosítsuk a kristáiyféhérjéket kódoló· mkteid-szekveneiákat a törzsekből, és igy azoI5 nősítetek a találmány szerinti természetben elöiórünlő kódoló szekvenciákat és genomiális nakleínsavakat.
Az izolált nukleinsavak nakleotid-szekveneiájárói demonstráltuk a nakléotíá-szekvencíák SscAerichm eaő-ha történő transzformálásával, hogy peszticid aktivitású fehérjéket kódolnak. .A transzformált £ co/í-bói készített lizámmoknak peszricíd aktivitása volt kukorfesbogár és kolorádóbogarak ellen táplálási vizsgáim! eljárásokban, demonstrálva, hogy a találmány szerinti: izolált nukleobd-szekveneiák peszticid aktivitású fehérjéket kódolnak. Egy·' adott iizáium jeüegezetességeítől függően felismertük, hogy a peszticid aktivitás demonstrálása bizonyos esetekben tripszines előkezelést igények a pesztieid .aktivitású fehérje aktiválására.
Ezt követően biológiailag aktív peszticid aktivitású poiipeptrdeket kódoló nukleimav-varíánsokai és firag-nenseket azonoshotúmk, A kódolt peszticid aktivitású fehérjék némelyike proteázos (például tripszines) aktiválást igényei, és más· fehérjéket biológiailag aktívnak (például peszticid aktivitásúnak) figyeltünk meg aktiválás hiányában. Bizonyos megvalósítási módok szerint a nukleinsav a természetben előforduló polipeptld esonköh: verziójú· kódolja, és ily módon variánsnak vagy frsgmensnek tekinthetjük:, Ezenfelül második generációs msklehmvakat állítottunk elő génsebészeti ötön, amely olyas uükleotid-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek olyan, ífeyó-szerü polipeptid.ek.ei kódolnak, amelyeknek javított vagy megváltoztatott peszticid aktivitása van a természetben előforduló polipeptidbez hasonlítva,
A találmány szerinti nukiesnsavak izolált poiinukleoí idokat és azok variánsait és fragmenseh tartalmazzák, amelyek biológiailag aktív (példád peszticid aktivitású) pollpepfideket kódolnak, köztük nem korlátozó példaként az 1., 3., 5., 7,,9., IE, Í5„ 17., 19., 21., 23.,.27,,.28., 29., 31., 33., 39., 4 E, 43. és 45. azoaosítószámü szekvencia szerinti éfevfS-szerS nakleotid-szekveneiákat. A leírásban feltárt tekleotid-szekvenciák két refereneiaszekvescíát biztosítanak, amelyeket a leírásban 1218-1 és 49FVD néven jelölünk, amelyekbe mutációkat építünk be. Bizonyos esetekben a szekvenciák két különálló klón variánsait biztosítják, amelyeket a leírásban 1218-1 és 1218-2 néven jelölünk. Közelebbről a 15. ozouositőszámú szekvencia. (Ι218-ΊΑ) az 5. azonosítószámú szekvencia variánsa, amelyek mindegyike a 121:8-1 jelű klón alternatív megvalósítási módját reprezentálja. Ezenfelül a 17. azonoshószánm szekvencia (1218-2A) a 7. azonosítószámú: szekvencia variánsa, amelyek mindegyike a 1218-2 jelű klón alternatív megvalósítási módját reprezentálja.
- Η * I *
A találtóay szerinti poiinokfeotídok közé tartozik bármilyen olyan szintetikus vagy rekombináns nukleoiid-szekveneia ís, amely 2„ 4,. 6., §.. 11)., 12,, 16., 18., 20., 22., 24., 30., 32., 34., 40.. 42., 44, és 46, azonosítószámú szekvencia szerinti anrmosav-szekvencíát tartalmazó peszticid aktivitású polipeptidet kódol.
Egy „Izolált” mskleinsav mentes olyan szekvenciáktól (előnyösen fehérjét kódoló szekvenciáktól), 5 amelyek a természetben szegélyezik a nukléinsavat (azaz a nukleinsav 5’ és 3’ végén található szekvenciák) annak az organizmusnak a genonnáhs DNS-ében, amelyből a nukleinsav származik. Például különböző megvalósítási módok szériát az izolált míkleinsav kevesebb, mint körülbelül 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, I kb, Ö.5 kb vagy 0,1 kb olyan nokleotid-szekveneiát tartalmazhat, amely a természetben szegélyezi a nukleinsavakai annak az organizmusnak a genomiális DNS-ébes, amelyből a nukleinsav származik,
A találmány tárgyát képezik olyan izolált snklcinsavak, amelyek a 2., 4., ő,, 8., 10., 1.2., 16., 18., 20.,
22'., 24., 30., 32., 34.., 40... 42., 44. és 46. azonosítószámú szekvencia, szerinti amln.o.sav-szekvenciákat kódoló nnkieoiid-szefcvcnciákat tartalmaznák. Előnyős megvalósítási módok szerint a találmány tárgyát képezik az alábbi nokleotid-szekvesciákst tartalmazó nukleínsavak: 1. azonosítószámú szekvencia (Crvf2/8~/ CDS) és á 3. azonosttószámú szekvencia (Qyf2Ó2-2 CDS), a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti knkorleára omknaii15 záit nukleinsav («κ>121§~1), és a 27., azonosítószámú szekvencia szerinti (genomiális Oy/2/é-/) és a 28. azonosítószámú szekvencia szerinti (genomiális Cry /2/8-2) natív genomiális szekvenciák. A 27. azonosítószámú szekvencia kódoló szekvenciája (CDS) a 731 .-tői a 4348. bázíspáríg tart. A 28. azonosítószámú szekvencia CDS-c a 1254.-tól a 4383. bázíspáríg tart. Az ezt az öt nukieinsavat tartalmazó plazmidot 2000. május 5-én és 2ÖÖ0, október 2Ö-án letétbe helyeztük a „Patent Deposátay of the American Type Culture Collection (ATCC)” intézménynél (Manassas, Va.) és az alábbi szabadalmi leteli számokat kapták; PTA-1821 (megfelel az 1. azonosítószámú szekvenciának);. PTA-181? (megfelel a 3, azonosítószámú szekvenciának); PTA-2635 (megfelel a 9. azonosítószámú szekvenciának); PTÁ-2634· (tartalmazza a 27. azonosítószámú szekvenciát); és PTA2ó3ó (tartalmazza a 28. azonosítószámú szekvenciái).
A PTA-1821 és PTA-181? számú szabadalmi letétek 2 klót· keverékét tartalmazzák, amelyek mindegyike a teljes .kódoló szekvencia egy részét tartalmazza. Közelebbről a letétbe helyezed plazmidok TA vektorba (invitrogen, Carlsbaá, Ca.) klónozott nnkleinsav-moíekulákat kódolnak, amelyek a kódoló szekvencia két átfedő Íragmensét kódolják. A teljes hosszúságú kódoló szekvenciákat átfedő PCR stratégiával lehet előállítani. Az első PCR-reakciősak olyan elülső és hamisé iáncínditókal kell íartakn.azxíía, amelyek a teljes hosszúságú kódoló szekvencia 5’ és 3’ végének feleinek meg. PCS-reakcióban alkalmazható megfelelő láncin30 dítókat mutatunk be a 35-38, azonosítószámú szekvenciákon. Közelebbről a 35. és 36. azonosítószámú szekvencia, egy „(a)” jelű első láncíndltó-készletet biztosít, amely tartalmazza & 35. azonosítószámú szekvencia szerinti elülső láncindítót (5’-ATGA<3TCCAAATAATCAAAATG) és a 36. azonosítószámú szekvencia szerinti hátulsó (5’-CCGCTTCTAÁÁTCTIX3TrCC) & kódoló szekvencia 5’ végeitek klónozásához, A 37. és 38. azonosítószámú szekvencia egy ,,(b)” jelű második íáncindító-készletet biztosit, amely tartalmazza a 37. azonosítószámú szekvencia szerinti elülső kmcisditót (5’-GGAA€AáCIATFTAGAC1G) és a 38. azonosítószámú szekvencia szerinti hátuteó (5'-CTCATGGTCTACAATCAATTCATC) a kódoló szekvencia 3’ végének klónozásához. A lent megadod láncindítókkal végrehajtott első PCR-reakc lóban keletkezed két DNS-csíkot meg kell tisztítani, és egy 7 c&lassai végzett második PCR-reakcíőf kell vágrebajtmá az első PCR-reakciőböl izolált tisztítod DNS alkalmazásával mindenféle láncimllíó nélkül, Az (a) jelű láncindító-készleítel létrehozott nukleinsav 3' vége és a (b) jelű láncindííé-liészleitel létrehozóit míkleinsav 3’ vége átfed, és kiváltja a teljes hosszúságú kódoló
- 13 * szekvencia léírchozását, Egy harmadik, utolsó PCK-reakciót végzőnk s teljes hosszúságó kódoló szekvencia tétrahozására. Ezt a reakciót a második F'CR-reakciő 1 μΐ-ének alkalmazásával hajtjuk végre, és a 35- azonosítószámú szekvencia szerinti {az (a) jeíü késztet elülső láaeindíiéjaj és a 38. azonosítószámú szekvencia szerinti (a (h) jelé készlet bátulsó láncinditójaj lánemditóhat tartalmazó iáncindítö-készieöcl.
A fent említett letéteket (például PTA-1321; PTÁ~13Í7; PT A-2635; PTA-2Ő34; és PTA-2Ó3Ó) fenntartják a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás- céljára történő tetétbehelyszésének nemzetközi elismeréséről .szóló Budapesti Szerződés értelmében. Á letéteket csupán a szakember kényelme kedvéért tettük, és nem annak az elismeréseként, hogy ti tetet szükséges a 35 U.S.-C. §112, -szakasza-értelmében.
Különösen érdekesek a találmány szerinti pesztielá aktivitású fehérjéket kódoló optimalizált nukleottá19 szekvenciák. A leírás szerinti értelemben az „optimalizált nukteetid-szekvencía’’' kifejezés alatt olyan nukleinsavakat értőnk,, amelyek optimalizálva. vasnak egy adott organizmusban, például növényben történő exprcsszáliat-ás céljából. Optimalizált nskteotiá-sxekvenelákst előállítbatank bármilyen jelentőséggel bíró organizmus számára- a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, .Például a 9. azonosítószámú szekvencián a lő. .azonosítószámú szekvencia szerinti peszöcid akti vitásé fehérjét {csonkolt 121.8-1 A.) kódoló optimalizált nukleissav-szok15 venciát tárunk fél. Közelebbről, a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti nakleorid-szekveucia kukorica által preferálj kodonokat tartalmaz. A 9. azonosítószámú szekvenciát a lő, azonosítószámú .szekvencia szerinti aminosav-amtnosav. revers-transzíáclöjávaí áWtotiuk éld, hogy tartalmazza a Murray és -mtsai. által leírt, kukoricában preferált kodeinokat [Hocteic Acíds Rés·. 17, 477-493, old. (1939)], Az optimalizált nnkteotíd-szckvencíák aikahnazhatók poszticid akti-vlíásö fehérje expressziójásak növelésére növényben, előnyösen egyszikű növény20 ben, -előnyösebben a pázsitfűfélék (Poaceae) közé tartozó növényben, legelőnyösebben kuteicanövén-ybm.
A találmány tárgyát képezik továbbá, izolált peszticsd aktivitású (például rovarirtó) poiípeptidek, amelyeket találmány szerinti, természetben előforduló vagy módosított (például mutagenizált vagy csonkolt) nokkoínsavak, kódolnak. Közelebbről,, a találmány tárgyát a 2., 4,, S,, 8., Iö,, 12., lő., 13., 20., 22., 24., 30., 32., 34...
49., 42., 44.. és 46. azonosítószámú szekvencia szerinti amlnosav-szekvenciákaí -tartalmazó polipeptláek es a 25 találmány szartori: nukleinsavak, .például -az 1., 3., 5,, 7.,9,, IL, 15., 17., 19„ 21.. 23., 27)/28., 29., 31., 33., 39.,
41., 43. és 45. azonosítószámú szekvencia szerinti autóeiasavak által kódok poiípeptidek képezik, és azok tragmenseí és varíássaí.
Előnyös megvalósítási módok szerint a találmány szerűül pesztieíd aktivitású fehérjék teljes hosszúságú 8-eodotoxin fehérjék, teljes hosszúságú S-endoíoxínok frsgmessei és olyan variárts poiípeptidek, amelyeket adott sminosav-székveacíáknak a találmány szerinti polípeptíáekbe történő beépítésére tervezett mutagemzáh nykleinsavakról állítunk elő. Előnyős megvalósítási módok, szerint a polípeptidbe beépített ammosav-szekvendák olyan szekvenciát tartalmaznák, amely enzim vagy profeáz hasító helyét tartalmazza.
Bizonyos találmány szerinti poiípeptidek, például a 2. és 4, azonosítószámú szekvencia szerintiek teljes hosszúságú ő-endötoxíoökat tartalmaznak; más poiípeptidek, mint például a ő., 8-., lő., 1 6., 18. és 20. azoaosiíó3-5 számú szekvencia szerintiek teljes hosszúságú Ó-erteotoxin fragmenseit testesítik meg; és a 12., 22,, 24,, 3ö.,
32., 34,, 40·., 42,·, 44, és 46. azonosítószámú szekvencia szerintiek polipeptid-variánsokat képviselnek. A találmány szerinti poíipeptíd-S'agmcnsck és variánsok némelyikének fokozott peszticld aktivitása van ahhoz. a. természetben előforduló-S-endotoatinhoz viszonyítva, amelyből származik, különösen sz endotoxinnak az aktivitásra való szkrinelést megelőzően pstoteázzal történő fe viw aktiválásának a hiáuyábau. Például a 6. példa I. táblá40 .zatában bemutatott adatok azt jelzik, 'hogy a 16, azonosítószámú szekvencia (csonkolt 1213-1A endotoxin)
.. 14NGRS addiciós mutánsának (12. asmoshószteű szekvencia) nsegnövekedeít peszticíd aktivitása van kolorádóbogár ellen.
A 6., IÖ., 16. és 20. azonosítószámú szekvencián a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti 1218-1 polipeptld csonkolt verzióit megtestesítő pollpepíidekei nnttatuttk b«. A ló. azonosítószámú szekvencián a 6. azeím3 -sítószántú szekvencia szerinti polipeptid — amit a leírásban 1218-1 néven jelölünk......egy variánsát mutáljuk be,, amelyet a leírásban 1218-1218-IÁ néven jelölünk. A feni említett .szekvenciák közül három, a 6., IÖ. és 16. azonosítószámú szekvencia olyan polipeptidet. reprezentál;, amely a 2, azonosítószámú szekvencia aanino-tenninálisának 3’ végén te vast rövidítve (csonkolva), Ezzel elleniéiben a 20. azonosítószámú szekvencia szerinti negyedik polipeptid-varíáns csonkolva vau a 2. azxsnoshószámú szekvencia szerinti teljes hosszúságú polipeptid lö 5’ és 3’ végén is. A 8, és 18. azonosítószámú szekvenciákon (sorrendben 1218-2 és Í 218-2A) a 4. azoaosltöszámú szekvencia szerinti polipeptióek csonkolt verzióit megtestesítő polipeptiáeket mutatunk. be. Mind a kettő polipeptid. olyast fehérje, amely csonkolva vas a 4. azonosítószámú szekvencia szerinti teljes hosszúságú. 1218-2 polipeptid 3' végén.
A 12., 22., 24., 4Ö, és 44. azonosítószámú szekvenciák olyan polipeptidck családját képezik, amelyek a
IS ló, azonosítószámú szekvencia szerinti 1218-1.4. csonkolt nulipeptidck variánsait testesítik meg, ily módon a
12,, 22., 24,, 40. és 44. azonosítószámú szekvencia a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti Oyő-szerü polipeptid biológiailag aktív iragmenséoek a variánsait (mutánsait) képviselik. Közelebbről, a 12. azonosítószámú szekvencián olyan mutánst mutatunk be — amelyet a leírásban NGSR.N 1218-1 néven jelölünk......amely egy további tápszin hasítási helyet tartalmaz; a 22. azonos-itószámú szekvencián egy második mutánst mutatunk
2ö be —-amelyet a leírásban LKMS2N1218-1 néven jelölőnk—, amely olyan kimotripszin hasítási helyet tartalmaz, amely nincs jelen a vsd típusú 1218-1 vagy 1218-1A poiípeptldhen; és a 24. azonoshószátnó szekvencián egy helyettesítő mutánst, mutatunk be — amelyet a leírásban LKMS.R1218-1 néven, jelölünk —, amelyben meglévő tripszin -hasítási hely tönkre vas téve és egy kimotripszis hasítási helye van a helyére beépítve. A 40. azonosítószámú szekvencián egy második, kimolripszm addiciós mutánst mutatunk be — amelyet a leírásban
LRMS.Ni2.18-! néven jelölünk --, amely az LRMS <4S. azonosítószámú szekvencia)- alternatív kimotripszin hasító helyet tartalmazza,. A 44. azonosítószámú szekvencián egy második helyettesítő vagy sznhszthúciös mutánst mutatunk be......amelyet a leírásban LRMS.R 1218-1 néven jelölünk amelyben a natív íripszin hely helyettesítve van LRMS-seí.
A 30., 32., 34., 42. és 46. azonosítószámú szekvenciák polipepadek egymásodik családját reprezeo30 tálják, amelyek a 20. azonosítószámú szekvencia szerinti csonkolt polipeptid variánsait vagy mutánsait testesítik meg; Ily módon a 30., 32., 34., 42. és 46, azonosítószámú szekvencián a 2. azonosítószámú szekvencia 20. azonosítószámú szekvencián bemutatott peszíieid aktivitású ft&grnensének a variánsait mulatjuk be. Közelebbről, a 30. azonosítószámú szekvencián olyas mutánst matatok -he......amelyet a leírásban NGSRN49RVD néven jelölünk amely egy további trípszis hasítási helyet tartalmaz; a 32. azonosítószámú szekvenciái’, egy tná35 sodík mutánst mutatunk be—-amelyet a leírásban LKMS1N4WVD néven jelölünk—, amely olyas, kimotripszin hasítási helyet tartalmaz, amely nincs jelen a vad típusú. 1218-1 vagy 1218-1A polípeptidben; és a 34. azonosítószámú szekvencián egy helyettesítő mutánst mutatok be......amelyet a leírásban LKMS..R49PVD néven Kiölünk —, amelyben agy meglévő tripszín hasítási hely tönkre van téve és egy kimotripszin hasítási helye van a helyére beépítve. A 42. azonosítószámú szekvencián egy második kimotripszin addiciós mutánst mutatunk be — amelyet a leírásban LRMS.N49PVD néven jelölünk......, amely az LRMS (48, azonosítószámú szekvencia)
- 15 alternatív kimotripszin hasító helyet tartalmazza.. A 46. azonos kószáink szekvencián (I,RMS,.R49PVO) egy második helyettesítő vagy szubsztitúeíős mutánst mutatunk be, amelyben a -natív tripszin hely helyettesítve van LRMS-sel.
Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti pelipeptid&keí vagy leírás szerinti nukleinsavskról történő 5 öxprssszáiíaíással, vagy szokásos molekuláris biológia módszerek alkalmazásával állíthatjuk elő. Például találmány szériád -csonkok fehérjét találmány szerinti rekornhináns nukieinsav szántása megfelelő gazdasejíben történő expresszáltatássai, vagy más megoldásképpen ax vim eljárások, mint például tisztított vad típusé fehérje proteázos emésztésének és tisztításának kombinációjával állíthatunk elő.
A leírás szerinti értelemben az „izolált” vagy „tisztítóit kifejezés alatt a találmány szerinti polipeptid 10 vonatkozásában azt érijük, hogy az izolált fehérje lényegében mentes sejtbeli anyagoktól, és olyan: febériekészitményt tartalmaz, amelynek kevesebb, mint körülbelül 30%-a, 20%-a, löéá-a vagy 5%-a fszáraz, tömeg szerint} szennyező fehérje. Amikor a találmány szerinti fehérjét vagy annak biológiailag aktív részletét, rekombináns ólon állítjuk elő, előnyösen a tenyésztő lápkőzegítek kevesebb, mint körülbelül 30%-a, 20%-a, 10%-a vagy 5%a. (száraz tömeg szerint) kémiai prekurzor vagy nem jelentőséggel bíró fehérjét képviselő vegyszer.
Nyilvánvaló, hogy a pesztícid aktivitású fehérjék lehetnek oilgomerek. és a molekulatömegük, oldalláncaik száma, alkotó peptídjeik, adott kártevők elleni aktivitásuk és más jellegzetességük változhat. Azonban a találmány szerinti eljárásokkal számos kártevővel szemben aktív fehérjéket -izolálhatunk és jellemezhetünk. A találmány szerinti pesztieid aktivitású tehéíjéket alkalmazhatjuk Bt-endoteinokkaí vagy más rovarirtó fehérjékkel kombinálva, hogy növeljük a célzott rovarok kőrét. Ezenfelül a találmány szerinti pesztícid aktivitású fehérjék Bt Ő-e«d»tex «tokkal vagy más, eltérő természetű- rovarirtó anyagokkal való kombinált alkalmazása különösen alkalmas rovarrezisztencía megelőzésére- és/vagy meuedzselésére-.. Más rovarirtó anyagok közé tartoznak proteáz inhibitorok (mind szerin, mind ereztem típusúak), Hetinek, o-armiáz és peroxidáz.
A nnkleoíid- és aminosav-szekvenciák fragmenseí és variánsai és az. azok által kódolt polipeptidek szinten a találmány tárgyát képezik, Á leírás szerimi értelemben a „fagmetts” kifejezés alatt találmány szerinti polinukleoíid nakieoíid-szekvenciájának vagy polipeptid aminosav-szekveociájának egy részletét értjük. Nukleorid-szekveaeia fragmenseí olyan fehérjefragmeoseket kódolhatnak, amelyek megtartják a natív fehérje akti-vitását, és ezáltal pesztícid aktivitásüak. Ily módon nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polinukleodd- és aminos&v-szekveoeták némelyikét helyesen akár iragntensnek, akár variánsnak Is- nevezhetjük. Ez különösen igaz a biológiailag aktív csonkok szekvenciák esetében..
Nyilvánvaló, hogy a „fragmens” klféje-aés alatt a- találmány szerinti -nnkleínsav-szekve-neiák vonatkozásában olyan szekvenciákat is értünk, amelyek hibridizációs próbaként alkalmazhatók. A nukleotíd-szekvenciák ezen osztálya általában nem. kódol biológiailag aktivitást megőrző íehésjefrsgm.en.st. Ily módos egy nukieínsavszekveneia feagnvensei legalább körülbelül 2Ö nukleotid, körülbelül 5Ő nukleotid, körülbelül löö nukleotid, és akár a találmány szerinti fehérjét kódoló nnkleortd-szekvencia teljes bosszúságáig terjedő tartományban iehet35 nek.
A találmány szerinti pesztieid aktivitású fehérje biológiailag aktív részletét kódoló Cm?-szsrü aokieotíd-szekvencia fragmense legalább 15,25, 30, 50, 100,200,300, 4Ö0, 500, 600, 700, SOÖ, 900, 1 Qöő, 1100 vagy 1200 összefüggő aminosavat kódolhat, vagy akár a találmány szerinti pesztieid aktivitású poi ipeptidfcen jelen lévő összes anrinosavst (például sorrendben 1206, 1210, 667, 667 és 669 antlnosavat a 2., 4„ 6., 8. és lö. azeno40 súószáraú szekvencia esetébe®).. A öyő-szerii ntíkisolid-szekvencia hibridizációs próbaként vagy PCR-16láncinditökéoí alkalmazható fragmen&eínek «em kell peszticid aktivitású fehérje biológiailag aktív részletét kódolniuk.
Ily mődon Cn-A-szerü nnkleinsav fragmense peszticid aktivitású fehérje biolőglailag aktív részletét kódolhatja, vagy olyan fragmens lehet, .amely hibridizációs próbaként vagy PCR-íáscmáítófcóní alkalmazható az.
.5 alább feliárí eljúrésnkban. Peszticid akiivitásü fehérje biológiailag aktív részletét a találmány szerinti Cryó-szerií rsukfeotid-szekvsnitiák egyikériek az .izolálásával, a. peszticid .aktivitású fehérje kódolt részletének az; expresszáltatásával (példáid fe vitro rekombínáns .expresszióval) és a pesztieid aktivitása fehérje kódolt részletének az: aktivitásának, a megállapításával állíthatlak elő.
.Az. olyan-nakleínsavak, amelyek Gyó-szerii niíkisráíd-szekvencia fragmensei, legalább 16, 26, 56,.75,.
106, 156, 260, 250, 300, 356, 400, 456, 560, 606, 766, S00, 1060, Í2Ö6, 1400, 1600, 1,800, 2066, 2260, 2400,
2660, 2S60, 3660, 3206, 3460 vagy 3606 nukleotidot iartalínazoak, vagy akár a találmány szerinti nukleotidszekvenciákban jeles lévő összes nukleotídot (például sorrendben 3621, 3633, 2003, 2603 és 2010 és 2022 sukleotídot az h, 3.,. 5., 7., 9, és 17. azonosítószámú szekvencia esetében).
Például az 5., 9., 15, és 19. azonosítószámú szekvenciák az 1. azonosítószámú szekvencia, és a 7. és
17. azonosítószámú szekvenciák a 3. azonosítószámú szekvencia fragmenseit reprezentálják. Közelebbről a találmány szerinti onkle insavak előnyös megvalósítási módjai egy első nakíemsavből .származó (például abból előálittoit) tragrnensek.es tárnak fel, ahol a fragmens pesztieid aktivitásé OyÓ-szerii csonkolt «ndotoxint kódok A találmány szerinti polimrkleotíd-fragmeosek által kódolt csonkolt poiipeptid peszticid aktivitású, azaz vagy ekvivalens, vagy javított az aktivitása ahhoz, az első nukleinsav által kódolt megfelelő teljes hosszúságú peiípeptidhez hasonlítva, amelyből származik,
Specifikus- megvalósítási módok szerint a találmány szerinti nukfeinsav-fragmerssek némelyike a vad típusú kódoló szekvencia 3’ végén csonkolt. Péktáal az: 5. és 15 . azonosítószámú szekvenciák az. 1. azonosítószámú szekvencia 3’ végen csonkolt fragmenseit reprezentálják. Egy .alternatív megvalósítási, mód szerint az egyik találmány szériáit poiimikleoíid — a 19- azonosítószámú szekvencia......olyan mikleinsav-szekvenciát tar25 tslmaz, amely a sorrendben az 5. és 15. azonosítószámú szekvencia által kódolt 1218-1 és I.2ÍS-ÍA tnxisdoménnak mind az 5', mind a 3' végen csonkolva van.
„Variáns” alatt lényegében hasonló szekvenciákat értünk. Nukleotid-szekvenciák esetében konzervatív variánsok közé tartoznak azok a szekvenciák, amelyek......a genetikai kód degeneréitsága miatt — a találmány szerinti peszticid -aktivitású poiipeptidek. ;wtinosav~sze:kvenciáját kódolják. Az ilyen, példán; tennészetben elfr30 forduló aíielíkus variánsok azonosíthatók jói ismert moleköiáris biológiai módszerek, mint például polimerázlánereakoiő (PCR) és hibridizációs módszerek alkalmazásával, amint azt alább ismertetjük.
A nnkleotid-szekvetrciák variánsai közé tartoznak; szintetikus eredetű nukieotid-szekveneták is, mint példáid a heiyspeeiíikiis mutagenezis útján előállítottak, de amelyek továbbra is taláhnásy szerinti peszticid aktivitású fehérjét kódolnak. Általánosságban a találmány szerinti adott mdíleoiid-szekvencia variánsainak leesés lábh körülbelül 49%, 5656, 60%, 65%, 70%, általában legalább körülbelül 7536, §0%, 85%, előnyösen legalább körSlbcldl 8734, 88%, 89%, 90%, 9Í%, 92%, 93%, 94%,. 9556, 96%, 9794, és előnyösebben legalább körülbelül 98%, 99%, vagy nagyobb a szekvencia-azonossága sz sdoti nukleobd-szekvesctávai, amint azt a leírásban máshol ismertetett, szekvenciákat egymás alá rendező programokkal meghatározzuk, az alapértelmezett paraméterek alkalmazásával.
-17* » * 9 XX « **
Φ ♦ X Φ Φ » Φ >
φ * *φφ * « < *
4 * Φ ***♦ * * »* * ♦ *Φ* X * *·♦
Α leírás, szerinti értelemben a „variáns fehérje” kifejezés alatt olyan poHpeptidefcet értünk, amelyek természetben előforduló fehérjéből szár-naznak egy vagy több aminosav deléeíőjávai (úgynevezett csonkolás) vagy addíciój-ávái a natív fehérje N-tersnínálisál»z és/vagy C-temunálisához; vagy egy vagy több aminosav delécíójával vagy addfeióiával a natív fehérje egy vagy több helyen; egy vagy több aminosav szubsztitúciójával a natív fehérje egy vagy több helyén. Ennek megfelelően a variáns fehérje kifejezés alatt natív fehérje biológiailag aktív feagmenseit értjük, amelyek elegendő^ szántó összeföggö aminosav-oldailáneoi tartalmaznak, hogy megtartsák a natív fehérje biológiai aktivitását
A találmány szerbül variáns fehérjék biológiailag aktívak, azaz továbbra is rendelkeznek a natív fehérje kívánt biológiailag aktivitásával, azaz a leírás szerinti peszticid aktivitással, ilyen variánsok példán! genetikai polímorriziaas vagy emberi beavatkozás eredményes lehetnek. Á találmány szerinti natív -peszticid aktivitású fehérje biológiailag aktív variánsainak legalább körülbelül 40%, 50%, 60%, 65%, 70%. állasában legalább körülbelül 75%, 8Ö%, 8.5%, előnyösen legalább körülbelül 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 9790, és előnyösebben legalább körusbelül 98%, 99%, vagy nagyobb a szekvencia-azonossága a natív fehérje amfoosav^zékveneiával, amist azi a leírásban máshol ismertetett, szekvenciákat egymás alá rendé15 zö programokkal meghatározzak, az alapértelmezett paraméterek alkalmazásává!, A találmány szerinti fehérje biológiailag, aktív variánsa esak .1-15 mnmosav-oldalláscban, vagy csak i-1'0, mint például 6-10, csak 5, csak 4, 3, 2, vagy akár csak I amioostv-oidakáncban különbözhet a fehérjétöL
Nyilvánvaló, hogy bármely találmány szerinti' poliaaldeotid nukieinsav-szefcveneiája megváltoztatható vagy mufagenizálhatö, begy megváltoztassuk (például javítsak) a kódolt peszticid akti vitású polipeptid biológiai aktivitását, és/vagy speoihtásái. Például a i 1, azonosítószámú szekvencia CryÓ-szerű nukleotíd-szekveneiát reprezentál, amelyet úgy mntag^nizátemk, hogy 12 további nukleotlóot (13. azonosítószámú szekvencia) tartalmaz,, amely nincs jelen a megváltoztatott vad típusú wkfemsav-szekvenciában (15. azonosítószámú szekvencia). A
15. azonosítószámú szekvencia kódoló régiójába inzertéit: nukleotíd-szekveneiát úgy terveztük, hogy egy NGR5 addfeies mutánst kódol, amely egy további tripszis hasítás! helyet kódol· (NöSK.) (14·. azonosítószámú szekvencia.) a kódolt polipeptid amioosav-szekvenciájában.
Közelebbről, a 14. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekveaeidt beépítettük a lő. azonosítószámú .szekvencia szerinti ŐVyó ő-endotoxio 164. és 165. aminesava közé,. Azért választottuk ezt az adott ammosav-szekvencíát, ötért megismétli a természetben. előforduló teljes hosszúságú fehérjében (2, azonosítószámú szekvencia) jelen tévő -endogén szekvenciát, és sgy második proíeáz-érzékeny helyet hoz léire. Köze39 iebbről-, a módosítása egy második trípszín-szerü helyet épít be. A szakember számára jól ismeri, hogy a Iripszio közvedenöl arginin és Iizin C-terminálisánál hasít. Amint a leírásban demonstráljuk, ért a rekombináns úton módosított fehérjét (12. azonosítószámú szekvencia) — amelyet all. azonosítószámú szekvencia kódol......javított aküvitás jellemzi fedeíesszárnyúak ellen, különösen koíorádóbogár (lásd a 6. példát, 1. táblázat), dél) kukortcabogár (lásd a 7. példát, .2-4. és 6. táblázat), és -amerikai kukorica-bogár (lásd a 7. példát, 5. táblázat) ellen.
A 21. azonosítószá-rtú szekvencián olyan Cryő-szerii nekleotid-szekvenctát mutatunk be, amelyet úgy mutagemzáltunk, hogy 12 további nttkfeoíidot (25. azonosítószámú szekvencia) tartalmaz, amely nincs jelen a vad típusú endotoxinbau. A oelnzertáh nukleotíri-szckveaeiát úgy terveztük, hogy egy LKMS addlciós mutánst kódol, amely kimotripszlh hasítási helyet (LKM.S) (26. -azonosítószámú szekvencia) tartalmaz a kódolt pobpeptid ammosav-szekveneiájában. Közelebbről, az LKMS addlciós. mutáns (l.KMS.N 1.218-1) olyan nakleotid4Ö szekvencia inzertet tartalmaz, amely az LKMS aminosav-szekvenciát építi be a ő. azonosítószámú szekvencia φ* φ φ $ # > .·.«·«* φ
».»ν* ' »*
-18160. és 161. amhsos&va közé. Az LRMS ,R 1218-ί jelű helyettesített LKMS mutáns olyan polipeptídeí tartalma?, amelyben az LKMS aminosav-székvencíát a ló. azonosítószámú szekvencia 160. és 161. amistosavai között építettük i?e, és ekávolítottuk az RGS aminosavakat a 16. azonosítószámú szekvencia 161-163. aminosav-poziciójáböl. Ez a módosítás eltávolítja a tripszin helyet, és egy kioiottipszin helyet épít ba. A kimotripszio közvetlenül a metíoain C-termínálistól hasít.
Az LRMS addíciós (LRMS.N1218-1) és helyettesített (LRMS.R 1218-1) mutánsok polipeptldek alternatív msgvaJósítósí módjait biztosítják, amelyek további vagy alternatív kimottipszm hasítási helyet tartalmaznak, de az LRMS matánsok különböznek a specifikus ammosav-szekvenciájukbao (48. azonositószámú szekvencia) és nukfeoúd-szekvertcíájakban (47. azonosítószámú szekvencia), amelyet a kimolrípszin hasítási helye beépítésére alkalmaztunk a mutáns polipeptíöeket kódoló nukteínsav-szekvenciába.
A 30. azonosítószámú szekvencia (NGSR.N49PVD), a 32. azonosítószámú szekvencia (LRMS.N49PVD), a 34. azonosítószámú szekvencia (LKM.S-.R49RVD), a 43. azonosítószámú szekvencia (LRMS.N49PVD) és a 46. azöoosítószáíuú szekvencia (LRMS.N49PVD) a 49PVD csonkolt pesztieid aktivitású polipeptíd mutánsait mutatja be, A 49PVD sttúnosav-szek vesetáj át a 20, azonosítószámú szekvencián mutatjuk he. Ezeknek a polipepíidekxtek az alapvető tervezése és elnevezése ugyanazt a mintázatot köved., amelyet fent alkalmaztunk a 1218-1 csonkolt pohpepíid esetében, és: a leírás más részében részletesebben ismertetőnk.
Nyilvánvaló, hogy az bíGSR, LKMS vagy LRMS ammosav-szekvenciákat kódoló bármilyen uukleotid-szekveneia alkalmazható, és hogy az ezeket a hasítási helyeket a variáns polipeptidekbe beépítő kodonok pontos azonossága változhat az alkalmazásától, azaz: egy adott növényfajban történő expresszAltatástól függően.
Az is nyilvánvaló, hogy bármelyik feltárt mutációt beépíthetjük bármelyik találmány szerinti polmukíeotídszekvenciába, amely tartalmazza a módosításra kiválasztott natív ttipszln hasítási helyet alkotó atomosa v-oldaltáncok kodonjait, Ennek megfelelően, akár a teljes hosszúságú endoíoxinoknak, akár azok bagmenseinék a variánsait módosíthatjuk úgy, hogy további vagy alternatív hasítási helyet tartalmazzanak, és ezek a megvalósítási módok a feltárt és igényelt találmány oltalmi kőiébe tartoznak.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan tnikroorganizíntts, amely transzformálva van legalább egy találmány szerinti nakfeiasawal, a nukleinsavat -tartalmazó: expresszíös kazettával vagv az. expresszíös kazettát tartalmazó vektorral. Előnyösen a mikroorganizmus olyan, amely szaporodik növényeken. Előnyösebben a mikroorganízmus· gyökeret kolonizáló baktérium. A találmány egy megvalósítási módjának, a tárgya burokba zárt pesztieid aktivitású fehérje, amely legalább egy, találmány szerinti pesztieid aktivitású fehérjét tartalmazó
3ö mikroorganizmust tartalmaz.
A találmány tárgyát képezik pesztieid aktivitású készítmények, amelyek laiáimány szerinti' transzformált organizmust, tartabuaznak. Előnyösen a transzformált mikroorganizmus hatásos pesztieid mennyiségben van jelen a pesztieid aktivitású készteőnybea,. együtt megfelelő hordozóval. A találmány tárgyát képezik olyan pesztieid akövltássú készítmények ís, amelyek izolált találmány szerinti fehérjét tartalmaznak, egymagában vagy kombinálva találmány szerinti transzformált organizmussal és/vagy találmány szerinti beburkolt pesztieid aktivitású fehérjével, hatásos rovarirtó mennyiségben, együtt megfelelő hordozóval.
A találmány tárgya továbbá eljárás .rovar-cáltartomány növelésére, találmány szerinti pesztieid aktivitású fehérje: alkalmazásával együtt legalább egy második pesztieid aktivitású fehérjével, amely különbözik a találmány .szerinti pesztieid aktivitású fehérjétől. Bármilyen, a szakterületen ismert pesztieid aktivitású fehérje • 19 alkalmazható a találmány szerinti eljárásokba». Kyen pesztlcid aktivitású fehérjék nem korlátozó példái közé tartoznak fo S-endotoxinok, proteáz-inbibitorok, lekéinek, n-aínilázok és peroxídázok,
A találmány tárgyát képszik transzformált vagy transzgenikus növények, amelyek legalább egy találmány szerinti nnkleotíd-szekvenciát tartalmaznak, Előnyösen a növény stabilan transzformálva vau olyan nuklevriid-konsizukelőval, amely legalább egy találmány szerinti onkleorid-szekvenciát tartalmaz; működőképesen kapcsolva egy olyan promóterhez, amely expressziét irányit növényi sejtben. A. leírás szerinti értelemben a „transzformált növény és transzgenikus növény” kifejezések alatt olyan növényt értőnk, amely imteroióg po.ltnukleotidot tartalmaz a genontjában. Általában a heterológ: pnlmakleotid stabilan be van épülve a transzgenikus vagy transzformált növény génomjába, oly módon, hogy a poliuukleotíd átadódik az egymást követő generáci10 ókban. A heterológ pollnnkleotíd önmagéban integrálódhat a gettómba, vagy rekombináos expressziós kazeíta részeként.
Nyilvánvaló, hogy a leírás szerinti értelemben a „transzgenikus” kifejezés alatt bármilyen olyan sejtet, ssjtvonalaí, kallnszt, szövetet, növényi részt vagy növényt ériünk, amelynek a genotípusát megváltoztattak heterológ nukleinsav jelenlétével, közlök, olyan íranszgenikns egyebekkel, melyek eredetileg ily módon tsegváitoz15 tabunk, valamint olyanokkal, amelyeket sz ereded traoszgcmkas egyedek ivaros keresztezésével vagy ivartalan szaporításával állltottoak elő, A „transzgenikus kifejezés a leírás szerinti értelemben nem foglalja magában a genom (kromoszómáik vagy extrakroraeszőmális) megváltoztatását hagyományos növéaynensesitési eljárások alkalmazásával, vagy természetben előforduló események, mini például véletlenszerű kereszi-megíercnékenyl·tés, nem rekombmátts vitális fertőzés, nem rekomhináns bakteriális transzformáeiö, nem rekomhináns irartszpo2ö zició vagy spontán mutáció révén..
A leírás szerinti értelemben a „növény” kifejezés alatt egész növényeket, növényi szerveket (íróidéul leveleket, szárakat, gyökereket, stb,), magokat és: növényi sejteket érittuk, és ezek utódait A találmány szerinti értelemben transzgenikus növényi részek alatt értendők például növényi sejtek, protoplasztok, szövetek, kallnsz, embriók, valamint virágok, szárak, gyümölcsök, levelek, gyökerek, amelyek olyan transzgenikus növényekből vagy azok utódaiból származnak, amelyeket korábban találmány szerinti DNS-moiekulával ttaoszformáhak, és ezáltal legalább részben transzgenikus sejtekből állnak, és ezek szintén a találmány tárgyát képezik.
A leírás szerinti érteleroben a „növényi sejt kifejezés alatt nem korlátozó példaként szuszpenziős magienyészeteket, embriókat, meriszíémás régiókat, kailuszszövetét, leveleket, gyökereket, hajtásokat, gamefofitont, sporofiíon·., pollent és mikrospörát ériünk. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható növények osztálya általánosságban olyan széles, mint a transzformációs módszerekben alkalmazható magasabb rendű növények osztálya, beleértve mind az egyszikű, mind a kétszikű növényeket, .Előnyös növény a So/őusík raóiZöríuu, Különösen előnyös növény a Zee tunys.
Bár a találmány nem fttgg növény növényi kártevő elleni rezfsztenciájársak egy adott biológiai mechanizmusától, a találmány szerinti nukleotid-szekveneia exprcssxiójs egy növényben eredményezheti a találmány szerinti pesztlcid aktivitású fehérje termelését, és a növény növényi, kártevő elleni rezisztenciájának növekedését. A találmány szerinti növények alkalmazhatók mezőgazdasági eljárásokban rovarkártevők befolyásolására, A találmány bizonyos megvalósítási módjainak. a tárgyát transzformált kakoricasövények képezik, amelyek alkalmazhatók amerikai és déli kukoricabogár befolyásolására. A találmány egy másik megvalósítási módjainak a tárgyát transzformáit burgonyanövények képezik, amelyek alkalmazhatók kolorádóbogár befolyásolására.
-20A -szakember számára. nyilvánvaló, hogy a rnefekularis biológia területének fejlődése, mini például a helyspecifikus és ráadom muísgenezís, pollmeráz-láncfealoriós módszerek, és felterjeméHtöki módszerek eszközök és protokollok széles körét biztosítják, amelyek alkalmasak mezőgazdaságba» jelentőséggel bíró fehérjék aminosav-szekveneíájának és genetikai szekvenciájának a megváitoztaíására vagy génsebészeti ötön történő módosítására. Ily módon, a találmány szerinti Cryá-szertl fehérjéket különféle utakon módosíthatjuk, beleértve az aminosav szubsztitúciókat, deiéeiókat, csonkolásokat és inzereiőkaí. Az ilyen manipulációm szolgáló eljárások j ól ismertek a szakterületen.
Például peszticid aktivitású fehérjék aminosav-szekveneia-variánsait előállíthatjuk mutációk beépítésével színtéfites mtkletnsoba (például DNS-molekulába). Matagenezism és. nukfeirssav-váitoztatásokra.
szolgáló eljárások jól ismertek a szakterüfeters. Például tervezeti változásokat oiigonukleotiá-közvetiteö helyspecifikus mutagenezis módszerrel építhetünk be (lásd például Kunkéi, Proc:. Natí. Acad. Scí. USA. 82,488-492. old. (1985); Kunkéi és mtsai., -Methods in Enzymol. 154, 367-382, old. (1987); 4 873 192. szánté .amerikai egyesül· államokbeli szabadalmi irat; „Techsiques m Molecular Biology'’, szerk.: Walker és Gassíra,. kiad.:: MaeMtllsn Pwbltshisg Company, New York (1983), és az azokban idézeti hivatkozások]:.
A vad típusú (például természetben előforduló) találmány szerinti nuklecáid-szekvenc iákat CHA-szeril
S-cudotoxinat kódoló fiacfite íímriRgjessts törzsekből állítottuk elő, lói ismert, hogy a természetben, előforduló t>-esdotöxktokss a spóraképző fi. ráermg/msís sejtek fehérjetermészető, kristályos zárványbeli protoxinként termelik. Áz érzékeny rovarlárvák. általi lenyelés után a mikrokrisíáiyok feloldódnak a középbélben, és a protoxin átalakul biológiailag aktív molekulává a rovar belében megtalálható jellegzetes entésztőenzime'k által.
Az aktivált ó-endotoxín magas aktivitással kötődik a kefeszegély-membránbólyagok fehérjereceptoraíhoz. A középbél epiíéliáiis sejtbevonata az endotoxin. elsődleges célpontja, és gyorsan elpusztul a toxln által létrehozott kapus, katiotr-szelekítv csatornák miatt kialakuló memhránperíoráeió következtében.
A különböző speeífilásó Gry-toxinok ateinosav-szekveneiáinak az összehasonlítása öt: erősen konzervált .szekvencia-blokkot tár fel. Szerkezetileg a é-endotoxmok kórom elkülönült áoménr tartalmaznak, amelyek az N-íerrninálistöl a C-termlnális felé haladva az alábbiak: a pőrusképzésbea részt vevő bét alfa-hélix csoportja, a sejt kötésében részt vevő bárom antiparalel béta-lemez, és egy béta-szendvics.
A találmány szerinti mtstáns Oyö poiipeptkleket általában az alábbi lépéseket tartalmazó eljárással állítottuk elő: Cryd poiipeptideí kódoló nukleoiíd-szekvencia előállítása; a polipeptíd szerkezetének az elemzése a génszekvencia helyspecitikus rauiageaezise. céljából történő azonosítása végett, a eéláoménnek az endotoxin hatásmecb&fhzmusában javasolt fonkeióiának a figyelembe vételével; egy vagy több mutáció beépítése a nukleinsav-sz.ekveneiába, hogy kívánt változtatási: állítsunk élő: a kódolt potipeptid-sz.ekveneis egy vagy több arninosav-oldal láncában, ahol a változtatást ágy tervezzük, hogy protoáz-érzékeny hasítási helyet adunk, a célzott régióba, vagy eltávolítjuk az eredeti proteáz-árzékeny helyet és olyan protoáz-érzékeny helyet hozunk létre, amely egy különböző proteáz hasítására érzékeny; és expresszáltatjuk a rékombináns úton módosított találmány szerinti: fehérjét kódoló mutagenízált nnkieínsav-szekveuciát transzformált gazdasejt: olyan körülmények között, amelyek Itatásosak a módosított GyA polipeptid exptesszálükására.
Sok S-soöotoxm. rőten különböző mértékig az aístnosav-szekvenciájuk és harmadlagos szerkezetok hasonlósága tekintetében, és fi. tiiaringiensis endotoxinok kristályszerkezetének az előállítási módjai jól isntertek. A Cry3A és Cry3B polipeptidek szemléltető nagyfelbontású kristályszerkezete hozzáférhető a szakiroda40 lomban, A Cty3A gén megállapított szerkezetét: fl.í és mtsai., Natore 353,3815-821. old. (1991)j alkalmaztuk a
2. azoísoshöszámú szekvencián bemutatod, itt feltárt és igényelt C?y6-s:zerö d-endötoxiu homológjai modelljének előállítására, annak érdekében, hogy betekintést nyerjünk az endotoxín szerkezetének és működésének összefüggéseibe, és találmány szerinti rekombináns ütőn módosított fehérjék tervezésére, A & rií’míHgl<m· vA enáotoxino'k publikált szerkezeti elemzésének, és sz adott, szerkezetekkel, motívumokkal és hasonlókkal kapcsolatos· ismert funkciók kombinált megfontolása azt mutatja, hogy az endotoxín specifikus régiéi korrelálnak bizonyos itmkeiőkka.1, és a fehérje haiásm.eehanizmusának elkülönült .lépéseivel. Például a & rh«?'?bgAm.«.s··· bői izolált δ-endotoxlnokat általában úgy Írják le, hogy három domént tartalmaznák, a pórusképzésben részi: vevő hét alfe-hélixet tartalmazó csoportot, a sejt kötésében részt vevő három antíparaíel béta-lemezt, és egy béta-szendvics motívumot [Li és mtsaí,, Natúré, 385, 815-821. old. (1991)].
Azt gondoltuk, hogy a Cmf-szerö fehérjék toxieháss, és különösen a Cn-Ő fehérje toxícitása javítható az endotoxín fehérje 1. dómén 3. és 4, alfá-hélixe között. található régió célzásával. Ezt az elméletet az alábbiak ismeretére alapoztuk: a Qy3A A-endötoxínofc 1. dómén 4. és 5. héíixeirol ismert volt, hagy az érzékeny rovarok kőzépheléí szegélyező sejtek lipid kettösrétegébe inzertálodnak be [Gazát és mtsaí., Eme. Natl, Acad. Scí, USA. 95,122:89-12294, old, (1998)j; a tripszm és kímoíripszm hasítási helyének ismerete a vad tlpos-ö fehérje amino15 sav-szekvenciájában; és a jelen leírásban ismertetett azon megfigyelés, hogy a 1218-1 által, kódolt fehérje (azaz a 2, azonosítószámú szekvencia) aktívabb volt bizonyos fedelesszárnyú fajok ellen tripszlnes vagy kimolripsziaes kezelés általi in váró aktiválást követően. Ennek megfelelően olyan mutáns íAvd-szerü fehérjét állítottunk slő génsebészeti úton, amely legalább egy: további tripszm hasítási helyet tartalmaz, az 1. dómén 3. és 4. hélíxe közölt található régióban.
Közelebbről olyan mulagenízáít Cryd-sxerú nakleoíl>d-szekvene:lá.kat állítottunk elő, amelyek mutáns öyó endoíoxiuokat (például polípeptideket) kódolnak, és amelyek vagy további, vagy alternatív proteáz-érzékeny helyeket tartalmaznak, A találmány tárgyát olyan mutáns polipeptidek képezik, amelyeket 1218-1 (6. vagy
16. azonosítószámú, szekvencia), vagy 49PVD (20. azonosítószámú szekvencia) háttérben állítottunk elő. Nyilvánvaló, hogy a. 1218-1 jelölés a leírás szerinti értelemben a találmány szerinti 1218-1 aukleotid- és amino25 sav-szekveness két megvalósítási módját (például 1218-1 és I218-1A) -tartalmazza. Ez különösen Igaz a feltárt addiciös és helyettesítő mofensok vonatkozásában, amelyeket 1213-1 vagy 49PVD háttérben állitohunk elő. Nyilvánvaló, hogy a leírás szerinti értelemben a mutánsokra alkalmazott nómenklatúra, mint például a leírt NGSR.NI21S-1 mutáns magában foglalja mind az: 1218-1, mind. az 1218-1A háttérben előállított mutánsokat. A következetesség kedvéért a 121.8-1. mutánsokra a szekvencialistában, bemutatott szekvenciák az 1218-1A szekvenciákban létrehozott mutánsokat testesítik, meg (1:5. és 16, azonosítószámú szekvencia),.
Általánosságban az összes leírás szerinti mutáns· poíipeptidet. úgy terveztük, hogy legalább egy proteoiitíkus hasítási helyet tartalmazzanak .az 1. dómén 3. és 4. hélíxe között, amely roncs jelen a vad típusú polipeptldben. Az összes leírásban feltárt mutánst a pET expressziós rendszerben klónoztuk, £. coo-ban expresszálfertuk és teszteltük peszticid aktivitásra először déli kukorioaimgár (SCRW) és azután amerikai, kukoricabogár iAVCRW) ellen. Ezenfelül a 49PVD variánst (28. azonosítószámú szekvencia) és az NGSK..N1218~ i mutánst (12, azonosítószámú szekvencia) teszteltük peszticid aktivitásra a kolorádőbogár (CPB) ellen.
Röviden, a találmány szerinti mutánsok közé az alábbiak tartoznak: egy második napsam hasiiási helyes [azaz N'GSR-t (14. azonosítószámú szekvencia)) a 6. azonosítószámú szekvencia, szerinti (1218-1) vagy a lő. azonosítószámú szekvencia szerinti (1218-1 A) nminosav-szekvenclába inzertálva, vagy a 20. azonositószá48 mú szekvencián bereurátótf íragmens (49PVG). Az LKMS (26. azonosítószámú szekvencia) vagy LRMS (48.
-22azonositószámú szekvencia) szekvenciát kőzvetieaöí a módosított polipeptid-szekveneiába» természetesen előforduló trips22n hasítási hely előtt (például attól közvetlenül 5’ irányban) tartalmazó kúnoírípszt» hasítási helyet tartalmazó mutánsok; és olyan helyettesítő mutánsok, amelyekben a módosított polípeptid toxfo-doménjáheu előforduló natív trapszin hely tőnkre van. léve, és egy künotripszin hely (például LKMS· vagy LRMS) van beépítve a helyére.
A mutánsok 1218-1 sorozatába tartozó mutánsokat a leírásban NGSS..N1218-1, LKMS.NÍ2Í8-I,. .LKMS.Ri2JS~l, LRMS.NI218-1 és LRMS.R1218-1 néven jelöljük, Ezen mutáns polipeptidek aminosav-szekveneíáját sorrendbe® a 12., 22., 24., 42. és 44. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be. A találmány tárgyát képezi mutáns polipeptidek egy második sorozata is· (30,. 32., 34., 42. és 46. azonosítószámú szekvencia), ame10 Ivekben a fent leírt .addíeió (tripszln vagy kimoíripszin hasítási hely) és helyettesítés (kimotripszin hasítási hely a tripszm hely helyett) mutációkat építettünk be a 2G. azonos kószái nú szekvencia szerinti csonkolt polipeptidbe (példáid 49PVD-bc). A mutánsok ezen sorozatát NGSR.N49EVD, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD, LRMS.N49RVD és LRMS.R49PVD néven jelöljük. A 49PVD mutáns .polipeptidek ummosav-szekvenciáját sorrendben a 30., 32,, 34., 42. és 4tk azonosítószámú, szekvencián mulatjuk be.
A találmány szerinti NGSR mutánsok egy további tripszínre érzékeny proteáz helyet tartalmaznak a polípeptid 1. doménját kódoló aminosav-szekveneia egy régiójában. Például az NGSR.N1218-1 mutáns NöSR szekvenciát tartalmaz a vad típusú fehérje 164. és 165. aminosava közé beépítve. Ez az aminosav-szekvencía egy második trípszin-érzékeary hasítási helyet kódol a II. azonosítószámú szekvencia szerinti mutáns endotoxinban. Közelebbről, az NűSR szekvencia (például a 14. azonosítószámú szekvencia) megduplázza az. endogén tripszi® hasítási, helyet, amely jelen van a eélrégíóbaa;, ezáltal egy második proteáz-érzékeny helyet épít be az 1. dómén 3. és 4. altá-hétixe közötti hmokréglófea. ily módon a 14. azonosítószámú szekvencia aminosav-szekvencíája a íúö. aminosavtő! kezdve NGSRMGSR. Ezzel ellestétben a vad típusú fehérje. 160-164. amínosavaí az NGS-R szekvenciát tartalmazzák.
Míg sem 'kívánjuk magunkat elméletileg korlátozni, úgy véljük, hogy a második proteáz-érzékeny hely (például tripszi® vagy kúsotripszm) jelenléte elősegíti az íniramoieknláris proteulitikus hasítást azáltal, hogy fokozza a 4. és 5. héiix elválás! képességei a íoxia többi részétől, A 4. és 5. héiíxnek a toxin többi részétől való elválást képességének a fokozásának a hatásai hatékonyabb pórusképző folyamat formájában nyilvánulhatnak meg, és ezáltal megnövelheti a toxin rovarirtó aktivitását. Valóban, a találmány szerinti: í>vŐ mutánsoknak javított toxleitása van számos fédelesszarnyú kártevővel szemben. Az adaték azt is sugallják, hogy a második.
proteáz-érzékeny hely jelenléte olyan pölipepttdet eredményez, amely jobban aktiválható az érzékeny rovarok •emésztő&iyamataái által.
A találmány szerinti matagenizált, Cryő-szerú mkieetid-szekvencíákat úgy módosíthatjuk, hogy körülbelül 1, 2, 3, 4, 5, ő, 8, I0, 12 vagy több, a kódolt polípeptid elsődleges szerkezetében jelen lévő aminosavet módosítunk. Más megoldásképpen a natív szekvenciába még több változtatási építhetünk be, oly módon, hogy a kódok fehérje kodonjalsak legalább körülbelül 1%-a vagy 2%-a, vagy más megoldásképpen körülbelül 3%-a vagy körülbelül 4%-a, vagy akár körülbelül 5%-a vagy több van megváltoztatva vagy másképpen módosítva. Nyilvánvaló, hegy a találmány szerinti: mutagenízált GryÖ-szerti nukleotíd-szekvetieiák magukban foglalnak biológiailag funkcionális, ekvivalens peptldeket. Az ilyen szekvenciák, a kodon-redundaaeta és foiikclonátss ekvivalencia következtében jöhetnek létre, amelyek ismert módon természete;; körülmények között
4ö előfordulnak a nuklemsav-szekvenciákban és az így kódolt fehérjékben.
- 23 A szakember számára nyilvánvaló,: hogy amsaosav-addíctók. és/vagy szubsztitúciók általában az atfonosav-eldálláncok relatív hasonlóságán alapulnak, például azok hidrofóbításán, töltésén, méretén, stb. Szemléltető- szubsztitúciók, amelyek a különféle előző jellegzetességeket figyelembe veszik, jól ismertek a szakember számára, és közéjük tartozik: argatin és lízin;: glufamínsav és uszparagmssv; szerin és treonin; giutamin és aszparagin; és valin, leuein és izoleucin.
A megfelelő, a jelentőséggel bíró fehérje biológiai aktivitását nem befolyásoló- arninosav-szubsztilúciókra vonatkozó iránymutatást találhatunk DayholT és- mtsai, modelljében („Atlas of Protein Sequence and Structure, kiad.: NatL Biomed. Rés. Found., Washington, D.C, (I97S}}, amely hivatkozás úiján a kltanitás részét képezi, A konzervatív szubsztitúciók előnyösek lehetnek, mint például egy aminosavnak hasonló tulajdonságú másik asuinosavvai történő kicserélése.
ily módon a találmány szerinti gének és nukleond-szekvenciák közé tartoznak a természeten előforduló szekvenciák, valamint mutáns formák is.. Hasonlóképpen,, a találmány szerinti fehérjék közé tartoznak természeten· előforduló fehérjék, valamint azok variációi (például csonkolt .polipeptidek}, és módosított: (például mutáns} formái Az ilyen variánsok továbbra is rendelkezhetnek: a kívánt peszticid akit vitássá:. Nyilvánvaló,
IS hogy a variánst .kódoló ÖNS-ben végre hajtandó mutációk setn módosítják a szekvescia olvasási fázisát, és előnyösen nem hoznak létre olyan komplementer régiókat, amelyek másodlagos mRNS-szerkezetekeí hozhatnak létre (lásd például a 75 444. számú európai szabadalmi bejeleutést).
Nem várjuk azt, hogy a találmány' szerinti fehérjcszekvetíoiák deiédót, inz-ercióí és szubsztitúciói radikális változást okoznak a fehérje jellemzőiben. Azonban amikor a kivitelezés előtt: nehéz megjósolni: a szabszti20 tóeiő, detéeió vagy inzereíő pontos hatását, a szakember számára nyilvánvaló, hogy a hatást rutin szkrtóő vizsgálati eljárásokkal értékelhetjük, mint például rovartáplálásr vizsgálati eljárásokkal (lásd például Mártoné és mtsai., 1 Eoort. Erttoutoi. 78, 290-293, old.. (19S5) és Czapla és Láng, j. Ecort. Eníornoh 83, 248Ü-2485, old. (1 $9ö}„ amelyek hivatkozás ötián a kltanitás részéi: képezik]:.
A variáns nukteötid-szekveneiák és fehérjék közé tartoznak tmitagerazáló és rekombináns eljárások, mint például DNS-keverés („shaffihtg’ú eredntényeként. létrejött szekvenciák és fehérjék, livest eljárással egy vagy több különböző tfo-vd-szerti kódoló szekvenciát: ntan:ípn:iáihaí3.tnk úgy, hogy egy új peszticid aktivitású fehérjét hozzunk létre, amely rendelkezik a kívánt tulajdonságokkal. Ezen a módon rekombináns polinukleettd könyv-tárait állítjuk elő rokon szekvenciájú poiinuklcotldokbóL amelyek olyan szekvenciarégiókat tartalmaznak, amelyeknek jelentős a szskveneiaazonosságs, és homológ módon rekombinálhatók fo v/tao vagy fo vívó. Példáu l ennek a megközelítési módnak az alkalmazásával teljes hosszúságú kódoló szekvenciákat, jelentőséggel bíró domént kódoló szekvetmla-motívumökat vagy találmány szerinti nukkotid-szekvencíák bármely részletét keverhetjük találmány szerinti CrrA-szerű aokleötid-szekvettciák és más ismert Crt-A nukleotid-szekvenciák megfelelő részletei között, hogy javított jelentőséggel bíró tuiajdonsággal rendelkező· fehérjét kódoló új gént állítsunk elő.
3-5 A jelentőséggel bíró tulajdonság. nem korlátozó példái közé tartozik peszticid aktivitás per peszticid aktivitású fehérje, fehérjestabiltfás és íoxicltás nem célzott fajokban, különösen emberben, haszonállatokban és olyan növényekben és mikrobákban, amelyek eypresszáljáka találmány szerinti peszticid aktivitású polipeptidekei. A találmányt nem korlátozzuk semmilyen adott keverési stratégiára, csuk annyi 'lényeges, hogy legalább egy találmány szerinti .nukleotid-szekvencia vagy annak része részt vegyen a keverési stratégiában. A keverés csak egy találmány szerinti nukleotid-szekvenciáí foglalhat magában, vagy ezenfelül magában foglalhatja bármilyen ·· 24 más, szakterületen ismert nukleotid-szekvencia keverését, nem korlátozó példaként az ÜD4364, 1JO43Ó5 és U8436o Genebank lajstromszám alatti szekvenciák keverését. DNS-keverési stratégiák jól ismertek a szakterületen, (lásd például Síemmer, Proe. Natl. Acad.. Ser. USA 91, 10747-19751. old. (5994); Stemmer,.Natúré 370, 389-391, old. i5994); Crameri: és mtsai,., Natúrt: Bioíech.. 55, 436-4.38. old. (5997); Moore és mtsai.., .1, Mól.
Bioi. 272, 336-347. old. (1997); Z’nang és mtsai., Proe. Kati. Acad. Ser. USA 94,.4504-4509. old, (1997); Grameri és rnísai., Natúré 395,288-391. old. (1998); es az 5 605 793 és 5 837 458, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok),
A találmány szerinti nukleotid-szekveuciákat alknhnazhatjuk megfelelő szekvenciák izolálására más. organizmusokból is, különösen: más baktériumokból, és előnyösebben Pacúlas törzsekből. Ily módon olyan eljárásokat, mint például PCR-t, hibridizációt és hasonlókat alkalmazhatunk ilyen szekvenciák azonosítására azoknak a találmány szerinti szekvenciákhoz való szekvencsa-bomológiáia alapján. A találmány szerinti teljes öyó-szerfi szekvenciákhoz vagy azok Iragmesseihez való· szekvencia-azonosság alapján izolált szekvenciák a. találmány tárgyát képezik. Ilyen szekvenciák közé tartoznak a leltári szekvenciák orsolőgjai. Az „ortoíőg” kifejezés alatt olyan géneket értünk, amelyek egy közös ösgértből származnak, és amelyek a lajkeleíkezés ered15 ményeiíéppen eltérő fajokban találhatok meg, A különböző kyokbar: található géneket akkor tekintjük oriológnak, amikor a nukleoíid-szekvencíáiuk és/vagy az általuk kódolt fehérje szekvenciája lényegében azonos, amint, azt: a leírásban egy másik helyen definiáljuk, Az ortológok funkciói gyakran erősen konzerváltak a fajok között.
Egv PCR-es megközelítési mód szerint oligonukleotid-láneinditökat tervezhetünk PCR-reakcióban történő alkalmazásra, hogy amplifikáljuk a megfelelő DNS-szekvenciákaí bármilyen jelentőséggel bíró organiz28 másból Izolált cDNS-böi vagy genomiális DNS-ből. PCR-láncinditők tervezésére és FCR-klónozásra szolgáló eljárások általánosan ismertek a szakterületen, és azokat Sambrook és mtsai. tárják léi („.Moieeular Cloníng: A Laboratory Hanttal”, 2, kiadás, kiad.; Coki Spring Lferbor Laboratory Press, Pianjview, N.Y. (5989)). Lásd még: „PCR Protocols: A. Gtóde to Methods árrá Appliearims”, szerk.:: trmis és mtsai.,. kiad.: .Academlc Press, New York (1998); „PCR Strateglés”, szerk.;: inhís és Oelfahd,. kiad.; Aesdemic Press, New Yöfk (1995);, „PCR .25 Methods Mattnál” szerk.; Inois és Gelfand, kiad.: Academlc Press, New York (1999). PCR ismert eljárásainak nem korlátozó példái közé tartoznak párosított láncindltókat, egymásba ágyazott lánc indítókat, egyetlen specifikus lánciudirót, degeseráit láncindltókat, gén-specifikus iánciodítókat, vektor-specifikus iáseindiíőkat, részlegesen nem illeszkedő iáncmdiíokat és hasonlókat alkalmazó eljárások.
A hibridizációs módszerekben egy Ismert nakl.eotid-szek.verseia egészét vagy egy részét alkalmazzuk
30: próbaként, amely szelektíven hibridizál más megfelelő rurkleoíid-szekvenciákhoz, amelyek a kiválasztott organizmusból származó klónozott genomiális DNS-feagmensek vagy cDNS-fragmensek. populációiban (azaz genomiálás vagy' cDNS-könyvtárakban) jeles vasnak. A hibridizációs próbák iebe-tnek genostiáiis GNS-iragmensek, cDNS-lragmensck, RNS-fhtgmensek, vagy más: oligorruklccíidok, és lehetnek jelölve detektálható csoporttal, mint például ''P-vsl, vagy bármilyen más detektálható markerrel. Ily módon például hibridizációs próbákat elöállhhaínrtk a találmány szerinti Qyó-szeriS szekvenciákon alapuló szintetikus ollgormkleotirlok jelölésével. Hibridizációs próbák és cDNS- és genomiális könyvtárak előállítására szolgáló eljárások általánosan ismertek a szakterületen, és azokat Sambrook és mtsai. tárják fel („Moiecnlar Cloníng: A Laboratory Maoual”, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)).
Például találmány szerinti teljes üryó-szerfí szekvenciát, vagy annak egy vagy több részletét alkalmazói) hatjuk megfelelő CryÓ-szerü szék véne Iákhoz és hírvivő RNS-akhez specifikusan bibridizálni képes próbaként.
- 25 Különféle körülmények közötti- specifikus hibridizáció eléréséhez az ilyen próbák közé olyan szekvenciák tartoznak, amelyek egyediek a Cn-B-szcrü szekvenciák közös, és előnyösen legalább körülbelül 10 nukleotid hosszúságúak, és legelőnyösebben körülbelül 20 nukleotid isosszúságúak, Az ilyen próbákat alkalmazhatjuk megfelelő Ovó-szarii szekvenciák kiválasztott organizmusból PCR-rel történő ampílfíkálására. Ezt a módszert alkalmazhatjuk további kódoló szekvenciák izolálására kívánt organizmusból vagy diagnosztikai vizsgálati eljárásként kódoló szekvenciák jelenlétének a meghatározásra egy organizmusban. Hibridizációs módszerek közé tartozik a szélesztett DNS-kőnyviárak hibridizációs szkrinelése {akár tarfokokon, akár kolóniákon; iásd például JMoiecular Cloning: A Laboratory Manna!, 2. kiadás, kiad. : Coki Spring Harfaor Laboraíory Press, Piafnview, N.V, (1989)],
Az ilyen szekvenciák hibridizációját sziringens körülmények között hajthatjuk végre. A „sztringens körülmények között” vagy „szttíngens hibridizációs körülmények között kifejezések alatt olyan körülményeket ériünk, amelyek között egy próba deísktálhaíóan nagyobb mértékben (példáid legalább a háttér kétszeresével) bibridizál a eélszekvencíájához, mint más szekvenciákhoz, A szíringens körülmények szekvenciaíüggöek, és különböznek különböző körülmények között, A hibridizáció és/vagy a mosási körülmények sztrmgessségénefe a szabályozásával a próbával 100%-bau koniplementer cé lszekve ne iákat azoaosithattmk (homológ próbázás). Más megoldásképpen a szíringens körülményeket úgy módosíthatjuk, hogy megengedjünk bizonyos mértékű hibás illeszkedést a szekvenciák között, oly módon, hogy kisebb mértékű hasonlóságot detektáljunk (heterológ próbázás). Általában egy próba kevesebb, mint 1000 nukleotid hosszúságú, előnyösen kevesebb, min; 5ÖÖ attfcleotid hosszúságú.
2Ö 'Tipikusan a szíringens körühnények olyanok, amelyekben a sékeneentrscíó kisebb, mint körülbelül 1,5
M, tipikusan körülbelül 0,01-1,0 M Na-koncentráció (vagy más só) 7,0-8,3 közötti pH-η, és a hőmérséklet legalább 3Ö CC rövid próbák (például 1.0-50 nukleotid) esetében, és legalább körülbelül 60 °C hosszú próbák (például 50 nakleoiidnái hosszabb) esetében, Sztringens körülményeket elérhetünk destabilizáló ágensek, mist például fermamid hozzáadásával is. Szemléltető alacsony -stiriagensségő kört'ilméuyek közé fertőzik hibridizá25 ció 30-35% íbrmamidot, 1 M NaCI-t, 1% SDS-t (rótiiam-dödecíl-smlíStot) tartalmazó pufferoldattal 37 -'C-on, és mosás 1 SSC-vel (2Ox SSC~3,G M NaCW3 M irínáírmm-citrát) 50-55 °C-o;r. Szemléltető közepes szterngcnsségö körülmények' közé tartozik hibridizáció 40-45% fbnwmdoé, 1,0 M NaCI-t, 1%. SDS-t tartalmazó-putibreldtatl 37 °C-on, és mosás 0,5x-!.x SSC-vel 55-60 °C-oa. Szemléltető magas sztringen-sségü körülmények közé tartozik hibridizáció 50% formamidoí, 1,0 M NaCi-t, 1% SDS-t tartalmazó pufferoldatta! 3? aC-on, és mosás 0,lx SSC-vel 60-65 cC-on. A hibridizáció időtartama általában kevesebb mint körülbelül 24 óra, általában k-örttlbelül 4 és körülbelül 12 óra közötti.
A spccifhás tipikusan a hibridizációt követő mosások függvénye, és a kritikus tényező az utolsó mosóoldat ionerösségo és a hőmérséklete. DNS-DNS hibridek esetében a Ta,-et Meinkoth és Wahl egyenletével besítiheijdk meg (Anal. Biochem. 538,267-284. old. (1984): Ϊ,,,ΜΗ ,5 °C < 16,6 (lóg M) + (1,41 -(%GC) - 0,61 (%íörm s - Söö/L; ahol M jelentése a monovalen-s kationok moialitása, %GC jelentése a DNS-ben levő guanozin és ehozia nukleotídok százaléka, %form jelentése a hibridizációs oldatban található formamid százaléka, és L jelentése a hibrid hosszúsága feázsspárokbanj, A Tffi az a hőmérséklet (meghatározott ionerösség és- pH mellett), ahol egy komplementer céiszekveneia 5'0%«a bibridizál egy teljesen illeszkedő próbához. A T„, körülbelül 1 °C~ kai csökken, minden 1% hibásilleszkedésre; ily módon a T;,;-et, a hibridizációs és/vagy a mosási körülményeket.
úgy változtathatjuk, hogy kívánt azonosságé -szekvenciákhoz hlhridizáljuuk. Például ha >90% azonosságot
-26akarunk elérni, a T,,.-et csökkenthetjük 10 °C-fcat Általában a szferisgens körülményeket úgy választjuk meg, hogy kőrüfeelül 5 ®C~kaI legyenek alacsonyabbak, mini a specifikus szekvenciának és a komplementerének a teítnális olvadáspontja (YKS) egy adóit íonerősség és pH mellett. Azonban erősen sztringens körülmények között a tersnális olvadáspontnál (?„,} I,2, 3 vagy 4 ®C-kai alacsonyabb hibridizációt és/vagy mosást alkalmazhatunk;
közepes sztriagensségü körülmények között a termálig olvadáspontnál (ΤΚ!) δ, 7, k, 9 vagy 10 “C-kal alacsonyabb hshridizáelöt és/vagy mosási alkalmazhatunk; alacsony szíringeusségü körülmények között a termális olvadáspontnál {Te) 11, 12, 13, 14, 15 vagy 20 Abkal alacsonyabb hibridizációt: és/vagy mosást alkalmazhatunk. Az egyenlet, a hibridizációs és mosó készítmények és a kívánt TOT alkalmazásával a szakember szántára nyilvánvaló, hogy a hibridizációs és/vagy mosó oldatok szíringensségének a variációi maguktól értetődnek. Ha a kívánt hibás illeszkedés 45 “C-uál (vizes oldatban) vagy 32 “C-nál (formamid oldat) alacsonyabb eredményez, előnyős az SSC koncentráció megnövelése oly módon, hogy magasabb hőmérsékletet alkalmazhassunk. Nukleinsavak hibridlzálásának kiterjedt iránymutatását találhatjuk meg Tijssen [„Laboratory Techniqoes in Bíoehemlstry and .Moleeular Siology-Hybridizstion with Nuclelc Acid. Probes”, 1. rész, 2. fejezet, kiad,: Eisevier, New York (1993)] és Ausubei és mtsai. LCurrem Protocols in Moleeular Bioiogy’', 2, fejezet, kiad:
Greeae Poblishing and Wiley-Iamrscien.ee, New York (1995)): leírásában. Lásd Sambrook és mtsai., Moleeular Cloning: A Laboralory Manuai”, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor táboratory Press, Plamview, N.Y. (1989). Ily módon a találmány szerinti Gyö-szerii fehérjét kódoló és találmány szerinti Cnri-szerü szekvenciákhoz szirhigens körühnények: között híhridizáiö izolált szekvenciák vagy azok fragmensei. a találmány tárgyát képezik,
Az alábbi kifejezéseket alkalmazzuk két vagy több nukleinsav vagy polipeptid szekvenciájának a rokonságának a le Írására: (a) „relereuclaszekvencia’', (b) „összehasonlítási ablak’, (c) „szekvenci a-azonosság”, (d) „szekvencia-azonosság százaléka” és (e) „lényeges azonosság”.
(aj A leírás szeristi értelemben a ,,refereneiaszekvesrcia7 kifejezés alatt meghatározott szekvenciát értünk, mint az összehasonlítás alapja. Referenciaszekvencia lehel: egy specifikus szekvencia egy részlete vagy egésze; például teljes hosszúságú eDNS vagy genomíális szekvencia szegmense vagy a teljes eDNS vagy genomíális szekvencia.
(b) A leírás szerinti értelemben .az „összehasonlítási ablak” kifejezés alatt poiinükieottd-szekvencia Összefüggő és meghatározott szegmenséi: értjük, ahol az összehasonlítási ablakban lévő poiinukleotid-szekveneia tartalmazhat addíclőkat vagy deléciókat (azaz réseket) a refersnelaszekvendávai összehasoniitva (amely nem tartalmaz addíclőkat vagy deléciókat) a két. szekvencia optimális egymás alá rendezése érdekében, Általában az Összehasonlítási ablak legalább 2.0 összehiggo nukleofid hosszúságú, és adott esetben lehet 3Í), 4ő, 50, 1 (íö nukieotíd hosszúságú, vagy hosszabb. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a referenctaszekveneiához való nagymértékű hasonlóság, réseknek a poilnukleotiő-szekveseiába való beillesztésével történő elkerülésére tipikusan rés-büntetési alkalmazunk, és azt levonjuk az illeszkedések szántából,
Szekvenciák összehasonlítás céljából történő egymás alá rendezésére alkalmas eljárások jól ismertek a szakterületen. Ily módon a százalékos azonosság meghatározását bármely két szekvencia között matematikai algoritmus alkalmazásával valósíthatjuk meg- Ilyen matematikai algoritmusok nem korlátozó pólóéi Myers és Miller algoritmusa ICABIOS 4,11-17, old. (!98S)|; Smith és mtsai. lokális homológra algoritmusa fAdv. Appl. Math. 2, 482. old:. (1981)]; Needletmsn és Wunsch homológiás egymás alá rendezési algoritmusa (3. Mól, Bioi.
48, 443-453, old, (1970)]; Pearson és Lipman hasonlósági kereső eljárásai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, -2?~
2448-2448.. old. i 198S)); Kariin és ARsckul ídgormnusánsk [Proc, blatt. Aead. Scl VSA 87, 2264. oki. (1990)] Karib és Altschul általi módosítása [Psroc, Natl. Aead, Set.US A 90, 5873-5877. old. (1993)].
Ezeknek a matematikai algoritmusoknak a számitógépes megvalósításait alkalmazhatjuk szekvenciák összehasonlítására a szekveacia-azoaosság meghatározására. Áz ilye® megvalósítások nem korlátozó példái az alábbiak: CL.USTAL a PC/Gene programban (Intdligeneties, Monntain Víew, Calif); az ALÍGN program (Version 2,0) és GAP, BESTP'IT, BLAST, PÁSTA és TfÁSTA a Wísconsin Geneiics Software .Package programcsoíuaghsn [Version 8; Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dríve, Madison, Wis., USÁ]. Ezeknek a programoknak az alkalmazásával az, egymás alá rendezést az alapértelmezett paraméterek alkalmazásával hajthatjuk végre. A CLUSTAL programot részletese leírják Higgins és mtsai. [Gene 73, 23710 244. old, (1988)]; Higgins és mtsai. [CÁBÍOS 5, 151-153. old. (1989)]; C-orpet és mtsai. [Nucleic Áeids Rés.
16, T0881-10390. old, (1988)]; Huang és mtsai. {CABIOS 8, 155-65. old. (1992)]; és Pearson és mtsai. (Metfe. Mel. Bioi, 24, 367-331, old. (1994)], Áz AL1GN program Mvors és Mslier algoritmusán alapul (1988, mint lent), PAMI20 tömsg-eídailáne táblázatot, 12 értékű réslrossz-bnntetésí, és 4 értékű rés-büntetést alkalmazhatok az ALíG'N programmal aminosav-szekvenclák Összehasonlításakor. Altschul és mtsai. BLAST programjai (3. Mól. Bioi. 215, 403. old. (1990)] Karib és Aliséba! algoritmusán (1996, Ránt (ént) alapulnak, BLAST nukletbd-kersséseket a BLASTN programmal hajthatunk végre, ’score1 -- 160, ’word length’ ~ 12 értékek alkalmazásával, hogy találmány szerinti fehérjei, kódoló nukleotíd-szekvenelával 'homológ uukleotid-szekvcnetákat kapjunk, BLAST fehérje-kereséseket a BLASTX. programmal hajthatunk végre, ’score’ ~ 50, Avord lengik’ értékek alkalmazásával, hogy találmány szerinti fehérjével vagy polipeptíddel homológ ambosav-szekven20 ciákat kapjunk, összehasonlítás céljára réseket tartalmazó egymás alá rendezésekhez a ’Gapped BLAST’ (BLAST 2.0) programot alkalmazhatjuk, ambt azt Altschul és mtsai. leírták (Nucleic Acitis Rés. 25, 3389. oki. (1997)], Más megoldásképpen a ESI-BEAST (BLAST 2,0) programot alkalmazhattok Héráit keresés végrehajtására, amely molekulák közötti távoli rokonságokat detektál [lásd Altschul és mtsai. (1997), mint fent]. .Amikor BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLA.ST programot .alkalmazunk, a megfelelő programok (például BLASTN ouklefeid-szekveneiák esetében, BLÁSTX fehérjék esetében) alapértelmezett paramétereit alkalmazhatjuk. Lásd a íbphÁvwwmcbl.nlm.nth.gov/ internetes helyet, Az egymás alá rendezést manuálisan ís elvégezhetjük szemrevételezéssel.
Amennyiben másképpen nem mondjuk, a leírásban megadott Ttukleoííd-szekvetoa-azonossági./hasonlóság! értékek alatt a GAP Version 10 program (vagy bártnilyeu ekvivalens program) alkalmazásával az alább;
3Ö paraméterekkel kapott értékeket erőnk: százalékos azonosság ’GAP Weighí’ ~ 56 és ’Leugth Weiglú’ ~ 3 alkalmazásával; százalékos hasonlóság ’Gap Weíght’ ~ 12 és ’Lengtb Weigbf - 4 alkalmazásával. Antinossv-szekveaeíák esetében, a leírásban megadott ammösav-szskvencía-azouosságj értékek alatt a GAP Version 10 program (vagy bármilyen ekvivalens program) alkalmazásával az alábbi paraméterekkel kapott értékeket értjük: százalékos azonosság 'Gap Weight' 8 és 'Lengd; Weight’ - 2 alkalmazásával. „Ekvivalens program” alatt bármilyen olyan szekvencia-összebasonistő programot értünk, amely bármely két kérdéses szekvencia esetében olyan egyórás alá rendezést állít elő. amelyben azonosak a nukieotid- vagy aminosav-oídalláncok illeszkedései: és azonos százalékos szekvencia-azonosság, amikor az előnyös program által előállított egymás alá rendezéshez hasonlítjuk.
A GAP N'eedieman és Wtmseh algoritmusát alkalmazza [3. Mól. Bioi. 48, 443-453. old. (1970)] két teljes szekvencia egymás aiá rendezésének megtalálására, ami tnaxbnaiizálja az Illeszkedések számát és
-28mmlmaőzáfja a rések számát A G AP figyelembe veszi az Összes lehetséges egymás alá rendezést és réspozíciót, és a legnagyobb szarná illeszkedő bázist és legkevesebb rési tartalmazó egymás alá rendezést állítja elő. Lehetővé teszi az illeszkedő bázisok. számával ínért rés-alkotási büntetés és rés-nagyobbitási büntetés alkalmazását. A GAP-mtk hozzá kell adnia a rés-alkotási büntetést minden egyes inzertált rés esetében. Ha nullánál nagyobb rés-uugyobbftásl büntetést választunk, ezenfelül a GAF-nak hozzá keli adnia minden egyes inzertált rés esetében a rés bosszúságát szorozva a rés-nagyobbltásí büntetéssel. Az alapértelmezett rés-alkotási bümerés és rés-nsgyofebítási büntetés értékek a Wísconsin Genetics Software Package programcsomagban (Version lö) Ishéíjs-szckvenciák esetében sorrendben 8 és 2, Nukleotiá-szekvencíák esetében az alapértelmezett rés-alkotási büntetés érteke 50, és az alapértelmezett rés-nagyobbitási bimteíés értéke 3. A rés-alkotási és rés16 nagyobbítási büntetést egész számként fejezhetjük ki a 0 és 20Ö közötti egész számok közül megválasztva. Ily módon a rés-alkotási és rés-nagyobbftásí büntetés lehet ö, 1,2, 3» 4, .5, ó, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 2.5, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65 vagy nagyobb.
A GAP a legjobb egymás alá rendezések családjának az egyik tagja. A családnak számos tagja lehet, de egyik másik tag sem jobb mlsöségű. A GAP négy értéket ad meg az egymás alá rendezésekre: „Minőség''1, „Arány”, „Azonosság” és „Hasonlóság”, A „Minőség” a szekvenciák egymás alá rendezése érdekében maximalizált mérőszám. Az „Arany” a „Minőség” elosztva a rövidebb .szegmensben található bázisok számával. A „Százalékos azonosság)' az aktuálisan illeszkedő szimbólumok százaléka. A „Százalékos hasonlóság” a hasonló szimbólumok százaléka. A résekkel szemben lévő szimbőlumoka· nem vesszük figyelembe. Akkor értékeljük a hasonlóságot, ha az értékelési táblázatban található érték a szimbólum-pár esetében nagyobb vagy
2Ö egyenlő, mint 0,50, ami a hasonlósági küszöbérték. A Wiseonsin Genetics Software Package programcsomgbau (Version lö) található értékelési táblázat a Bi.,OSUMő2 [lásd í-ienikoff és Henikofi) Proc. Kati. Aead. Scí, USA 89, 1091.5. old. (1989)),
A találmány szerinti értelemben nukleotíd- vagy fehérje-szekvenciák összehasonlítását a találmány szerinti öyó-szerű szekvenciák szekvencia-azonosságának meghatározására előnyösen a Wiseonsin Genetics
Software Package (Version 8. vagy későbbi) programcsomagban található GAP program alkalmazásával végezzük, vagy bármilyen ekvivalens programmal. Nukleond-szekvenciák GAP-elemzéséhez ’GAP Weígbri «= 50 és Lengik' ~ 3 értékeket alkalmazzunk.
(ej A leírás szerinti értelemben a 'szekvencia-azonosság” vagy „azonosság” kifejezések .alatt nakSelnsav- vagy polipeptid-szekvenciák. vonatkozásában azt értjük, hogy a két szekvenciában található oldailáocok azonosuk, amikor egy meghatározott összehasonlítási: ablakban maximális megegyezésre egymás alá rendeztek azokat. Amikor a százalékos szekvencia-azonosság kifejezést fehérjék vonatkozásában alkalmazzuk, nyilvánvaló, hogy a nem azonos oldailáne-pozíelők gyakran csak konzervatív atósosav-szubsztitúcióban különböznek, ahol ammosav-oidaliáncok hasonló kémiai toktjdönságü (például töltés vagy hidrofóbitás) másik aminosavöldalláoccal vannak sz-ubszíiíuálva, és ezáltal nem változnak meg a molekula funkcionális tulajdonságai,
Amikor szekvenciák konzervatív szubsztitúciókban térnek el, a százalékos szekvencia-azonosságot felfelé korrigálhatjuk, hogy beszámítsuk a szubsztitúció konzervatív természetéi. Az ilyen konzervatív szubsztitúciókban különböző szekvenciákról azt mondjuk, hogy „szekvencia-hasonlóság” van közöttük, vagy „hasonlóak”. Ennek a korrekciónak a módjai jól ismertek a szakesafeet számára. Tipikusan ez magában foglalja a konzervatív szsfbsztítúciók tőrtszámmal való értékeléséi teljesen hibás illeszkedés hc-lyeft, ezáltal növelve a százalékos szek40 venela-azonosságot. Ily módon például amikor azonos aminosavnak í-es értéket, és a nem konzervatív
-29szahsziiláeiónak nulla értéket adunk, konzervatív szubsztitúciónak nulla és. 1 közötti értéket adunk.. A konzervatív szabsziúúcíők értékelését például a PC/GENE programban (íntelligenetlcs, Meuntain View, Calif) megvalósított módon számíthatjuk.
(d) A leírás szerinti -értelemben κ „százalékos szekvencia-azonosság” kifejezés alatt azt'az. értéket ért5 jak, amelyet egy összehasonlítási- ablakban két optimálisan egymás alá rejtezett szekvencia összehasonlításával határozunk meg, ahol a polínukleodd-saekveucia ősszehasoatttásl ablakban lévő részlete addiciókat vagy deléeiókat (azaz zéseket) tartalmazhat a referenctaszekvenciávai összehasonlítva (amely nem tartalmaz addíciökat vagy deléeiókat) a két szekvencia optimális egymás alá rendezése érdekében, A százalékot azon pozíciók számának meghatározásával számítjuk ki, amelyekben azonos oukiemsav-bázis vagy amínosav-oldallánc forda!
elő mindkét szekvenciában, ily módon kapjuk meg az illeszkedő pozíciók számát, elosztva az illeszkedő pozíciók számát az összehasonlítási ablakban lévő összes pozíció számával (azaz az ablak méretével), és az eredményt löfozai megszorozva kapjuk meg a százalékos szekvencia-azonosságot.
(e) (i) PöHnukleotid-szek véne iák „lényeges azonossága· kifejezés alatt azt értjük, hogy egy poiinukíeotid legalább 70% szekvencia-azonosság®, előnyőse» legalább 88% szekvencia-azonosságú, előnyösebben legalá íább 90% szekvencia-azonosságé és legelőnyösebben legalább 95% szekvencia-azonosságé a reforenciaszekvsnciúval összehasonlítva az ismertetett egymás- alá rendező programok és a szokásos parauiéterek alkalmazásával. A .szakember számára nyilvánvaló, hogy ezen. értékeket megfelelő módon módosítha-ijak két nukleotíd· szekvencia által kódolt fehérje megfelelő- azonosságának meghatározásra, figyelembe véve a kodoo-degeneráltsúgót, .mmsosav-hasonlóságot, olvasási fázis pozíciót és hasonlókat; Amínosav-szekvenciák lényeges azonos20 sága ebben a vonatkozásban normális esetben legalább ó0%, előnyösebben legalább '78%, 80%, 90%, és legelőnyösebben 95% szekvencia-azonosságot jelent.
Annak egy másik jele, hogy sukleotíd-szekveneíák lényegében, azonosak az, ha két molekula hifcrbiizái egymáshoz szíringens körülmények között. Általában a sztrmgess körülményeket ágy választjuk meg, hogy körülbelül 5 öC-kál legyenek alacsonyabbak, mist a specifikus szekvenciának a termállá olvadáspontja (T,„) egy adott mnertmég és pH mellett. Azonban szttingeas körülmésyek masakban foglalják a körülbelül í °C és körülbelül 2.Ö °C közötti tartomáayha eső hőmérsékleteket, a sztringerssség kívánt mértéke — amit a leírás más' részében definiálunk ...... ffiggvényében. Az olyan nukfeinsavak, amelyek sem htbrídizáinak egymáshoz.
sztringess körülmények között, még mindig. lényegében azonosak, ha az .általuk kódolt polipeptidek lényegében azonosak, Ez akkor fordulhat elő példán!, .amikor előállítják egy nukleinsav másolatát a genetikai köd által megengedett maximális ködou-degeneráltság alkalmazásával. Egy jele annak, hogy kél: mikíeínsav-szekvencia lényegében -azonos az, hogy az első nukleinsav által kódolt polipeptid ímmuaoíőgiaiíag keresztreagál a második nukleinsav által kódolt polipeptíddéi.
(e)(ií) A „lényeges azonosság” kifejezés alatt a peptídek vonatkozásában azt értjük, hogy a peptid legalább 70% szekveneia-azortosságó-, előnyösen 80%, előnyösebben 85%, legelőnyösebben legalább 90'% vagy
95% szekveucia-azonoságú a reíerencíaszekveaelával egy- meghatározott összehasonlítási ablakban. Előnyösért az optimális egymás alá rendezést N'eedleman és Wusseh bomolögiás egymás alá rendezési algoritmusával végezzük [1 Mól. Siói. 48, 443-453. óid. (19?ö)j. Annak egy jele, hogy két pepíidszekvertcia lényegében, azonos az, hogy az egyik peptid immurmlőgiaiSag keresztreagá! a második peptid ellen termeltetett ellenanyagokkal. Ily módon egy peptid lényegében azonos egy második pepiiddel például amikor a két peptid
40- csak konzervatív szubsztitúciókban különbözik egymástól. „Lényegében hasonló” pepsidefc közös szekvenciákat ;,s.:
-30tartalmaznak, amint fent megjegyeztük, kivéve, hogy sí nem azonos öksaílánc-poziciók konzervatív aminosavYáltozásokban különbözhetnek egymástól.
A „imkfeotbi-komtrukeió” kifejezés találmány szerinti alkalmazása nem. korlátozza a találmányt DNS-t tartalmazó nnkieotid-konstrukdókra. A szakember számára nyilvánvaló, hogy olyan nukleotíd-konslrukciók, különösen a polinnkleotidok és oltgontddeotidok, amelyek ribonukleotidokból és ríbonukleotidok és dezokírihonukfeotidok kombinációsból. állnak, színsen alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokban. A találmány szerinti nrtklecítid-konstrukeiók, nokfelnsavak és smkleetid-szekveneiak .ezenfelül magukban foglalják az ilyen konstrukciók, molekulák és szekvenciák komplementer formált is. Ezenfelül a találmány szerinti nukleotidkonstrukciók, nukleotid molekulák és nnkleötíd-szekvencíák magukban foglalják az összes- olyan nukleotidlö konstrukciót, molekulát. és szekvenciát, amely alkalmazható a találmány szerinti eljárásokban növények transzlorrnálására, nem korlátozó példaként beleértve azokat, amelyek dezoxlribonukleotidokböl, ribonukíeotidokhől és azok kotnbfoáciéfoól állnak. Az. ilyen deszcxlribenakleotídok és ríbonukleotidok közé természetben előforduló molekulák és -szintetikus analógok: tartoznak.. A találmány szerinti nukleotld-konstrukciók, nukfemsavak és nakleotiíl-szekveuciák szintén magukban, foglalták a •aukleotid-kosslmke.iók minden formáját, ne-tn korlátozó példaként beleértve az egyszáló. formákat, kéíszálú formákat, hajtüket, szár-és-hurok szerkezeteket és hasonlókat.
A találmány egy további megvalósítási módjának a tárgya transzformált organizmus, előnyösen növényi és rovarsejtek, baktériumok, élesztők,, hakutovirasök, egysejtűek, hengeresférgek és. algák közül bármilyen transzfermáii organizmus, amely találmány szerinti ÖN'S-melekulát, a DNS-molekuíát tartalmazó expressziós kazettát vagy az. expressziós kazettát tartalmazó vektort tartalmaz, előnyösen stabilan beépülve a transzformáit organizmus genomjába.
A találmány szerinti Cn-ó’-szero szekvenciákat expressziós kazettákban biztosítjuk a jelentőséggel bíró organizmusban történő expresszáltatás céljából. A kazetta tartalmazhat 5’ és 3’ szabályozó szekvenciákat működőképesért kapcsolva a találmány szerinti öyk-szerii .szekvenciához. A „működőképesen kapcsolt’' kifejezés alatt fonkcionáhs kapcsolatot értünk prontóter ős egy második szekvencia között, ahol a promóter szekvencia megindítja és közvetíti s második szekvencia szerinti DNS-szekvencja transzkripcióját. Általában a működőképesért kapcsolt kifejezés sóért azt értjük, hogy az összekapcsolt oukleínsav-szekvenciák folyamatosak, és — szükség szerint, ahol két fehérjét kódoló régiót kell összekötni .....folyamatosak és ugyanabban az olvasást fázisban vannak. A kazetta ezenfelül tartalmazhat legalább egy további géni, az organizmusba történő együttes transzformálás céljából. Más megoldásképpen a további. gén(eke)t több expressziós kazettán biztosíthatjuk.
Egy Ilyet! expressziós kazettát több restrikciós hellyel láthatunk el a CrvŐ-szerű szekvencia inzertálása céljából, hegy az a szabályozó régiók transzkripciós szabályozása alatt legyen. Az expresszié» kazetta ezenfelül tartalmazhat szelektálható maricergéneket is,
Az expressziős kazetta a transzkripció S'-3' kányában tartalmazhat transzkripciós és transzlációs imcíációs régiót, íídálmány szerinti CnA’-szerü szekvenciát, és transzkripciós és transzlációs termtnácíós régiót, amely működőképes a gazdaként szolgáló organizmusban.. A transzkripciós inieiációs régió — a promóter.....
lehet natív vagy analóg vagy idegen vagy heterológ s gazda organizmusban. Ezenfelül a promőier fehet természetes- szekvencia vagy más megoldásképpen szintetikus szekvencia. Az „idegen” kifejezés alatt azt értjük, hogy a transzkripciós inieiációs régió nem található meg abban :a natív organizmusban, amelybe a transzkripciós inidádös régiót bejuttatjuk. A leírás szerinti értelemben kiméra gén kódoló szekvenciát tartahnaz működőképesen kapcsolva olyan transzkripciós iniclációs régióhoz, amely heterológ a kódoló szekvenciához képest.
A terminádós régió lehet natív a transzkripciós Inidádös régióhoz képest, lehet natív a működőképesen kapcsolt jelentőséggel bíró DNS-szekvencíához képest, vagy származhat más forrásból. Kényelmes ieruu'nációs régiók hozzáférhetők az ,4. íöhjí;/ócííw Tí-plazmidjam, tolni példáid az okiopin-szlntáz: és nopalro·színtáz terndn&cíós régiók [lásd Gnerinean és nrtsai., Mól. Geo. Génét. 262, 141-144. old. (1991); Proudtnot, Cell 64, 671-074, old. (1991); Sanf&con és Búsai, Genes Dev. 5, 141-149. old. (1991); Mogen és sntsai,, Plánt Cell 2, 1261-3272. old. (.1990); Manroe és mtsai., Gene 91, 151-358. old. (3990); Bahas és mtsak. Nncieic Adós Rés. 37, 7S91-79Ö3. old. (1989); és .loshi ésmisai., Nneleíc Add Rés. 15,9627-9639: old, (1987)1.
Adott esetben egy nukleinsav optimalizálva lehet a gazda organizmusban való megnövekedett expresszióra, ily utódon......ahol a gazda organizmus növény — a szintetikus nukleinsavakat növényekben preferált kodonok alkalmazásával sziníetizálbatjuk a megnövekedőit expresszió céljából. Lásd példán! Campbell és Govrri cikkét {Plánt Physioi. 92, 1-11. old, (1999)]' a gazdák által preferált kodenhasználat tárgyalásáról. Például — habár a találmány szerinti nokleinssv-szekveueiák expressxálíaíhatök mind egyszikű, mind kétszikű növényló fajokban — a szekvenciákat ágy módosíthatjuk, hogy figyelembe vesszük az egyszikű és kétszikű növények specifikus kodon-preferendáit és GC-tartaiom preferenciáit, minthogy· ezekről kimutatták, hogy eltérőek (Murray és mtssL Nucldc Acids Kés. 17,477-498. old, (1989)), Ily módon a kukoricában preferált .kosion egy adott amlnosav «setébe» kukoricából származó ismert .génből származhat, 28 gén kukoricabeli kodonhasználntát a 4. táblázatban ismertetik Mnrray és latsai. (mint fent), ismertek a szakterületen eljárások növényeket preferáló gének szintetizálására [lásd például as 5 389 831. és 5 436 391. szánttá amerikai egyesült államokbeli szabadulod iratokat és Mnrray és mtsak, Nndeic Adds Rés. 17,477-498. old. (1989), amelyek hivatkozás utján a fciíamtás részéi képezik].
Ismertek további .szekvencia-módosítások a génsxpresszíő fokozására sejtes gazdában, Ezek közé tartozik a hamis poíiademlsciős szignálokat kódoló- szekvenciák, cxen-lníron hasítást helyek, transzpozon-szerü ismétlődések és egyéb ilyen jól karakterizált szekvenciák eliminálása, amelyek károsak lehetnek a génexpressziöra. A szekvencia G-C-tartalmát az adott sejtes gazdában átlagos mértékűre állíthatjuk be egy, a gazdasejilreo expresszáli ismert génekre való hivatkozással számítva. A „gazdásejí kifejezés alatt olyan sejtet értünk, amely vektort tartalmaz, és elősegíti az expresszlós vektor rephkádóját és/vagy expresszióját Gazdasejtek lehetnek prokaríóta sejtek, mint például g. no/;, vagy eakartóía sejtek, mint példán! élesztő, rovar, kétéltű vagy emlős sejtek. Előnyösen a gazdasejtek egyszikű vagy kétszikű növényi sejtek. Különösen előnyős egyszikű gazdasep ? kukorica gazdasejt. Amikor lehetséges, a szekvenciát úgy módosítjuk, hogy ne tartalmazzon megjósolt másodlagos bajlű mRN'S szerkezeteket.
Az expresszi-ős kazetta ezenfelül tartalmazhat 5’ vezető szekvenciákat az expresszlós kazetta konstrukcióban, Az ilyen vezető szekvenciák fokozhatják a írasszládói. Transzládős vezető szekvenciák ismertok a szakterületen és például közé tartoznak az alábbiak: EMCV vezető szekvencia (E3?céynfeí/omy£v?ardiíA 5' nem kódoló régió) [Elroy-Stein és mtsaf., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, ói26-6330. old. (1989)); Ampvöw vezető szekvenciák, például TEV (’Tobaceo Eteh Virus’) vezető szekvencia [Gallle és mtsai., Gene 165,233-238. old. (1995)], MDMV (fed?,ize Dwarf Mosaic Vírus’) vezető szekvencia [Virology 154, 9-20. old.], és a humán immmigtobulk) nehéziánc-kötö fehérje (BíP) (Macejak és misaí.. Natúré 353, 90-94. old. (1991)]; a lucerna40 ntozaikvirus barokföhérje snRNS-ének (AMV SNA 4) a nem iranszlált vezető szekvenciája [Jobiing és mtsaí..
5« ί **
-32biatsre 325. 622-625. old. (1987)}.; dohány-moazikvíms (TMV) vezető szekvenciája [öailie és tnls&i., 237-256. old., „Molecuhs- Biology of RNA”, szerk.: Cecb, kiad.: Üss, New York (1989)}: és a kukorica sápkőros foltosság vírusa (MCMV) vezető szekvenciája [Lömmel és mtsai., Virology 81, 382-385. old. (1991)}. Lásd még Delia-Bloppa és mtsai., Efent Ehysiol. 84, §65-968. old. (1987). A transzláció fokozására ismert más eljárások is sikaimaíhstók, például intronífk és hasonlók.
Az expresszíós kazetta előállításához a különléle DNS-fragmenseket manipulálhatjuk oly módon, hogy azok a DNS-szekveneiákst a megfelelő irányítottságban.....és adott esetben megfelelő olvasási fázisban·......
tartalmazzák. Ebből a célból adaptereket vagy kapcsolőmoiekaiákat alkalmazhatunk a DNS-fragrnensek összekapcsolására, vagy más manipulációt alkalmazhatunk kényelmes restrikciós helyek, a felesleges D'NS eltávolítása, restrikciós helyek eltávolítása és hasonlók biztosítására. Erre a célra »; viira mutagenezis, láncinditó-helyreállkás, restrikció, anaeátás, ójraszubszriíüeiő, például tranzfció és transzverzió alkalmazható.
Számos préméiért alkalmazhatunk a találmány gyakorlatba vételénél. A proinótereket a kívánt eredmény alapján választhatjuk ki. A nukleinsavakai kombinálhatjuk konstitutív, szbvetsped.őkus, indukálható vagy másfajta promöterekkel, amelyeke a. gazda organizmusban való espresszálfatásra valók. Alkalmas, növényi sejt15 ben alkalmazható konstitutív promoterek közé tartozik például az Rsyn? promőier magpromőtere, és egyéb promóterek, amelyeket a Wö 99143838. szántó nemzetközi közzétételi iratban és a 6 832 Ő.S8. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi iratban feltártak; a Csh4V 35S magpromötcr [Odeil és falsai.., Natúré· 313, 81ö812. old. (1985); a rizs aktin promoter [McElroy és mtsai.. Plánt Cell 2, 163-171. old. (1990)}; ubiquiim (Chris.tensen és mtsai, Elánt Mól. felöl. 12, 619-632. old. (1989) Carfetensen és mtsai., Plánt Mól. Bíol, 18,675-689.
old, (1992): pEMU [Last és mtsai, Theor. Appl. Génét. 81, 581-588, old. (1991)]; MAS [Veken és mtsai., EMBO .1. 3, 2723-2736, old. 1984)); ALS promőier (5 659 026. számú amerikai egyesült államokbeli szabadultai irat), és hasonlók. Más konstitutív promóterek közé tartoznak például az 5 608 149.; 5 608 144.; 5 604 12;
569 597.; 5 466 785.:: 5 399 680.; 5 268 463,; 5 6Ö8 142. és 6 177 611. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban feltártak.
A kívánt eredménytől fhggóen előnyös léket s gén fedúkálható promóterről történő expresszáltatása. A.
tai'áioiásy szerinti nukleotid-özekvencfek expressziójának szabályozására különösen jelentősek növényekben a seb-indukált promóferek. ilyen seb-indukált promóterek rovarok táplálkozásával indukált károsodásra reagálhatnak.. és közéjük tartozik a burgonya proieináz-lshibltor (pia ÍI) gén [Ryan, Ana. Rév. Phytopath. 28, 42544§.okt (1990); Duan és mtsai., Natúré feiofechnelegy 14, 494-498. old. (1996)}; wnl és 'wu«2 (5 428 148.
szántó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat);: vrinl és wia2 {Staaförd és mtsai,, Mrd. Gén. Génét. 215, 2ÖÖ-208. old, (1989)]; szísziemin [McGurí és mtsai., Science 225, 1570--1573. old. (1992)]; W1P1 (Rohmeler és mtsai., Elánt Mel, Bioi. 22, 783-792. old. (1993); Eckelkamp és mtsai., FESS Lettem 323, 73-76,. old. (1993)]:: MP1 gén (Borderük és mtsai.. Plánt .1, 6, 141-150. old, (1994)); és hasonlók, amelyek hivatkozás útján a kitanüás részét képezik.
Ezenfelül paíogén-indukáit promótereket alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásokban és nnkisotid-kűostrukciőkban. Ilyen patogén-indukált promóterek közé tartoznak a patogenezfesel kapcsolatos fehérjék (PR. fehérjék) promóteret, amelyek psíogésmei való megfertőzódést követően: isdnkálödnak;. például FR fehérjék, SAS fehérjék. béta-l,3-glukanáz, ksrináz, stb. [lásd például P.edolri. és tnfsal, bfeth. 3, Plánt Fató. 89, 245-254. oki, (1983): Oknes és mtsai.. Fiam Bell 4, 645-656.. old. (1992); és Van Loon, Plánt Mól. Viroi. 4, .·* * ♦ φ ·* * * -ί » χ « <
<ί Α *
- 33 :.ί, ί 11-116, oki. (1985)]. Lásd még a WÖ 99/43819, számú nemzetközi közzétételi iratot, amely hivatkozás útjáo a •kitasítás részét képezi.
Érdekesek azok a promóterek, amelyek lokálisan expresszálódnak a patogén fertőzés helyén vagy annak közelében (lásd például Marineau és mtsai., Plánt kiöl. Biok 9, 335-342. old. (1987); Matton és mtsai,
Molecuter Piaat-Microbe- Interactions 2, 325-331. old. (1989); Sontsisch és mtsai,, Proe. Natl. .Acad, Sci. USA 83, 2427-2430. old. (1986); Somsisch és mtsai., Mól. Gén. Génét. 2, 93-98. old.. (1988); és Yang, Proe. Nati. Acaá. Sci. USA 93, 14972-14977. old. (1996)]. Lásd még Chen és mtsai., Plánt 3. 19, 955-966. old. (1996); Zhang és mtsai., Proe. Natl. Acad. Sci., USA 91, 2507-2511. old. (1994); Warner és mtsai., Plánt ,1. 3, 191-201. old, (1993); Siefesrtz és mtsai., Plani Cell 1, 961-968. old. (1989); 5 750 386. számú amerikai egyesült államok10 beli szabadalmi írat (hengeresféreg által indukált); és az azokban idézeti hivatkozások.. Különösen érdekes a kukorica PRnts génjének az indukálható promöiere, amelynek az exprssszlóját a tMö/MÖjfónwg patogén indukálja (lásd például Cordero és mtsai., Physíol. Mól. Piám Patti. 41, 189-200. old. (1992)1.
Kémiailag szabályozott, promótereket alkalmazhatunk egy gén expresszíójának a szabályozására növényben exogén kémiai szabályozóanyag alkalmazásával. A célkitűzéstől függően a prontóter lehet kémiailag indukálbató promóter, .ahol: a vegyszer alkalmazása génexpressziót indukál, vagy kémiailag represszálbatő premdier, ahol a vegyszer alkalmazása génexpressziót repressz&l. Kémiailag indukálható promóterek ismertek a szakterületen, nem korlátozz; példaként közéjük tartozik a kttkorica Ιπ2-2 promoter, amelyet a bcmzénszuifonamld széfeaer gyomirtó szerek indukálnak, a kukorica GST promótsr, -amelyet hídrofób eiektrofi! vegyöletek aktíváinak, amelyeket újonnan megjelenő gyomirtó szórókként alkalmazóik, és a dohány FR-la promóter, ame26 lyet a szalicllsav aktivál. Más kémiailag szabályozott jelentőséggel bíró promóterek. közé tartozunk szterosdra reagáló promóterek [lásd például a glukokortíkoid-isdukált promótert; Sehena és mtsai,, Proe. Nath Acad. Sci. USA 88, 1042.1.-16425. old. (1991) és MeNdlls és mtsai,, Plánt J. 14, 247-257. old. (1998)] és íetraciklinIndukált és tefeacikíío-represszált promóferek (lásd például Gatz és mtsai., Mól. Gén.. Geset. 227, 229-237, old. (1991) és az 5 814 618. és 5 789 156. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok], amelyek hivat25 kozás- útján a kitárolás részét képezik.
Szövet-preferált prornőtereket alkalmazhatunk a fokozott pesztieid aktivitású fehérje expresszáltatásá.nak célzására egy adott növényi szövetben. Szövet-preferált prom.óterekct; tárgyalnak az, alábbi irodalmi helyeket;: Yauwnote és mtsai., Plánt J. 12, 255-265. old. (1997); Kawamuta és mtsai., Plánt Cell Physíol. 38, 792863. old. (1997); Hnnsen és íntsai., Mos. Gén Génét. 254, 337-343. old. (1.997); Russell és mtsai., Transgenic
Rés. 6, 157-168, old, (1997); Rinehart és tntsal., Fiam Physíol, 112, 1.331-1341. old. (1996); Van Camp és mtsai,., Platt!: Physíol, 112, 525-535. old, (1996); Csnevaseini és mtsai,, Plánt Physíol. 112, 513-524. old, (1996); Yamamoloés mtsai.. Plánt Cell Physíol. 35, 773-778, old, (1994); La, Resnlís Probi, Cell Differ. 26, 181-196, old. (1994); örozeo és mtsai., Plánt Mól Bioi. 23, 1129-1138. old. (1993); Matsueka és mtsai,, Proe Natl Acad. Sci. VSA 96, 9586-9596. old. (1993); és Guevara-Gareia és mtsai.. Plánt 1. 4, 495-505. old:. (4993). Az ilyen prornőtereket szükség esetéit módosíthatjuk gyenge expresszióra,
Levélspeeiftkus promóterek ismertek a szakterületen [lásd például Yaatamoto- és mtsai,. Plánt: J. 12(2),
255-265. öld, (199?).; Kwon és mtsai., Plánt Phystol. 165, 357-67. old, (1994); Yamamoto és mtsai.. Plánt. Cell Physíol. 35(5), 773-778. old, (1994) Gotor és mtsai., Pfem I 3, 5Ö9-I8. öld. (1993); Orozuo és mtsai.. Piám: Mól, Bioi, 23(6), 1129-1138. old. (1993): és Matsuoka és mtsai., Proe, Natl. Acad. Sci. USA 96(2.0), 958640 9590. old, (1993)1, *♦ «> * * χ*
-34Győkérspecífitas promóterek ismertek, és: kiválaszthatók a szakterületen ismert sok prornóter közül, vagy Ae novo izolálhatok különféle kompatibilis fajokból [lásd például Ilire és mtsai., Plánt .Moh Bioi. 20(2), 207-218, old. (1992) (szója gyökérspeeifikus glntamxn-szintetáz gén); Keller ás Bauragariner, Plánt Céh 3, 1051-1061. old. (1991) (győkérspccibkus szabályozó elet» a francíabah GRP 1.8 génjében); Sangef és mtsai.,
Plánt Mot Bioi. 14(3), 433-443. old. (1990) (a mannopís-szi-ntóz (MAS) gén gy.Sk.érspeciftkus prosnótere Agröbacterium twmfcÍŐ&s-behf ás Mtao és: mtsai.. Plánt Ceti 3(1), 11-22. óid. (1991) (a citoplazmás glutami»szintetázt (GS) kódoló teljes hosszúságú cDNS-kión, amely szója gyökerében és gyökércsomójában expresszálődlk)), .Lásd még Bogusz ás mtsah, Plánt Cell- 2(7), 633-641, old. (1990), amelyben két gyökérspecifikus promóter izolálását Írják le a nitrogénkötő N&nlegmfe mrferseftíf és a. rokon, nitrogént nem kötő sem hüvelyes
Tretna tameraos-e hemoglobin génjéből. Ezeknek a géneknek a promóterét kapcsolták β-ghikurenldáz jelzőgénhez, és bejuttatták a nem hüvelyes Mcoööuu tnöntwn-ba és a hüvelyes fzvxís eomcutoas-ba, és mindkét esetben megőrizték a győkérspecilrkns premóteraktivitást. Lcaeh és Aoyagi (1991) leírják az Agrebaclerium rhtsogenes magas -szintet· expresszálódö rolC és rolD gyökérisdukák génjei prométerének az elemzéséi [lásd Plánt Seteteo (Limerick) 79, 69-76, old.j, Azt a következtetést vonták ie, hogy az enbancer és a szövetspectfi15 tást meghatározó DNS-deiermisássok elkülönülnek ezekben- a protnőterekben. Teeri és mtsai. (1989) lac2-vei alkotott géníüziöt alkalmaztak annak kimutatására, toogy az Xgmbacterium oktopm-szimizt kódoló T-BNB génje különösen aktív a gyökéresócs epidermiszében, és hogy a TR2; gén győkérspeciíikos az intakt növényben és sebzéssel stimulálható ievélszövetóen, ami a. jellegzetességek különösen, kívánatos kombínácíójg rovarirtó vagy 1 árvairtó génekkel kapcsolatos alkalmazásra [lásd EMBO .1. 8,343-350. old.). A TRI ’ gén......fnzionáitatva nptll-höz (neemjcin-foszfotrasszíéráz-íl) — hasonló jellegzetességeket mutatott. További gyökérspeeifikns promóterek közé tartozik a V1EKOD-GRP3 gén promótere [Knster és- mtsai., Plánt Mól. Bioi, 29(4), 759-772. old, (1995)); és a rolB promótere [Capasa és mtsai., Plánt Moh Bioi, 25(4), 681-691. old, (1994)). Lásd még az 5 837 876.; 5 750 386.; 5 633 363.; 5 459252.; 5 401 836.; 5 110 732. és 5 023 179. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat.
A „mag-preferált promóíerek közé tartoznak a „niagspecitltos” promóterek (amely promóterek a mag fejlődése alatt aktívak, mist például a mag tárolófehésjémek a promóterci), valamint a „mag-csirázási” promőterek (amelyek a mag csírázása alatt aktívak) [lásd Thompson és mtsai., BioEssays 10, 168. old. (1989), amely hivatkozás útján a ki-tanítás részéi képezi), ilyen mad-preierált promoter nem korlátozó példái közé tartozik a Ciml (citokin-lndukáít hírvivő); eZ19B 1 (kukorica 19 küa zein); mílps (mio-inozitol- i -fbszfát-szintáz); és celA (eeliulöz-színtáz) (lásd a WO 00/11177. számú nemzetközi közzétételi iratot, amely hivatkozás útján a kitaniíás részét képezi). A gamma-zem egy előnyös endöspermium-speci tikos promoter, A Glob-i egy előnyös - embrióspecifikus proorőter, Kétszikőekben a tnagspeeifikus protítóierek nem korlátozó példái: közé tartozik a bab βfazeolio, napin,, b-kooglicimn, szójabab iektin, kmcxferln, és hasonlók. Egysziküekb-so magspecifikus promóterek nem korlátozó példái közé tartozik a kukorica 15 Wa. zent, 2.2 Wa zein, 27 kDa zein, g-zein, wsy, sfcw35 /, Txfííxketi 2, globuirn 1, stb. Lásd még a WO (10/12733. számú nemzetközi közzétételi iratot, amelyben a eadl és ead2 génekből származó magspecsfikw promótereket tárnak fel. és amely hivatkozás útján a kitam'tás részét képezi.
Ahol alacsony szintű expressziét kivártunk, gyenge promótereket alkalmazhatunk. Általában a „gyenge promóter’ kifejezés· alatt olyan promótert ériünk, amely a kódoló szekvencia alacsony szintű expresszióját:
4Θ Irányítja. Az alacsony szint alatt kösálibelítí 1/1000: transzkriptumtóí körülbelül I/IOÖÖÖÖ transzkripúmion
- 35 kérésziül körülbelül I/S99Ö9Ö öwsztóphwtg. terjedő színiét értünk. Más megoldásképpen nyilvánvaló, hogy gyenge promóterek alatt olyan promótereket is értünk, amelyek csak néhány sejtben expresszálódnak, és másokban pedig nem, lm alacsony szintű expressziét eredményeznek. Amikor a promőter elfogadhatatlanul magas szinten expresszálódlk, a promóterszekvencia részleteit de leláthatjuk vagy módosíthatjuk az expresszié» színt csökkentésére.
Ilyen gyenge konstitstlv promóterek közé tartozik például az Rsyn? prowóier magpromötere (WG 99/43838. szántó nemzetközi közzétételi irat és 6 072 950. számú amerikai egyesül; államokbeli szabadalmi irat), a 35S CaMV magpromóter, és hasonlók. Más konstitutív promóterek közé tartoznak például az 5 608 149,; 5 608 144,; 5 6Ö4 121.; 5 $69 59?.; 5 466 785.; 5 399 óSO.; 5 208463.;. 5 608 142. és 6 1776! I.
számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok, amelyek hivatkozás útján a kitanhás részét képezik.
Általában az expresszíós kazetta tartalmazhat egy szelektálható markergent a transzformált sejtek szelektálására. Szelektálható markergeneket alkalmaznak transzformált sejtek vagy szövetek kiszelektálására. Markergének közé tartoznak antibloíikum-rezlszíenriát kódoló gének, mint például a neomicm-lószioiranszleráz-ll-t (NEO) és Mgyomtem-foszíotranszferázt (HF'f) kódoló gének, valamint a gyomirtó vegyületek, mint például glníózlnát-ammöniam, bromoxmíl, ímidazoknonok és 2,4-díkiorofenoxiaeeíáf (2,4-D) elleni rezisztenciát biztosító gének (lásd általában Varrsníon, Csűr. öpin. Bloíeeh. 3, 506-511. old. (1992); Christopherson és mtsai., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89, 6314-6318. old. (1992); Yao és mtsai., Cél! 71, 63-72. old. <5992); Reznikoíí, Mól, Mforobiol, 6, 2419-2422. old, (1992); Barkiey és mtsai,, „The Operon”, 177-220. old. (1980); Hu. és mtsai,, Cell 48, 555-566. old. (1987); Brown és mtsai.. Cell 49, 603-612, old. (1987); Fígge és mtsai.,
Célt 52, 713-722. old. (1988):; Densehle és mtsai., Proc. Natl, Acad. Aci. USA 86, 5400-5404. old. (1989); Fuerst és ontsál,, Proc, Wt Acad. Sói. USA 86,2549-2553. old. (1989); Densehle és mtsai., Science 248, 48Ö483. old. (1999); Gossen, PLD., disszertáció, Universlíy eí Heiöelherg (1993); Reínes és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1917-1921. old. (1993); tabow és mtsai,. Mól. Cell, Bioi. 19,. 3343-3356. old. (1990); Zamhretö és mtsaí., Proc. Natl. .Acad. Sri, USA 89, 3952-3956. old. (1992); Bakács mtsai., Proc. Natl. Acad,
Sci. USA 88, 5072-5976.. old. (1991); Wyborski és mtsai., Nndelc Acids Rés. 19, 4647-4653. old, (1991); Hillenand-Wissnuin, Toplcs Mot. Siruc. Bioi.. 10, 143-162. old. (1989): Dagenkolb és mtsai., Amimforob. Agents Chemotber, 35, 1591-1595. old, (1991); Klemsehnidf ás mtsai., öioehemistry 27, 1994-1194. old. (1988); Bonirs, Pb,D, disszertáció, Univershy of Héldelberg (1993); Gossen és mtsai., Proc. Natl, Acad. Sri. USA 89, 5547-5551. old. (1992); Oltva és falsak, Astimferob. Agents Chemotber, 36, 913-919. old. (1992); Híavka és mtsai.,, „Uandbook of Experiineaía! Pharmaeology”, 78, kötet, kiad.: Springer-Verlag, Berlin (4985); Gill és mtsai... Natúré 334, 721-724. old. (1988)]. Esek az irodalmi helyek hivatkozás útján a kitamtás részét képezik.
A szelektálható markerek fenti: listája nem tekinthető korlátozónak. Bármilyen szelektálható markcrtgén alkalmazható a találmányban.
Transzformációs protokollok, valamim nükleoíld-szskvertriák növényekbe történő bejuttatására szol35 gáló protokollok változhatnak a transzformálásra célzott növény vagy növény! sej; típusától függően, azaz attól, hogy egyszikű vagy kétszikű a növény. Mukieotid-szekvencíák növényekbe történő bejuttatására és azt követően a növény genomjába történő ínzerriőjára alkalmas eljárások közé tartozik a miteomjekrió [Grossway és mtsai,, Biotechniques 4, 320-334. old. (1986)], elektroporárió [Riggs és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83, 56025696. old. (1986)1, dgxöóorteí'rim-közvobfett transzformáció [Townsentí és mtsai., 5 563 055. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Zhao és mtsai,, 5 981 S4Ö. számú amerikai egyesült államokbeli »·*
- 36 szabadalmi irat), közvetlen gértáíviiel [Paszktwvski és mtsai., EMBO J. 3,2717-2722. old. (1984)], és ballisztikus részeeskegyorsítás [lásd például Smfixd és mtsai.,, 4 945 O5O. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat; Tömés és mtsai,,. 5 879 918. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Toraes és mtsai., 5 88Ó244. számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi irat: Biduey és mtsai, 5 932 782. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Irat; Tömés és mtsai., „Dimet DNA Transicr intő hrtact Plánt Cells vsa Microprojeetíle Bombardment, „Plánt Cell, Tíssue, aad Organ Cuiture: Fundamentai Metbods”, szerkő Gamborg and Phillips, kiad.: Springer-Verlag, Berlin (1995); és MeCabe és mtsai., Bieteehnology 6, 923-926. old. (1988)): és Led transzformáció (WO 98/28058. számú nemzetközi közzétételi Irat). Burgonya transzformálásához lásd To és mtsai. (Plánt Moiecular Blology 37. 829-838. old. (1998)1 és Chong és mtsai. [Transgeoic Research 9, 71-78.
old. (2000)] cikkét. További transzformációs eljárások megtalálhatók az. alábbi irodalmi helyeken: Weissinger és mtsai., Ana. Rév. Génét, 22, 421-477. old. (1988); Santord és mtsai., Paríiculate Science and Technology 5, 27-37. old. (1987) (hagyma); Cbriston és mtsai,. Plánt Pbysiol. 87, 671-674. old, (1988) (szójabab); McCabe és mtsai., Bío/Tecbnology 6, 923-926. old. (1988) (szójabab); Fater és McMuilen, In Vitro Cell Dev. Bioi. 27P, 175-182. old, (1991) (szójabab); Slugh és mtsai., Theor, Appl'. Génét. 96, 319-224, old, (1998) (szójábab); Dada és sntsai., Biotechnology 8, 736-740, old. (1990) (rizs): Kieia és mtsai,. Proc. Natl. Acad. Seb USA 85, 43054309. old. (1988) (kőkorién·); Klein és mtsai., Biotechnology 6, 559-563. old. (1988) (kukorica); Tömés, 5 240 855. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Buísing és mtsai., 5 322 783. és 5 324 646, száma amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Iratok; Temes és mtsai., „Dlreet: DNA Traasfer intő intaet Plánt Cells via Microproteetile Bombardmcnf, „Plánt Cell, Tsssue, and Organ Culíure: Fundamentai Metbods”,
2ö szerfc.: Gamborg, kiad.: Springer-Verlag, Berlin (1995) (kukorica); Klein és mtsai.. Plánt Pbysiol. 91, 446-444. old. (1988) (kukorica): Fromm és mtsai., Biotechnology 8, 833-839. old, (1990) (kukorica): Booykaas-Van Slogteren és mtsai., Natúré (London) 311, 763-764, old. (1984); Bowen és'mtsai., 5 736 369, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (gabonafélék); Byíebier és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sói, USA 84, 53455349. old. (1987) (Ir&siceae); De Wet és mtsai., „The Experimetítal Manipukkion of Ovtde Tíssoes”, 197-269.
old., szerk.: Chapman és mtsai., kiad.: tongmsn, New York (1985) (pollen); Kaeppier és mtsai,. Plánt Cell Reporís 9, 415-418.eld, (1996) és Kaeppier és mtsai., Theor. Appl. Génét. 84, 566-566. old. (1992) (címerközvetített transzformáció); LYHaiiuin és mtsai,, Plánt Cell 4, 1495-1505. old. (1992) (elektroporáció); Li és mtsai., Plánt Cell Reporís 12, 256-255., old. (1993) és Chdstoo és Ford,. Annals ef B-otany 75, 407-413. old. (1995) (rizs); Osjoda. és mtsai... Natúré Biotechnology 14, 745-756. old,. (1996) (kukorica Agrebaclerittm ftíBjg/iíCHvxs útján); amelyek mindegyike hi vatkozás útján, a.kitaolíás részét képezi.
A transzformált sejteket növényekké növeszthetjük, hagyományos módszerek alkalmazásával [lásd például McCormick és mtsai, Plánt Cell Reports 5, 81-84, old. (1986)]. Ezeket a növényeket azután, felnevelhetjük, és uíögtennélí.eÍryhhegúk ugyanazzal a transzformált törzzsel vagy más törzsekkel, és azonosíthatjuk a kapott 'konstitutív vagy Indukálható expressziét mulató hibridet. Két vagy több generációt növeszthetünk annak bizto35 sírására, hogy a kívánt lenotípusos jellegzetesség expressziója stabilan- fennmarad és öröklődik, és azután magokat gyűjthetünk be annak biztosítására, hogy a kívánt fenotipusos jellegzetesség expresszióját elértük.
A találmány szerinti nukleotid-szekveneiákat a növénybe vírussal vagy vlrálts nufciemsawai történő ériníkeztetésévei juttathatjuk be. Általában az ilyen eljárások magukban foglalják a jelentőséggel btró nukleotidkonstmkeiouak virális DNS- vagy RNS-raolekalába történő beépítését. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti rekomhináns teher jókét először vlrálts poliproteln részeként szintetizálhatjuk meg, amelyeket később
-3? proteoiszísse! dolgozhatunk fel fo vivő vagy fe v/öo a kívánt peszö'cid aktivitású fehérje előállítására. Az ís nyilvánvaló, hogy az ilyen virális poiiproteln — amely a találmány szerinti peszüeld aktivitású aminosav-szekvertcia legalább egy részét tartalmazza......a kívánt pesztieid aktivitással rendelkezhet, ilyen vitális poliprotemek és az szokat kódoló nokleotíd-szekvenclák a laiálntány tárgyát képezik. Eljárások Rukleotsd-konstrukei-ók növé5 nyékbe történő bejurtataíására és a kódolt fehérjék növényekben történő előállítására vitális DNS- vagy RNSmolekulák alkalmazásával jól ismertek a szakterületen {lásd például az 5 889 191., 5 889 190., 5 866 785., .5 589 367. és 5 316 931. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat, amelyek hivatkozás útján a kiíanstás részét képezik],
A találmány tárgyát képezi továbbá laiáimány szerinti transzformáit növény szaporítóanyaga, nem kor1 9 látozö példaként magok, gumók, hagymagúmók, hagymák, levelek és gyökerek és 'hajtások levágott, részei.
A találmány alkalmazható bármilyen növényfaj Iranszlornráiására, nem korlátozó példaként egyszikűek és kétsziköek transzformálására. A jelentőséggel bíró növény nem korlátozó példái az alábbiak: Zee mgys, ísj-mfoca sp., például & Kapus, &, rapa, S. /iíbcso, különösen az olaj forrásaként szolgáló fájok, Afetúcago sa/ivö, öryrs sadva, Secofe cer-eefó, ,$argfea« SarghiaK vulgarű,. Pemusetum g/aacmi, Ραηκακ?/ éfeteris rte/ren, Sassii® c&facaaa, hkdimtt.ÚHx ammro·, -CisAkamus- íújeíorfos, Tritictttf/ «estmw,
Gívcíkv mar, Nieoííano íaónea,'», Sítórnní?? í'»6«ros«w, /tórndas /ívpogacar, Go.wpúís·? óarööifooss?, í'foasvpfom birsiaua;, A.’smoea baiaías, Afa??;óoi essafeptfa, Cqffea spp., Cocos nueifera, ,4n«nas twasss, C7?rr«· spp,, Táeoőrowta cöcöö, ómon/öa s/wnsfs, 6/mío ,ψρ., Peowm «wericana,. Ffew aasica, Pf«6'»w gurafovu, ΑύζνρΙίόζο úídííta, Oha eMfijpaea, Carica papaya, Anacardiúet aeidde/iíah, Macaítímua tntegrtfiAiö, Pranas a/KVgdahs,
Sete vííÍgöí'ís’, SxcobwtKKspp., zab, árpa, zöldségfélék, dísznövények és tűlevelűek.
A zöldségfélék közé tartoznak a /.ycgoezrteon eacaha/itKs, Ladacít sálivá, SSeeseoí^s vulgáris, foúmeofos /««Cttsds, biPbirxs spp., és a-Cspwtó nemzetség tagjak mint példás! C. íoífom', C eontn/npenírt és C. w/o. Dísznövények közé tartoznak a foíotójúemów spp., AíncropövHa bydsaKgea, hhisnus rasosaRmrts, Süss s'pp., Tíííípö gozz, MmrtsstíJ spp., Petiniia fahada, Draníótis zaryapbybxs, Euphoráí'o ptúcberrítsa és krizantém, A találmány gyakorlatba vétele során alkalmazható tűlevelűek közé tartozóak például fenyők, mint például Pi/ms teeeia, Pórus edtabó Pís»s panderosa, Pintts c&Rtah&, és Pimis m<á'o/a; Pssudoisiiga metíziesh, Tsiíga catiadensisi, Picea gfo&oö; Sc^uotó s«s?pewrc«s; és valódi fenyők, mint például Abies amabdis és zíőíex baÍi'i'ii-ti-sa; és cédrusok, mint például Tbii/a p/hate és Cbamsecyparis neoíkaieftsis. Előnyösen a találmány szerinti növények termesztett növények (például kukorica, lucerna, napraforgó, káposzta, szójabab, gyapot.
pórsáífány, földimogyoró, cirok, búza, köles, dohány, stb.), előnyösebben kukorica és szójabab, még előnyösebben kukorica.
Különös jelentőséggel bíró növények közé tartoznak azok a növények, amelyek jelentőséggel bíró magokat hoznak:, olajos magvú növények és hüvelyes növények. A jelentőséggel bíró magok közé tartóznák gabonák, mini például kukorica, búza, árpa, rizs, cirok, rozs, köles, stb. Az olajos magvak közé tartozik a .35 gyapot, szójabab, pórsáfrány, napraforgó, káposzta, kukorica, lucerna, pálma, kókuszdió, len, ricinus, olajfa, stb. A. hüvelyes növények közé tartoznak babok és borsók. Babok közé tartozik a -gitár, szentjánoskenyér, görögszéna, szójabab, kerít babok, Íehénborsó, mtnrgóhsb, Ifeabah, favabab, lebcse, csicseriborsó, stb.
Mielőtt a rsövény szaporítóanyagot (gyümölcsöt, gumói, hagymái, hagymagumöt, gabonái, magot), de különösen magot eladnánk kereskedelmi forgalomban kapható termékként, azt megszokod módon védőbevonat·· tai látjuk, el, amely herbicideket, inszektieideket, fongicideket, h&ktericideket, nematíeideket, molluszkicideket,
- 33 vagy ezek közöl többnek a keverékét tartalmazza, kívánt esetben további hordozókkal, felületaktív anyagokkal vagy az alkalmazást elősegítő adjuváusokkal együtt, amelyeket szokásos módon alkalmaznak a kiszerelés szakterületén, hogy védelmet biztosítsunk bakteriális, gombás vagy állati kártevők állal okozott károk ellen, A mag kezelése érdekében a magok védőbevonatát alkalmazhatjuk akár a gumók vagy magok folyékony készítménnyel iörténö ímpregnáiásával, akár azok kombisáli nedves vagy száraz kiszereléssel történő bevonásával. Ezenfelül speciális esetekben más, növényekre való felviteli eljárások is lehetségesek, például a gyümölcs rügyeire irányitód kezeléssel.
A találmány szerinti pesztieíd aktivitású fehérjét kódoló nukleotid-szekvenciáí tartalmazó DNS-molekulát tartalmazó találmány szerinti növényi magot kezelhetjük olyan magvédő bevonattal, amely magkezelő
0 vegyületet tartalmaz, tolat például kaptánk karboxint, tirámot. mefeiaxih, ptómlfósz-metilt, vagy a magok kezelésére szokásosan alkalmazott más vegyületet. Egy találmány szerinti megvalósítási mód szerint találmány szerinti pesztieíd aktivitású készítményt tartalmazó megvédő bevonatot önmagában alkalmazunk, vagy 'kombinálva a magok kezelésére szokásosan alkalmazott magvédő bevonattal.
Nyilvánvaló, hogy a pesztieíd aktivitású fehérjékéi kódoló géneket alkalmazhatjuk patogén rovarok öanszfonmálásám. ilyen organizmusok közé tartoznak bakulovírusok, gombák, egysejtűek, baktériumok és hengeresférgek.
Találmány szerinti pesztieíd aktivitású fehérjét kódoló gént alkalmas vektor alkalmazásával bejuttathatunk ntikrobiális gazdába, és a gazdát alkalmazhatjuk a künsyszelben, vagy növényeken vagy állatokon. A „hejutiatotf’ kifejezés alatt nukleinsavak. sejtbe történd inzertálásanak vonatkozásában «Iranszfekeióf, vagy „transzformációt” vagy ttsanszdukcíóf’ ériünk, és magában foglalja a nukieinsavnak eukarióta vagy prokarióta sejtbe történő beépítését, ahol a nukleínsav beépülhet a sejt genornjába (például kromoszómába, plazmid, plasz·· tid vagy mitökoaoriális DNS-bej, autonóm replikonná alakul át vagy tranziensen expresszáiődik (például transzfektált mí<N $).
Olyan mikroorganizmusokat választhatunk ki, amelyekről ismert, hogy egy vagy több jelentőséggel bitó haszonnövény „litoszféráját” (llifeplán, tillosziéra, rizoplán és/vagy rízoszféra) foglalják el. Ezeket a. mikroorganizmusokat úgy választjuk ki, hogy képesek legyenek sikeresen versengeni az adott környezetben· a vad típusú ntikroorgamzntussai, a posztleid aktivitású fehérjét exgresszáló gén stabil fennmaradását és expressz.iőját biztosítsák, és kívánt módon a pesztieíd javított védelmét biztosítsák a környezeti lebomlás és inaktiválás ellen.
Ilyen mikroorganizmusok közé baktériumok, algák és gombák, tartoznak. Különösen jelentős mikroor30 ganíznmsok baktériumok, mint például /’seWoweíMa.', &->v/«/ö, tierraőo, ti'feójfe/fe, Afenfőosvíjnns, Sirepíemyoes, Mrzoóium. ifcd^seadiwwas. A/éz/pd/as, rigröóaeíerfowí, .4 eeíobacZőr;. Lactóbacilías, Arthrob&eter. Az&iebacter, Leuc&nest&e és AlceÍ'feenes, gombák, különösen élesztők, mint például Saccharomyces. CrypteCGCctts, Kíuyverontyc^. ág.wsíóo/omyce,v, ίί/míiotorw/í? és zfereoőasá/fem. Különösen jelentősek a fitoszpbérába tartozó bakteriális fajok, mint például FseKítezwms jsyrítogae, PWö««$^«orescem, Sernél /sercesems, deeíoóíizxer xfeöMim, dgrobacíem, titit>í/'ops(mdoí«o«its sp&mtiáes,. ATwtfAo/nonaí eamporírA,..Rte&bíw me/ioti, /iá;móge«as' mérete, CAndóncíer .ryti és /feoroőöorer vótiortdlr és a titoszferába tartozó gombák, mint például /főöífeíoríióí f'íi&'íz ti. g/í-ihHís, ti. marina, ti. ffifraslta, Gypfocoeetóf a$W«s, C. aipiueny C. lauretáti, Sacehctnwyces ro.se/. ti. prororísvísA, ti. corevó’/ae, tijxvoővtizíuyees msaes, 5. oaorus. KZnyverowyces· verreme és Aareobammií® p>ö//a/u?is. Különösen jelentősek a pigmeusait mikroorganizmusok.
*♦
X* ♦ * * * ♦ ♦ « > ·».
* ♦ ♦ * » * ♦ ·> * « * » »*»* * « *» *♦«* * Μ #*
- 39 Számos öt elérhető a peszticid aktivitású fehérjét express2álő gén bejuttatására a mikroorganizmus .gazdába olyan körölmények között, amelyek lehetővé teszik a gén stabil fennmaradását és expresszíőját. Például expressziós kazettákat állíthatunk elő, amelyek tartalmazzák a jelentőséggel btró rmkteoííd-konstrukciöt működőképesen kapcsolva a nttkleotid-konsírukciók expresszáltatására szolgáló transzkripciós és transzlációs szafeá5 iyozó szignálokhoz és a gazán organizmus egy szekvenciájával homológ nukleotld-szekvencíához, és ily módon integrálódás mehet végbe, és/'vagv a gazdában működőképes replikációs rendszert tartalmaznak, miáltal integrálódás és stabil fenntartás következik he.
Transzkripciós és transzlációs szabályozó szignálok nem korlátozó példái közé tartoznak promóterek, transzkripciós iniciációs starthelyek, operátorok, aktívátorök, esb&ncerek. egyéb szabályozó elemek, riboszómá10 lis kötőhelyek, iniciációs kodon, terminácíós szignálok, és hasonlók [lásd például 5 039 523. és 4 853 331, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok; EP Ő4S0762A2:. számú európai szabadalmi irat; Sambrook és mtsai,, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2, kiadás, szerk.: Maniatis és mtsai., kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cola Spring Harbor, N.Y, (1992).; „Advanced Bacterial Genetics’, szerk.: Davis és mtsai., kiad.; Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, N.Y. (19S0); és az. azokban idézett hivatkozások].
Az alkalmas gazdasejtek — amelyekkel a peszticid: aktivitású fehérjéi tartalmazó sejteket kezeljük a peszticid aktivitású fehérje sejtheti aktivitásának meghosszabbítására, amikor a kezelt sejtet a célzott kárteve(k) környezetében alkalmazzuk — lehetnek prokariöták vagy eukarióíák is, normális esetben azokra a sejtekre korlátozva, amelyek nem termelnek magasabb rendű organizmusokra, mint például emlősökre káros anyagokat.
Azonban alkalmazhatunk magasabb rendű organizmusokra toxikus anyagokat termelő organizmusokat, olyankor, amikor a toxln nem stabil, vagy az alkalmazás szintje megfelelően alacsony, hogy elkerüljünk bármilyen lehetséges íoxiciíásí emlős gazda szántára. Gazdaként különösen jelentősek lehetnek a prokaríóták és az alacsonyabb rendű eukartoíák, mint például gombák.. Szemléltető prokaríóták — mind Gram-negativok, mind Grampozílfvok.....közé tartoznak az .fetarohorúer/ozz’íta, tnini például Ascóíu-úfota, öwm; SfugéÜ'a. Stí/süsA és
Profom:; őöd/fecaw; Mfe-oő&we, sütni például ΑόΕοόηοη; Stard/occac, mint például /ó'roío;5m<?rm«í, Zywoműkss, Serzűdö, ,-feromonus. fWfe, .öess^feviMő» Spó'/i/nm; Laeíöbecftíaeeae; Psseadomomdaceas, mint például Psendomoftm? és Aneíoőorttvs, .tosteaw® és: Aftro&seímKwe, Az enkarióták között gombák, mint például PMv'omycgfes és .L'Cűím.'esms találhatók, amelyek közé tartoznak élesztők, mint például Saccfar&myces és Scófeosacchartvwyces; és: éioskűomyc’ctas élesztők, mint például fcfotonáj, Aur-eobasi30 diám, ópoíOÖo/fZ'uvcíS', és hasonlók.
Különösen jelentős tulajdonság a gazdasejt kiválasztásában a peszticid aktivitású fehérje termelése vonatkozásában a peszticid aktivitású fehérje génjének könnyű ixduífathatósága a gazdába, expressziós rendszerek elérhetősége, az expressziő hatékonysága, a feltétje stabilitása a gazdában, és kiegészítő· genetikai lehetőségek jelenléte, jelentős tniajdonságpk peszticid aktivitású núkrokapszulaként történő alkalmazásban a peszticidet védő tulajdonság, mint például vastag sejtfalak, plgmeotáltság, és intr&ceiluláris p&kolódás, vagy zárványtestek kialakulása^ levélhez való affinitás, emlős toxicifás hiánya» kártevők általi elfogyasztásra vonzó küllem, az elpusztítás és· rögzítés könnyűsége a taxin károsítása nélkül, és hasonlók.. Más íneglonlolások közé tartozik a kiszerelés és kezelés könnyűsége, gazdaságosság, tárolási stabilitás, és- hasonlók.
Különösen jelentős gazda organizmusok közé tartoznak élesztők, mint pékfául ΑόοίΖοήϊηΕο fajok, rtureoőooííúa/:!·; fajok, Saceharamyces fajok és ,^οζΰόο/esri'ces fajok, f'dloplán organizmusok, mist például φ .·**.«
-40/Niíiiiíímofw fejek, Anem/u fejők és Ftavobacterium fájok, és más ilyen organizmusok, fejni például fetóMonas ai’i/rgifíosa, PsenJomö»®» Jhíaresce'ns, Saccftemmyce® cerevisiae, Bociilus thuringiettsis, Escherichia coli, Bacitlus s-itbiilis, és hasonlók.
.A találmány szerinti peszticid aktivitású fehérjéket kódoló géneket olyan mikroorgantemsokfos juttav hatjuk be, amelyek nbvésycken szaporodnak (epíbták), hogy a peszticid aktivitású fehérjéket potenciálisan célzott kártevőkbe- héjuttassuk. Epifdák például lehetnek Gram-negítttv vagy Gram-pozifiv baktériumok.
Gyökér-kolóstizálő baktériumok például Izölá’featók a jelentőséggel bíró növényből a szakterületen ismert eljárások alkalmazásúval Közelebbről, a gyökereket kolonizáló Bac-Ufos cenzus törzseket izolálhatunk növény gyökereiből {lásd példás! Handelstnsn és .stíriai-,, Agpl, Environ. Microbfol 56, 7 1.3-71 8. old. (1991)]. A találmány szerinti peszticid aktivitású fehérjéket kódoló géneket .szakterületen szokásos eljárások alkalmazásával juttathatjuk he gySkér-kölőalzáló éteífc cccmís-ba,
A peszticid aktivitású fehérjéket kódoló géneket például elektro-feanszfermáció alkalmazásával juttathatjuk be a gyökér-kolóujzáló 8aciih>s~k&. Közelebbról, a peszticid aktivitású fehérjéket kódoló géneket klónozhatjuk Ingázó vektorba, például pfEOiOl vektorba [Lereeits és fetsal., FEMS Mícröbiól. Estis. 60, 211-21.8.
old. (1989)]. Az adott peszticid aktivitású fehérje kódoló szekvenciáját tartalmazó pHT31.01 ingázó vektort például be transzformálhatjuk a gyökér-kolőuizáló Aoetihís-ba efeklroporáeió alkalmazásával [tereems és mtsaí., FEMS Microhioi. Leits. 60, 211-218. old. Í1W)].
Olyan expressziós rendszereket tervezhetönk, amelyekben a peszticid aktivitású fehérjék a Gram-oegativ baktériumok, például A c&li eitoplazmájábói a környezetbe szekretálődnak. A peszticid aktívhúsú fehérjék szekréciójának az előnyei- az alábbiak: (1) az. expresszált peszticid aktivitású fehérje potenciális ettotoxikas hatásainak az elkerülése, és (2) a peszticid aktivitású fehérje tisztítási hatékonyságának a javítása, nem korlátozó példaként beleértve az adott tápközeg-térfogatra számított kitermelés és tisztítás ntegnövekedett hatékonyságát és az egységnyi fehérje tisztításának csökkent idejét és/vagy költségét.
Peszticid aktivitású fehérjéket szekretálíathamnk £, eoti-bsr például egy megfelelő E. coli szsgoáSpep25 tídnek a peszticid aktivitású fehérje antiúoAermlnáfis végéhez történő (uzfottáhatásával, Az E. coli által felismert szignálpepfidekef találhatunk olyan fehérjékben, amelyekről már ismert, hogy A coli .szekretá-lja, például az OmpA fehérje (Ghrayeb és mísak, EMBO 3. 3, 2437-2442. old. 1984)1. Az OmpA az Al coli külső membránjáa&k egyik fő fehérjéje, és ily módos a szlgnálpepíldjéről szí gondolják, hogy hatásos a transziokációs folyamatban. Ezenfelül az OmpA szignálpeptidnek nem kell ufedosulni a feldolgozás előtt, amint az előfordulhat más szignálpeptitiekkel, például a lípeprotein szigtíálpeptidel [Duffand és mtsaí., Meth. Enzymol. 153, 492. old, (1987)].
A találmány szerinti peszticid aktivitású fehérjékéi fermentálhatjuk bakteriális gazdában, és a kapott baktériumokat feldolgozhatjuk, és mikrobíáiis permetkéot aikabuazhatjuk ugyanolyan módon, mint a rovarirtó per-netekben alkalmazott Sacilfas tlutríaglensis törzsek esetében. Azon peszticid aktivitású fehérjék esetébe», amelyek Ermí/m-ból szekjefáithluak, a szekréciós szignált eltávolítjuk vagy smtáltatjuk szakterületen ismert eljárások alkalmazásával Az ilyen mutációk és/vagy deléciók megakadályozzák a peszticid aktivitású fehérjék szekrécióját a tenyésztő tápközegbe a fermentációs folyamat során, A peszticid aktivitású fehérjék visszamaradnak a sejten belül, és a sejteket azután feldolgozzuk, burokba zárt peszticid aktivitású fehérjéket létrehozva. Bármilyen alkalmas mikroorganizmust alkalmazhatunk erre a célra, Asemfecnonov-í alkalmaztak Aacufoí
- 41 /Wfogj'msís endotoxinok burokba zárt fehetjekéfo történő expresszáltatására, és a kapott sejteket feldolgozták és rovarirtó szerként kipefmeíszték [Gaeriner és utísak, „Advanced Engíusered Pesticides”, szerk,: Kim (1993)].
Más megoldásképpen a peszticíd aktivitású fehéíjékei heterológ génnek a sejtes gazdába történő bejuttatásával állítjuk elő. A hetesekig gén expressziója......közvetlenül vagy közvetve — a peszticid intraeeihí5 láris termelését és fenntartását eredményezi. Ezeket a sejteket azután olyan körülmények közöd kezeljük, amelyek meghosszabbítják a sejtben termelt toxín aktivitásának időtartamát, amikor a sejteket a célzott kártevő(k) környezetébe kijuttatjuk. A kapott termék megtartja a toxln toxicításúti Ezeket a természetes úton borokba zárt peszticid aktivitású fehérjéket azután a célzott kártevőt hordozó környezetben — például talaj, víz és növényi levélzet — történő alkalmazás esetében hagyományos módszerekkel szerelhetjük ki (lásd például
Ki EP A (>192319. számú európai szabadalmi iratok és .az azokban Idézett hivatkozásokjaí.
A találmány szerinti: transzformált mikroorganizmust......amelybe beletartoznak egész organizmusok, sejtek, spórák, peszticid aktivitású fehérjék, peszticid akíivitásö komponensek, kártevőt befolyásoló komponensek, mutánsok, előnyösen elő vagy elpusztult sejtek és sejtkomponensek, beleértve élő és elpusztult sejtek és sejtkömpooenssk keverékét, és beleértve törött sejteket és sejtkomponenseket, vagy Izolált peszticid aktivitású fehérjét......kiszerelhetjük elfogadható hordozóval peszticíd aktivitású készhményíekjbe, azaz például szuszpenzióba, oldatba, emulzióba, kiszórható porba, diszpergálhaíö granulátumba, nedvesíthető porba, és emalgeáibató koncentráiumba, aeroszolba, impregnált granulátumba, adjuvánsba, bevonható pasztába, és bezárható például polimer anyagokba.
A fent feltárt készítményeket felületaktív anyag, inért hordozó, tartósítószer, nedvesitőszer, etető stimuláns, aítraktáns, burkoló ágens, kötöszer, emulgeálószer, festék, UV-védöanyag, puffer, folyási ágens vagy trágya, mikronutríens donor vagy más készítmények hozzáadásával állíthatjuk elő, amelyek befolyásolják a növényi növekedést. Mezőgazdasági vegyszerek nem korlátozó példái közé tartoznak herbieídek, ínszekticldek, fungíeldek, bskíerieídek, nematocidek, molluszktcidok, akaraeidek, növényi növekedést szabályozó anyagok, betakarítást elősegítő anyagok és trágyák, amelyeket kombinálhatunk hordozókkal, felületaktív anyagokkal
2.5 vagy adjuvánsokkai, amelyeket megszokott módon alkalmaznak a kiszerelések szakterületén, vagy más komponensekkel, a termék kezelésének és egy adott célzott kártevő esetén történő alkalmazás elősegítésére. Alkalmas hordozok és adjuvánsok lehelnek szilárdak vagy folyékonyak, és a kiszerelési technológiában rendszeresen alkalmazott anyagoknak felelnek meg, például természetes vagy regenerált: ásványi anyagok, oldószerek, diszpsrgálöszerek, nedvesítő ágensek, ragaszíöszerek, kötőszerek vagy trágyák. A találmány szerinti hatóa30 nyagokat normális esetben készítmények formájában alkalmazzuk, és a vetésterületen vagy a kezelendő növényen alkalmazhatók, más vegyületekke! egyidejűleg vagy egymást kővetően. A találmány szerinti hatóanyag vagy találmány szerinti mezőgazdasági készítmények — amelyek a találmány szerinti bakteriális törzsek által termelt peszticid aktivitású fehérjék legalább egyikét tartalmazzák — alkalmazására szolgáló eljárások nem korlátozó példái közé tartozik a levélszörás, magbevonás és: talajon történő alkalmazás. Az alkalmazások szárna és az alkalmazás gyakorisága íhgg az adott kártevővel: való elfertőződés intenzitásától.
Alkalmas felületaktív anyagok nem korlátozó példái közé tartoznak anionos vegyületek, mint például fém karboxí látja; bossző szénláncú zsírsav karboxilátja.; N-aciiszarkosmát; foszfersav mono-vagy diésztere zshtilkohol-etoxi Iátokkal, vagy ilyen észterek sói; zsúalkoitol-sznlfátolg mim: például nátrium-dodecii-szuiíát, náírium-oktadeeil-szulíát vagy nálrforo-cetii-szulfet; etoxilálí zsiraiköirol-szuifáfok; etoxiláít alkilferíoi-szulía··
4Θ tok; iignin-szulfonaíok; peírőleum-szalfonátok; alkll-aril-szuSforiátok, mint például alkíl-benzol-szniforsátok
- 42 vagy kis sssésatoms?^»» alkduad:aié:n-szal fonótok, például buiíl-nalfelén-szuifonáf; sxulfoaált naftalén-formaldehid koodeuzátaínök sók sznlfortálí fenol-fommfdehid kondöazátamok sói: komplexebb szulfonátok, mint például amid-szulfóaáfok, -például olajsav és N-fneíll-íanrin szulfhnálí kondenzációs: terméke; vagy dialkil-szub ibszukelnátok, például oáíriutu-szulfónáí vagy díoktil-szakeinát. Nemionos ágensek közé tartoznak zsítsav-ész5 terek, zsiralkeholok, zsirsavamldok vagy zslr-alkií- vagy aikenil-sztibszíiíuálí fenolok és etífeoKid, políhidrikus a&ohol-éterek, például szorisítás zsírsav-észterek kondenzációs termékei, ilyen, észterek kondenzációs termékei etilénoxíddak például polloxíedlés-szorbbán zsírsav-észterek, etilénoxid és propiiénoxid biokk-kepolimerei, acedién-giikoiok, mint például 2,4,7:,9-tefrast:íí-5-deein-4,7-dioí, vagy etoxiWt aeetilén-giskolok. Kariortos felületaktív anyagok sem. koriálozó példái közé tartozik például alifás mono-, di- vagy poliamin, mist például ace-át, nattesát vagy oleál; vagy oxigén-tartalmú amin. mint például polioxietilés-alkdamm amin-oxidja; karboxilsav és di- vagy pofiam m kondenzációjával előállított amld-kötésu amis; vagy fcvaterner amxnónium -só.
inért anyagok nens korlátozó példái közé tartoznak szervetlen ásványi anyagok, mint például kaolin, íiiiosz! Ilkátok, karbonátok, szulfátok, foszfátok, vagy növényi anyagok, mint például parafa, porított kukoricacsutka, földímogyorébéj, rizshéj és dióhéj.
A találmány szerh-ti készítmény lehet közvetlen felvitelre alkalmas formában, vagy egy elsődleges •készítmény koocerüráhrnra lehet, amelyet: hígítani: kell megfelelő mennyiségű vízzel vagy más oldószerrel az alkalmazás «lőtt A. pesztieid koncentrációja változhat az adott kiszerelés természetétől függően, közelebbről, hogy az koneentrátirm-e, vugy közvetlenül. kell alkalmazni. A készítmény 1-98% szilárd vagy folyékony Inért hordozót tartalmaz, és ö-5Ö%, előnyőse» 0,1-50% felületaktív anyagot. Ezeket a .'készítményeket a kereskedelmi forgalomban kapható terméken jelzett arányban alkalmazhatjuk, előnyösen száraz forrna esetén körülbelül ö,012-6,0 kgfoa: (0,01-5,0 lő. per acre), és folyékony forma esetén körülbelül 0,012-12,0 1/ba (0,01-10 pís. per acre) menny íságbe n.
További megvalósítási módok szerint a találmány szerinti készítményeket, valamim: a transzformált, mikroorganizmusokat és pesztieid aktivitású fehérjéket a kiszerelést megelőzően kezelhetjük, hogy meg25 hosszabbítsuk a pesztieid aktivitás Időtartamát, amikor a célzott kártevő környezetébe kijuttatjuk, mindaddig, amíg az előkezelés nem árt az aktivitásnak. Az ilyen kezelés lehet kémiai és/vagy fizikai, mindaddig, amíg a kezelés nem befolyásolja károsan a kásztexé»y<ek) tulajdonságait, Kémiai reagensek nem korlátozó példái közé tartoznak halogén ágensek; aldehidek, mim például: formaldehid és glötáraldefúd; fertözéselfenes szerek, mmt például zeíiráft-klorid; alkoholok, mint például izopropanel és etanol; és hiszíológia rögzitöszerek, márt például
Bouin-fois rögzíföszer és kíelly-fele rögzítőszer (lásd például: Humassn, „Animál Tissue Technlques”, kiad.: W. H. Freeman and Co. (19ő7)j,
A találmány más megvídősfiásl módjai szerint előnyős lehet a Oy£~$zerü polipeptíd profeázzai, például tripszinnel történő kezelése, hogy aktiváljuk a fehérjét a találmány szerinti pesztieid aktivitású fehérje-készítménynek a kártevő környezetébe törtéuő kijuttatását megelőzően. Protoxin szerrn-profeázzal történő aktiválásá35 ra szolgáló eljárások jől ismertek a szákferSfeíen [lásd példáid Coofesey, Biochem. J. ő, 445-454. old. (1968) és Cárról: és Ellar, Biochem, ,i, 261, 99-105. oki. (1989), amelyek kitanítása hivatkozás útján a kltanítás részét képezi]:. Például egy alkalmas aktiválási protökel.1 nem korlátozó példája szerint az: aktiválandó polípeptidet, például tisztított 1218-1 polípeptidet összekeverjük íripsziuaet i/HX? értékű 1218-1 fehérie/lripszírt tömegarány mellett 20 siM NaHCOj, pH 8 pofferben, és a. mintát 36 cC-on emésztjük 3 órán keresztül.
3,.
- 43 A találmány szerinti készítményeket, valamint a transzformált mikroorganizmusokat és peszticid aktivitású fehérjéket a rovarkártevő környezetébe például permetezés, atomlzáiás, porzás, szétszórás, bevonás vagy öntés útján juttathatjuk kí, kijuttathatjuk a talajba vagy a talaj: felszínére, bejuttathatjuk az öntözővízbe, kijuttathatjuk magok kezelésével vagy általános kijuttatással vagy porzással akkor, amikor a kártevő kezd megjelenni, vagy a kártevők megjelenése előtt megelőzésképpen. Általánosan fontos, hogy a kártevőket ellenőrzés alatt tartsuk a növényi növekedés kezdeti fázisaiban, mivel ez az: az, időszak, amikor a növények legkomolyabban károsodhatnak. A találmány szerinti kész.ítmények kényelmesen tartalmazhatnak másik rovarirtó szert is, ka erről art gondoljuk, hogy szükséges. A találmány egy megvalósítási módja szerint & készítményt közveflenüi a talajra juttatjuk ki, ültetés idején hordozó és őnczriüs törzs vagy találmány szerinti transzformált nukroorganix1ö mos elpusztult sejtjeiből álló granuiáris formában, Egy másik megvalósítási mód szerint a készítmény grannláris formája mezőgazdasági vegyszert, mint például herbicidei:, inszekticídet, trágyát, ínért hordozót tartalmaz, és Z&ariZ&s törzs vagy találmány szerinti transzformált mikroorganizmus elpusztul· sejtjeit.
A találmány szerinti megvalósítási módok hatékonyak lehetnek különféle kártevőkkel szemben. A találmány szempontjából kártevők nem korlátozó példái közé tartoznak rovarok, gombák, baktériumok, henge15 resiérgek, atkák, egysejtű kórokozók, állati parazita máj mételyek, és hasonlók. Előnyös kártevők a rovarkártevők,'különösen olyan rovarkártevők, amelyek szignifikáns kárt okoznak, legelőnyösebben olyan rovarkártevők, amelyek szignifikáns kárt okoznak mezőgazdasági növényekben. A „rovarkártevő” kifejezés alatt rovarokat és hasonló kártevőket értünk, mint például az: Aoaz; rendbe tartozókat, nem. korlátozó példaként atkákat és kullancsokat A találmány szerinti rovarkártevők nem korlátozó példái közé tartoznak a lepiöfoprt»·» rendbe tartozó
2Ö rovarok, például Acriozom gr/re/őr, 3'eferá g/overa««, A'c&rá itokí, /ído.rophyes' öröm, Ag/'Oíb í.ro'í/o«, ,lföői?í«íí ortgíí'/ooeö', ΑΝοο/ό/ο /mmeíorró, A»)y;rioó· rio.urim/úi, /tnogizsfo áí,<&We.'ór, /űw-tte/fo.
,4msom se.oo'íoríg. ,4®tew peme, ,4ste« gemmovo,’»', Aroó/ps sp., AzgyTCróeHíd ,ψ;, Ariiéi;?? mmíázrü, őomvba· ί?;·:»·?, Bimoirioriáv ,ri.urrrierferio, CWfő ctabeíkt, Choristanevre sp.< C&ehyils kosp&s, Ceiias ewryíftimie, Coroyröí cepWcwcö, CVriú; faíjíérreiiníis, ÖW«? pomötíerig Bmaas j.«íegsrri»?< Dé«í(förii?ms siöerieas, Dér 25 /??/<? feneraiis·, Diepheme byeltneia, Ebnpb&tbci niíidsíis, Biairaea grawttosetía, Dmíroeo .söcc&öto&í, Ernőm?
.«i&síg/jarísf, E&rewna ípdriri. Espbesdíá ebpetia, £«»v;,A ri/am, acrea, Eatia sakibric-ala,
EapccoM/is ambiguelfa. ΕρρηβοϊΗα embiguelte, Eapzocris Ewcoa -fnessoria, Galíeria meüaiteE-a,
GrapMiía mplesta, BPrríssna awerícew, Derieoverpo subjfexa, Heliceverpa zee, Deriofriis Hmmt, /fem&KOü írimíoe, Baínűeűsoma ejeetefhon,. ffyptettiíta. cwtee, Keíferia !ye.pper$ice?fe·, Eíimbdón? rttoeriozizí /Aoeriűzlp. liiimőriíoífyboeriaí'io őigvózoso, sűrieri, Loőss/o boirono, zozosfege sricrioorií, Ejwwrfű ribpi'íí·, Atfoeaf/ö ripvlam'A, Afe/ooosOmrt sp,, .AföísesíZű óívovícíío, Afewstro c'o,grig«rű.m, Λ/οοζίοοο g-nriípaeraocafo/a, áfenrivos semw, Aőrrvíz; resririírib, AfeknK-riro pleíp, Oneroo/Aera émsa/a, örgyri? sp., Ösírfniö .««&&/&, riírZeiíoröii Kewte& Ραρίίΐο crespbafítes, AeoriuppiWo gossyírie&o, /riAygő«írií<? eő/.yö.rmeö, Pnyrio«orycfór ririmcűríte&'ír. Ρ&·ζ& «orv, P/ms mp&e, .ririiriigsene scsfÖra, P/aíyne/a/fo«e«ífona, .%ζν«οίο sínriörto, ?οί£»>ρίίί;;ϊ sx'rrivsíámrurii, E'íodm í.uiiayoHZíoíeriö, ElsízEa xpiestella, Pomía pret&dice,. Pseudatetia wmpunsta, Pseudoptasia iriehtdem, Sabsdvdix oegzotom, őehcnro ccmeima, 8fto(roga cereatéífa, Spílonta OceHatM, Spodtipiera sp, pityacampa, TíksgIg bissvlEcda, Trickophaia hí, t’daa rx.bsgib;s. Ayíowges ciiriads és YpanGmetiia padídla.
A találmány megvalósítási módjai hatékonyak lehetnek az alábbi rendekbe tartozó rovarkártevőkkel szemben is: Bbplttra. Βν^ΐίί^ρΜρα, Lepíriopíerá, Mtffop/jaga. íA??Hopíe?';r, /fe.vrioí&ro, Or&pöptem,
-44dnsampteríz Dertnaplera, fscptera, dn&pktra, Sipkanapfera, úxúapÍara, stb.,. különösen Co&optem, előnyösen öíefew'co virgifera és iepidcptera A fe haszonnövények találmány szerinti rovarkártevői közé tartoznak sz alábbiak: Kukorica: Gdrinia «iíMöAs, dpnoíA Ipri/en, M&fáxnwpa zea. Spadtpfera fwgiperda, Dsatraea grandtoseifa; giiuwapaÍpus tignasetk/s, Otaíraea seeckarafíe, Diabranca virgiferti Bdabradca iangi5 cot® berbert, Diahroíice undecimpuncfeía h&wordi, .ikfe/örtoöv.s spp., Cyaíacapftaia bareaiis, Cycfacephaía knmacdata, Fopiíiia japemca. Chaetücnetne puliaaria, Sp&enaphoras tsaüiis, Kkopal&siphwn xabdis, Anurapkis. maidiradicis, Blissiix leueepieras íeueopferus, A-feínzíopíus'/eammrömn. 4fe7ö«opZ«.? saagnádpes, Hysearvö ptétura, dgrosrprs pamcwrá, Anapbefbrips akscrnrte, SaknapdA .aidesía, Tefrenyckus «rtíeae; Cirok.- Chda parte&tts, Spadapiera frttgiperda, fíelicaverpe zsa, Eíazbíepúpiís íignasedas, Fúria s«Pterra??ea, Pkyi'iophaga iö· crinita. Eúades, C&fíoderus -és Aeahts spp., Ovleme. tnefenapus, Ckeefeeneinepariaaúa, őpnenopöoníj aiasdis, Phapaiasiphafíi tttaidis, Sipka /lova, Bfíssus feucppterus feucepfertts, Cattfarinia sargkicekt, ferrenydm Cfsmáösrüw, ífeföfn-’efe aríicae; Búza: A-seode/dm unipancfafa, Spodoptero fn/giperda, giesnmpeipus iignese/fiis, d-gre/is oríftögoKíö, £Íe#tnepaipii$ /ígíioseífos, Oidema nudatiapus, fíypera punciaie, Diabraiiaa andeúáipaaatáia harvardi, Sekisephis gr-anfifatm, biaarasipkxfii avsáae, MúánopíuS femuri^bruito, Meiamiptes
IS di/fáraaiiaris, FBdaaoplas .sORgatepes, Maycrio&r destrect&r, Sdadiptods Masettane, Áíerofnysa afasricana, Ffyúaiya aaaroaía, Frenkriaiúla fusca. -Cepkus einctws, Aeerie ndipas; Napraforgó: Cybúdraaupfia-íiA aa&psr.sws, 3/úarapyx fiihis, Srúarnays Aerdidw.. Su/ebna WíOKíóam .Komoeesoms eJeeteffuw, Zygogmn/wo exe/«fff.oí!Ó«j.r, Böí:éw’;v.s gfeéosvs, Frea/.asiapféra ntxrtféidtibna; Gyapot: Heífatkis w-aseens, ffeiieoverpa eső, Epadapiera arzgw, Aoetórophöra goiprpfed.hj, Axtík&ti&itms graodfe grondts, Apkis gossypH, Asvííaóíoíííosee/A sarrom, Trieiesiredes ebatifemea, Zygas i&teúaús, MeÍantypkrsJéanzrrabr&aa, Meicnapbtis d^feraRrto/íy,. '?7v;pr fakad, Aröoköokiőtiíí /rscű, Tdrenycktts dntteharkttis, Tefrepycktis urfícee·, Rizs: Diafraea saeekarefís, Spadiopíera frvgiperda, Heíicaverpe zna, Colaspis brunnea, £&«>rköpír«s os^zogú/te, 5«fopfe7«s- on-zae, kfepáoíehix »4gro/KCías, .8<%s«s ietteapferas leacopferaa, Acrasternmtt bdare; Szójabab:: Aseodopfe/ar iaúaaeaA, dRfrcasrafe geamefa/is, Fiafbyp&za scebra, Ös/röte notkiiaiis,. dgrods ipfefo.o, 5/?θί«·>ρή?Γΰ exigua, /fe&otte ww»^ ffefieoverpe saa. Epdaab.aa vorrvasrtí, ΑΛον» parsraae, JS/ttpeta-ca /eőaa, rtcrosterjw» hi&ra,. Méfsnapfas f&nurrubmm. Metanopius differsrúaris, Gykazya piafttra, Szúcatririps variebifás, Tkrips fakad, ?gíí'aayúitiA ften&ssíam, Ted'aayútaz urficae; Árpa: Osfrinia /afbífaíís, Xgroífe ípiúap. Sckizepkís grwnimm, Brissas feíítwíerz»· /aHeojtRaras, 4ícrwrtv8K?H kj&ra, Fasariisn.’s ,?amis, .úistnya pbsfttra, áfevaft'o/o daíft-aattr; Petrokie iatens; Repce: Predc&yne ómss/eaa, Pkydaíreta crsc^arae; Burgonya: £eprt«ofüsr,m dec&nikteafe.
Ezenfelül a találmány megvalósítási módjai hatékonyak lehetnek /few/jfero fejok ellen, mint például £pgK.v b&speros, Zygss iitieoierk, L>g«spratfemis, fygus rvgtdipemjs Papp, Lygtts pekuiinus, Caioceris mmg/ens, dtíhops campestriz, 'Pleziacaris mgicaUiz, Cyrfopsbis madnAbíA, CvAope/íö hoíoíws, ^?aoőgo«/c«s a/öp/ósda/íív, öfcsphnpcom· ctó>ri«ő»í$, babapidiatda add Eííavíkswíosoő/G reráKsar. Aöó.lokooods rapida*. Föecfccff/ww dnaafas, ΡΡαα^ϊ fewopttvMS, Aksóö' {írícae, ?fysátsraphaaas, PiisahiAms servas, Nezare viriduía, .f'«.'ygtís;er, Careádae, Pyrrhocoridae, Tinidbe, Bfostamaddae, Baduviidae és Canáddae.
l-ínegeresférgek közé tartoznak növényi parazita hengeresférgek, mint például gyökérosomó, ciszta és seb hengeresférgek, beleértve a tteiaradsí-a és (ífoőodötű spp., különösen a Glohadera rodochienzís és Giabod&a padida, GetaradePa gÍycifíss, Feíerob&'ű zabacún és btei&adara a'.'anae.
Az előnyős fejlődési fázisok peszticid aktivitás tesztelésére a fent említett rovarkártevők lárva vagy éretlen formái. A rovarokat teljes sötétségben nevelhetjük körülbelül 20 '-'C és körülbelül 39 ®C között ás·
Χ.\. .Íx.
- 45: körülbelül .30% és körülbelül 79% párafertaiom: melleit Biológiai vizsgálati eljárási végezhetünk, amint azt Csapta és Láng leírja {). Esős. Ernőméi. 83,. 2480-2485) old. (1990)], Eljárások rovarlárvák felnevelésére és biológiai vizsgálati eljárások végrehajtására j el ismertek a szakember számára.
Sokféle biológiai vizsgálati eljárás módszere ismert a szakember számára. Áz általános eljárások ma5 gokban fitglalják a kísérleti vegyület vagy organizmus hozzáadását a zárt tartályban lévő táplálékíomáshoz. A pesztieid aktivitást sem korlátozó módon a mortalitás, tömegvesztés, vonzás, taszítás és más viselkedési és fizikai változások útján mérhetjük megfeleld ideig tartó etetés és hatni hagyás atán. A leírás szermii biológiai vizsgálati eljárásokat alkalmazhatjuk bármilyen rovarkárte vő táplálására lárva vagy felnőtt állapotban:.
Az alábbiakban a találmányt részletesebben is bemutatjuk, azonban az oltalmi kört nem kívánjuk a 1 0 bemutatott megvalósítási módokra korlátozni.
1. példa; & törzsek amerikai kukorieahogár és déli kukomeafeogár elleni pesztieid aktivitásának tesztelésére szolgáló biológiai vizsgálati eljárás
Kolotádőbogár (CFE), déli kukorteabogár (SCRW) és amerikai kukoricshogár (WCR W) lárvák számá15 ra való rovartápök ismertek a szakterületen {'lásd például Rese- és McCabe, .1, Eeon, Entomoiogy óó, 393. old, (1973), amely hivatkozás útján a kitanlíás részét képezi]. A rovartápot elkészítettük és Piítman-íálcára öntöttük.
Általában 1,5 ml tápot mértünk ki az egyes cellákba további 159 pl mintával a táp felszínén.
A jelentőséggel blrő pesztieid aktivitású fehérjét expresszálo eredeti csészéről származó bakteriális kolóniákat vittünk át replika csészékre, és leoltottak azokat 5 ml 2x¥T tápközegbe, amely 500 phlöOO mi kan20 amicin antibiotikumot tartalmazott. A csöveket éjszakán keresztül tenyésztettük. Ha nem volt növekedés, a csöveket további 24 óráit keresztül tenyésztettük. Áz inkubálást követően a csöveket leeentrifugáituk 3500 rpm-mel 5-8 percen keresztül A felüiöszót eldobtuk, és a csapadékot újra felszuszpendáltuk 1000 ul PBS-ben. A mintát azután átvittük 1,5 mt-es eppendorf csövekbe, és: jégen mkubákuk addig, amíg elérték a 3-4 °C-os hőmérsékletet, majd szonikáltuk 12Ί 5 másodpercen: keresztül.
Microbiális tenyésztő tápkózegskeí (150 μΐ) vagy más mintákat (150 pi) rétegeztünk 1,5 mi mesterségestápra, amnek a felszíne 2,54 enk volt. A gyökérfergek elleni pesztieid aktivitás szkrsnelésére 25 pl 0,8%-os tojásagar-oidatot vittünk fel a tálcák fedelére, A tálcákat és a fedeleket hagytuk megszáradni fülke alatt. A száradás után a fedeleket rátetiük a tálcákra, és 4-7 napon keresztül inkubálfek azokat 2ő %-os hőmérsékleten. Azután értékeltük a biológiai vizsgálati eljárás eredményét az „élő” és „elpusztult lárvák ieszámiálásávai. A mortalitást az elpusztult lárvák: százalékos arányával számítottuk ki az összes tesztelt lárvára vonatkoztatva.
2, példa: A .8, 1218 törzs lízátumaínak a pesztieid aktivitása
A & íó«rú?g.fe«sís 1218 törzsének tenyészeteiből készíteti mintákat teszteltünk pesztieid aktív hás jelenlétére CPS., WCRW és SCRW ellen, amint az i. példában leírtuk. Kontroliként a tápot Íoszfáí-pufferelt sóoldattal (FŐS) kezeltük.
Az egyes minták előállításához LB-csészén növő törzs egyedi kolóniáit választottuk ki, és alkalmaztuk 50 ml TB-tápkÖzeget tartalmazó csövek: beoltására. A. csöveket éjszakán: keresztül inkubáltuk 28 *C-os és 250 rptu-en. .Az rnkubálási követően a csőveket ieeentrifegáltuk 4300 x g-n 15 percen keresztül. A felüiöszót eldobtuk, és a csapadékot újra felszztszpendáhuk 50 ml sporalációs tápkő2x-gben. A csöveket ismét leeeferi fugáitok
4300 x g-n 15 percen keresztül. A második felüiöszót eldobtuk, és a második csapadékot újra felszuszpendáltuk *
... 46 50 mi sporulációs tápközegben. A csöveket azután 48 órást keresztül ínkubáltuk 28 cC-on és 250 rp.m-en, Ezt az iűkubűlást követően a csöveket leeentrifogáltuk 4300 x g-n 15 perces keresztiül. A feiüiűszóí eldobtuk, és a csapadékot újra felszuszpendáitíík 10 ml ix M9 tápközegben:. A mintát azután átvittük 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövekbe, és jégen ínkubáltuk addig, amíg a hőmérséklet körülbelül 3-4 °C lett, és azután szonikáltuk 12-15 snásodpercen keresztül. A biológiai vizsgálati eljáráshoz, 150 pl szonikák mintát alkalmaztunk.
A sporuláelős tágközeg 200 mi 5x. M9 sóoldatnt, 5 ml sőoldaföt, 5 ml CaCl2 oldatot és desztillált vizet tartalmaz 1 L vé-gíértógatm. Az M9 sóoldat az alábbiakat tartalmazza: 64 g Na2HP04.?HjO; 15 g KIEPOg 2,5 g. NaCl; 5 g NHjCl; és desztillált vfz 1,0l.. vágtórfogaíra, A sóoltiai az alábbiakat tartalmazza: 2,6 g MgSÖ4.7H2ö; 0,04 g MnSOíAEO; 0,28 g ZnSO4..?H2O; 0,40 g Pé$04.?»A és desztillált víz 1,0- L végtérfogatra. A CaCE oldat 3,66 g CaCE.2.H?O-t és desztillált vizet tartalmaz 100 mi végtérfogaíban.
A mintákat melegítéssel és anélkül tesztetek, hogy meghatározzuk. azt, hogy a peszticid aktivitásért felelő» komponens(ek) hóstabiiak-e, A hőkezeléshez a mintákat 15 percen keresztül forraltuk a biológiai vizsgálati eljárásban történő alkalmazást megelőzően. Az 1218 jelű törzsből előállított nem hőkezelt minták peszticid aktivitást mutattak :a amerikai festaícabogár ellen, es kisebb peszticid aktivitást mutattak a déli kukorieáfcögár· ellen. Az 1218 jelű törzsből előállítod minták közepes mértékben akadályozták a amerikai kukorieabogár lárváinak a fejlődését. A hőkezelést követően a mintáknak nagymértékben csökkent a peszticid aktivitása a gyökérféreg mindkét fajával szentben.
A peszticid aktivitás melegítés utáni csökkenése azt jelezte, fengv az 1218 jelű törzsből származó minta egy vagy több peszticid aktivitásért felelős komponense feöiabiiis. Ez a fajta csökkenés konzisztens azzal, hogy egy vagy több komponens fehérje.
3. példa: &. 1218 jelű törzséből izolált kristály fehérjék peszticid aktivitása ti. íí'íarírppg.nsís 1218 jelű törzse- sporulált tenyészeiemek 2. példa szerint előál lított mintáinak az alkalmazásával krístályfehérjéket izoláltunk, és azután tripszínnel kezeltük azokat, a szakterületen: ismert eljárások alkalmazásával. Röviden, a tisztítás (zónába gradiens eentriíagáiás, tie«ogrg^»-Ző) után a tisztított kristályokat feloldottuk alkalikus pufferben (50 mk4 NmCOj, 10 ®M ditiotrestol, pH lö). A vizsgálati eljárásban történő felhasználást megelőzően a feloldott kristáiyfehéjjékeí szűréssel töményítettűk (Miilipore Corp.) eemrdugás szűrőegységek alkalmazásával (molekulatömeg vágási érték: 10000 Da).
Nyilvánvaló, hogy bizonyos kísérleti körülmények között előnyös lehet a Cn-A-szerű poiipeptidek pro30 teázos kezelése, például tripszinnel, hogy aktiváljuk a fehérjét egy adott minta pesztieid aktivitásának a meghatározása előtt. Protoxin szerimproteázzal történő aktiválására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen [lásd például Cooksev, Bloohem. 1 6, 445-454. old. (1968) es Cárról! és Ellát, Bioehem, J. 261, 99-105, old. (1989), amelyek hivatkozás útján a kftanílás részét képezik]. Az izolált kristály fehérjéket amerikai kukorieabogár lárvák elleni pesztieid aktivitásra teszteltük, amint azt az 1. példában leírtuk. Mind az áj krisíályfehérje-ké35 szítmény, mind a korábban előállítod: készítmény („régi készítmény) jelentős peszticid aktivitással rendelkezik amerikai kuk.orieabogár ellen. A feloldott krlstályfehertéket 20 napon. keresztül -80 “'C-οπ tároltuk a vizsgálati eljárásban történő felhasználás előtt.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy sok. jele van a pesztieid aktivitásnak, és olyan változók moniterozhatők, mint például az elpusztult rovarok szánta vagy a kezelt rovarok átlagos tömege Például a pesztieid * *
- 47 aktivitást kényelmesen kifejezhetjük -százalékos mortalitásként, ami elpusztult lárvák százalékos aránya az összes- tesztelt lárvára vonatkoztatva.
4. példa: A & tó#riKg&»s& 1218 jdö törzsből izolált sukleotid-szekveneiák
5- Vállalkoztunk azoknak a nukleofiti-szekvencíáknak az izolálásár:;, amelyek a $. tfiwmgiensis 1218 jelű törzséből származó krislélyfehérjéket kódolják. Két nakleottó-szekvenciát izoláltunk az 1218 jelű. törzsből, amelyeknek a nakleotid-szekveacíája és amímsav-szekveaeiája homológ a CfyőWf-gyel (GenBANK elérési szám: UÖ4365). Az 1218 jelű törzsből izolált kát CryS-szerö -szekvenciát &y;2/ő-/-nek (1, azonosítószámú szekvencia) és ö>7278-2~nek (3. azonosítószámú szekvencia) neveztük. A 27, azonosítószámú szekvencián és a 28, iö azorsositószámö szekvencián sorrendben a Cz;u’2/A-/ és Cr;7z/&-2 natív genomiális nukíeínsav-szekvencíáját mutatjuk be,
Annák meghatározására, hogy a találmány szerinti variáns vagy mutáns polínukleotidok által kódolt fehérjék peszticid aktivitású fehérjék-e, az egyes nukleotid-wkvenciá&at Esdíeric&x colí-feau expresszáltattak. .Például annak meghatározására, hogy a találmány szerinti 1218-1 vagy 1218-2 po-lintddcotid-szekvencták pesztíeiti aktivitású polípeptidet kódolnak-e, csonkolt íuíkleol iá-szekvenciákat állítottunk elő. A 15. azonosítószámú szekvencia megfelel a.-Crv 1218-1 (1. azonosítószámú szekvencia) nnkleotid-szekvencia í-2007. nukleotidjának. A 17. azonosítószámú szekvencia megfelel &Cry 1218-2 (3, azonosítószámú szekvencia) nukleotidszekvencia 1-2019. nukieotitijának.
A 15. és I?. azonosítószámú szekvenciák csonkolt Cryd-szerú poiípeptldeket kódolnák, amelyek asninossv-szekvenciáját sorrendben, a. -lő. és 18. azonosítószámú szekvencián mutatjuk be, A csonkolt nukleotldszekyeo&iák (15. és 17, azonosítószámú szekvencia) mindegyikéi pET28a expressziős vektorba 'klónoztuk és azután £. coli transzformálására használtak. Trauszfonuált kolóniákat szelektáltunk ki, és tenyésztettünk folyékony tenyészetben, amint az 1, példában, leírtuk. Az expresszáliatött, N-íerminálisán Bís-cimkézett, csonkolt GyA-szerú fehérjéket affinitás; ksomatográíiávali izoláltuk £ «fo lizátumokből nikkel .affinitás; oszlopok alkalmazásával. A. jelentőséggel bíró fehérjét tartalmazó- oszlop-frakciókat alaposan kiölniizáholc Hl mM TrisHC1 (pH 8,5) pufferrel szemben, és azután (Miiltpere Corp.) eentrifugás szűrőegységekkel betöményltaltök (molekulatömeg vágási érték; löŐÖO) a gyártó utasításai szerint A betőményited OyA-szerii léhérjemintákta teszteltük amerikai kukoricabogár elleni peszticid aktivitásra, amint azt az 1. példában leírtuk.
As & cö/í-ban expresszáliatott készítményekből tisztított rekombínáns Oyó-szerü fehérjék peszticid aktivitását értékelő biológiai vizsgálati eljárásokat az I. példában leírt módon hajtottuk végre, a vizes fehérjemintáknak a győkérférgek tápjára történő ráréfegezésével. A vad típusú (azaz natív) és mutáns eodotoxln. pestjeid aktivitását értékeltük. déli kukoricabogárral szemben. .Amint vártuk, azt figyeltük meg,, hogy a peszticid aktivitás csökkent, ahogyan a tápra felvitt csonkolt öyd-szeni fehérjék koncentrációja csökkeni.
A peszticid aktivitást értékeltük a peszticid aktivitása tébésjék győkérférgek tápjába történő heépűlésé35 vei ís, ellentétben a. fen; leírt eljárással, ami magában foglalta fehérjetartalmú oldat beépítését a tápkeverékbe, Például 1000, 560, 400, 300, 2ÖÖ vagy 100 ppm peszticid aktivitású polípeptidet tartalmazó mintalapot vizsgáltunk, „JU, ♦.
- 48 5, példa: Peszticid' aktivitású fehérjét kódoló Kövéoy-preferált mfkieeíid-szekveadák előállítása Mivel a kodönbasználal különbözik a növények es baktériumok között, bakteriális eredetű nukleotidszekvencia által kódolt fehérje expresszié növényben korlátozott lehet a növénybe!! transzláció» hatástalanság, miatt. A szakterületen ismert, hogy az expressziét növelhetjük a növényben a fehétjét kódoló szekvencia
5' megváltoztatásával, hogy az növény-preferált kodonokuí tartalmazzon. Egy fehérje növényben történő optimális expresszáhatása érdekében szintetikus nttkleotid-szekvenciát állíthatok elő a fehérje amínosav-szekvencíájának az alkalmazásával, és visszatranszlálva a szekvenciát növény-preferált kodonok alkalmazásával.
Ilyen megközelítési mód alkalmazásával a CnG2íS-2 (2, azososltöszámtt szekvencia) által kódolt ansnosav-szekveneía egy részletét visszatranszJálfak kukorica-preferált kodonok alkalmazásával. A kapott növény-preferált nukleotid-szekvenciát a 9. azonosítószámú szekvencián matatjuk be. A 9. azonosítószámú szekvencián bemutatott nukleotid-szekvetreia olyan polipepttdet (lö. azonosítószámú: szekvencia) kódol, amely a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekveoela első 669 aminosavá? tartalmazza, i ly módon a 10. és 16. azonosítószámú szekvenciák olyan polipeptideket kódolnak, amelyek, ugyanazt az aminösav-szekveacíat. tartalmazzák, és a. 15. azonosítószámú szekvencia egy atásodtk polínukleotidof mutat be, amely a 1(1.
azonosítószámú szekvencia, szerinti aminossv-szckveneiáí kódolja.
ó, példa; Biológiai vizsgálati eljárás, mutáns OjtR-sserő polipeptidek peszticid akrivitásáoak tesztelésére koiorádébogár úit&emRteeefó) ellen
Protokoll
2S Röviden, a biológiai vizsgálati eljárást az alábbiak szerint hajtottuk végre; Bié-Serv tápot (katalógusszám F98ÖÖB, BIOSERV, Entomology Division, One SStreet, Sülte I, Prenéhtovvn, N.J. 08825) mértünk szét 128-mérÖhelyes Pltmao-tálcákra.{katalógusszám BIO-ÖA-I28, CD foternationai, Piíman, KJ, ÖS071), amelynek a felszíne 2,4 cm2, CnA-szerü mintákat (12IS-1A, 49PVD és NGSRÍ218-!) alkalmaztunk helyileg a táp felületére Sö pl/méróheiy mennyiségben. .Annyi mintát adtunk, amely elegendő volt mintánként 4 megfigyelés elvégzésére. Miután a mintát megszárííottuk, 2 újszülött kolorádóhogarat adtunk az egyes mérőhelyekhez. Ezáltal összesen 8 lárva/mlnta volt, Fedelet raktunk mindegyik tálcára (katalógusszám BíO-CV-lő,-CO imentstional, Pitoas, ML, 0807í), és a tálcákat 25 °C-os inkubátorba helyeztük.
A vizsgálati tálcák nem mutatták felszíni szennyeződés jelenlétét a puffer kontroliba» vagy azokban a mérőhelyekben, amelyek OyÓ-szerti mintás tartalmaztak, A tesztet mortalitásra értékeltük a fertőzést kővető 4.
Ά,
-49ί. Táblázat: Csonkolt 121.8-1 polipepíldek és trípszin-addiclös mutáns peszticld akii vitása kolorádóbogárral szentben
Kőd Minta Fehérje (mg/ml) Mortalitás
.A 3 a-pní'fer b-1218-ΙΑ 6,05 1/8 7/8 13% 88%
C C-12IS-IÁ 0,025 7/8 88%
D d-1218-ÍÁ 0,013 4/6 67%
F IM9PVÖ 0,1 8/8 10ö%
G g-49PVD 6,65 4/8 56%
H h~49FVD 0,02.5 8/9 89%
L 1-NGSR.Í218-1 ÖJ 8/8 160%
M' m-NGSR121S-l 0,65 8/8 166%
N n-NGSRI2'í8-'i 6,025 8/8 306%
&ydmények
Az ,,A” jelű minta az 1. táblázatban egy kontroll minta, amely lö mM karbonát-puffért tartalmaz (pH
10). Az összes csonkolt és mutáns fehérjeminiát (1218-íA (b-d), 49PVD (f-b) és NGSR1218-1 (í-n)] 10 mM karbonát-pafferben (pH 18) szolubílízáhuk.
Az 12 IS-1A minták (b-d) 16. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciút tartalmazó csonkolt polipeptiáet tartalmaznak. Közelebbről, az 1218-IÁ minták csonkolt texm-doméní tartalmaznak, amelyet a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvencia 1-669 aminosavaí (M-töl E-tg) reprezentálnak.
A 49PVD minták (f-h) 20. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciájú mutáns pobpeptídet tartalmaznak A 49PVG-t a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvencia Ntermmálisának és C-terminábsának a lerövidítésével állítottak elő. Közelebbről, a 49PVD mutáns N-íermináli15 sál 47 oidaliánccal rövidítettük le, ily módon: a polípeptid a 48. aminosav-oldaíláncnál (M) kezdődik, és a C1218-1A (16. azonosítószámú szekvencia) a 48, aminosav-oldallánctól a 663.-ig tart.
A2 NGSR minták (1-n) 12. azonosítószámú szekvencia szerinti mutáns 1218-1 pobpeptídet tartalmaznak. Az NGSR12í8-l-eí NGS'R motívumnak a 16, azonosítószámú szekvencia szerinti amlaosav-szekvenela 164, ammosava utáni hozzáadásával állítottak elő. Közelebbről, as NGSR mutáns egy 1218-1A mutáns, amely tartalmazza az NGSR atninosav-szckveneiát a 16. azonosítószámú szekvencia 164. és 165. atninosava között. A 4 oldalláne hozzáadása az 1218-IA-böz 673 aminosav bosszúságé fehérjét hozott létre. Az 1218-1 A, 49RVD és NGSR.121S-1 biológiai vizsgálati eljárása azt mutatta, hogy min<i a három fehérje hatásos koíorádöhogár (GPÖ) ellen. Azt találtuk, hogy az NGSR1218-1 mutáns hatásosabb volt, mint a a szülői Í218-IA és a 49PVD mutáns, A módosított (például csonkolt, vagy mutáns) 1218-1 pohpeptidek (49EVD, NGSR1218-Í} legalább olyan aktívak voltak, mint a releváns 1218-1 vagy 1218-1A kontroll salnía.
* * « * ·5» -ί * ·>
- 56 7, példa: Mutáns öylNszerü pöfipeptidek déli kafcotiea&ogár és amerikai kukorica-bogár elleni pesztieid aktivitásának tesztelésére szolgáló biológiai vizsgálati eljárás
Röviden, a fenti 6. példában ismertetett vizsgálati paramétereket módosítottuk, hogy lehetővé tegyük további 1218-1, 1218-1A vagy 49PVD mutánsok pesztieid aktivitásának az értékelését amerikai kukoricábogér (WCRW) és déli kuköricábögár (SCRW)· ette». Röviden, Bio-Serv tápot (katalógusszám F9860B, BIOSERV, Eatomology Divísion, One SStreet, Sülte 1, Frenchtowt, NJ. 08825} mértünk szét 128-mérö'helyes Fhntantálcákra (katalógusszám ΕΙΌ-ΒΆ-128, CD Intemstional, Plttnan, NJ. 0807 í),. amelynek a felszíne 2,4 cm'\
CnA-szerű mintákat vittünk fel helyileg a táp felületére 50 μί/mérőhely mennyiségbe». Annyi, mintát adtunk, amely elegendő volt mintánként ismételt megfigyelések elvégzésére. A gyökérférgek elleni pesztieid aktivitás szkrlnelesére 25 pl 0,8%-os tojásagar-oldstöt vittünk fel a tálcák fedelére. A tálcákat és a fedeleket hagytuk megszáradni fülke alatt. A száradás után a fedeleket rátettük a tálcákra, és 4-7 napon keresztül inknbáltak azokat 26 *C-os hőmérsékleten. Fedelet raktunk mindegyik tálcára (katalógusszám BIO-CV-lö, CD Iníematlonai, Pitmaa, N J., O8071), és a tálcákat 25 cC-os ittkabátorba helyeztük.
Az SCRW elleni pesztieid aktivitás értékelése érdekéden rovarokat tettünk ki vagy puffért (50 ®M fcarbonát-puffer, pid 10), vagy 1218-1 vagy 1218-IA mutáns polipeptídet (például 1218-IA,, LKMS.NÍ218-1, LKMS.R1218-1, NGSR.N 1218-1, EKMS.N49FVD, LKMS.R49PVD vagy NGSR.N49PVD) tartalmazó oldatnak, 36 vagy 3,6 ug/enr dózisban.
A WCRW elleni pesztieid aktivitás értékelése érdekében rovarokat tettünk ki vagy puffért (50 mM karboaát-pufíér, pH 10), vagy korlátozott számó 1218-1 mutáns polipeptidet iXKMS.RI218-1, NCSR.NI2I8-1, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD vagy NGSR.N49PVD): tartalmazó oldatnak, 88 gg/em dózisban. Azután értékeltük a biológiai vizsgálati eljárás eredményét az „éló” és „elpusztult” lárvák leszámlálásával. A mortalitást az elpusztult lárvák százalékos arányával számítottuk ki az: összes tesztelt lárvára vonatkoztatva.
2. Táblázat: Cryl218-I mutáns polipeptidek pesztieid aktivitása déli kukoricabogár ellen......I. ismétlés
Pollpeiáid Dózis % iHortahtás Dózis % mortalitás
1218-IA 36 pg/eurt 0 3,6 pg/cnr 3
LKMS.N 1218-1 36 ag 'enk 6 (nincs fehérje) 3,6 pg/cuC 4
LKMS.R 1218-1 36 gg/cm’ 89 3,6 μο/επΓ
NGSR.N 1218-1 36 pg/enr 80 3,6 ugróm’ »3
5ö mM karbonát (pH 10) - 1) - ö
49PVD 36 pg/cm3 3, 3,6 ügyem'
LKMS.N49PVD 36 pg/em3 60 3,6 ugróm-5 11
LKMS.R49PVD 36 ,ugZcmz 60 3,6 pgrótrr 17
NGSR.N49PVD 36 pgZcnA 93 3,6 pgróm3 v>
«4
-51 4 > - «,Γ χ , 4’
3. Táblázat; Cry 1218-1 matáns poripeptidek peszricfe aktivitása déri kukorioabogár ellen -- 2, ismétlés
Polipeptid Dózis % mortalitás Dózis % mortalitás
Í218-1A 36 pg/ctró 3 3,6 pg/csrr Ö
ÍXMS.N 1218-1 - - - -
imS.R 1218-1 36 pg/otró 75 3,6 pg/enr 20
NGSR.N 1218-1 36 pg/em2 77 3,6 jig/cnr 23
50 nrM karbonát (pH 1Ö) - 0 - 0
49PVD 36 ;ig/cm’ 0 3,6 pg.cnr ?
LKMS.N49PVD 36 pg/pm2 83 3,6 pg/enr 0
LKMS.R49PVD 36 pg/em 62 3,6 pg/cnó 3
NGSR.N49PVD 36 pg/erírt 81 3,6 pa/enó 25
4. Táblásat: Csy 12.18- Ϊ matáas polipeptiáek pesztieid aktivitása déli kukoricabogár allén......2. ismétlés
Poiipeptíd Dózis % mortalitás Dózis % mortalitás
1218-1A 36 pg/enr 2 3,ópg/cm2 0
LKMS.N 1218-1 - - - -
1..RMS.R 1218-1 3 6 pgfetrr A ?« 3,6 pg/cra 15
NGSR.N 1218-1 36 pgxnv 65 3,6 pg/cm2 17
50 ®M karbonát (pH 1Ö) - 0 - 0
49RVD 36 pg-knv Ö 3,6 pg/cm2 0
LKMS.N49FVD 36 pg/enr 70 3,6 pg/em2 5
LK.MS.R49PVD 3 6 pg/enrt 57 3,6 pgfem2 4
NGSR.N49PVD 36 gg/cnC 81 3,6 pg/em2 28
5, Táblázat: Cry 1218-1 mutáns polipegtidek peszticid aktivitása amerikai kukoricabogár ellen
Polipeptid Dózis % mortalitás
1218-1Λ
LKMS.M 1218-1
1..K.MS.R 1218-1 88 pg/cm2 16
’NGSR.N 1218-1 88 pg/cnr í ·<· i-+
5Ö mM karbonát (pH 16) - 4
49PVD 1..KMS.N49PVD LKMS.WPVD SS pg/cm2 SS pg/cm2 88 pg/cnrt 7 12
NGSR.N49PVD SS pg/em2 10
* »:'· «<ν *
Ν.ί·
C·)
~ 53 8·. példa: Kukorica transzformálása részecskebombázással és transzgenite növények regenerálása
Növényház! donor növényektől származó éretlen kukorica-embriókat bombáztunk a növényre optisnalízált CryJ2/8~/ nukleotld-szekvenciát (9. azonosítószámú szekvencia) ubiquitin protnóíerre! és PAT szelektálható markergérmeí — amely a Siaiapkas: herblcid ellent rezisztenciái okoz [Wohllebers és mtsai., Gene
70, 25-37, old, (19S8)'j — működőképesen kapcsolva tartalmazó plazmiddal. Más megoldásképpen a szelektál· ható markergéní különálló plazmídon biztosítjuk. A transzformációt az alábbi módon végezzük. A tápközegek összetételét alább adjak meg.
Célszövet preparálása
A csövekről a leveleket kiosztottuk, és sterilizáltuk a felszínüket 30%-os C/or&x bipóban és 0,5%
Micro detergenshen 20 percen keresztül, majd kétszer leöblítettük steril vízzel. Az éretlen embriókat kivágtuk, és a tengelyével lefelé (a pajzsocskávai felfelé) 560Y íápközegre helyeztük csészénként 25 embrió sűrűségben, 4 órán keresztül, majd 2,5 cm távolságra tettük a célzónától, előkészülve a bombázásra.
HNSelÖáiiltása
Növényre optimalizált €ryr2i8~i aukleotid-szekvenciát (9. azonosítószámú szekvencia) nbtqmtin promóferhez működőképesen kapcsolva tartalmazó plazmidot állítunk eiö. Például alkalmas transzformációs vektor Zea mays-bói származó U.B11 promótert, 5’ UTR-t és UBfl iníroní tartalmaz., kombinálva Piníí termináterrai.. A. növényre optimalizált nukleotld-szekvenciát tartalmazó plazmid-DNS-í és egy második plszntid-DNSí, amely PAT szelektálható markert tartalmaz [például CAMV35S(Aí5K) promóter által szabályozott PAT CAMV35S termmátorrai’j kicsapunk 1,1 pm (átlagos átmérőjű) wollraro pelfeten, CaCb kicsapásí protokoll alkalmazásával az: alábbiak szerint:
100 pl, vízben előkészített woiffam részecske lö pl (1 pg) DNS Trts-EDTA pufferben (összesen 1 gg DNS)
100 pl 2,5 M CaCT ai 0,1 M $pemudin
Mindegyik reagenst egymás után adjuk wolfram-részeeske szuszpenzíóhoz, miközben több csövet tartó vortexen tartjuk. A végső keveréket röviden szonikáliuk, és állandó vortexeiés mellett hagyjuk inkubálódni lö percen keresztül. A leülepedés! időszak után a csöveket röviden leeentriíngáljuk, a folyadékot eltávolítjuk, és mossak 5Ö0 ml 100% etanollal, és centrifugájuk 30 másodpercen keresztül. A folyadékot ismét eltávolítjuk, és 105 gi 100% etanolt adunk a végső wolfram-részeeske csaptíáékhoz. A részecskeágyús bombázáshoz a wolf36 ramZDNS részecskéket röviden szonikáljuk és 10 p.l-t viszünk fel az egyes makrohordozok: közepére, majd hagyjuk körülbelül 2 percen keresztül száradni a bombázás előtt,
Bűszeesekágyús kezelés
A mintalernezöket #4 szinten botaházzuk #HE34~1 vagy 4HE34-2 részecakeágyúvai. Minden minta egyetlen lövést kap 4,5 MBa (656 ESI) nyomáson, és összesen lö aíikvotot veszünk mindegyik,, előkészített részecske/DNS-t tartalmazó csőből. löyáWkezelés
A bombázást köveiden sz embriókat 560Y tápközeges tartjuk .2 napén keresztül, majd átvisszük azokat SóöS. szelekciós tápkőzegre, atnely 3 mg/ii.ter Bieletpk&s-t tartalmaz, és minden második héten szubkultúrái készítünk. Megközelítőleg lö heti szelekció után a szelekcióra rezisztens kallnsz-klönokat átvisszük 23S.1: tápkö40 zegre, a növény regenerációjának megindítása érdekében. A szotnarikus embrió-érést követően (2-4 hét) a jói « 4 4
- 54 fejlett szomatikus embriókat átvisszük csírázás! tápközsgre,. és átvisszük a megvilágított tenyésziőszobába. Megközelítőleg 7-10· nappal később a fejlődő növénykéket: átvisszük bonnonmeatss 272V tápközegre, csövekben 710 napra, amíg a növénykék jól kifejlődnek. Azután a növényeket átvisszük virágíöídet tartalmazó tálcákra (amelyek 6 cm-es cserépnek felelnek meg), és egy héten keresztül növesztjük tenyésztőkamrában, majd azt kö5 vetően további 1-2 héten keresztül növesztjük az üvegházban, majd átvisszük azokat klasszikus .609-as (6 literes) cserepekbe, ős teljes fejlettségig növesztjük. A növényeket monitorozzuk és értékeljük a Cty 1218-1 fehérje expressziójára a szakterületen ismert vizsgálati eljárások alkalmazásával, mist példátíl immunológiai vizsgálati eljárásokkal és Westera-feioftal olyan ellenanyag alkalmazásával, amely kötődik a Cty 1218-1 fehérjéhez. BpmbázáyéstenxfegztŐ.tápközegek
A bombázási tápközeg (SőüY) az alábbiakat tartalmazza: 4,0 g/l .Yő alapsó (SIGMA C-1416), 1,9 ml/1
Eriksscm's Vitamin Mi? (löööx, SiöMA-15 11), 0,5 rog/í tíanün.kíCl, 120,0 g/1 szukróz, 1,0 mg/i 2,4-D és 2,88 g/i L-prolin (atiotí térfogatra feltöltve ioncserélt vízzel, és a pH-ja beállítva 5,8-ra KOH-vaí)·; 2,.9 g/1 Ge/r/fe fáz ioncserélt vízzel váló feltőkés után hozzáadva); és 8,5 mg/1 ezüst-nitrát (a tápközeg sterilizálása és szobahőmérsékletre történő lehűtése után hozzáadva). A szelekciós íápközeg (569R) az alábbiakat tartalmazza: 4,9 g/1 Yő aiapsó (S.1GMA C-14ló), 1,0 ml/l EnkssiW's Vitamin Mix flOOOx, SíGMA-3511), 9,5 mg/1 tiamin.HCl, 39,9 g/1 szukróz és .2,0 mgő 2,4-D (adott térfogatra feltöltve ioncserélt vízzel, és a pH-ja beállítva 5,8-ra KOH-val); 3,9 g/1 Gelrite (az ioncserélt vízzel való föltölíés után hozzáadva); és 9,85 mg/1 ezüst-nitrát és 3,0 mg/1 Bisiaphos (mindkettő a tápközeg sterilizálása és szobahőmérsékletre történő lehűtése után hozzáadva).
A növény-regenerációs íápközeg (288,1) az alábbiakat tartalmazza: 4,3 g/i MS-sö (GíBCO 11117-074),
5,0 ml/1 MS vitamrn-tőrzsoldat {©.100 g mkotínsav, 0,02 g/1 flasníh..HCí, 0,10 g/i piridoxin.HCl és 0,40 g/1 glíein, adott térfogatra feltöltve ioncserélt vízzel) [Murashíge és Skocg, Physioi. Plánt. 15, 473. old. (1962)1, 100 mg/1 miomozitol, 0,5 mg/i zeatin, 60 g/1 szukróz é& 1,0 ml/10,1 mM abszaizinsav (adott térfogatra feltöltve ioncserélt vízzel, miután a pH 5,6-ra be lett állítva); 3,0 g/i G&b-íte (az ioncserélt vízzel való feköltés után hozzáadva); és 1,0 mg/1 indolecetsav és 3,15 mg/1 ^ielaphos (a tápfcözeg sterilizálása és 60 ’C-ra történő lehűtése után hozzáad25 vaj. A -hortncumrenies íápközeg (272V) az alábbiakat tartalmazza: 4,3 g/1 /HS-só (GíBCO 11 117-074), 5,0 ml/1 íHS vitamin-törzsoldat (9,.199 g. mkotínsav, 9,92 g/1 tianrin.líCl, 0,10 g/1 piridoxin.HCl és 0,40 g/1 glíein, adott térfogatra feltöltve ioncserélt vízzel), 0,1 g/1 míoinozitol és 49,9 g/1 szukróz (adott térfogatra feltöltve Ioncserélt vízzel, miután a pH 5,6-ra be lett állítva); és 6 g/1 hakto-agar (az .adott térfogatra való feltöltés után hozzáadva), sterilizálva és 69 °C-ra lekötve.
9, példa: Kukorica .4§fo(>ucfe'rt««í-kőzs(etítet? transzformálása és transzgenikus növények regenerálása Kukorica rtgwbűeföfemví-közvetített, növényre optimalizált Cryl218~3 nukleorid-szekvenciával (9.
azonosítószámú szekvencia) történő transzformálásához előnyösen Zhao eljárását alkalmazzuk (5 981 840. számú amerikai egyesölf államokbeli szabadalmi irat és WO 98/32326. számú nemzetközi közzétételi irat; ame35 Ivek tartalma hivatkozás útján: a kitaníiás részéi képezi). Röviden, éretlen embriókat izolálunk kukoricából, és az embriókat érintkezésbe hozzuk Agro&aüteríitm szuszpenziójáva! olyan körülmények közölt, ahol a baktériumok képesek átvinni a növényre optimalizált Cty!2l8-i nukleotld-szekvenelát (9, azonosítószámú szekvencia) legalább egy éretlen embrió legalább egy sejtjébe (1. lépés: fertőzési lépés). Ebben a lépésben az éretlen embriókat előnyösen rtgro/rocferhí/s-szuszpenzióba mártjuk a ferőzés megindítása érdekében. Az embriókat együtt te40 syászíjük egy ideig az Hgre>&í.mtmw-mal (2. lépés: együtt tenyésztési lépés). Előnyösen az éretlen embriókat φ φ « φ φ
- 55 szilárd tápközegen tenyésztjük a fertőzési lépési követően. Ezen együtt tenyésztési időszak után opcionális „pihentetést' lépés következhet Ebben pihentetés! a lépésben az: embriókat legalább egy olyan antibiotikum jelenlétében inkubáljuk, amely ismeri módon gátolja az Agre&tcteriif/in növekedését, növény i traoszfor-nánsokra szelektív ágensek hozzáadása nélkül (3. lépés: piisentetési lépés). Előnyösen az éretlen embriókat antibiotikumot tar5 talmaző szilárd tápközegen tenyésztjük, de szelekciós ágens nélkül, az Agrobaeteriwn eliminálása és a fertőzött sejtek pihentetése érdekében. Azt kővetően az embriókat szelektív ágenst tartalmazó tápközegen tenyésztjük, és növekedő transzformált kalluszt állítok elő (4. lépés: szelekciós lépés). Előnyösen az éretlen embriókat szelektív ágenst tartalmazó szilárd lápközegen tenyésztjük, .ami a transzformált sejtek szelektív növekedését eredményezi. Azután a kalluszt növényekké regeneráljuk (5. lépés: regenerációs lépés), és előnyösén a szelektív tápkö10 zegen. nőt; kalloszokat szilárd tápközegen tenyésztjük a növények, regenerálása érdekében.
A leírásban említett mindegyik publikáció vagy szabadalmi bejelentés jelzi az azon a szakterületen jártas szakember íttdás,szintjét, amelyre ez a találmány vonatkozik. Az összes publikáció é.s szabadalmi bejelentés hivatkozás útján a kitolíás részét képezik olyan, mértékben, mintha minden egyes publikációról vagy szabadalmi bejelentéstől specifikusan és egyedileg jeleztük vofea, hogy hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
Habár az előbbi talslrnáiryt bizonyos részletességgel Ismertettük szemléltetésként és példaként a világosság és érthetőség kedvéért, nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatások és módosítások végezhetők a mellékelt megvalósítási módok oltalmi körén beiül.

Claims (36)

  1. Szabadstai igénypontok
    1. Izolált nukleinsav, amely az alábbi, axeeribű kökoricabogár elleni pesztieid aktivitású poiipeptidet kódoló nukleotid-szekveneiák bármelyikét tartalmazza:
    (a) sz 1 3., 5,, 9,, 15. vagy 17. azonosítószámú szekvencia szerinti saíüeotíd-szekvencta;
    (b) a 2,, 4., éri 8,, lé. vagy 18, azonosítószámú szekvencia szerinti amtaosav-szekveneiát kódoló nukleotíd-szekvencía;
    (<) az (a) pontban megadott uukleotid-szekveoeiával legalább 88%-ban azonos szekveneíájú nukleotidszekveneia;
    (d) a (b) pontban megadott aminosav-szekvenciávái legalább 85%-ban azonos szekvenciái ö amrnosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló nakleotib-szekveneia: vagy
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav, amely legalább 90%-fean azonos az 1., 3., 5.., 7., 9., I.S. vagy 17.. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotid-szekvencíávai.
  3. 3. Az I, igcttyportl szerinti nukleinsav,, amelynek a onkleotid-szekvendája optimalizálva vsa növényben történő expresszáltatásra.
  4. 4. Expressziös kazetta, amely 1. igénypont szerinti nukleínsavat tartalmaz, amelyben & nakleotidszekveneía rnrikotlóképesen kapcsolva van expressziét mikroorganizmusban vagy növényi sejtben iráuyúó prouíóterhez, .
  5. 5, Izolált, amerikai kukorieabogár ellen pesztieid aktivitású polipeptid, amely az alábbiak bármelyike:
    (a) a 2,,..4,, é,, 8., ló. vagy 18, azonosítószámú szekvencia szerinti ammosav-szekveneiát tartalmazó polipeptid; vagy tb) az (a.) pontban megadott aminosav-szekvenelával legalább 85%-ban azonos szekveneíájú polipeptid.
    •
  6. 6. Áz 5. igénypont szerinti polipeprid, amely legalább 9ö%-ban azonos a a z., 4„ 6., 8., 16. vagy 18. azonosítószámú szekvencia szerinti autátosav-szskvenciával.
  7. 7. Pesztieid aktivitású készítmény, amely legalább egy 5. igénypont szerinti poiipeptidet tartalmaz hordozóval kombinálva.
  8. 8. Eljárás növényi rovarkártevő: befolyásolására, ezzef jellemezve, hogy 7. igénypont szerinti pesztieid aktivitású készítményt juttatunk a rovarkártevő környezetébe permetezés, porzás, szórás vagy magbevonás bármelyikével.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ozzfo feifeíreervg, hogy koíorádöbogár, amerikai kukoricabogár vagy déli kukorieabogár bármelyikét befolyásoljuk.
    lö. Transzformált növény, amely a gencünjábas legalább egy stabilan beépült rmk.leorid-konstrrskciót tartalmaz, amely kódoló szekvenciát tartalmaz, működőképesen kapcsolva olyan pronróíerhez, amely olyan polipeptid expressziójás irányítja, amely pesztieid aktivitásé amerikai kukorieabogárrai szemben, és a kódoló szekvencia az alábbiak bármelyike:;
    (a) az I „ 3., 5., 7., 9., 15, vsgy 17. azonosítószámú szekvencia szerinti nttkleotifoszekvencia;
    (bt a 2., 4., 6,, 8„ 16, vagy 18. azrmositószámó szekvencia szerinti amíaosav-saekvencíát kódoló nukleodd -szekvencia;
    - 60 (c) az (a) pontban megadott nukleotid-szekvertciávai legalább 88% azonos, szekvenciája nukleotidszekvencia;
    (ti) a (b) pontban megadott aminosav-szekvenciával legalább 85%-ban azonos szekvenciájú aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló nuklcütiá-szekveneis;
    (e) az (aj-td) pontok bármelyike szerinti nnkleotíd-ssekvencía, amely növényben történő expresszáítatásra optimalizált kodonokat tartalmaz: vagy
  10. 11. A lö. igénypont szerinti növény, amely az L, 3., 5., 7., 9., IS, vagy 17. azonosítószámú szekvencia szerinti nnkleotld-szekvenciával legalább 90%-ban azonos nnkkotíd-szekvencíát tartalmaz.
  11. 12. A lö. igénypont szerinti sövény, amely egyszikű.
  12. 13. A lö. igénypont szerinti sövény, amely kétszikű.
  13. 14. Transzformált mag, amely a 10, igénypontban meghatározott nnkieotíd-kosstiukcíót tartalmaz.
  14. 15. Transzformált mikroorganizmus, amely az alábbi, amerikai kukorícabogár elleni peszticíd: aktivitású poiipeptideí kódoló nnkleotid-szekvenciák bármelyikét tartalmazza:
    fa) az 1.. 3., 5,, ?., 9.,17,, 27. vagy 28, azonosítószámú szekvencia szerinti nukieotíd-szekvencía;
    (b) a 2., 4,, ó., 8.,
  15. 16, vagy 18. az.osroshósz.ámú szekvencia szerinti annnosav-szekvenclát kódoló ntikieotid-szekvenc la;
    (c) az: (a) pontban megadott nukleotid-szekveneiával legalább 88% azonos szekvenciájú nukíeotidszekvencra;
    (d) a (b) frontban megadott amínosav-szekvenciával legalább 85%-ban azonos szekvenciájú ammosavszekvencíát tartalmazó fehérjét kódoló nukleotid-szekvencia; vagy ló. Á 1.5, igénypont szerinti transzformált mikroorganizmus, amely az 1., 3., 5,, 7., 9,, 15. vagy 17. azonosítószámú szekvencia szerinti nukíeeííd-szekvenciávaí legalább 90%-ban azonos nnkieotid-szekvenclát tartalmaz..
  16. 17. A 15. igénypont szerinti transzfermáit mikroorganizmus, amelyben a nukleond-szekvencia működőképesen kapcsolva van olyan prométerhez, amely expressziét irányít a mikroorgatuzmusbatt,
  17. 18. .Peszticíd aktivitású készítmény, amely 15. igénypont szerinti transzformált mikroorganizmust és hordozót tartalmaz:, és a készítmény kezelve lett a peszticid aktivitás meghosszabbítására.
  18. 19. Eljárás növényi kártevő befolyásolására, aszú/ jeif&nezve,, hogy 18. igénypont szerinti peszticíd aktivitású készítményt juttatunk a kártevő környezetébe permetezés,, porzas, szórás vagy magbevosás bármelyikével.
  19. 20. Eljárás sövényt kártevő befolyásolására, azzo/ ye/Zemezvc, hogy a növénybe vagy annak sejtjébe legalább egy olyan nukieotíd-konsirukciót jntlatuak be, anroly kódoló szekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva olyan prométerhez, amely peszticíd aktivitású polipeptíd expressziéját irányítja növényi sejtekben, almi a polipeptid anrerikai kukoríeabogár elleni pesztíeiti aktivitású és a kódoló szekvencia az alábbiak: bármelyike:
    fa) az 1., 3., 5., 7., 9,, 15. vagy 17. azonosítószámú szekvencia szerinti ntdrieotid-szckvencía;
    (b) a 2., 4., 6,, 8,, ló, vagy 18. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvencia:
    fc) az fa) pontban megadott nukleotid-szekveneiával legalább 88% azonos szekveneiájú nukleotidszekvencia
    -61 (d) a (b) pontban megadott aminosav-szekvenciával legalább 85%-bas azonos szekvenciájú atninosavszekvescíái tartalmazó fehérjét kódoló nukleotid-szekveucia; vagy
  20. 21. A 26, igénypont szerinti eljárás, űccű7 je/tenmeve, hogy az L, '3,, 5., 7-, 9., 15. vagy 17. azonosStószáínö szekvencia szerinti nukleoíid-szekvencíávai legalább 90%-ban azonos nukleotid-szekvenciát juttatok he a növénybe.
  21. 22. A 19. azonosítószámú szekvencia szerinti onklerssav variánsa, amely olyan nnkleoíid-szekvencíát tartalmaz, amelyben legalább egy, a 19. azonositoszsow szekvencia szerinti nukSeotid-szekveneíában jelen nem lévő további kodon található, és a legalább egy további kodon egy további proteáz-érzékeny helyet épít be a kódolt polípeptid 1, doménjánafc a 3. és 4> aliá-hélixe közötti feuroktégíóba, és ezenfelül a variáns által kódolt polipeptídnék javított peszticid aktivitása van a íedelesszámyáak rendjébe tartozó kártevővel szemben a 2. azonosílőszánró szekvencia szerinti polípeptid aktivitáshoz viszonyítva.
  22. 23. Áz 22. igénypont szerinti nukleinsav, amelynek a nukleotid-szekvenciája optimalizálva van. növényben történő expresszál tatásra.
  23. 24. Expressziós kazetta, amely 2.2. igénypont szerinti nakleinsavaí tartalmaz, ameiybeo a tíukteottdl· szekvencia működőképesen kapcsolva van expressziét mikroorganizmusban vagy növényi sejtben irányító promóterhez.
  24. 25. Izolált nukleinsav, amely az alábbi mtkíeetid-szekvenciák bármelyikét tartalmazza:
    (a) az 5., 11,, 15,, 21., 23., 39. vagy 43.. azonosítószámú szekvencia bármelyike szerinti nnkieotidszekveseia;
    (b) a 6., 12., 16., 22., 24., 40. vagy 44. azonosítószámú szekvencia szerinti atninosav-szekveneia bármelyikét kódoló nufcíeorid-szekvencia;:
    («) a 16. azonosítószámú, szekvencia szerinti polípeptid variánst kódoló rmkleotid-szekvencia, amely polípeptid egy további proteáz-érzékeny hasítási helyet tartalmaz a 16. azonosítószáorú szekvencia 164. és 165. attoosav-oldallánea közé inzertálva;
    (d) a 16. azonosítószámú szekvencia szermíl pobpepíid variánst kódoló nukieotid-szekvencia, amely polípeptid variáns egy további, tripszin hasítási helynek a 16, azonosítószámú szekvencia 164. és 165. aminosav-oldaílánca közé történő beépítésére tervezett antincsav-szekvenciát tartalmaz;
    (e) a 16, azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variánst kódoló nökíeotid-szekvencia, amely polípeptid egy további, kimotrípszin hasítási helynek a 16. azonosítószámú szekvencia 16Ö. és 161. amínoaavoldaliánca közé történő beépítésére tervezett aminosav-szekvenciát tartalmaz; vagy (fi 16. azonosítószámú szekvencia szermíl polípeptid variánst kódoló uukleotíd-szekvencía, amely poilpepíid olyan ammosav-szekvenciáí tartalmaz, amelyben a 16. azonosítószámú szekvencia 161-163. pozícióinak megfelelő oídalláncok ei vannak távolítva, és további, kimoíripszin hasítási helyet tartalmazd aminosavak vannak a helyükre beépítve.
  25. 26. Az 25. igénypont szerinti nukleinsav, amelynek a nukleotid-szekvenciája optimalizálva van növényben történő exprcsszáltanisra.
  26. 27. A 15, azonosítószámú szekvencia szerinti nukleinsav variánsa, amely olyan nttkleotid-szekveneiát tartalmaz, amelyben legalább egy olyan to vábbi kodon taláfeató, amely-egy további proteáz-érzékeny helyet épít be a variáns nakleinsav által kódolt polípeptid I, dotnénjáaak a 3. és 4. alfa-hélixe közötti hurokrégíóba, és a
    - 62 ködolt polipeptidnek javított peszticid aktivitása van a iedeiésszárnyúak rendjébe tartozó kártevővel szemben a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptid aktivitáshoz viszonyítva,
  27. 28. Expresszíós kazetta, amely 27. igénypont szerinti nukle insavat tartalmaz, amelyben a nukleoíidszekvencia működőképesen kapcsolva van expressziéi mikroorgafiízmasban vagy növényi sejtben irányító promóterhez
  28. 29. Izolált rntkleínsav, amely az alábbi ntskieinsav-szekvenciák bármelyikéi tartalmazza:
    (a) a 19, 29, 31,33 ., 41. vagy 45. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotí'd-szekveneia;
    (b) a 29,
  29. 30, 32, 34, 42. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti ammosav-szekvencíát kódoló nükteetid-szekvencia;
    (e) a 19. azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó nukieoőd-szekvencia, amely variáns a 20. azonosítószámú szekvencia 114, ammosavátóí közvetlen 5' irányban beinzertált további proteáz-érzéketty hasítási helyes tartalmaz;
    (á) a 19. azonosítószámú szekvencia szerinti variánst, nnkieotid-szekvencia, amely variáns egy további, tripszin hasítási helynek a 2öt azonosítószámú szekvencia 113. és 114. aminosav-oldailánca közé történő beépítésére tervezőit ammosav-szekvenciát tartalmazó pohpeptídet ködök (e) a 19. azonosítószámú szekvencia szerinti variánst nokieotid-szekveneia, amely variáns egy további, kimotripszro irasítási helynek a 20. azonosítószámú szekvencia 113, és 114. aminosav-oldailánca közé történő beépítésére tervezett aorinosav-szekvenelát tartalmazó pohpeptidet kódol: vagy (f) a 19. azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó nukieotid-szekveneia, amely variáns olyan polipepiídet kódol, amelybe® a 20. azonosítószámú szekvencia 11.4-116, pozícióinak megiélelö oidalláncok el vannak távolítva, és további, kimotripszin hasítási helyet tartalmazó ammosavak vannak a helyükre beépítve.
    '30. A 29. igénypont szerinti núkleinsav, amelynek a nnkicotíd-szekvenciája optimalizálva van növényben történő expresszáitatásra.
  30. 31. A ló. azonosítószámú szekvencia^ szerinti polipeptid variánsa, amely olyan zminosav-szekveneiát tartalmaz, amelyben legalább egy olyan további aminosav-eidallásc található, amely egy további pcoteázérzékeny helyet épít he a kódolt polipeptid t. deménjának a 3. és 4. attá-hélixe közötti húrokrégióba, és ezenlélúí a variáns által kódolt polipeptidnek javított peszticid aktivitása van a íédelesszántyúak fentijébe tartozó kártevővel szemben a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptid aktivitáshoz viszonyítva.
  31. 32. izolált peszticid aktivitású polipeptid, mely ó, 12., 16, 20, 22,, 24, 3ö, 32, 34, 40., 42, 44. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát tartalmaz.
  32. 33. Transzformált növény, amely a genomjában legalább egy stabilan beépült mikleoiid-konstrukciói tartalmaz, amely kódoló szekvenciát tartalmaz möködőképesen kapcsolva olyan promóterhez, amely peszticid aktivitású polipeptid expresszíóját irányúja transzformált növény sejtjeiben, ahol a polipeptid amerikai knkoricabogár ölteni peszdeid aktivitású és a kódoló szekvencia az alábbiak bármelyike:
    (a) a 11, 19„ 21, 23, 29, 31, 33, .39, 41, 43. vagy 45. azonosítószámú szekvencia szerinti nnkleotid-szek vette is:
    (b) a 12, 20, 22., 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti anninosav-szekveacíát kódoló míkleotid-szekvendn;
    -63(c) a. 16. azortesltöszámú szekvencia szerinti polipeptíd variánst kódoló sukleotid-szekveucia, amely variáns egy további proíeáz-érzefeeny hasítási helyet tartalmaz a 16, azonosítószámú szekvencia 164. és 165. amiaosav-oidafiásíea közé inzertálva;
    (di a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polípeptid variánst kódoló nukleotid-szekvencia, amely variáns egy további, tripszín hasítási helynek a 16. azosttosltószánsö szekvencia 164. és 165. amlftos&voidalíáaea közé történő beépítésére tervezett ammosav-szekvendát tartalmaz;
    (e) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptíd variánst kódoló nukleotid-szekvenda, amely variáns egv további, khnotripszin hasítási helynek a íó, azonosítószámú szekvencia 160. és 161. aminosavoldallánca közé történő beépítésére tervezett amínesav-szekvendát tartalmaz;
    (t) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptíd variánsát kódoló nukleotid-szekvencia, amelyben a 16. azonosítószámú szekvencia 161-163, pozícióinak megfelelő aminosav-oldalláttcok el vannak távoíílva, és további, khnotrípszin hasítási helyet tartalmazó amínosavak vannak a helyökre beépítve;
    (g) a 19. azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó nukleotid-szekvencia, amely variáns a 20. azonosítószámú szekvencia 114., aminesavától közvetlen 5’ irányban beinzertáit további proteáz-érzékeny hasítási helyet tartalmaz;
    (h) a 19. azonosítószámú szekvencia variánsát tartalmazó nukleotid-szekvencia, amely variáns- egy további, tripszm hasítási helynek a 2Ö. azouosiíöszámú szekvencia 114. antinosaváíől közvetlen 5’ irányban történő beépítésére tervezeti smlaosav-szek vendét tartalmazó polípeptidet kódol;
    i) a 19. azonosítószámú szekveneia variánsát tartalmazó nukleotid-szekvencia, amely variáns kimotripszín hasítási helynek a '20. azonosítószámú szekvencia 113. és 114. aminosav-oldallánca közé történő beépítésére tervezett további nukíemsav-oldaíláncokat tartalmaz;
    j) a '20-, azonosítószámú szekvencia polípeptid variánsát kódoló nukleotid-szekvencia, amelyben a 20, azonosítószámú szekvencia 114-116. pozícióiban található aminosav-oid&Háncofc el vannak tavoBva, és további, kimotripszm helyei tartalmazó ammosavak vannak a heíyökre beépítve; vagy
    k) az (a)-<i) pontok bármelyike szerinti nukleotid-szekvencia, amely növényben történő expresszáltatásra optimalizált kodeinokat tartalmaz,
  33. 34. A 33, igénypont szerinti növény, amely egyszikű.
  34. 35. A 3.3. igénypont szerinti növény, amely kétszikű.
  35. 36. Transzformált mag, amely a 33. igénypont szerinti növény magja,
  36. 37. Transzformált mikroorganizmus, amely az alábbi nukleinsavak bártnelyikéí tartalmazza;
    {ai a 11-, 19., 21., 23-, 29., 31,, 33., 39., 41,, 43. vagy 45. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotid-szekvencia;
    (b) a 12., '20., 22., 24., 30., 32,, 34., 40,, 42., 44. vagy 46. azonosítószámú szekvencia szerinti amiaosav-szekveneíst kódoló tuíkicotid-szekveBcsa;
    (c) a 19.. azonoshöszáom szekvencia variánsát kódoló nukleotid-szekvencia, amely variáns további proteáz-érzékeny helynek a 20. azonosítószámú szekvencia 117. és 158. aminosav-oldallánca közé történő beépítésére tervezett núkleínsav-iszertet tartalmai; vagy (d) a 16. azonosítószámú szekvencia szerinti polipeptíd variánst kódoló nukleotid-szekvencia, amely variáns egy további proteáz-érzékeny helyet tartalmaz a 16. azonosítószámú szekvencia 164, és 165. antincsavoídaüánca közé inzeriálva; vagy
    -64(e) a 20. azonosítószámú szekvencia szerinti poíípeptid variánst kódoló nukieotid-szekvencia, amely variáns egy további proteáz-érzékeny helyet tartalmaz a 20. azonosítószámú szekvencia i 17. és US. amioosavoidaí lánca közé inzertál va.
HU0302523A 2000-10-24 2001-10-24 Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének HU228699B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24283800P 2000-10-24 2000-10-24
US10/032,717 US7605304B2 (en) 2000-10-24 2001-10-23 Genes encoding novel bacillus thuringiensis proteins with pesticidal activity against coleopterans
PCT/US2001/045468 WO2002034774A2 (en) 2000-10-24 2001-10-24 Bacillus thuringiensis proteins and variants thereof with pesticidal activity against coleopterans

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0302523A2 HUP0302523A2 (hu) 2003-10-28
HUP0302523A3 HUP0302523A3 (en) 2005-11-28
HU228699B1 true HU228699B1 (hu) 2013-05-28

Family

ID=26708782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302523A HU228699B1 (hu) 2000-10-24 2001-10-24 Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének

Country Status (11)

Country Link
US (3) US7605304B2 (hu)
EP (1) EP1356054B1 (hu)
AT (1) ATE338820T1 (hu)
AU (1) AU2002228705A1 (hu)
BR (1) BR0114891A (hu)
CA (1) CA2426793C (hu)
DE (1) DE60122931T2 (hu)
ES (1) ES2271098T3 (hu)
HU (1) HU228699B1 (hu)
MX (1) MXPA03003666A (hu)
WO (1) WO2002034774A2 (hu)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7462760B2 (en) 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
EP1531664A4 (en) * 2002-06-26 2005-11-16 Du Pont GENES ENCODING PROTEINS WITH PESTICIDAL ACTIVITY
CA2804953C (en) 2003-12-23 2016-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant activation of insect toxin
CA2556927A1 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for enhancing insect resistance in plants
CN100532555C (zh) * 2004-11-16 2009-08-26 中国农业科学院植物保护研究所 对鞘翅目害虫高效的cry8F基因、其表达蛋白及其应用
CN1323159C (zh) * 2004-11-16 2007-06-27 中国农业科学院植物保护研究所 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因
CA2608717A1 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm
EP1893638B1 (en) 2005-06-08 2011-08-10 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Insect-specific protease recognition sequences
US7449552B2 (en) * 2006-04-14 2008-11-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis cry gene and protein
US7329736B2 (en) * 2006-04-14 2008-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis cry gene and protein
US9133475B2 (en) 2008-11-26 2015-09-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Aphid resistant soybean plants
US20100210460A1 (en) 2009-02-19 2010-08-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production
AR080658A1 (es) * 2009-06-16 2012-05-02 Dow Agrosciences Llc Toxinas insecticidas cry dig-5 de bacillus thuringiensis
WO2011009182A2 (pt) 2009-07-24 2011-01-27 Embrapa - Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária Molécula de ácido nucléico isolada, construção gênica, vetor, célula transgênica, método para obtenção de uma célula e de uma planta transgênica, polipeptídeo isolado e purificado, composição pesticida biodegradável, método para o controle de uma praga, método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga
RU2662995C2 (ru) * 2010-10-27 2018-07-31 Девген Нв Уменьшение экспрессии генов у насекомых-вредителей
US9125419B2 (en) * 2012-08-14 2015-09-08 Marrone Bio Innovations, Inc. Bacillus sp. strain with antifungal, antibacterial and growth promotion activity
US10253329B2 (en) 2013-01-04 2019-04-09 Board Of Trustees Of Michigan State University Sources of aphid resistance in soybean plants
AU2014241045B2 (en) 2013-03-13 2017-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
WO2014153254A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International Inc. Compositions and methods to control insect pests
CN105473605A (zh) 2013-03-15 2016-04-06 先锋国际良种公司 Phi-4多肽及其使用方法
CN106232820A (zh) 2013-08-16 2016-12-14 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
ES2937045T3 (es) 2013-09-13 2023-03-23 Pioneer Hi Bred Int Proteínas insecticidas y métodos para su uso
US10480007B2 (en) 2014-02-07 2019-11-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants
RU2021113662A (ru) 2014-02-07 2021-05-31 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
CN105246327B (zh) * 2014-02-18 2017-11-10 日本写真印刷株式会社 害虫防除片
WO2015148976A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Monsanto Technology Llc Pesticidal toxin proteins active against coleopteran insects
US10028510B2 (en) * 2014-08-28 2018-07-24 Dow Agrosciences Llc DIG-17 insecticidal cry toxins
WO2016044092A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods to control insect pests
UA126192C2 (uk) 2014-10-16 2022-08-31 Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. Інсектицидний білок та спосіб його застосування
UA119885C2 (uk) 2014-10-27 2019-08-27 Ньюліф Сімбіотікс, Інк. Способи та композиції для контролю кукурудзяного жука
US20170359965A1 (en) 2014-12-19 2017-12-21 E I Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
CA2985198A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA2986265A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CA2994676A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant derived insecticidal proteins and methods for their use
DK3341483T3 (da) 2015-08-28 2020-03-16 Pioneer Hi Bred Int Ochrobactrum-medieret transformation af planter
CA3021391A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
EP3960863A1 (en) 2016-05-04 2022-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US20190185867A1 (en) 2016-06-16 2019-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP3475430B1 (en) 2016-06-24 2022-06-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CN116003539A (zh) 2016-11-01 2023-04-25 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
EP3555118B1 (en) 2016-12-14 2021-08-18 Pioneer Hi-Bred International Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US11213028B2 (en) 2016-12-22 2022-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2018140214A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nematicidal protein from pseudomonas
WO2018148001A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Pioneer Hi-Bred International Inc Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
MX2019013321A (es) 2017-05-11 2020-02-10 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
US20210002657A1 (en) 2018-03-02 2021-01-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant health assay
WO2019178042A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
EP3764796A4 (en) 2018-03-14 2021-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. INSECTICIDAL PROTEINS FROM PLANTS AND METHOD OF USING THEM
CA3096516A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
CA3106444A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for conferring pesticidal activity to plants
TW202142114A (zh) 2020-02-04 2021-11-16 美商陶氏農業科學公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN116096903A (zh) 2020-08-10 2023-05-09 先锋国际良种公司 植物调节元件及其使用方法
TW202345696A (zh) 2022-05-18 2023-12-01 美商科迪華農業科技有限責任公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5554534A (en) * 1991-12-16 1996-09-10 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests
US5185148A (en) 1991-12-16 1993-02-09 Mycogen Corporation Process for controlling scarab pests with Bacillus thuringiensis isolates
US5837458A (en) * 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5659123A (en) 1994-08-26 1997-08-19 Plant Genetic Systems, N.V. Diabrotica toxins
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
EP1531664A4 (en) * 2002-06-26 2005-11-16 Du Pont GENES ENCODING PROTEINS WITH PESTICIDAL ACTIVITY
US7462760B2 (en) * 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
CA2804953C (en) * 2003-12-23 2016-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant activation of insect toxin
EP1893638B1 (en) * 2005-06-08 2011-08-10 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Insect-specific protease recognition sequences

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002228705A1 (en) 2002-05-06
CA2426793A1 (en) 2002-05-02
ATE338820T1 (de) 2006-09-15
WO2002034774A2 (en) 2002-05-02
DE60122931T2 (de) 2007-06-21
US7696412B2 (en) 2010-04-13
US20020151709A1 (en) 2002-10-17
MXPA03003666A (es) 2005-01-25
CA2426793C (en) 2012-03-20
ES2271098T3 (es) 2007-04-16
HUP0302523A2 (hu) 2003-10-28
US7605304B2 (en) 2009-10-20
US8188036B2 (en) 2012-05-29
US20030177528A1 (en) 2003-09-18
WO2002034774A3 (en) 2003-08-14
US20090291896A1 (en) 2009-11-26
HUP0302523A3 (en) 2005-11-28
DE60122931D1 (de) 2006-10-19
EP1356054A2 (en) 2003-10-29
BR0114891A (pt) 2005-06-28
EP1356054B1 (en) 2006-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228699B1 (hu) Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének
RU2725953C2 (ru) Подавление экспрессии генов у насекомых-вредителей
CN101686705B (zh) 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白
US7230167B2 (en) Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
KR101841295B1 (ko) 곤충 내성 관리를 위한 ＣＲＹ１Ｃａ 및 ＣＲＹ１Ｆａ 단백질의 조합 용도
UA125168C2 (uk) ВАРІАНТНИЙ ПОЛІПЕПТИД Cry1B
EA020327B1 (ru) Гены токсинов и способы их применения
UA125683C2 (uk) Інсектицидний білок, який є токсичним для лускокрилого шкідника, та спосіб контролю шкідників рослин
UA126058C2 (uk) Інсектицидний ген і спосіб його застосування
TW200900008A (en) Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
TW201619181A (zh) 賦予對鞘翅目及半翅目害蟲之抗性的ＣＯＰＩ外被體γ次單元核酸分子
CN105705007A (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN108192901A (zh) 人造叶绿体转运肽
BRPI0611681A2 (pt) moléculas de ácido nucléico isolada, métodos para proteger uma planta de uma praga de inseto, plantas transformadas, protoxina para inseto isolada, composição, método para impactar uma praga de inseto, polipeptìdeo isolado apresentando atividade proteolìtica
EP1848265A2 (en) Plant defense signal peptides
EA032560B1 (ru) Инсектицидные полипептиды с широким спектром активности и их применения
CN101133079A (zh) 来自苏云金芽孢杆菌的分泌的杀虫蛋白质和基因组合物及其用途
UA124757C2 (uk) Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування
US9879056B2 (en) Insecticidal protein
UA125684C2 (uk) Молекула нуклеїнової кислоти для експресії інсектицидного білка cry, композиція та спосіб контролю шкідників рослин
MX2014009282A (es) Proteinas pesticidas modificadas.
BR112020005321A2 (pt) isolados bacterianos biologicamente puros, lisados, caldos de células inteiras, método de obtenção de um isolado bacteriano modificado biologicamente puro, polipeptídeos isolados, construto de ácido nucleico, células vegetais transformadas com um construto de ácido nucleico, planta, composições de matéria, recipiente adaptado para um sistema de irrigação, kits, semente revestida, e, métodos para aumentar uma resistência de uma planta a um inseto e para inibir um inseto em uma planta.
UA124050C2 (uk) Химерний ген, який кодує білок, токсичний для кукурудзяного метелика, та спосіб його застосування
US5446127A (en) Antipathogenic peptides and compositions containing the same
AU655277B2 (en) Novel antipathogenic peptides and compositions containing same

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees