KR100990317B1

KR100990317B1 - 고추의 병저항성 및 세포 사멸 관련 엡시스산 반응 유전자 씨에이에이비알１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR100990317B1
Application number: KR1020080097669A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 최두석
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2010-10-26
Also published as: KR20100038627A

Abstract

본 발명은 식물병 저항성 및 세포사멸 관련 신규 엡시스산 반응 유전자인 CaABR1(Capsicum annuum Abscisic acid-responsive protein 1, 서열번호 1) 및 상기 유전자를 이용한 식물체 저항성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 식물체의 병저항성 탐색방법도 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 식물체 병원균의 방어반응의 표지 및 병저항성 식물체의 분자육종을 위한 유전재료를 제공할 수 있고, 식물병 저항성 등의 탐색을 촉진할 수 있다.

고추, 식물병, 저항성, 세균성 점무늬병, 세포사멸, 엡시스산, CaABR1

Description

고추의 병저항성 및 세포 사멸 관련 엡시스산 반응 유전자 씨에이에이비알１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Pepper disease resistance- and cell death-related, abscisic acid-responsive gene CaABR1 and transgenic plants using the same}

본 발명은 고추 (Capsicum annuum L.) 식물로부터 분리된 식물병 저항성 및 세포 사멸 관련 엡시스산 반응 유전자 CaABR1 (Capsicum annuum Abscisic acid-responsive protein 1) 및 이를 이용한 식물에서의 병저항성 탐색방법과 병 저항성 형질전환 식물체 제작에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 병원균 감염 후 고추 녹광 품종으로부터 분리된 식물병 저항성 및 세포 사멸 관련 신규 유전자인 CaABR1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용하여 병원균 감염 및 엡시스산 처리 시 해당 유전자의 차별적 발현 여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 CaABR1 유전자를 이용한 재조합 벡터(pBIN35S:CaABR1)와 아그로박테리움 매개 일시적 발현 방법(Agrobacterium-mediated transient expression)을 통하여, 고추 식물에서 이 유전자를 일시적으로 과발현시키는 방법, 바이러스 유도 유전자 사일런싱(VIGS, virus-induced gene silencing) 방법을 통해 이 유전자를 무발현 시키는 방법, 그리고 애기장 대(Arabidopsis thaliana) 식물에 이 유전자를 도입, 과발현(overexpression)하여 CaABR1 유전자의 식물체 병저항성 활성화기능을 확인하여, 이를 통한 형질전환 식물체를 제공하는 것에 관한 것이다.

고추는 우리나라에서도 가장 많이 이용되는 채소 중 하나이다. 그러나 친환경적 고추 재배에 있어서 고추병 발생으로 인한 고추 생산량의 감소 및 품질손상으로 안정적 고추 수급에 문제가 제기되고 있다. 고추병 발생을 억제하기 위해 실제 고추재배에서 화학농약 사용이 일반화되고 있지만, 농약의 인체 잔류 문제, 환경 독성, 오염문제 등이 발생하고 있어 현재와 미래 고추 생산은 화학 농약 사용을 자제하고 친환경적으로 고추병 방제를 수행하는 방향으로 고추재배기술이 발전하고 있다.

현재 가장 바람직한 고추병 방제방법은 병저항성 품종을 육종하고 재배하는 것이다. 이러한 병저항성 고추 품종을 육성하기 위해서는 유용한 고추 병저항성관련 유전자를 찾아 분자육종학적으로 고추품종을 육종하는 것이 효율적이라 할 것이다.

한편 식물은 병원균 침입을 방어(저항)하기 위하여 외부적으로는 세포벽을 강화하고 내부적으로는 칼루스(callus)를 형성하거나 스스로 사멸하여 더 이상의 증식을 억제하는 등의 물리적 장벽을 가지는 것으로 알려져 있다.

또한 식물체내 호르몬의 변화가 일어나고 이 호르몬 변화에 따라 다양한 반응이 나타나게 된다. 식물 호르몬의 일종인 엡시스산(abscisic acid)이 내부적으로 증가하거나 외부적으로 처리해주면 병원균과 식물의 종류에 따라 저항성 반응을 일으킨다는 보고가 있다. 식물체내에서는 이 호르몬에 의하여 유도되는 수많은 유전자들이 있으며 이들은 각각 다른 기관에서 발육에 따라 다른 발현을 보이고 있고 또한 생물적, 무생물적 환경 스트레스에 대하여서도 특이적으로 유도되는 것으로 알려져 있다.

고추 식물에서 아직 그 기능이 알려지지 않은 엡시스산 반응 유전자의 기능을 규명하면 이를 통해 앞으로의 고추 식물체의 식물병에 대한 방어기작을 연구할 수 있어 이들 유전자는 고추병 저항성 품종의 분자적 육종에 유용한 유전육종자원으로 이용될 수 있을 것이다.

본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 그 목적은, 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 및 세포 사멸에 관련된 유전자의 하나인 엡시스산 반응 단백질 유전자 1(Abscisic acid-responsive protein gene 1, CaABR 1)을 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 CaABR1 유전자를 이용하여 식물병에 대한 저항성 존재 여부와 식물 호르몬의 변화여부를 탐색하는 저항성 탐색방법을 제공하고자 하는 것이다. 더 나아가, 이 유전자를 식물체에 도입하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 상기 목적은, 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종한 후, 접종되어진 고추 잎으로부터 분리한 신규 저항성 및 세포 사멸 관련 엡시스산 반응유전자 CaABR1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, 이를 이용하여 병원균 접종과 엡시스산 처리를 통하여 CaABR1의 발현 여부를 조사하고, 고추식물과 이 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 CaABR1 유전자의 식물병 저항성 유도 기능을 확인하여 달성하였다.

따라서 본 발명은 고추 녹광 품종(Capsicum annuum L. cv. Nockwang)에서 유래된 식물체 병저항성 및 세포 사멸 관련 엡시스산 반응과 관련된 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자 CaABR1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 엡시스산 반응 단백질(CaABR1)을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 제조한 재조합 벡터 및 형질전환 식물체를 제공한다.

나아가 본 발명은 병원균 또는 엡시스산을 접종 또는 처리한 식물체로부터 RNA 분리하여 노던블럿 분석으로 CaABR1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병저항성 또는 식물호르몬 변화여부를 탐색하는 방법을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광고추 품종으로부터 단백질을 추출하여 이차원 겔 전기영동을 수행하여 차별적으로 발현하는 단백질을 동정하고 동정된 부분 서열 정도를 이용하여 접종된 잎에서 mRNA를 분리하여 제작한 cDNA 라이브러리로부터 완전한 유전자 서열을 결정한 뒤 CaABR1으로 명명된 고추 녹광 품종의 엡시스산 반응 단백질 코딩 유전자 염기서열(서열번호 1) 및 그에 따른 아미노산 서열(서열번호 2)을 제공한다(도 1 참조).

본 발명에 의한 CaABR1 단백질은 아미노산 서열의 분석결과 여러 진핵생물에서 나타나는 하나의 GRAM 도메인(domain)을 가지는 것으로 나타났으며, 포도나무(Vitis vinifera)의 unnamed protein product 유전자(Accession no. CAO41288)와는 뉴클레오타이드(nucleotide) 수준에서 74%, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 GRAM 도메인-함유 단백질(GRAM domain-containing protein) 유전자(Accession no. NP_196824)와는 63%의 상동성을 나타냄으로써 신규임을 알 수 있었다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, nucleotide blast program). 확인된 CaABR1의 유전자 염기서열과 이 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

다음에, 본 발명은 고추식물의 여러 기관 및 병원균과 호르몬적 유도방법을 적용하고, RNA 노던 겔 블롯을 수행함으로써 CaABR1 단백질 발현 여부를 확인하는 것으로 이루어지는, 식물체의 저항성 탐색방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명은, 병원균 또는 엡시스산을 접종 또는 처리한 고추 개체에서 선정된 기관에 대해 상기 CaABR1 단백질 유전자를 프로브로 이용하여 CaABR1 단백질 발현 여부를 확인하는 것으로 이루어지는, 식물체의 저항성 탐색방법을 제공한다. 본 발명에 의한 CaABR1 유전자가 식물병원균 또는 엡시스산에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaABR1 유전자는 식물체의 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 CaABR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 고추식물과 형질전환 애기장대 식물의 식물병 저항성 생성여부 및 세포 사멸을 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체의 제작방법 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명은 CaABR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pBIN35S::CaABR1)(도 5)와 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여, 고추 식물에서의 일시적 발현(transient expression) 방법, CaABR1 유전자의 발현을 억제하는 VIGS 식물체 제작과 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물에서의 형질전환 발현(transgenic expression)을 통한 CaABR1 유전자의 식물체 병저항성 활성화기능을 확인하여(도 6a 내지 도 15 참조), 이를 통한 형질전환 식물체를 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명이 완성됨으로써, 고추 식물 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)에 대한 방어반응에 관여하는 것으로서 식물병 저항성 관련 유전자의 하나인, 엡시스산 반응 단백질을 코딩하는 CaABR1 유전자를 분리하여 해독함으로써 그 서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공함과 동시에, 이 유전자를 이용하여 식물병 저항성 및 식물 호르몬 반응의 탐색방법을 제공할 뿐 아니라 저항성 식물 육종 및 형질전환 식물체 제작에 기여하는 효과를 도모할 수 있게 되었다.

아울러 본 발명에 의한 CaABR1 유전자를 고추 및 애기장대에 과발현시켜 식 물병 저항성을 확인하고 역으로 CaABR1 유전자 사일런싱을 통한 저항성 감소를 확인하는 것으로 식물병 저항성 탐색방법을 제공하고 본 발명에 의한 CaABR1은 병 저항성 식물체의 육종을 위한 재료로서 제공되어 질 수 있다.

이러한 본 발명으로 병에 대한 반응 및 이와 관련된 병생성 관련 단백질(PR protein)의 유전자 정보를 축적이 가능해져서 식물의 병에 대한 신호전달에 대한 흥미로운 모형을 제공해 줄 수 있으며, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써, 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전 기작을 촉진하도록 작동하는 식물보호 화학물질을 개발하는 데에 실용적으로 이용될 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 저항성 품종 개발을 촉진할 수 있는 효과가 있으므로 식물육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. CaABR1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 결정

고추 세균성 점무늬병에 대한 병저항성 관련 단백질 중 하나인 엡시스산 반응 단백질 (CaABR1 : C apsicum a nnuum Ab scisic acid- r esponsive protein 1) 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균 비병원성 균주(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Bv5-4a)를 접종하고 18시간 동안 습실 처리한 후 습실에서 꺼내어 저항성 병반인 과민성 세포사멸반응이 나타난 식물체와 병균을 접종하지 않은 건전한 식물체에서 잎을 수거하였다.

각각 수거한 잎으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 또한 수거한 잎으로부터 단백질을 추출하여 이를 이차원 겔 전기영동을 수행하였다.

이차원 겔 전기영동을 수행한 결과 비병원성 균주가 접종된 식물체의 단백질 젤에서만 특이적으로 증가된 단백질을 병저항성에 관련된 단백질로 추정하고 이 단백질을 젤에서 분리하여 LC-MS/MS (liquid chromatography/tandem mass spectrometry)를 이용하여 동정을 수행하였다.

이렇게 동정된 단백질의 알려진 mRNA 서열정보(Accession no. CA524559)를 이용하여 cDNA 라이브러리에서 완전한 유전자를 클로닝하여 해독(Sequencing)한 후에 블라스트(BLST) 프로그램을 이용하여 그 전체 서열을 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교하여 CaABR1 단백질 코딩 유전자를 확인하고 엡시스산 반응 유전자 1 (CaABR1)으로 명명하였다.

본 발명에 의한 CaABR1 단백질은 아미노산 서열의 분석결과 여러 진핵생물에서 나타나는 하나의 GRAM 도메인(domain)을 가지는 것으로 나타났으며, 포도나 무(Vitis vinifera)의 unnamed protein product 유전자(Accession no. CAO41288)와는 뉴클레오타이드(nucleotide) 수준에서 74%, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 GRAM 도메인-함유 단백질(GRAM domain-containing protein) 유전자(Accession no. NP_196824)와는 63%의 상동성을 나타냄으로써 신규임을 알 수 있었다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, nucleotide blast program). 확인된 CaABR1의 유전자 염기서열과 이 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 여러 고추 기관에서의 고추 CaABR1 유전자의 발현 탐색

상기 실시예 1에서 수득한 CaABR1 유전자의 고추 기관에서의 발현 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 시험을 수행하였다.

고추의 각 기관인 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 푸른 열매, 붉은 열매 등에서 RNA를 분리하고, 분리한 RNA를 포름알데히드가 첨가된 겔 상에서 전기영동한 후 나이론막(Hybond N+)으로 전이시켰다.

실시예 1에서 수득된 CaABR1 유전자를 ³²P-dCTP를 이용하여 표지한 후 이를 반응액 [0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염]에서 65℃ 온도로 18시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 실시하였다.

이렇게 ³²P가 표지된 상기의 DNA 탐침자는 나이론막의 mRNA에 붙게 되며 이 막위에 X-ray 필름을 놓으면 ³²P가 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시켜 이 유전자 의 발현 여부를 알아볼 수 있게 하였다.

상기 RNA 노던 겔 블롯 수행시 리보솜 RNA양이 동일하게 로딩되었는가를 확인하는 것이 도 2에 나타나 있으며, 실험결과 CaABR1 유전자는 줄기, 푸른 열매, 붉은 열매에서 발현하고 있는 것이 관찰되었다.

실시예 3. 식물 호르몬 엡시스산 처리에 의한 CaABR1 유전자의 발현 확인

본 발명의 CaABR1 유전자가 상동성을 가지는 다른 유전자들처럼 엡시스산에 반응하여 발현하는지 알아보기 위해 하기와 같은 시험을 수행하였다.

100 uM 농도의 엡시스산을 6엽기의 고추 식물 잎에 분무기를 이용하여 처리하고, 처리 후 6, 12, 18, 24 시간 후에 잎을 수거하여 RNA를 추출하고 이 RNA를 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 RNA 겔 블롯을 수행하였다.

실험 결과 CaABR1 유전자는 도 3에 나타난 바와 같이 6시간 이후에 발현이 시작되어 12시간에 강하게 유지되고 그 이후로 감소하는 것을 볼 수 있었다.

실시예 4. 병원균 접종에 의한 고추 식물에서의 CaABR1 유전자의 발현 탐색 방법

상기 실시예 1에서 수득한 CaABR1 유전자의 저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위하여 다음과 같이 시험하였다.

먼저 저항성 탐색방법을 구체적으로 제시하기 위하여 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu / ㎖의 농도로 6엽기의 고추 녹광 품종 3, 4엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 접종(infiltration)하고, 28℃ 온도와 100% 상대습도 조건에서 18시간 동안 습실처리 하였다. 접종 후 1, 5, 10, 15, 20, 25 시간 후에 각각 접종한 3, 4엽을 채취하여 RNA를 분리하고, 실시예 2와 같이 RNA 겔 블롯을 수행하였다.

상기 RNA 겔 블롯 수행시 리보솜 RNA양이 동일하게 로딩이 되었는지 확인한 것이 도 4에 나타나 있으며, 실험결과 CaABR1 유전자는 비병원성 균주에 접종되었을 때 발현이 나타나면서 접종 후 20시간 까지 저항성 반응이 일어나는 동안에 그 발현이 강하게 증가하다 감소하는 것을 보였다.

실시예 5. CaABR1 유전자의 일시적 과발현에 의한 고추 식물의 변화

고추 식물에서 CaABR1 유전자가 과발현되었을 때 어떠한 변화가 일어나는지를 알아보기 위해 실시예 1에서 수득한 CaABR1 유전자를 Stratagene에서 제공하는 pBIN35S 벡터에 도입시켜 35S:CaABR1을 제조하였다(도 5).

이렇게 제조된 재조합벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefacien strain GV3101)에 전기천공법(electroporation)을 통하여 도입하고 이것을 고추 잎에 접종하여 CaABR1 유전자를 과발현시켰다.

CaABR1 일시적 과발현(transient expression) 실험에 대조구로 유전자가 도입되지 않은 대조구 벡터 (35S:00)를 이용하였다. 이 두 벡터를 포함하는 GV3101 균주를 Yeast-Peptone (YEP : yeast extract 10 g, peptone 10 g, sodium chloride 5 g / L) 배지에서 진탕배양한 뒤 분광 광도계(spectrophtometer)를 이용하여 균현탁액 농도를 흡광도(optical density) 600(OD₆₀₀)에서 0.5, 0.2, 0.1, 0.05로 맞추고 이를 고추 잎의 엽맥을 경계로 각각 접종하고 그 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.

그 결과 접종 후 36시간에 CaABR1 유전자가 과발현하는 부위에서는 세포 사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었으며 (도 6a의 첫 번째 사진), 세포 사멸을 뚜렷하게 관찰하기 위하여 트리판 블루 염색(trypan blue staining)을 실시한 결과 세포 사멸이 일어난 부위가 파랗게 염색되어 있는 것을 관찰할 수 있었다 (도 6a의 세 번째 사진). 또한 이 유전자의 과발현으로 인한 활성산소의 변화를 알아보기 위해 댑(DAB, 3,3'-Diaminobenzidine) 염색을 실시하였다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 접종으로 인하여 실험구와 대조구 모두에서 활성산소의 축적이 일어나지만 CaABR1의 과발현으로 인한 증가는 뚜렷히 나타나지는 않았다 (도 6a의 가운데 사진).

세포 사멸을 구체적으로 수치화하기 위하여 이온 측정기를 이용하여 전도도 (conductivity)를 측정하였다. 각각의 실험구과 대조구가 접종된 잎에서 OD₆₀₀=0.2의 농도로 접종된 부위를 원 모양으로 잘라내서 증류수에 한 번 씻어낸 후 다시 새 증류수에 담근 후 30분 후에 전도도를 측정하였다. 그 결과 CaABR1 유전자가 과발현되어 세포 사멸이 많이 일어나는 잎에서 이온 누출이 많아 전도도가 대조구보다 높은 것을 관찰할 수 있었다 (도 6b).

CaABR1이 과발현된 고추 잎에서 병 저항성 관련 유전자의 발현을 관찰하기 위해 접종된 잎 부위를 수거하여 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR(Real time RT-PCR)을 수행하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, CaABR1이 과발현하는 부위에서 병저항성 관련 유전자로 보고된 CaBPR1 (Capsicum annuum basic pathogenesis-related protein 1)과 CaDEF1 (Capsicum annuum defensin 1) 등의 발현이 증가된 것을 관찰할 수 있었다.

CaABR1이 과발현된 고추 잎에서 방어기작으로 알려진 칼루스 형성이 증가하였는지를 알아보기 위하여 상기 CaABR1 유전자가 과발현된 잎 부위를 아닐린 블루(aniline blue)로 염색을 실시하였다. 도 8에 나타난 바와 같이 CaABR1이 과발현하는 부위에서 GV3101 접종 농도에 따라 칼루스도 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 6. 바이러스를 이용한 CaABR1 유전자의 사일런싱(silencing)과 그에 따른 병저항성 변화

CaABR1 유전자가 고추 식물에서 기능이 상실되었을 때의 병저항성의 변화를 알아보기 위하여 담배얼룩바이러스(Tobacco rattle virus)에서 유래한 TRV1 벡터와 TRV2 벡터를 이용하여 상기 유전자를 사일런싱시키고 하기와 같은 시험을 수행하였다.

먼저 CaABR1 유전자를 TRV2 벡터에 도입하여 TRV:CaABR1 재조합 벡터를 제조 하였다. 보다 구체적으로 실시예 1에서 수득한 CaABR1 유전자를 바이러스-유도 유전자 사일런싱(virus-induced gene silencing, VIGS)에서 이용되어지는 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaABR1 유전자를 TRV2 벡터(참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113)에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2::CaABR1을 제조하였다.

이렇게 제조된 TRV:CaABR1 재조합 벡터를 실시예 5와 같이 GV3101 균주에 형질전환시켰다. 대조구로 이용하기 위해 이 유전자가 도입되지 않은 벡터(TRV:00)를 GV3101 균주에 형질전환시켰다. 또한 함께 이용할 TRV1 벡터((참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113)로 같이 형질전환시켰다.

이 벡터들을 가진 균주를 실시예 5에서처럼 배양하고 그 농도를 OD₆₀₀에서 0.4로 맞추고 TRV1을 가진 균주와 TRV:CaABR1을 가진 균주를 1:1로 섞어준 뒤 고추의 떡잎이 나왔을 때 주사기를 이용하여 떡잎에 접종하여 CaABR1 유전자가 사일런싱되는 식물체를 제작하였다. 대조구를 위해 TRV1을 가진 균주와 TRV:00를 가진 균주를 마찬가지로 섞어 접종해주었다.

이렇게 제작된 고추가 6엽기에 이르렀을 때 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하여 병저항성 감소여부를 확인하였다. 도 9a 및 도 9b에서 보는 바와 같이 병원성 균주(Ds1)에 접종되었을 때 CaABR1 유전자가 사일런싱된 식물에서 병징이 크게 나타나고 세균의 생장률이 증가하는 것을 관찰할 수가 있었다. 그러나 병균을 접종하기 하루 전에 엡시스산을 처리한 식물에서 엡시스산에 의한 세균 생장률의 변화는 관찰되지 않았다. 또한 비병원성균주(Bv5-4a)로 접종했을 때는 CaABR1 유전자가 사일런싱된 식물에서 병저항성 반응인 세포사멸반응이 지연되면서 세균 생장률도 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 10a와 10b). CaABR1이 사일런싱되지 않은 식물에서 엡시스산은 세균생장을 억제하지만 이 유전자가 사일런싱된 식물에서 엡시스산의 처리는 세균 생장을 증가시켰다(도 10b). CaABR1이 사일런싱된 식물에서 세포사멸이 지연되기 때문에 실시예 5와 같이 전도도를 측정한 결과 이 유전자가 사일런싱된 식물에서 사일런싱되지 않은 식물보다 전도도가 낮아 세포 사멸이 감소되어 이온 누출이 감소되었음을 관찰할 수 있었다 (도 10c).

실시예 7. CaABR1 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조 및 CaABR1 유전자의 과발현에 의한 애기장대 식물의 병저항성 변화

CaABR1 유전자가 과발현되었을 때 병저항성의 증가 여부를 알아보기 위하여 실시예 5에서 이용된 재조합 벡터를 가진 GV3101 균주를 꽃침지(floral dipping) 방법을 통하여 형질전환이 용이한 애기장대 식물체에 고추 CaABR1 유전자를 도입하여 형질전환을 시킨 후 하기와 같은 시험을 수행하였다.

CaABR1 유전자가 과발현된 식물체에서 병 저항성 변화 여부를 알아보기 위하여, 우선 상기 CaABR1 유전자가 과발현된 애기장대와 대조구로서의 야생형 애기장 대 식물체에서 CaABR1 과발현 여부를 관찰하였으며 그 결과를 도 11에 나타내었다. #1, #2, #3은 사용된 형질전환식물체의 계통번호를 나타낸 것이다.

상기와 같이 CaABR1이 과발현된 애기장대 식물에 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 (Pseudomonas siryngae pv. tomato) DC3000 균주를 5 x 10⁴cfu / ml 농도로 주사기를 이용하여 접종하고 28℃에 두고 식물체의 변화를 관찰하였다. 도 12에서 보는 바와 같이 CaABR1이 과발현된 식물체에서 야생형과 비교하여 세균 생장률이 감소하여 저항성을 나타내고 있음이 관찰되었다.

또한 노균병을 일으키는 하이알로 페로노스포라 파라시티카(Hyaloperonospora parasitica) Noco2 균주를 CaABR1 과발현 애기장대 식물과 야생형 대조구 애기장대 식물의 떡잎 시기에 5 x 10⁴spores / ml 농도로 접종한 후 17℃ 온도에서 습실처리한 후 병저항성의 변화를 관찰하였다.

그 결과 도 13에 나타난 바와 같이, CaABR1 유전자가 과발현된 식물에서 야생형 대조구 식물보다 포자낭경(sporangiophore) 형성이 적게 관찰되었다 (도 13). 또한 각각 식물의 떡잎에서 포자경수를 확인해 본 결과 CaABR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물에서 포자낭경수가 적게 형성되었다 (도 14). 나아가 각각의 식물 떡잎을 수거하여 1 ml 살균수에 현탁한 뒤 강하게 풀어내어 분생포자(conidiospore) 수를 확인해 본 결과 분생포자수도 CaABR1 유전자가 과발현된 식물에서 감소하는 것으로 관찰되었다 (도 15).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종(Capsicum annuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 엡시스산 반응 유전자의 염기서열 및 아미노산서열을 나타낸 도면이고,

도 2는 고추 녹광 품종의 각 기관에서 CaABR1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,

도 3은 고추식물에 엡시스산(Abscisic acid)을 처리한 후 시간 경과에 따른 CaABR1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,

도 4는 고추 녹광 품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성 및 비병원성 균주를 접종하였을 때, 접종된 잎과 접종되지 않은 잎에서의 CaABR1 유전자의 발현 결과를 나타낸 도면이고,

도 5는 CaABR1 유전자를 고추 및 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물체에서 과발현(overexpression)하기 위한 재조합벡터(pBIN35S:CaABR1)의 배열지도이고,

도 6a 및 도 6b는 상기의 재조합벡터 pBIN35S:CaABR1을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주에 도입한 후 이를 이용하여 고추 식물에서 CaABR1 유전자를 일시적 과발현(transient expression)하였을 때 나타나는 세포 사멸, 활성 산소 발생 및 세포사멸에 따른 이온 누출 결과를 나타낸 도면이고,

도 7은 고추 식물에서 CaABR1 유전자가 일시적 과발현되었을 때 고추 식물의 병방어 관련 유전자들의 발현을 실시간 PCR(Real-time PCR)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이고 (CaBPR1 : Capsicum annuum basic pathogenesis-related protein 1, CaPR10 : Capsicum annuum pathogenesis-related protein 10, CaDEF1 : Capsicum annuum defensin 1),

도 8은 고추 식물에서 CaABR1 유전자가 일시적 과발현되었을 때 고추 식물에서 일어나는 방어기작으로서의 칼루스 형성을 아닐린블루염색(Aniline blue staining)을 통해 확인한 결과이고,

도 9a 및 도 9b는 TRV 벡터를 이용하여 재조합벡터 TRV:CaABR1를 제작하고 이를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주에 도입한 후 이것을 고추 식물이 떡잎 시기일 때 접종하여 제작한 CaABR1 유전자 사일런싱 식물에 엡시스산을 처리하고 고추 세균성 점무늬병균의 병원성 균주를 접종한 후 병징이 나타난 식물체 사진과 식물체 내에서 병원균 생장을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 10a 내지 도 10c는 도 9a 및 도 9b와 같이 제작한 CaABR1 유전자 사일런싱 식물에 엡시스산을 처리하고 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성 균주를 접종한 후 병징이 나타난 식물체 사진과 그 식물체를 트리판블루염색(Trypan blue staining)한 사진, 그리고 식물체 내에서 병원균 생장을 검정한 결과 그래프 및 이온 누출을 확인한 결과 그래프이고,

도 11은 상기의 재조합벡터 pBIN35S:CaABR1과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 CaABR1 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 CaABR1 유전자의 과발현 여부를 RT-PCR로 확인한 도면이고,

도 12는 상기의 재조합벡터 pBIN35S:CaABR1과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101) 균주를 이용하여 CaABR1 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 식물에서 슈도모나스 시링게 패소바 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000) 접종한 후 병원균 생장률을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 13은 CaABR1 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 노균병균인 하이알로 페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Hyaloperonospora parasitica Noco2)를 접종한 뒤 병저항성이 나타난 결과를 보인 도면이고,

도 14는 CaABR1 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 노균병균인 하이알로 페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Hyaloperonospora parasitica Noco2)를 접종한 뒤 병저항성이 나타날 때 잎에 생성된 포자낭경(sporangiophore)을 검정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 15는 CaABR1 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대 식물에 노균병균인 하이알로 페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Hyaloperonospora parasitica Noco2)를 접종한 뒤 병저항성이 나타날 때 생성된 포자낭경(sporangiophore)으로부터 나온 분생포자(conidiospore)를 검정한 결과를 나타낸 그래프이다.

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Pepper disease resistance- and cell death-related, abscisic acid-responsive gene CaABR1 and transgenic plants using the same <130> P11-080929-01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1172 <212> DNA <213> Capsicum annuum cv. Nockwang <400> 1 cttgaaaata gttttccgca cttaaatcag ttaatcatga caggcacaac agaagaaaat 60 caacccaaag ttcaagaatc agagcctcaa gcaccctcta ttcctacatc ttcttcttct 120 gatgagaaag agaaacaacc agaaatggat caacaaaaat ggggcacaca cataatgggt 180 ccaccagcag ttccaacaag tcatccagat aatcagaaag ctgctgcgtt atggagagct 240 gcagaccaaa aagaagagtt tcacccacag ccttacgttg tttatactcc agttgatcat 300 aggcctacta ataatccact tgaatctgtt gttaatatgt ttaattcttg gagtaatcga 360 gctgagacca tcgcccgcaa catctggcat aatctgagaa ctggaccatc agtgacagaa 420 gcagcgtggg gaaagcttaa tttgacagcc aaggccttaa cagaaggcgg attcgagccg 480 ctttacaagc agattttctc tacggaccct aatgagcagc tgaagaagac atttgcttgt 540 tatctttcaa caactactgg tcctgttgct ggaacactct atttgtcatc tactaaggtt 600 gctttttgca gtgatcgacc tttatccttc aaagctccat caggtcagga ggcttggagc 660 tactacaagg tagcaatacc attgacaaac attgggacta tgaacccaat agtgatgaga 720 gagaatccac cagagaggta cattcagata gttacaatcg atggtcatga cttctggttc 780 atggggtttg tcaattttga gaaagcaaca catcatctcc ttgatgcctt gtctaatttt 840 aaggcccaac ctcctcatgt tggggaagtg ccacaaccag ctagtaacta ggaaaaaatg 900 gctctgtcat aacttattgg gctgcacact gctttacttt ttctattttc tttgtttgtt 960 cctgcattag atatatgtat tctctgtatg tatttttatt gcaacattat ttgtattata 1020 cacactgctt tagtttttat tttctctgtt taggagattg acatatatac tgtctgtatt 1080 tttattgtaa catttttgta ttagactctc gtgtgtattt ttattgtaac attatttata 1140 ttgtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1172 <210> 2 <211> 284 <212> PRT <213> Capsicum annuum cv. Nockwang <400> 2 Met Thr Gly Thr Thr Glu Glu Asn Gln Pro Lys Val Gln Glu Ser Glu 1 5 10 15 Pro Gln Ala Pro Ser Ile Pro Thr Ser Ser Ser Ser Asp Glu Lys Glu 20 25 30 Lys Gln Pro Glu Met Asp Gln Gln Lys Trp Gly Thr His Ile Met Gly 35 40 45 Pro Pro Ala Val Pro Thr Ser His Pro Asp Asn Gln Lys Ala Ala Ala 50 55 60 Leu Trp Arg Ala Ala Asp Gln Lys Glu Glu Phe His Pro Gln Pro Tyr 65 70 75 80 Val Val Tyr Thr Pro Val Asp His Arg Pro Thr Asn Asn Pro Leu Glu 85 90 95 Ser Val Val Asn Met Phe Asn Ser Trp Ser Asn Arg Ala Glu Thr Ile 100 105 110 Ala Arg Asn Ile Trp His Asn Leu Arg Thr Gly Pro Ser Val Thr Glu 115 120 125 Ala Ala Trp Gly Lys Leu Asn Leu Thr Ala Lys Ala Leu Thr Glu Gly 130 135 140 Gly Phe Glu Pro Leu Tyr Lys Gln Ile Phe Ser Thr Asp Pro Asn Glu 145 150 155 160 Gln Leu Lys Lys Thr Phe Ala Cys Tyr Leu Ser Thr Thr Thr Gly Pro 165 170 175 Val Ala Gly Thr Leu Tyr Leu Ser Ser Thr Lys Val Ala Phe Cys Ser 180 185 190 Asp Arg Pro Leu Ser Phe Lys Ala Pro Ser Gly Gln Glu Ala Trp Ser 195 200 205 Tyr Tyr Lys Val Ala Ile Pro Leu Thr Asn Ile Gly Thr Met Asn Pro 210 215 220 Ile Val Met Arg Glu Asn Pro Pro Glu Arg Tyr Ile Gln Ile Val Thr 225 230 235 240 Ile Asp Gly His Asp Phe Trp Phe Met Gly Phe Val Asn Phe Glu Lys 245 250 255 Ala Thr His His Leu Leu Asp Ala Leu Ser Asn Phe Lys Ala Gln Pro 260 265 270 Pro His Val Gly Glu Val Pro Gln Pro Ala Ser Asn 275 280

Claims

고추 녹광 품종(Capsicum annuum L. cv. Nockwang) 유래의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자(CaABR1).
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaABR1).
제1항 기재의 CaABR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제1항 기재의 CaABR1 유전자를 pBIN35S에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 pBIN35S::CaABR1.
제1항 기재의 유전자 또는 제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
제5항에 있어서, 상기 식물체는 고추 또는 애기장대인 식물체.
고추 세균성 점무늬병의 비병원성 세균을 접종한 식물체로부터 RNA 분리하여 노던블럿 분석으로 제1항 기재 CaABR1 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성 탐색방법.
엡시스산 (Abscisic acid)을 처리한 식물체로부터 RNA 분리하여 노던블럿 분석으로 제1항 기재 CaABR1 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 저항성 탐색방법.
제1항 기재의 CaABR1 유전자를 바이러스-유도 유전자 사일런싱(virus-induced gene silencing, VIGS)을 위한 벡터인 TRV2(Tobacco Rattle Virus 2) 벡터에 삽입시켜 제조한 재조합벡터 TRV2:: CaABR1.
제9항 기재의 재조합벡터가 도입되어 제1항 기재 CaABR1 유전자가 사일런싱된 고추.