KR20090049668A - 식물의 환경 스트레스 및 병원균 저항성에 관여하는 고추유전자 ＣａＮＡＣ２ - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 환경 스트레스 및 병원균 저항성에 관여하는 고추 유전자 CaNAC2에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는데 관여하는 고추 유래의 CaNAC2 단백질; 상기 CaNAC2 단백질을 코딩하는 유전자; 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터; CaNAC2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는 방법; 상기의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성이 증가된 식물체에 관한 것이다.

칠리고추, NAC 영역 전사인자, 세포사멸, VIGS, transient expression assay

Description

식물의 환경 스트레스 및 병원균 저항성에 관여하는 고추 유전자 ＣａＮＡＣ２{Pepper CaNAC2 gene involved in environment stress and pathogen resistance of plant}

본 발명은 식물의 환경 스트레스 및 병원균 저항성에 관여하는 고추 유전자 CaNAC2에 관한 것이다.

감자, 담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오래전부터 양념(고추가루) 또는 채소작물로 재배되어온 대표적인 작물로서, 그에 대한 대표적인 병으로는 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 고루 다양하게 보고되어 있는데, 그중 우리나라에서 가장 치명적인 것으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병 및 세균에 의한 세균성 점무늬병 등을 들 수 있다.

고추재배에 있어서 이러한 식물 병들을 방제하기 위해 지금까지는 살균제를 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어 왔는데, 그 독성으로 인하여 병원균뿐만 아니라 주변 생태계와 생물에게까지도 영향을 끼쳐, 생태계를 파괴시키고 토양과 수질을 오염시키는 폐해가 있어 왔다.

따라서, 앞으로는, 식물이 처해 있는 환경 및 생태조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용함으로써 농약의 사용을 가능한 줄이는 방법을 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있으며, 더 바람직하게는 병에 대해 저항성을 가지고 있는 저항성 품종의 개량 및 육종 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 좋다고 할 수 있다.

일단 식물이 병원균에 의해 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적반응 (병이 일어남)과 불친화적반응(병이 나지 않음)으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.

불친화적반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 켈러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽이 후벽화 등의 반응을 나타내며, 파이토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병원성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불려지는 방어 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다.

식물에서 전사조절인자는 특정한 상황에 식물이 처하게 되면 그 발현이 증가하여, 단백질이 생성되고, 타겟이 되는 유전자들의 프로모터에 결합하여, 다양한 유전자들의 발현을 유도함으로써, 그 상황에 대한 조절을 가능케 한다. 이러한 전사조절인자는 한 개의 유전자가 여러 개의 다양한 유전자들을 조절할 수 있으므로 본 발명에서와 같이 병이나 환경스트레스에 대한 내성을 주기 위한 방법으로 아주 효과적일 수 있다. 따라서 본 발명에서는 고추에서 전사조절인자군을 찾아내고, 그 중에서 발현이 병저항성 상황에서 증가하는 유전자들을 찾아서 기능을 분석하였다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로써, 본 발명은 CaNAC2의 발현을 VIGS(Virus induced gene silencing)를 이용하여 억제시킬 경우, 박테리아 병원균의 세포 수를 증가시키고 감염부위의 병징을 확대시키는 것을 확인하였다. 이뿐 아니라 고추에서 Phytophthora capsici, oomycete (고추역병원균) 병원균에 대해서도 병이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한 환경스트레스 반응의 하나인 염에 대해서도 침묵된 식물이 더 민감한 반응을 보였다. 반면에, CaNAC2 유전자를 transiently over-expression시키게 되면 HR 세포사멸 반응이 나타나게 된다. 이러한 결과들을 통하여 CaNAC2는 식물의 저항성 반응에 중요한 HR 반응을 나타내고, 다양한 병원균(세균, oomycete 병원균, 바이러스)에 대해서 저항성을 부여하는 유전자임을 확인함으로써 본 발명에서는 CaNAC2유전자의 발현을 조절하여 병 저항성 식물체를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는데 관여하는 고추 유래의 CaNAC2 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 CaNAC2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, CaNAC2 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성이 증가된 식물체를 제공한다.

따라서, 본 발명은 CaNAC2 유전자의 발현을 조절하여 식물의 병 저항성 품종의 개량 및 육종의 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는데 관여하는 고추 유래의 CaNAC2 단백질을 제공한다.

고추 (Capsicum annuum)로부터 분리한 CaNAC2은 NAC DNA binding domain을 갖는 여러 가지 유전자들과 서열의 유사성을 보인다. 특히 고추의 CaNAC2 유전자와 가장 높은 염기서열 유사성을 갖는 유전자로는 페튜니아에서 분리된 NAM(No Apical Meristem) like protein1 (CaNaC2유전자와 아미노산 염기서열에 있어서 76% 동일성과 83%의 유사성을 보임) 과 애기장대에서 분리된 TIP, TCV 외피단백질 Interacting Protein, (CanNAC2와 아미노산 서열에 있어 46%의 동일성과 60%의 유사성을 보임) 유전자가 있다. CaNAC2 단백질은 두 개의 핵 위치 신호 (만들어진 단백질이 핵으로 이동할 수 있는 신호 (nuclear localization signal) 와, 두 개의 PEST (단백질 절단 효소에 의해 잘려지는 부위로써 proline, glutamic acid, serine, threonine 과 같은 4개의 아미노산이 많이 존재하는 부분)영역과 C-말단 부위에 막투과 영역(trans-membrane domain)이 있는 것으로 분석되었다. 고추 식물체에서 비기주 병원균(non-host pathogen)의 감염에 의한 저항성반응과, 병원균이 비병원성 단백질 (avirulent protein)을 가질 때 보여지는 기주저항성 반응이 일어나는 동안 CaNAC2 발현은 상당히 많은 양이 유도되었다. 살리실산(salicylic acid), 에테폰(ethephone), NaCl 및 만니톨(mannitol)을 처리한 경우 CaNAC2 전사체의 발현은 증가하였다. 게다가, CaNAC2::smGFP 융합 단백질을 이용하여 CaNAC2의 세포내 위치를 조사한 결과 담배의 원형질체의 원형질막에 존재하는 것으로 확인되 었다.

본 발명에 따른 CaNAC2 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는데 관여하는 활성을 의미한다.

본 발명은 상기의 CaNAC2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 유전자는 CaNAC2 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CaNAC2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 벡터는 도 6에 기재된 pMBP1::CaNAC2 벡터이다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용 어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효 율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 CaNAC2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 병원균은 세균, oomycete 병원균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 병원균은 세균성 점무늬병균 또는 고추역병원균 (Phytophthora capsici, oomycete)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 살리실산, 에테폰(ethephon), 염, 만니톨, 냉해 및 메틸 비올로겐(methyl viologen)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성이 증가된 식물체를 제공한다.

고추에서 CaNAC2의 유전자가 병원균에 대한 저항성 반응에 관여하는 지 여부를 분석하기 위해, VIGS (virus-induced gene silencing)를 수행하였다. 바이러스-유도 유전자 비활성화법(virus-induced gene silencing; VIGS)은, 바이러스를 이용 한 gene knockdown 기법의 하나로, 바이러스를 이용하여 연구하고자하는 특정유전자의 염기서열을 바이러스 제놈상에 포함시켜 재조합 바이러스를 만들고 이를 식물체에 감염시켜 식물이 이 바이러스에 저항하기위해 유도하는 siRNA 저항성 기작에 의해서 바이러스 제놈상에 포함시킨 식물체내 특정유전자의 발현을 감소시키는 방법이다. 아직까지 형질전환식물을 만들 수 없는 고추와 같은 식물에서, 유전자들의 기능을 규명하는 데 있어 매우 유용한 방법이다. CaNAC2 유전자의 발현을 감소시킨 고추 식물체에서 효과적으로 CaNAC2의 발현이 감소되었는지 RT-PCR을 통해 확인 하였으며, CaNAC2 감소 고추 식물체에서 박테리아 병원균, 역병원균(oomycete pathogens) 및 높은 농도의 염을 처리했을때 병원균 뿐만아니라 염에 대한 저항성도 감소되었음을 확인하였다. 한편, N. benthamiana 잎에서 CaNAC2 유전자를 VIGS와 반대로 아그로박테리움을 이용하여 과발현 시켰을 때 식물의 병저항성반응에 의해 나타나는 HR(hypersensitive response)과 유사한 세포사멸반응이 일어남을 확인 하였다. 이러한 HR반응은 병원균의 성장과 확산을 막아 건전한 조직을 보호하며, 식물이 병원균의 침입을 빨리 감지하도록 하여 아직 병원체가 감염되지 않은 식물의 다른 부위의 방어기작을 작동하도록 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 고추 또는 담배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1. CaNAC2 유전자의 발현 분석>

CaNAC2 유전자의 식물의 병저항성에서 발현을 확인해 보기 위해, ECW30 고추에 두 가지의 고추의 세균성 점무늬병균 (race1을 접종한 고추에서는 저항성 반응을 보이고, race3를 접종하면 병이 발생한다.)을 접종한 후 CaNAC2 유전자의 발현양을 5'-GTGATACAACACATGAAGAATACG-3'(서열번호3)와 5'-CAACCTCTAATGTCTCAACTCAGG-3'(서열번호4)으로 RT-PCR 분석을 수행하였다.

저항성을 보이는 쪽과 병이 나는 곳 모두에서 발현이 초기에 증가했지만, 저항성 반응에서는 3시간부터 72시간이 지난 후까지 지속적인 발현을 보였고, 병이 나는 상황에서는 이보다 늦게 발현이 약하게 증가하였다. 따라서 병저항성 발현에서 CaNAC2 발현이 강하게 나타남을 알 수 있다. 양성대조구(positive control)로 사용한 고추의 CaPR-1 유전자의 발현은 저항성 상황 시에만 48시간에서 72시간까지 발현되는 것을 5′-ACTTGCAATTATGATCCACC-3′(서열번호5)와 5′-ACTCCAGTTACTGCACCATT-3′(서열번호6)을 이용한 RT-PCR로 확인하였다. CaActin의 발현은 5′-AGTGATCATTCTTTGCTTTATTCTTAC-3′(서열번호7)와 5′-AACATTCATTCCCATGCTATC-3′(서열번호8)으로 확인하였다(도 1A).

병저항성에 관여하는 것으로 알려진 식물의 호르몬에 대한 발현을 분석하였다. SA, 에테폰을 고추 잎에 처리한 후 CaNAC2 유전자의 발현을 노던블럿(Northern blot) 방법으로 확인하였다. SA에 의해서는 1시간부터 발현이 유도되어 3시간에 발 현이 가장 강하고, 24시간까지 발현이 유지되었다. 에테폰의 경우에는 1시간에 발현이 유도되어 48시간까지 지속적인 발현을 보였다. 호르몬 처리에 대한 양성마커(positive marker)로는 고추의 PR-1유전자가 사용되었고, 각각 24시간에 발현이 유도되어, 48시간에는 강한 발현을 보여서, 호르몬이 제대로 처리가 되었음을 보여주었다. RNA 젤을 EtBr로 염색한 사진이 분석에 사용된 RNA가 동량임을 보여 준다(도 1B).

CaNAC2 유전자의 발현을 여러 가지 다양한 환경스트레스 상황에서 분석하였다. 고추에 각각 400mM의 NaCl과 만니톨 (가뭄피해와 유사한 효과를 보여줌)을 처리한 후 RNA를 분리하고 발현분석을 하였다. 염분처리에 의해서는 3시간에 발현이 유도되어 48시간까지 강한 발현이 유지됨을 알 수 있었고, 만니톨의 경우에는 1시간에 발현이 유도되어서 6시간에 가장 강한 발현을 보이고, 48시간에는 발현이 감소함을 알 수 있었다 Cadehydrin 유전자가 환경스트레스에 대한 양성마커(positive marker)로 사용이 되었고, 강한 발현이 유도되어서 환경스트레스 처리가 잘 이루어진 것으로 생각된다. 또 다른 환경스트레스로 cold처리와 MV(Methyl viologen, ROS(활성산소)를 많이 생성시킴)를 처리하여 분석하였다. Cold의 경우에는 고추를 4℃에 처리한 후 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 3시간에 발현이 증가하여 24시간에 가장 강한 발현을 보였고, MV의 경우에는 1시간에 발현이 유도되고 12시간 후에는 발현이 이루어지지 않았다. Cold에 대한 양성마커(positive marker)로는 Cadehydrin을 사용하여서 2시간에 발현이 증가함을 보았고, MV에 대한 양성마 커(positive marker)는 고추의 아스코빅 퍼록시다제(Ascorbic peroxidase)가 사용되었다. 3시간에 발현이 강하게 유도됨을 알 수 있었고, 각각의 분석에서 RNA 젤을 EtBr 염색을 통해 동량의 RNA가 사용되었음을 확인하였다(도 1C).

<실시예 2. CaNAC2 단백질의 구조 및 담배 원형질체에서 CaNAC2의 위치 분석>

도2는 CaNAC2 유전자 산물인 633개로 이루어진 단백질의 구조 모식도이다.

CaNAC2 단백질은 5' 말단에서부터 핵으로 가는 신호(nuclear localization signal) 2개와 단백질의 절단(cleavage)에 관여하는 PEST 영역이 2개가 있고, 3'말단에 막관통영역(transmembrane domain)을 1개 가지고 있는 구조로 이루어져 있다(도 2A).

CaNAC2 유전자의 3'말단에 Green Fluorescence Protein(GFP)단백질을 결합시켜서 N. benthamiana 담배의 원형질체(protoplast)에 형질전환(transformation) 시킨 후 형광현미경으로 단백질의 세포내 위치를 관찰하였다. 대조구로는 벡터만(empty vector)을 형질전환 시킨 세포를 사용하였다. 로다민(Rhodamin)에서는 식물세포에서 관찰되는 엽록체를 볼 수 있다. CaNAC2::GFP 단백질은 현미경 분석에서 세포막에 위치하고 있음을 알 수 있었다(도 2B).

<실시예 3. CaNAC2의 trans-activation 기능 여부 확인>

실험에 사용한 결손 구조체(deletion constructs)들의 모식도를 나타내었다(도 3A).

효모(Yeast)를 사용하여서, LexA결합(LexA binding) 시스템을 이용해서 CaNAC2유전자가 활성(activation) 기능을 가지고 있는 지를 확인하였다. 음성대조구(negative control)로는 벡터(empty vector)만을 효모(yeast)로 도입한 세포라인(cell line)을 사용하였고, CaNAC2 유전자는 full-length와 N-(1-227), C-(228-633)말단으로 나누어서 실험하였다. 실험의 결과는 배지에 X-gal을 넣고 키워서, X-gal assay를 테스트하였다. 결과는 CaNAC2 N-말단에서만 trans-activation 기능을 가지는 것으로 확인되었다(도 3B).

<실시예 4. 고추에서의 VIGS 후 병에 대한 반응 분석>

고추에서 CaNAC2유전자가 실제로 병저항성 반응에 관여하고 있는 지를 확인하기 위해서 VIGS(Virus Induced Gene Silencing)를 수행하였다. Tobacco Rattle Virus로 만들어진 TRV2 벡터에 CaNAC2의 N-, C-말단의 일부분의 유전자를 클로닝(cloning)하고, Agrobacterium ag2260에 형질전환한 후 TRV1 벡터가 들어있는 Agrobacterium (10 mM MgCl₂, 10 mM MES 버퍼에 섞음)과 같이 1:1로 섞어서 발아한 고추의 떡잎에 감염시켰다(infiltration). 16℃에서 2일 동안 배양한 후 24℃ 배양실에서 키운다. 21일이 지난 후 잎에서 샘플을 채취한 후 RNA 레벨에서 CaNAC2 유전자 산물이 실제로 침묵(Silencing) 되었는지를 RT-PCR을 통해서 확인하였다. CaNAC2 N-말단부분의 프라이머인 5'- AAATGGGCAGCGATTGAACCGAGC-3'(서열번호9)와 5'-GGTGATTTGGCAGCTGAAGCATTC-3'(서열번호10)을 이용하여 PCR을 한 결과 C-말단 부분이 삽입된 벡터로 침묵시킨 식물에서는 CaNAC2의 전사체량이 감소하였음을 알 수 있었고, N-말단의 유전자 일부가 포함된 식물에서는 프라이머에 의해 증폭되어서 벡터에 삽입되어 있는 유전자가 증폭되었음을 알 수 있었다.

병저항성 양성마커(positive marker) 유전자인 고추의 PR-1유전자는

5′-ACTTGCAATTATGATCCACC-3′(서열번호5)와 5′-ACTCCAGTTACTGCACCATT-3′(서열번호6)으로 확인한 결과 침묵된 식물에서 발현이 감소한 것으로 보여, CaNAC2 유전자가 고추에서 저항성 반응에 관여함을 알 수 있었다. CaActin은 5′-AGTGATCATTCTTTGCTTTATTCTTAC-3′(서열번호7)와

5′-AACATTCATTCCCATGCTATC-3′(서열번호8)을 사용하였다(도 4A).

CaNAC2가 침묵된 고추 식물에 병저항성 반응의 하나인 HR(Hypersensitive response 과민감반응) 세포사멸 반응을 일으키는 세균을 접종하여서 HR이 일어나는지 여부를 관찰하였다. 대조구로 사용한 GFP가 침묵된 식물에서는 HR 반응이 유도된 반면에 CaNAC2유전자가 침묵된 식물에서는 HR 반응이 일어나지 않았다. 따라서 CaNAC2가 저항성 반응시 유도되는 HR 반응에 관여하는 유전자임을 알 수 있었다(도 4B).

CaNAC2가 침묵된 고추에 실제로 고추에 병을 일으키는 고추의 세균성점무늬 병원균을 감염시키고, 이 병원균들의 증식을 확인하였다. 병원균을 감염시킨 후 바로, 그리고 2일 후, 5일까지 세균의 증식을 확인하였다. 2일의 경우에는 대조구 식물보다 병원균의 증식이 조금 증가한 것을 확인할 수 있었고, 5일에서는 2-3배의 증식이 증가함을 볼 수 있었다. 따라서 CaNAC2유전자가 고추에서 세균에 대한 저항성에 관여함을 알 수 있었다(도 4C).

CaNAC2가 침묵된 식물에 이번에는 곰팡이 병원균의 일종인 Phytophthora capsici 병원균을 접종하였다. 배지에서 병원균을 키운 후 곰팡이가 자란 배지를 코르크로 떼어내서, 고추의 잎 위에 상처를 내고 올려서 감염시켰다. 3일이 지난 후에 곰팡이에 의해서 병이 난 부분을 Trypan blue (식물의 죽은 세포가 파랗게 염색이 되는 시약) 염색법을 통해서 관찰하였다. 대조구 식물에 비해서 병원균의 증식이 훨씬 더 많이 이루어져 거의 대부분의 잎이 죽은 것을 확인할 수 있었다(도 4D).

고추역병균(Phytophthora capsici)을 접종한 고추 잎을 접종 후 2, 3일에 병이 진전된 길이를 재서 그래프로 나타내었다. 3일째에 보면 2cm 이상 병원균이 더 증식한 것을 확인할 수 있다(도 4E).

<실시예 5. CaNAC2가 침묵된 고추의 염처리 민감성 조사>

CaNAC2가 침묵된 고추에서 염에 대한 반응을 조사하였다. 0.5M의 NaCl 용액 에 CaNAC2 유전자가 침묵된 잎조각 6개를 잘라서 넣고, 5분 동안 진공(vacuum)을 주어서 NaCl 용액이 잎조각(leaf disc)에 잘 흡수되게 한 후, 24℃에서 2일 배양한 후 사진을 찍었다. CaNAC2 유전자가 침묵된 식물이 염에 더 강하게 손상(damage)을 받아서 백화현상(leaf bleach, 잎이 하얗게 되는 현상, 잎을 파랗게 하는 엽록소가 파괴되어 나타남)를 보였다(도 5A).

염에 처리한 고추의 잎조각을 모아서 80% 아세톤 용액에 넣고 갈아서 cell debris를 원심분리로 분리시킨 후에, 상층액을 분리하여서, 엽록소의 양을 측정하였다(Spectrophotometer로 측정하며, [(20.2×A₆₄₅)+(8.02×A₆₆₃)] 공식은 다음과 같다). CaNAC2를 침묵 시킨 식물에서는 엽록소의 양이 대조구에 비해 반 이상 줄어들어 있음을 알 수 있었다(도 5B).

<실시예 6. 담배에서 CaNAC2 의 transient overexpression>

도 6에서와 같이, CaNAC2 유전자를 pMBP1 벡터에 클로닝한 후에 Agrobacterium LBA4404에 도입한 후, 200ppm 농도의 아세토시링원(acetosyringone)으로 24℃에서 2시간을 배양하여 virulence를 유도한 후, N. benthamiana 잎에 needleness syringe로 감염시켰다(infiltration) (O.D₆₀₀: 0.5) (transient expression assay). 잎의 왼쪽 반에는 대조구로 사용한 pMBP1이 들어있는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 감염시켰다. 24, 48, 72시간을 관찰하여 보 니, 잎이 HR 세포사멸 반응이 유도됨을 알 수 있었다. 눈에 HR이 일어나는 것이 보이는 시간은 36시간 정도이다. 48시간 뒤에는 확실한 HR이 보이고, 72시간에는 감염된 모든 잎이 괴사했다. 같은 시간 동안 UV등 밑에서 잎을 관찰하여 보니, HR이 일어날 때 나타나는 현상중의 하나로, 형광을 띠는 것이 CaNAC2가 과발현된 잎의 오른쪽에서 24시간부터 형광이 유도됨을 알 수 있었고, 48, 72시간에 아주 강하게 나타남을 알 수 있었다. UV등 밑에서 형광만을 잘 볼 수 있도록 녹색필터(Green filter)를 장착하고 사진을 찍어서, 같은 결과를 확인하였다. 또 다른 HR이 나타날 때 일어나는 현상인 ROS (Reactive Oxygen Species,활성산소) busting을 확인해보기 위해서, DAB 염색 (세포내 과산화수소를 관찰하는 방법)을 실시하였다. DAB 용액에 잎을 0시간부터 72시간까지 하루 간격으로 샘플링하여, 페트리디쉬에 담고, 5분 동안 진공(vacuum)을 걸어서 용액이 잎 속으로 잘 흡수되어지도록 하였다. 5분 뒤 2시간 동안 형광등 밑에서 배양한 후에 전자레인지에서 살짝 거품이 생길 정도로 끓인 후 하루 동안 염색한 후, 다음 날 DAB 용액을 버리고, 알코올에 담가서 남은 엽록소를 제거하고 사진을 찍었다. DAB 염색법에서도 CaNAC2가 과 발현한 잎에서만, ROS busting이 일어남을 알 수 있었다. 실제로 세포가 죽은 HR 반응인지를 알아보기 위해서, 트리판블루염색(Trypan blue staining)을 실시하였다. 같은 시간동안 잎을 샘플링하여, 트리판블루 용액에 넣고 5분간 진공(vacuum)을 가하여, 용액이 흡수되게 한 후, 전자레인지에서 살짝 끓인 후 하루 밤 동안 배양하고, 다음 날 트리판블루 용액을 버리고, Chloral hydrate solution으로 엽록소를 모두 제거한 후 파랗게 염색된 죽은 조직을 관찰하였다. HR 역시 CaNAC2가 과발현된 오른쪽 잎 조직에서만 발견되었다. 따라서, CaNAC2가 과발현되면 HR cell death 반응이 일어남을 알 수 있었다(도 7A).

CaNAC2의 과발현됨에 따라서 생성된 HR반응에서 실제로 CaNAC2가 많이 발현되었는지 그리고, 다른 HR 양성마커(HR positive marker)유전자들의 발현이 증가했는지를 알아보기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. 대조구로 사용한 벡터(empty vector)만을 감염시킨(infiltration) 왼쪽을 대조구로 사용하였고, 0, 24, 48시간 동안의 발현을 분석하였다. CaNAC2 유전자가 24, 48시간에 강하게 발현되고 있는 것을 5'-AAATGGGCAGCGATTGAACCGAGC-3'(서열번호9)와 5'-GGTGATTTGGCAGCTGAAGCATTC-3'(서열번호10)을 이용한 PCR 결과에서 확인되었다. 세포사멸의 marker 유전자인 NbPR2은 5'-ACCATCAGACCAAGATGT-3'(서열번호11)와 5'-TGGCTAAGAGTGGAAGGT-3'(서열번호12)으로, p69d은 5'-ACTTCTCACTGCAATTGG-3'(서열번호13)와 5'-TCAGACATGATCAACTCC-3'(서열번호14)으로, 630은 5'-CAAGAAATCCGTCCAGGT-3'(서열번호15)와 5'-CTTCTGTATCTGAGGCCT-3'(서열번호16)으로 각각 확인한 결과 CaNAC2 과 발현 조직에서 그 전사체의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 병저항성에 관여하는 조절유전자인 TGA2.1 전사인자(TGA2.1 transcription factor)은 5'-CGGGAATTCGGCTAGTAAGATTGGTACAGCAGG-3'(서열번호17)와 5'-CGGGGTACCGTTCTGGGCAAGTCGCCGCAGTGT-3'(서열번호18)으로, NDR1은 5'-CTCGACGAATTCATGGCCCTTCCATTCCGCCACCAG-3'(서열번호19)와 5'-CGCGCGCTCGAGCCCCTAAATTCTTCTCATTATTG-3'(서열번호20)으로 각각 확인한 결과, 그 발현량도 역시 증가하는 것을 확인하였다. HSP90유전자는 5'-GATATTTACTACATTACTGGTGAGAGCAAGAAG-3' (서열번호21)와 5'-CAACACGGTCAGAAACAATGACCTTTTC-3(서열번호22)으로 확인한 결과 발현량은 차이를 보이지 않았다. N. benthamiana의 actin 유전자는 프라이머 5'-TGGACTCTGGTGATGGTGTC-3'(서열번호23)와 5'-CCTCCAATCCAAACACTGTA-3'(서열번호24)를 이용하였다.(도7B).

<실시예 7. 병저항성 반응에 관여하는 저항성 반응 조절 유전자가 침묵된 담배 식물체에서 CaNAC2 의 과발현은 HR을 유도한다>

CaNAC2의 과 발현에 의해서, 일어나는 HR 세포사멸 반응에 관여하는 유전자를 찾기 위해서, 병저항성 반응에 관여하여 저항성 반응을 조절하는 것으로 알려진 유전자들을 VIGS 방법으로 침묵 시킨 후에 대조구인 pMBP1과 CaNAC2가 들어있는 아그로박테리움을 침묵시킨 잎의 각각 왼쪽과 오른쪽에 감염시킨 후 관찰하였다. CaNAC2 과 발현에 의한 세포사멸 반응에 관여하는 유전자가 침묵되었다면 그 식물에서는 HR이 일어나지 않을 것이다. 실험 결과 HSP90와 SGT1 이 침묵된 식물에서는 CaNAC2에 의해서 일어나는 HR이 생기지 않았다. 따라서, HSP90와 SGT1유전자는 CaNAC2의 과발현에 의해서 일어나는 세포사멸 반응에 매우 중요하게 관여한다는 것을 알 수 있었다(도 8A).

도 8A를 통해서, HSP90와 SGT1이 CaNAC2에 의한 HR 반응에 관여하는 것을 알 았다. 이 두 유전자는 그 기능상 프로테아좀(proteasome)을 구성하는 유전자들로 알려져 있다. 이것을 다시 한 번 다른 방법을 통해서 분석해 보기 위해서, 잘 알려진 화학적 저해제(chemical inhibitor)를 사용해서 분석하였다. MG262는 범주가 넓은 프로테아좀 저해제(Broad range proteasome inhibitor)로 잘 알려져 있다. 이것을 DMSO에 녹인 후 아그로박테리움(Agrobacteria)과 같이 감염시켜, 프로테아좀이 CaNAC2에 의한 HR 반응에 관여하는지를 분석하였다. DMSO 용매 자체가 높은 농도에서는 식물에 독성을 나타내기 때문에, DMSO만으로도 HR과 같은 세포사멸반응이 유도될 수 있으리라 생각되어서, 처리구에 DMSO만을 감염시킨 것과 MG262를 처리한 것으로 나누어서 실험하였다. 실험결과로 72시간이 지난 후에 HR 반응이 MG262를 처리한 조직에서 나타나지 않은 것을 확인하였다. 그리고 UV등 밑에서 형광을 띠는 지도 확인한 결과 MG262를 처리한 조직에서는 나타나지 않았다. 물론, DMSO만을 처리한 조직에서도 손상(damage)에 의한 HR 반응은 나타나지 않았다(도 7B).

도 8B와 같은 방법으로 실험하였는데, 이번에는 프로테아좀 저해제(proteasome inhibitor)중 범주가 좁은 저해제(Epoxomicin)를 사용하여 실험하였다. 그 결과 CaNAC2에 의한 HR 반응이 상당히 저해되었지만, MG262만큼 완벽하게 저해되지는 않았다. 따라서, 프로테아좀이 CaNAC2의 과발현에 의해 일어나는 HR 반응에 필요한 구성요소이며, 광범위한 프로테아좀 구성 요소들이 저해된 조직이 특이하게 몇 개의 구성요소를 저해한 조직에서 보다 더 강하게 HR 반응이 저해된 것을 알 수 있었다(도 8C).

도 1은 박테리아 병원균의 감염, 방어 기작과 관련된 식물-호르몬 및 염 처리에 반응하는 CaNAC2 발현을 노던 블럿으로 확인한 결과를 나타내는 그림이다((A): Early calwonder-30R (ECW30R)에 두 개의 고추 박테리아 병원균 Xav 1 (저항성)와 Xav 3 (민감성)을 침투시킨 것. (B): Chili pepper에 일정 시간 간격으로 SA와 에테폰을 처리한 결과(CaPR1은 양성 대조구). (C): Chili pepper 잎을 400 mM NaCl, 400 mM 만니톨, 냉한 및 40㎛ 메틸 비올로겐(methyl viologen)을 처리한 결과.).

도 2는 CaNAC2::smGFP의 세포내 위치를 확인한 그림이다((A): CaNAC2 단백질 구조를 모식적으로 나타낸 그림. (B): CaNAC2::smGFP 융합 단백질 또는 smGFP 구조체(대조구)는 PEG를 이용한 형질전환 방법으로 담배 원형질체에 도입한 그림.).

도 3은 CaNAC2의 전사체 발현 분석을 나타내는 그림이다((A): CaNAC2 유전자의 결손 구조체를 나타내는 그림. 형질전환체: pLexA-BD, pLexA-CaNAC2-F (1-633 아미노산), pLex-CaNAC2-N (1-227 아미노산) 및 pLexA-CaNAC2-C (228-633 아미노산). (B): CaNAC2-N의 형질전환체 모두는 X-gal 배지에서 β-galactosidase 활성을 보임.).

도 4는 고추에서 CaNAC2 유전자의 침묵은 박테리아의 감염에 대한 민감성을 증가시키고, HR을 억제하는 결과를 나타내는 그림이다((A): Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra 박테리아 병원균(O.D₆₀₀: 0.1)의 감염 후 일정시간이 지난 뒤 유전자가 침묵된 잎 조직으로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행한 결과. (B): Pseudomonas syringae pv. syringae 61 비기주 박테리아 병원균(O.D₆₀₀: 0.01)을 유전자 침묵이 일어난 고추 잎에 감염시킨 후 48시간이 지난 결과를 나타내는 그림. (C)는 칠리고추 잎 점무늬 병의 병원균인 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria race1 (O.D₆₀₀: 0.001)을 유전자 침묵이 일어난 잎에 감염시키고, 잎 조각을 모아서 일정 시간이 지난후 콜로니 수를 센 결과. (D): Phytophthora capsici 접종 후 2일이 지난 잎을 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 결과를 나타내는 그림. (E): TRV::GFP 과 TRV::CaNAC2인 고추에 P. capsici으로 접종한지 2 또는 3일이 지난 질병 상태를 보여주는 그림.).

도 5는 CaNAC2 유전자 침묵 식물체는 염 처리에 대한 민감성을 조사한 결과를 나타내는 그림이다((A): TRV::GFP와 TRV::CaNAC2 고추 잎 조각을 0.5 M NaCl에 처리한 결과. (B): TRV::GFP와 TRV::CaNAC2 고추 잎 조각을 갈아서 80 % 아세톤을 처리한 후 엽록소의 함량을 흡광도 645와 663nm[(20.2 ⅹA645) +(8.02ⅹA663)]에서 측정한 결과.).

도 6은 CaNAC2을 pMBP1에 삽입하여 제작한 CaNAC2 과발현 벡터 pMBP1::CaNAC2 이다.

도 7은 N. benthamiana에서 CaNAC2의 일시적인 과발현은 HR과 같은 세포사멸을 유도하는 결과를 나타내는 그림이다((A): pMBP1::CaNAC2 구조물은 아그로박테리움을 매개하여 N. benthamiana에 도입하였다. 잎의 왼쪽은 대조구로 pMBP1을 접종하였고, 오른쪽은 pMBP1::CaNAC2 을 접종하였다. 사진은 UV하에서 또는 DAB 및 트리판 블루 염색을 하여 일정시간에 찍은 사진. (B): 이미 알려진 방어 및 세포사멸 마커 유전자를 검출할 수 있는 프라이머를 이용한 RT-PCR 결과.).

도 8은 SGT1와 HSP90 유전자 침묵 식물체와 프로테아좀 저해제 처리는 CaNAC2와 연관된 HR와 같은 세포 사멸을 절충한 결과를 나타내는 그림이다((A); SGT1 또는 HSP90와 같은 방어 관련 담배 유전자는 N. benthamiana에서 유전자 침묵이 이루어진 것을 확인한 그림. pMBP1::CaNAC2을 포함하는 아그로박테리움을 각각의 유전자 침묵 식물체의 잎에 감염시키고, 감염 후 3일째 찍은 사진. (B): 10mM DMSO에 섞은 MG-262. (C): 10mM DMSO에 섞은 epoxomicin).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pepper CaNAC2 gene involved in environment stress and pathogen resistance of plant <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1899 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 atgatggctg tactgcccgg agataatccg atcgctgcta ttccggtgga taaacagatg 60 ggtataccgc cgttaaattc tctgccggta gggtatcgtt ttcggccgac ggatgaggag 120 cttgttaatc actatttgag gttgaagatt aacggtgctg atagtcaagt tagcgttatt 180 cgtgaagttg atatatgtaa actcgagccc tgggacttac ctgatatgtc tgtggtagag 240 tccaatgaca acgagtggtt cttcttctgc ccaaaggatc gtaagtacca aaatgggcag 300 cgattgaacc gagcaacaga acgaggctac tggaaagcta ctggtaaaga taggaacata 360 acaactaaga agggagcaaa aattgggatg aagaagacct tggtatacta cattggtcga 420 gctcctgatg gcaagaggac tcattgggtg attcatgaat atcgtgcaac tgaaaagtca 480 ttggatggat cacaccctgg ccagggggcc tttgtgcttt gtcgtctgtt taggaagagt 540 gatttgaagc aggatgagca tgttgagaac tccaatttag atgctgaaca gaatgcttca 600 gctgccaaat cacctaccga agatgaatta tcagagggag ccactccatt 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Leu Asn Arg Ala Thr Glu Arg Gly Tyr Trp Lys 100 105 110 Ala Thr Gly Lys Asp Arg Asn Ile Thr Thr Lys Lys Gly Ala Lys Ile 115 120 125 Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Tyr Tyr Ile Gly Arg Ala Pro Asp Gly 130 135 140 Lys Arg Thr His Trp Val Ile His Glu Tyr Arg Ala Thr Glu Lys Ser 145 150 155 160 Leu Asp Gly Ser His Pro Gly Gln Gly Ala Phe Val Leu Cys Arg Leu 165 170 175 Phe Arg Lys Ser Asp Leu Lys Gln Asp Glu His Val Glu Asn Ser Asn 180 185 190 Leu Asp Ala Glu Gln Asn Ala Ser Ala Ala Lys Ser Pro Thr Glu Asp 195 200 205 Glu Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Leu Thr Val Val Gln Pro Leu Gly 210 215 220 Asp Ser Asp Lys Ser Tyr Ala Ala Thr Phe Pro Lys Thr Lys Leu Tyr 225 230 235 240 Gly Lys Gln Ile Pro Val Glu Ser His Ser His Ser Cys Ile Ala Asp 245 250 255 Asp Thr Glu Asp Gln Met Leu Asp Ile Thr Ser Ile Pro Pro Ala Gln 260 265 270 Asp Leu Glu Lys Glu Leu Gly Asn Phe Cys Asp Pro Ser Ser Gln Pro 275 280 285 Leu Asp Trp Lys Ile Phe Ser Pro Leu His Ser Gln Leu Gln Val Glu 290 295 300 Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Gln Ala Pro Met Asn Asn Asp Ile Ser Ala 305 310 315 320 Tyr Pro Lys Glu Asp Val Gln Phe Gln Tyr Gly Thr Asn Ala Leu Asp 325 330 335 Ile Asn Asp Phe Leu Asp Ser Val Phe Val Gly Ser Asp Glu Phe Ser 340 345 350 Cys Glu Asp Ser Gly Gln Glu Leu Ala Ser His Gln Ile Asp Thr Lys 355 360 365 Asn Cys Ser Ile Thr Gly Pro Met Ile Lys Asp Ser Gly Ser Cys Ser 370 375 380 Glu Ser Glu Ala Glu Val Thr Gln Arg Leu Ala Glu Pro Asp Phe Phe 385 390 395 400 Asp Pro Glu Met Leu Trp Gly Asn Tyr Asp Gln Glu Thr Ala Val Lys 405 410 415 Asn Glu Val Asn Ser Ile Ala Ala Thr Met Leu Glu Ala Arg Gly Ala 420 425 430 Pro Tyr Val Ser Thr Asp His Ala Val Gly Asn Ser Gly Phe Leu Gln 435 440 445 Asn Thr Tyr Pro Gly His Tyr Gly His Pro Val Ser Phe Gly Ala Ser 450 455 460 Gln Val Pro Asn Phe Leu Lys Asp Gly Phe Asn Ser Val Val Ser Asn 465 470 475 480 Asp Ser Gly Ser Gly Thr Gly Ile Lys Leu Arg Pro Arg Pro Met His 485 490 495 Asn Gln Pro Asp Asp Met Gln Ser Arg Pro Gln Gly Thr Ala Pro Arg 500 505 510 Arg Ile Arg Leu Gln Met Lys Met Gln Val Gly Pro Val Glu Cys Cys 515 520 525 Thr Arg Pro Asp Ser Ser Gln Glu Ala Gly Ser His Gln Ala Val Thr 530 535 540 Asp Gly Glu Lys Ala Ser Asp Glu His Asn Pro Thr Ala Ser Asp Thr 545 550 555 560 Thr His Glu Glu Tyr Glu Gly Val Ser Gly Glu Val Asp Asp Leu Ser 565 570 575 Thr Arg Val Lys Asp Ala Asp Asp Ser Pro Val Gln Glu Ser Leu Asp 580 585 590 Glu Pro Leu Lys Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Ser His Ile Tyr 595 600 605 Met Thr Lys Phe Leu Val Val Ala Ser Leu Leu Val Val Phe Ile Gly 610 615 620 Val Trp Gly Cys Ile Arg Leu Tyr Val 625 630 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgatacaac acatgaagaa tacg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caacctctaa tgtctcaact cagg 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acttgcaatt atgatccacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 actccagtta ctgcaccatt 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agtgatcatt ctttgcttta ttcttac 27 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aacattcatt cccatgctat c 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaatgggcag cgattgaacc gagc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggtgatttgg cagctgaagc attc 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 accatcagac caagatgt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tggctaagag tggaaggt 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 acttctcact gcaattgg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcagacatga tcaactcc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 caagaaatcc gtccaggt 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cttctgtatc tgaggcct 18 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgggaattcg gctagtaaga ttggtacagc agg 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cggggtaccg ttctgggcaa gtcgccgcag tgt 33 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctcgacgaat tcatggccct tccattccgc caccag 36 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgcgcgctcg agcccctaaa ttcttctcat tattg 35 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gatatttact acattactgg tgagagcaag aag 33 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 caacacggtc agaaacaatg accttttc 28 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tggactctgg tgatggtgtc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cctccaatcc aaacactgta 20

Claims (12)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는데 관여하는 고추 유래의 CaNAC2 단백질.
2. 제1항의 CaNAC2 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
6. 제5항에 있어서 상기 벡터는 도 6에 기재된 pMBP1::CaNAC2 벡터.
7. 제5항의 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 식물의 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성을 향상시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 병원균은 세균, oomycete 병원균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 병원균은 세균성 점무늬병균 또는 고추역병원균 (Phytophthora capsici, oomycete)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 살리실산, 에테폰(ethephon), 염, 만니톨, 냉해 및 메틸 비올로겐(methyl viologen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성 또는 병원균 저항성이 증가된 식물체.
12. 제11항에 있어서, 상기 식물체는 고추 또는 담배인 것을 특징으로 하는 식물체.

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