JP2002503475A - ストレス誘導性プロモーターの配列およびスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の配列を含む核酸 - Google Patents

ストレス誘導性プロモーターの配列およびスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の配列を含む核酸

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エスノルト、ロベール
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シャンパーニュ モエ エ シャンドン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 病原体に対する抵抗性が改善された植物を提供する。 【解決手段】 スチルベンに感受性である病原体に対する抵抗性が改善された植物。より詳しくは、生物によるストレス、特に該病原体により生じるストレスにより誘導されうる植物プロモーターと、スチルベンシンターゼをコードする遺伝子とを連結した１組の構築物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はスチルベンに感受性である病原体に対する抵抗性
が改善された植物に関し、より詳しくは、生物によるストレス、特に該病原体に
より生じるストレスにより誘導されうる植物プロモーターと、スチルベンシンタ
ーゼをコードする遺伝子とを連結した１組の構築物に関する。
【０００２】 栽培植物の世界中の収穫の大部分は、寄生体と病原体により一様にそこなわれ
ている。栽培植物に対するこれらの寄生体による攻撃を減少又は防御するための
可能な選択のうち、最もよく行われている方法は化学的制御 (植物の防御処理)
である。しかし、化学製品は環境への影響なしには適用されず、時には、醸造分
野において技術的問題、例えば新しい耐性病原株の出現、発酵の間に起こりうる
問題 (ステロール生合成の阻害剤の使用は発酵の末期の酵母の成長を阻止する)
、又は化学製品の存在、例えばワイン中に見出されることがある抗ボトリティス
(anti-Botrytis) 剤であるプロシミドン(procymidone) など、の問題を生じる。
【０００３】 これらの病原体により引き起こされる病気に対して栽培植物の抵抗性を改善す
ることからなる制御方法が、化学的制御に伴う欠点を克服する方法として考えら
れてきた。
【０００４】 例えば第１の方法では、この改善を、抵抗性が改善されるべき植物を耐性の品
種と交雑させることにより、性的経路を介して、即ち典型的遺伝学を用いて行う
ことが可能である。しかし、この方法は常に可能とは限らない (自然の耐性の品
種が知られていない) か、または、認可された産地名の記載(Appellations d'Dr
igine Controlee)(A.D.C) に関するフランスの法律の結果としてのブドウ栽培に
おける規制−ある名称に使用されるべきブドウの木の品種を制限する−などによ
り許されないことがある。
【０００５】 第２の方法では、代謝物又は代謝経路を増強するため、又は新しい生合成経路
を開くか、新しい生合成経路の開始を増加させる、例えば問題の病原体に関する
防御機構を増強することにより植物の抵抗性を向上させるための新しい分子を合
成させるために、対象となるタンパク質性の分子を過発現又は発現することがで
きるような、１又は２以上の同種又は異種遺伝子を細胞及び分子生物学の新しい
技術を用いて植物のゲノム中に組み込むことができる。
【０００６】 植物においてこの種の防御機構はいくつか存在する。このうちのいくつかは、
受動的であるとみなすことができ、植物の細胞、表皮組織および／または器官の
物理化学的特性と関連している。その他は、遺伝子／遺伝子相互作用の動力学 (
植物耐性遺伝子と病原体無毒性遺伝子、宿主／病原体相互作用の機構) に属して
いる。これらの相互作用は、過敏反応 (植物における微生物の定着を阻止するた
めの、感染部位の周囲の植物細胞の急速な死) の進展を導く一方、一連の化合物
全体の合成及び蓄積を導きうる。これらの中で、いくつかは感染部位の周りの「
物理的」障壁の形成 (カロース、リグニン、ヒドロキシプロリンに富むタンパク
質：ＨＲＧＰ等) に関与する側膜成分であり、その他の化合物は、多かれ少なか
れ明らかにされている抗菌機能を有する分子 [フィトアレキシン、病原体関連タ
ンパク質：PRタンパク質 (病原性関連タンパク質、pathogenesis-related prote
ens)等] でありうる。植物により、例えば宿主／病原体相互作用の間に合成され
蓄積されるフィトアレキシン型の分子には、特に、微生物に対して特に毒性をも
つスチルベン類がある。スチルベンの用語は、共通の基本骨格としてトランス−
ジフェニル−1,２−エチレン骨格を有する一群の化学物質を意味し、最も簡単な
ものの中には、リスベラトロール(resveratrol) 及びピノシルビン(pinosylvine
) がある。この基本骨格は、スチルベンシンターゼ又は関連酵素により、全植物
に存在する物質 (フラボノイド前駆体) である、マロニル−CoA 、シナモイル−
CoA 、又はクマロイル−CoA などの基質から植物において合成される。スチルベ
ンシンターゼ又は関連酵素の遺伝子は、特にアメリカホドイモ (groundnut)、ラ
ン及びブドウの木 (grapevine)において単離され、配列決定され、クローン化さ
れている。これらの遺伝子を用いて、ジャガイモ、アルファルファ (lucerne)又
はタバコなどの植物を形質転換することができ、これらの植物は形質転換されて
いない植物よりも病原体の攻撃に対してより高い抵抗性を示す (EP−309862; EP
−648839; MELCHIOR,F.et al., Arch. Biochem, Biophys. 1991, 288, 2, 522-5
57; WIESE, W.et al., Nature 1993, 361, 153-156) 。
【０００７】 抗菌性機能を有するこれらの分子の発現又は過発現は、ストレス、特に微生物
型のストレスに対して「自然な」抵抗性を提供しうる。しかし、この種のタンパ
ク質の構成的過発現は植物に対して不利益をもたらすことがある (エネルギー消
費、成長の遅延など)(FISCHER,R.et al., The Plant Journal 1997, 11, 3, 489
-498) 。
【０００８】 一方、ある植物、例えばブドウの木や草本植物においては、スチルベン類は健
全な組織のいくらかに非常に低濃度で見出されるにすぎない。逆に、感染又は損
傷後に、これらのスチルベン類は感染部位又は損傷部位で非常に増加する。なぜ
なら、スチルベンシンターゼ遺伝子は生物的又は非生物的ストレス (例えば傷、
紫外線等) 下の状態で誘導性であるためである。
【０００９】 しかし、この制御は農業に有用な植物中にはあまり存在しないか、あるいは存
在しても十分な効果はない。例えば、ブドウの木におけるフィトアレキシンの合
成に関する研究により、リスベラトロールを含むスチルベンが存在する健全な組
織のみが健全な木の組織であることが実証された。スチルベンは、一方で、果実
が病原体による攻撃などのストレス[(灰色かび病に対するボトリティス・シネリ
ア(Botrytis cinerea)やべと病に対するプラスモポーラ・ビチコラ(Plasmopora
viticola)]を受けた場合に、他方、若い果実の成熟初期までの間のみに、ブドウ
の実の組織中に存在することが見出されている。これに対して、スチルベンの濃
度は成熟初期から成熟までの間著しく減少する。しかし、例えばボトリティスに
よる損傷は、成熟初期までの期間中にはほとんど受けることがなく、むしろ果実
の成熟に近い期間に受ける。このため、スチルベン植物遺伝子の発現は、この遺
伝子の自然の制御を免れ、特にストレスそれ自身により制御されなければならな
い。本発明は詳しくはこの性質をもつプロモーターに関する。
【００１０】 本発明は、スチルベンシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子配列に
連結したアルファルファPRタンパク質のプロモーター配列を含む核酸に関する。 本発明は、特に、アルファルファPRタンパク質のプロモーターが生物的又は非
生物的ストレスにより、組織特異的にまたはそうでなく、植物中に誘導されうる
プロモーターであることを特徴とする、本発明の核酸に関する。
【００１１】 また、本発明は、アルファルファPRタンパク質のプロモーター配列が以下から
なる群より選択されることを特徴とする、本発明の核酸に関する。 ａ) IND S1配列、 ｂ) IND S1配列の断片に相当し、植物におけるプロモーター配列の効果を有す
る任意の配列。
【００１２】 アルファルファPRタンパク質に対するプロモーター配列は、IND S1配列と少な
くとも80％の相同性を示すものが好ましい。それらの配列はIND S1配列と少なく
とも90％または95％の相同性を示すものが特に好ましい。
【００１３】 本発明のアルファルファPRタンパク質のプロモーター配列は、アルファルファ
(Medicago sativa) とシュードモナス・シリンゲ pv pisi (Pseudomonas syring
ae pv pisi) との間の宿主／寄生体の関係において得られる不適合反応 (過敏反
応、ＨＲ) をこの反応を担う遺伝子の制御配列を単離する目的で利用することに
より、PRタンパク質に対する遺伝子の制御配列から得られる。
【００１４】 シュードモナス属菌がアルファルファを攻撃すると、この菌の感染により生じ
る壊死の隣接部分に、植物の反応が生じることが観察される。 従って、この壊死の隣接部分に生じるメッセンジャーRNA からcDNA ライブラ
リーを作製するために、該菌の攻撃後に植物材料を採取する。
【００１５】 マメ科のPRタンパク質遺伝子において保存されるモチーフに相当する合成ポリ
ヌクレオチドを用いる、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR) による増幅に
より、放射性プローブを得ることができ、これをcDNAライブラリーにおいて転写
物を選択するのに用いる。これらのうちの１つ(cDNA-PR7)は、PRタンパク質をコ
ードし、他の植物由来の既知の同等の遺伝子とよい相同性を示すので、これを採
用した。 (プロモーターを単離するための方法の全体図を示す図１及び図1aを参
照) これは、VAN LOON(1994)の分類によればクラス10のPRタンパク質をコードする
遺伝子に相当することが分析により分かった。この遺伝子は、従って、Ms PR10-
1(Medicago sativa PR class 10 protein, clone 1) と命名された。単離し、ク
ローン化したcDNA PR7は、内部のBamHI 部位 (図１中のB)の存在により２つのプ
ローブを得ることを可能にした。これらのプローブ、それぞれ5'及び3'と称され
るEBとBE(Eは図１中のEco RI部位に相当) を、アルファルファのゲノムライブラ
リーをスクリーニングするのに用いた。5'及び3'プローブにより認識されるクロ
ーンの中から、その中の１つであるＣ15を選択し、配列決定した(6.1kb) 。それ
自身は、必然的にBamHI 部位も有し、これは、E-B(g)及びB-E(g)とそれぞれ命名
された (g は得られた断片がゲノム性であることを表す) 、2.4kb と3.7kb の新
しいEB及びBE断片を得ることを可能にした (図1a参照) 。C15 クローンの5'に位
置し、プロモーター及びそのMs PR10-1 遺伝子コーディング配列の一部を含むE-
B(g)断片を、bluescriptプラスミドの EcoRIとBamHI 部位の間に挿入した。この
プラスミドを、E-B(g)断片中のBamHI の上流に位置するPstI部位により直鎖状と
した。IND S1プロモーター配列が得られるまで、この断片において3'から5'まで
除去した (図３) 。平滑末端連結により、Ms PR10-1 遺伝子のプロモーター配列
の末端に、C15 クローンに対して内部の、他のBamHI 部位を再帰させることがで
きた。これらの条件下で、C15 クローンに対して内部であるこのBamHI 部位の上
流に位置する、Ms PR10-1 遺伝子のコーディング配列の13個のヌクレオチドを、
このようにしてIND S1プロモーター配列中に組み込んだ。この全体はEcoRI/BamH
I 切断により単離しうる (実施例１参照) 。
【００１６】 本明細書において、PMs PR10-1は、植物においてプロモーター効果をもつIND
S1配列の任意の核酸断片、及び以下に述べるようなMs PR10-1 遺伝子のコーディ
ング配列の13個のヌクレオチドを有するIND S1配列の任意の核酸断片も意味する
。
【００１７】 本発明はまた、同種又は異種の、スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の
配列が、アメリカホドイモ、ラン、ブドウの木 (grapevine)及びマツのゲノムか
ら単離した遺伝子(EP-309862、EP-464461)から選択されることを特徴とする、本
発明の核酸にも関する。
【００１８】 該核酸の中で、ブドウの木のスチルベンシンターゼをコードする核酸が好まし
く、特に、HAIN,R.et al. による論文 (Nature 1993,361,153-156)に記載された
もの、及びWIESE,W.et al., による論文 (Plant Mol.Bil.,1994,26,2,667-677)
中に記載されたものが好ましい。これらの論文中の配列vst1に対応する核酸が最
も好ましい。
【００１９】 スチルベンシンターゼ遺伝子を発現可能にする核酸には、当然ながら、特に、
該遺伝子に加えて、コーディング鎖の3'末端のポリアデニル化配列及び、該遺伝
子又は異なる遺伝子からのエンハンサー配列が含まれる。
【００２０】 当然、上記核酸は、該遺伝子がプロモーターにより正しいリーディングフレー
ク中で実際に読まれることを確実にするために適応させねばならないであろうし
、必要であれば、同じタイプのいくつかのプロモーター、及びいくつかのエンハ
ンサー配列を用いることを予測することは明らかに可能であろう。
【００２１】 縦列に配列されるか、異なる発現系で行われるかして、いくつかのスチルベン
シンターゼ遺伝子を発現させるために本発明の核酸を用いることも可能である。 本発明の核酸は、形質転換された植物の組織又は器官に応じて、誘導性および
／または構成性となりうる、植物中の発現系を作製するのに使用できる (実施例
２、３及び４参照) 。
【００２２】 従って、本発明は植物中の少なくとも１つのスチルベンシンターゼ遺伝子を発
現する系であり、本発明の少なくとも１つの核酸を含むことを特徴とする系にも
関する。本発明の系の中で、形質転換ベクター、特にプラスミド型の形質転換ベ
クターが好ましい。有利には、この形質転換ベクターはアクロバクター属の菌株
に導入されうることを特徴とする。
【００２３】 本発明の核酸により発現しうるスチルベンシンターゼ遺伝子は、植物において
スチルベン、特にリスベラトロール、pinosyl gravevine 又はそのグルコシル化
誘導体 (例、ピセイン) 又はオリゴマー (例、ビニフェリンス) 、に感受性であ
る病原体に対する抵抗性の機構を活性化する目的で、プロモーターPMs PR10-1の
制御下におかれる。スチルベンに感受性である、このような性質の寄生体はBotr
ytis cinerea、Plasmopora viticola 、ユウティパ・ラータ (Eutypa lata)等が
挙げられる。
【００２４】 植物中で生物的又は非生物的ストレスにより誘導されうることを特徴とする、
本発明の発現系が好ましい。 本発明における生物的ストレスとしては、スチルベンに感受性の寄生体 (例え
ば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、特にBotrytis cinerea又はPlasmopora vitic
ola)の攻撃により生じる生物的ストレスが特に好ましい。
【００２５】 本発明における非生物的ストレスとしては、特に昆中や風や霜のような物理的
現象により生じる損傷などの機械系損傷から生じる無生物的ストレスが好ましい
。
【００２６】 本発明はまた、本発明の系又はベクターで形質転換された植物細胞にも関する
。有利には、この植物細胞はブドウの木の細胞である。 さらに、本発明は、１つの (又はいくつかの) スチルベンシンターゼ遺伝子を
発現する植物を得るための方法であり、該植物の細胞が本発明の系又はベクター
を用いて形質転換され、該遺伝子を発現する細胞が選択され、植物がこれらの細
胞から再生されることを特徴とする方法に関する。
【００２７】 最もよく使用される形質転換方法としては、特に、アグロバクター属細菌−ア
グロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) でもアグロ
バクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)でもよい−を用いる方法
、又は他の任意の方法 (エレクトロポレーション等) が挙げられる。
【００２８】 これらの方法は既知であり(REAM,W.,1989; NEGRETIU,I.and GHARTI-CHHETRI,G
.B.,1991; GASSE-DELBART,F.,1996; STANFORD,J.C.,1990)、ここでは詳細には説
明しない。
【００２９】 この技術、特にプラスミド系を用いるもの、はコンピテントな菌株、一般的に
はE.coliの最初の形質転換を可能にし、この形質転換はプラスミドの構造がクロ
ーン化され検出されることを可能にする。次いで、該菌株は、組み換えプラスミ
ドをアグロバクター属の菌株に導入するのに用いられ、この菌株は植物細胞を形
質転換するのに使用されるであろう。
【００３０】 本発明の発現系または細胞を含む植物は本発明の一部である。 本発明の方法を実施することにより得られる植物もまた、本発明の一部である
。
【００３１】 最後に、本発明は、農業に有益な植物、特にブドウの木である、本発明の植物
に関する。 本発明の構成及び方法のその他の特徴又は利点は以下の実施例から明らかとな
ろう。
【００３２】 図１及び1aは、IND S1配列に対応する誘導性プロモーターPMs PR10-1を単離す
る方法における種々の工程を図示する全体図である。 図２は、単離された、サザンブロットに対応する種々のクローンを表わし、こ
のブロットはcDNA-PR7の5'及び3'部分とハイブリッド形成し、これらの部分は、
このcDNA中に検出される内部BamHI(B)部位により範囲を限定されたものである。
【００３３】 制限酵素部位：Ｅ＝EcoRI 、Ｂ＝BamHI 。 図中に示した数値は kb(キロベース) で表わされる。 図３は、誘導性の、アルファルファプロモーターPMs PR10-1の単離されたゲノ
ム配列であるIND S1配列に対応するDNA 配列を示す。
【００３４】 図４は、アダプターの付加により改変されたブドウの木のスチルベンシンター
ゼの遺伝子配列に相当するDNA 配列を示す (改変 vst1)。 改変部分をイタリック体で示す。
【００３５】 コーディング及び非コーディング (イントロン) 部分はそれぞれ大文字、小文
字で表わす。 図５は、アダプターを付加して改変したブドウの木のスチルベンシンターゼの
遺伝子配列 (改質 vst1 、図４に相当) に連結した、誘導性プロモーターPMs PR
10-1配列 (小文字のIND S1配列に相当) を含むDNA 配列を示す。この２つ (小文
字のプロモーターの末端及び大文字の翻訳開始コドンを含む遺伝子の開始) の間
に、Ms PR10-1 遺伝子のコーディングフレームの内部配列由来の13ヌクレオチド
(配列において枠) があり、ATG は改変vst1遺伝子を有するリーディングフレー
ム中に位置するので、これらのヌクレオチドはvst1のコーディングフレーム中に
組み込まれる。
【００３６】 誘導性プロモーターPMs PR10-1の配列は、Ms PR10-1 遺伝子配列の13ヌクレオ
チドのうちの７つ (枠中の小文字) を含む。 ブドウの木のスチルベンシンターゼに対する遺伝子配列に相当する部分のコー
ディング及び非コーディング (イントロン) 部分はそれぞれ大文字及び小文字で
図示される。
【００３７】 図６は、スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の紫外線による誘導を立証
する図である。 紫外線による誘導の17時間後に約１ｇの葉からRNA を抽出する。10〜20μｇを
ホルムアルデヒド／ホルムアミド変性ゲル上に置く. 泳動(3V.cm-1) 後、RNA を
ナイロン膜へ移し、紫外線(254μｍ、33mJ.cm -2) に暴露して固定する。ビオチ
ニル化プローブvst1を用いて65℃で一晩ハイブリッド形成させることによりノー
ザンブロットを得る。
【００３８】 出発材料として用いる外植片は、41B(対照) ビトロプラント(vitroplant)、又
はブドウの木のスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の余分なコピーをそれ
自身のプロモーターの制御下で組み込んだ構築物 (２つの完全なスチルベンシン
ターゼ遺伝子、vst1及びvst2、ブドウの木のゲノムDNA の断片及び別の切り詰め
た(truncated) ブドウの木のスチルベンシンターゼ遺伝子(vst3)を含む13kb挿入
物) で遺伝的に形質転換された41B ビトロプラント (それぞれ、クローン55-2及
び55-3に相当するクローン２及び３) から分離した葉からなる。
【００３９】 41B ：台木 雑種 V.vinifera,Chasselas× V.berlandierii. 図７は、紫外線による誘導後のスチルベンシンターゼmRNAの蓄積の動力学を示
す。
【００４０】 RNA を約１ｇの葉から抽出する。10〜20μｇをホルムアルデヒド／ホルムアミ
ド変性ゲル上に置く。泳動(3V.cm-1) 後に、RNA をナイロン膜に移し、紫外線(2
54nm、33mJ.cm-2) 照射により固定する。ビオチニル化プローブvst1を用いて、6
5℃で一晩ハイブリッド形成させることによりノーザンブロットを得る。
【００４１】 外植片は、41B ビトロプラントから単離した葉である。対照は、遺伝的に形質
転換されたものではなく、クローン２及び３ (それぞれクローン55-2及び55-3に
対応する) は、ブドウの木のスチルベンシンターゼをコードする遺伝子(vst1+vs
t2) を含む13kb挿入物 (上記参照) をそのゲノムに組み込んだものである。41B
：雑種台木 V.vinifara,Chasselas× V.berlandierii 。
【００４２】 図８は、紫外線で８分間処理され、誘導後に種々の時期に分析されたビトロプ
ラントの葉に存在するリスベラトロールの量を示す。 量は新鮮材料の１ｇ当たりのμｇとして表わす。
【００４３】 NI：誘導されず。 対照は、形質転換されない41B から採取した葉からなる。PCT55-2 及び55-3は
、２つの完全なスチルベンシンターゼ遺伝子(vst1+vst2) を含む13kb挿入物を組
み込んだ２つの形質転換体である。
【００４４】 図９は、20℃で７日後の、Botrytis cinerea mycelium.,916T 株の増殖阻害を
示す。 このmyceliumは種々の濃度のリスベラトロールを含むマルト／グルコース培地
で培養される。
【００４５】 図10は写真１を示す。 分生子の懸濁液を用いてビトロプラントの葉−非形質転換植物−に接種して５
日後の、Botrytis cinereaとの相互作用における種々の品種のブドウの木に特徴
的な肉眼観察。
【００４６】 上の列： −左：Folle blanche 種、クローン280 、感受性。 −右：Pinot noir種、クローン386 、中位の耐性。
【００４７】 下の列： −左：Ugni-blanc種、クローン479 、耐性。 −右：41B 台木、耐性。
【００４８】 図11は写真２を示す。 分生子の懸濁液を用いてビトロプラントの葉に接種して５日後の、Botrytis c
inereaとの相互作用における、異なる構築物(145：Ms PR10-1 プロモーター−vs
t1遺伝子; 55：２つの遺伝子、vst1及びvst2をそれら自身のプロモーターの制御
下に含む13kb挿入物) で形質転換された41B 台木のクローンに特徴的な肉眼観察
。
【００４９】 上の列： −左：クローン145-2 。 −右：クローン145-5 。
【００５０】 下の列： −左：クローン145-6 。 −右：クローン 55-3 。
【００５１】 図12は写真３を示す。 分生子の懸濁液を用いてビトロプラントの葉に接種して５日後の、Botrytis c
inereaとの相互作用における、種々のブドウの木の品種に特徴的な蛍光顕微鏡観
察。
【００５２】 蛍光：フルターユニットＡ(340から380nm への励起; 425nm のストップフィル
ター) 。リスベラトロールは青白い及び青い (その濃度により) 蛍光を発し、一
方、クロロフィルは赤の蛍光を発する。黒色部分は、菌類の感染部分又はそれら
が小さい場合は壊死部分に相当する。
【００５３】 上の列： −左：Folle blanche 種、クローン280 、感受性。 リスベラトロールの合成はほとんどないか全くない。
【００５４】 −右：Pinot noir種、クローン386 、中位の耐性。 葉脈及び真菌の解離 (maceration) 部分におけるリスベラトロールの合成。 下の列： −左：非形質転換台木41B(耐性) 感染の小さい非常に局部的な部分 (壊死部分) の周囲の葉脈及び葉片において
強いリスベラトロールの合成。
【００５５】 −右：構築物145 、即ちvst1遺伝子プロモーターPMsPR10-1 で形質転換され
た台木41B 、クローン145-5 、高耐性。感染部位の周囲及び感染部位で葉の葉身
ほぼ全体にわたって、リスベラトロールの強い合成。
【００５６】 実施例１ アルファルファPRタンパク質遺伝子の制御配列を含むゲノムクローンの取得 Ａ) プロモーターを見つけるためのプローブの取得 (図１及び1a参照) アルファルファ(Medicago sativa) とPseudomonas syringae pv pisiの宿主／
寄生体の関係において得られる不適合反応 (過敏反応、HR) により、cDNA ライ
ブラリーの構築が可能になった。これは、細菌感染により生ずる壊死に隣接する
部分から抽出及び精製したメッセンジャーRNA から調製された。植物材料は、細
菌の懸濁液を浸透させてから６時間後に採取した。
【００５７】 マメ科植物におけるPRタンパク質は、保存されたモチーフを有することが知ら
れている; 従って、エンドウ豆及び大豆のPRタンパク質ですでに行われた配列決
定に基づいて定義された、これらのモチーフに対応するオリゴヌレオチドを合成
することが可能であった。PCR 増幅により、cDNAライブラリーにおいて転写物を
選択するのに用いられる放射性プローブを得ることができた。これらのクローン
の１つ、cDNA-PR7は、配列決定後にエンドウ豆及び大豆PRタンパク質をコードす
る遺伝子と87％の相同性を示したので、採用した。分析により、これが、VAN LO
ON等(1994)の分類による、クラス10のPRタンパク質をコードする遺伝子に実際に
相当することが判明した。これはMs PR10-1(Medicago sativa PRクラス10タンパ
ク質、クローン１) と命名された。
【００５８】 ノーザンブロッティングによりアルファルファで行われた調整により、不適合
反応においては、感染の３時間後に対応する転写物が蓄積しはじめ、24から48時
間の間に最大になり、72時間から先はゆっくり減少することが示された。
【００５９】 この断片は、次の２つの部分の範囲を定める内部BamHI 部位 (図２中Ｂで表わ
される) の存在を特徴とする： −１つは、5'と呼ばれ、約340 塩基を有するもので、ATG(転写されるが翻訳され
ない) の上流領域、及び306 塩基に相当する下流配列を含む、 −他方は、3'と呼ばれ、コーディング部分、即ち165 塩基の末端、及び停止コド
ンからpolyＡの始まりまでの186 ヌクレオチドである非翻訳3'領域に相当する。 Ｂ) ＰＲタンパク質のプロモーターを含むゲノムクローンの単離 1)ゲノムクローンの単離 EMBL4(カ価：7.108 p.f.u. (プレート形成ユニット) ×ml-1) 中で調製された
アルファルファのゲノムライブラリーをこの場合は用い、6.105 p.f.u.をまいた
。Ms PR10-1(cDNA PR7) の5'断片を、このライブラリーをスクリーニングするた
めのプローブとして用い、45個のクローンがシグナルを与え、このシグナルはこ
れらのクローンのうち13個において強かった。
【００６０】 Ms PR10-1 の5'及び3'断片を用いて行った制御酵素によるマッピング及びハイ
ブリッド形成により、７個の異なるクローンが存在するという結論に達した (図
２参照) 。アルファルファのゲノムDNA のブロットで検出されるバンドの大きさ
と、ライブラリーをスクリーニングすることによって得られたこの７個のクロー
ンの大きさ(9.3; 6.5; 6.1； 5.8; 4.8; 4.2; 2.2kbp) を比較すると、これら２
種の実験データの間によい一致がみられた (図２参照) 。従って、これから、PR
7 タンパク質をコードする遺伝子が小さい多重遺伝子族に相当することが推測で
きた。
【００６１】 これらのクローン (クローンC12 とは別に) の断片(EcoRI/EcoRI部位) を次い
で、その全体又は一部をサブクローン化し、配列決定を行った。 2)配列決定の実施 まず、配列決定するのに１つのクローン、即ちクローンC15 を選んだ (図１及
び1a参照) 。初期の配列決定作業により、PRタンパク質をコードする遺伝子のオープンリー
ディングフレーム中の約315 個のヌクレオチドのイントロンの存在が実証された
。次いで、検討対象のクローンを、BamHI で切断した後に分析した (図１a 参照
) 。クローンC15 ：6.1kb EcoRI とBamHI を用いたクローンの分析により、２つの断片、即ちE-B(約2.4k
bp) 及びB-E(約3.7kbp) を得ることができた。コーディング配列(600ヌクレオチ
ドのイントロンが介在) を配列決定し、Ms PR10-1(cDNA-PR7) のものと比較する
と、このゲノムクローンは、この参照cDNAと全く同一であることが分かった。 3)アルファルファ／シュードモナス系における単離したクローンの発現の分析 実験はクローンC15 にしぼり、防御反応の誘導の間、実際に転写されたメッセ
ンジャー分子を決定するために5'延長法を用いた。この方法は、さらに転写開始
部位の位置を決定しうる利点がある。結果より、クローンC15 はアルファルファ
／シュードモナス相互作用の一部としての、葉の防御反応の誘導の間に実際に発
現することが実証された。
【００６２】 実施例２ 単離したクローンのプロモーター活性を確認するために行われた遺伝的形質転 換 Ａ) 使用するプロモーター領域 立証のためのこれらの形質転換には２つのプロモーターが用いられた：対照プ
ロモーターと、アルファルファのゲノムから単離され、C15 に由来するPRプロモ
ーター(PMs PR10-1 プロモーターに相当する) 。 1)CaMV-35Sプロモーター 構成性であるこのプロモーターを、標準プロモーターとして用いる。これは、
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35S RNA サブユニットに対する遺伝子の
転写を制御する配列に相当する。gus レポーター遺伝子を有する構築物を製造す
るために用いられたプロモーター領域は実際にこのプロモーターの画分に相当し
、この画分は、プラスミドpDH51(PETRZAK et al.,1986)からのEcoRI/BamHI 断片
の形態で再分離された。 2)ＰＲプロモーター C15ゲノムクローンのプロモーター領域の検討を行った。このプロモーターはPM
s PR10-1と命名された。PMs PR10-1 これは、C15 クローンの2.4kb のEcoRI/BamHI(E/B)断片に由来する (図1a) 。
この断片をレポーター遺伝子 (下記参照) の上流でバイナリープラスミド (bina
ry plasmid) に組み込むことは、クローンC15 ではTATAボックス (転写開始) と
ATG(翻訳開始) の間に制限酵素部位がないため、困難であった。従って、欠失実
験を、約1.5kb の断片が得られるまで行った (INDS1 配列 )。次いで、次に用い
る異なるコーディング配列の上流に挿入されるよう、得られる断片へ平滑末端連
結によりBamHI 部位を付加した。この断片は、従って、これおよび上流プロモー
ター領域をクローン化するのに用いたcDNAに関して発現され、開始ATG コドンか
ら10bpに位置する、Ms PR10-1 遺伝子の5'UTR(非翻訳領域) の39末端ヌクレオチ
ド、Ms PR10-1 遺伝子のATG 及び、組み込まれたBamHI 部位のすぐ上流のコーデ
ィング領域(10bp)の短い断片を含む。クローニング部位を考慮すると、こうして
構築されたプロモーターは、潜在的ATG を有し、これは、キメラ遺伝子を作製す
る場合に少し離れた２つのATG コドンを存在させうることができる。従って、使
用される遺伝子 (レポーター遺伝子又はスチルベンシンターゼ遺伝子) のコーデ
ィングフレームを変化させる危険がある。
【００６３】 レポーター遺伝子を用いる形質転換実験には、例えばSTRATAGENE Bluescript
pSK+/-プラスミドにクローン化された後に、PMs PR10-1(PRI) を用いた。これを
、約1.5kb のEcoRI/BamHI 断片の形で再分離することが可能であった。 3)使用するプラスミド a) p35S-gusイントロン(VANCANNEYT et al.1990) このプラスミドは、pBin 19(BEVAN,1984) の誘導体であり、例えばバイナリー
プラスミドの右及び左の末端を有し、これらの末端の間に含まれる断片をアグロ
バクター細菌を用いて植物中へ挿入することを可能にする。
【００６４】 gus イントロン (ジャガイモLSI 遺伝子由来のイントロン) レポーター遺伝子
の開発により、混入したアグロバクター細菌による偽陽性 (特に一過性発現の間
) を除去することが可能になった。これらの細菌はイントロンをスプライシング
できない。
【００６５】 標準的な系では、β- グルクロニダーゼをコードするこの遺伝子により、特定
の基質(5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド) を用いた
場合に青色の発色が得られる。そこで、この青色は、分析した植物が形質転換さ
れ、その結果、酵素に対応する遺伝子のコーディング配列が転写され、従って、
それを制御するプロモーターが誘導されたことを示す。
【００６６】 b) pER97 このプラスミドは、プロモーター効率を試験するためのプロジェクトに参加し
ている研究所の１つにより構築された(P.RATET,ISV,SZABADOS et al. 1995 に引
用) 。これは、特に、LST イントロンを有するgus 遺伝子(E.coli uid A)のコー
ディングフレームとの転写融合を可能にする、複数のクローニング部位を有する
という利点がある。これはまた、上記プラスミドp35S gusイントロンの性質のい
くつかも有する (植物ゲノムへの組み込みのための末端、ネオマイシン型の抗生
物質へ抵抗性を付与する選択遺伝子：nptII 遺伝子) 。
【００６７】 プロモーターの活性はGUS 型の組織化学的及び酵素的試験により可視化して測
定できる。 ４)pPR97の誘導体 ２つの主要な構築物をつくり、次いでモデル植物の形質転換に用いた。
【００６８】 a)pPR97−35S プラスミドpDH51(以下の第５項参照) にクローン化された35S プロモーターを
切り出し、EcoRI/BamHI 断片の形で、レポーター遺伝子の上流の、pPR97 の複数
のクローニング部位に挿入した。このプラスミドは構築物が機能していることを
実証するための陽性対照であり、35S プロモーターがPRタンパク質クローンから
単離したプロモーターと同じ環境に置かれているので参照ともなる。
【００６９】 b)pPR97−PMs PR10-1 1.5kb 断片を上記と同じクローニング部位に、この場合もまたEcoRI/BamHI 断
片の形で挿入した。
【００７０】 c)pG 3-3 これは、２つの35S プロモーターを逆方向の縦列としてクローニングすること
により、組織化学的及び酵素的試験のための強い陽性対照が得られることを可能
にした。このプロモーターのアクチベーター配列は共同的に作用する。次いで、
gus イントロン遺伝子のコーディングフレームが、２つの35S プロモーターのう
ちの１つの制御下に置かれた。 ５) アグロバクター属菌株の調製 異なるプラスミドを用いて、塩化カルシウム培地で熱ショックによりコンピテ
ントE.coli DH5αの株を形質転換した。抗生物質 (カナマイシン) を含む培地上
で形質転換細胞を選択し、miniprepを用いてそれらが組み換え体であることを確
認した後、これらの細菌を用いて、組み換えプラスミドを、自己伝達性プラスミ
ドであるpRK2013(DITTA et al.,1985)を有するE.coli HB101株を用いて三親 (tr
iparental)接合によりアグロバクター属の菌株へ移行させた。
【００７１】 ２つのアグロバクター属の菌株を用いた：EHA105、無毒化したアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) 、形質転換植物の再生に
用いる (安定な形質転換) 、及びA4TC24 アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes)、これは毛根反応及び、その根が形質転換されているが
、そうでない場合は、もとの表現型と同じ表現型を有する複合植物を得るために
用いた。 ６) モデル植物における遺伝的形質転換 ２種類の形質転換 (一過性及び安定な) を、３種類のモデル植物、即ち、ニコ
チアナ・ベンタミアナ(Nicotiana benthamiana) 、メディカゴ・トルンカツラ(M
edicago toruncatula)及びローツス・コルニクラツス(Lotus corniculatus)を用
いて行った。
【００７２】 示される結果は主に、N.benthamiana で得られたるものであろう。 ７) 一過性形質転換 この最初の一連の実験は、gus 遺伝子を用いて作製された構築物が真核細胞で
機能することを迅速に証明するために行われた。
【００７３】 従って、N.benthamiana の葉を採取し、EHA105株の異なる誘導体と共に寒天培
地で共培養した。次いで、形質転換の48時間後に組織化学的検査を行い、次に、
一晩(12 時間) 培養後に調べた。
【００７４】 対照プラスミド、p35S gusイントロン及びpPR97-35S は、二次プラスミドの場
合で弱い場合であっても、陽性のGUS 着色を生じさせた。 ポリリンカーの一部がgus 遺伝子の転写開始部位及びATG の近くに保持されな
ければならないので、この弱い反応性は構築の問題であることは疑いない。この
ポリリンカー部分はくり返し配列を含むので、この遺伝子の転写を妨げうる。
【００７５】 pPR97-PMs PR10-1構築物は、35S gus イントロン陽性対照のものと同様のgus
遺伝子活性を与えた。従って、誘導性であると予想されたこのプロモーターは、
構成性プロモーターに匹敵する効果を示した。
【００７６】 この結果は、試料採取中か培養中、葉に加えられた細菌の感染または傷の結果
であると説明できる。第一の仮説は証明できないので、実験プロトコルを、外植
片に生じるストレスを減少させるために改変した(10 〜30 g.l-1のショ糖濃度を
用いる共培養培地の浸透圧の増加、比較例高い真空度範囲の適用：水銀柱10〜10
mmの相対真空度、及び表皮の著しい又は適度の圧搾によるかなりひどい傷を葉に
生じさせる) 。
【００７７】 結果は、形質転換細胞の数は圧力が高くなるほど増加することを示した。しか
し、安定な形質転換を達成するためには妥協が見出されるべきである。なぜなら
、この場合に得られる一過性形質転換の多くは、その後該細胞に対してしばしば
致死的となるからである。後者は、次いでカルスを生じさせ、次いで苗条を、そ
れから植物体を再生することはできない。いずれの場合も、プロモーターの誘導
性は部分的に確認される。というのは、35S-gus イントロン構築物による着色が
共培養５日後までに検出されうるのに対し、pPR97- PMs PR10-1-gus イントロン
を用いて得られたものは、48時間でより急激に生じるが、非常に速く減少するか
らである。 ８) 安定形質転換 ９) タバコ：N.benthamiana pPR97-35S 、pPR97-PMs PR10-1およびpG3-3 を用いて一連の形質転換を行った
。かなりの数の小植物体 (plantlet) をこの一連の形質転換で得られた。使用す
る各プラスミドに対し少なくとも７つの馴化した植物体を得ようと試みた。しか
し、p35S-gusイントロンに関してはできず、５つの植物体を再生させ馴化させた
だけであった。得られた結果は表１にまとめられる。
【００７８】
【表１】
【００７９】 表１の説明 結果は得られた量として表す。 Accl. ：馴化された小植物体 外植片に対する苗条の数：( ) 内の数字は、最初の一連の実験において１カ月
で得られた苗条の数に相当する。この系列 (35S gus イントロン構築物を含む)
においては、最大数の苗条、従って最大数の馴化する植物体を得るために、カル
スは培地においてより長く置かれた。第２の系列の場合では、１カ月後十分な数
の苗条が得られ、そこで実験をやめた。
【００８０】 遺伝的形質転換：これらは標準的方法で、葉身１cm2 の部分に行い、この部分
は30秒アグロバクター属細菌の懸濁液に浸漬し、次いで、細胞分裂とコーロゲネ
シス (caulogenesis) 用の寒天培地 (MURASHIGE etc al.,1962),0.1mg. l-1 NAA
(ナフタレン酢酸) 、１mg.l-1 BAP (ベンジルアミノプリン) 、400mg. l-1セフ
ォタキシム (アグロバクターの除去) および70mg.l-1 カナマイシン (形質転換
細胞を選択するための試薬) で、継代培養する前に48時間共培養した。最初の苗
条が現れる (共培養の約１カ月後) と、植物ホルモンを含まないこと以外は前記
と同じ発根培地に入れる。
【００８１】 遺伝子のコーディングフレームの上流にあるプロモーターの性質に応じ、gus
イントロン遺伝子の発現に関する結果を迅速に分析すると、PMs PR10-1プロモー
ターが試験したすべてのプロモーターの中で最もよい結果を示すことが分かる。
より詳しい分析は以下に示される。
【００８２】 9)PMs PR10-1プロモーターの特性決定 プラスミドpPR97-PMs PR10-1-gusイントロン このプロモーターは、gus 遺伝子の構成的発現において、試験した器官により
異なるが、最もよい結果を示した。
【００８３】 a)カルスにおける活性 強い構成的発現がみられた。陽性の組織化学的試験を得るには数分の培養で十
分であった。従って、このプロモーターは、この種の材料では強く誘導され、VA
N LOON (1985) により得られた結果と一致するものである。インビトロで培養さ
れるカルスはストレスのかかった状態であり、PRタンパク質はこのような条件下
で発現される。
【００８４】 b)馴化された全植物体における活性 根 プロモーターを誘導し、培養２時間後に組織化学的検査は陽性となる (35S プ
ロモーターを用いた場合は５時間) 。gus 遺伝子の活性はタバコの根では均一で
なく、古い部分の表皮と頂端分裂組織のみが、この試験に特徴的な青い発色を示
した。文献によれば、根における防御遺伝子活性は普通の条件下でもみられる。
【００８５】 花 強い構成的活性が、この構築物で形質転換されたタバコの全植物体の中で花、
特に葯および花粉でみられた。gus 遺伝子活性は、萼片の突起様構造体 (tricho
me) においても、また花弁ではより弱く検出された。これらの結果も、花の部分
において防御遺伝子が誘導されることを示す、VAN LOON (1985) の結果と一致す
る。
【００８６】 葉 植物成体の若い葉の突起様構造体において弱い構成的gus 活性がみられた。タ
バコの場合は、大きい葉を有するロゼット (rosette)期が幼若期に、そしてエイ
ジング期が種子形成期に相当する。この弱い活性は主に、多細胞の突起様構造体
にみられた。知る限り、このような構造物におけるPRタンパク質の発現はこれま
で文献に記載されていない。
【００８７】 従って、分離されたPMs PR10-1プロモーターはタバコの葉 (７つのうち３つの
植物体) の突起様構造体において構成的誘導活性を有することは可能であるが、
この活性は発育段階の影響下にあるようだ。
【００８８】 従って、病原体による誘導がないと、タバコ中のプロモーターの活性は根、花
部 (葯および花粉) および気中部分 (基本的には突起様構造体) の数個の細胞に
限られる。
【００８９】 実施例３ 形質転換されたその他の植物種 1) メディカゴ・トルンクラータ (Medicago trunculata) この種の場合、複合植物、すなわち、野生型の気中部分 (非遺伝的形質転換)
と形質転換された根をある同じ時期に有する植物を作製する試みがなされた。
【００９０】 若い芽を用いた。主根を伸ばした後、切り出した胚軸をプラスミドp35S-gusイ
ントロンまたはプラスミドpPR97-PMsPR10-1-gus イントロンを有するAgrobacter
ium tumefaciens EHA 105 の懸濁液に浸漬し、形質転換された新たに形成した根
を得た。１週間後、根を採取し、組織化学的 GUS試験を行った。この実験では、
対照は上記の群と同様の方法で処理した (胚軸を切り取るが、アグロバクター属
細菌の懸濁液には浸漬しない) 若い芽からなる。
【００９１】 対照群の全外植片が１週間以内に新しい根を形成したが、対照的に、アグロバ
クター属細菌で処理した群では外植片の50％が反応したにすぎなかった。処理が
どのようなものであれ、GUS 試験に対して陽性反応を示す根はなかった。
【００９２】 他方、壊死していても、処理群の胚軸の基部は青色の発色 (形質転換細胞の存
在) を示すことにより、よく反応した。次いで、外植片の壊死部分を切り取り、
これらを再び発根させた。すると、50％が新しく根を形成し、そのいくつかは、
いくらかの部分において試験に対して陽性であるはずであった。
【００９３】 従って、基本の幹細胞中に構築物を組み込んだ細胞系に対応する形質転換部分
を有する、キメラ根 (形質転換細胞および非形質転換細胞を含む根) が得られた
。
【００９４】 試験した二つの構築物、即ち、P35S-gusイントロンおよびpPR97-PMs PR10-1gu
s イントロンは、各群において実験した６つの外植片のうち、それぞれ３および
２の外植片でこれらの形質転換された根の細胞系を与えた。
【００９５】 実験モデルは、検討中のもの [リゾビウム属細菌 (Rhizobium)による根粒着生
の現象に関連するPRタンパク質形質転換の検討] には適応されないが、それにも
かかわらず、これはPMs PR10-1プロモーターはこの植物においてもとの植物 (Me
dicago sativa)と同様に機能性であることを実証した。
【００９６】 2)ローツス・コルニクラツス (Lotus corniculatus) この場合も、実験は、共生菌、リゾビウム・メリロチ (Rhizobium meliloti)N
ZP2037株 (PETIT et al.,1987)による根粒着生に関与するプロモーターの誘導を
検討する目的であった。従って、毛根現象 (毛根表現型) を生じさせるために若
いLotierの芽の胚軸細胞をAgrobacterium rhizogenes A4TC24 株で形質転換する
ことにより複合植物を生産した。これが発育したら、この現象の進展を増幅させ
るために、主根を切り取り、小植物体を液体培地に入れた。植物体が馴化したら
、窒素固定共生に関連するプロモーターの誘導を、根粒着生条件 (BLONDON, 196
4)下に小植物体を置くことにより研究した。この研究に用いる二つのプロモータ
ーは、M.trunculataで行った実験で使用したものと同じであった：35S およびPM
s PR10-1。これらの二つの構築物を用いると、毛根表現型を有する根の10％以下
が、GUS 試験で陽性の根を示した。一般的には、この表現型を有する根は対照の
根よりも根粒着生が少なかった。
【００９７】 35Sプロモーターを含む構築物で得られものの場合は、gus 試験に陽性反応を示
す根粒のみであり、他方、その他の構築物 (PMs PR10-1プロモーター) の場合は
、二次根の開始点から離れた根全体にわたり着色が生じた。それとは別に、この
後者の構築物では、Rhizobium melilotiとの相互作用において毛根由来の根で根
粒を得ることはできなかった。
【００９８】 実施例４ アルファルファPR遺伝子のプロモーターおよびgus イントロン遺伝子を用いた 構築物で形質転換したタバコの過敏反応の検討 Ａ) アルファルファPR遺伝子プロモーターおよびgus イントロン遺伝子を連結 した構築物で形質転換したN.benthamiana における過敏反応 1)過敏反応 (HR) 試験 N. benthamiana/Pseudomonas syringae pv.pisi 相互作用において進展した過
敏反応 (HR) を本実験で用いた。ゲノムに、プラスミドp35S gusイントロンおよ
びpPR97-PMs PR10-1-gusイントロンの異なる挿入断片を導入して形質転換したタ
バコ植物体を馴化させ、次いで109 菌/ml の濃度のP. syringae (ESNAULT et al
.,1993) の懸濁液を浸透させた。この溶液を皮下注射器を用いて葉片に注射した
。この性質を有するモデルを用いると、HR反応は48時間後に十分に生じるとみな
される。
【００９９】 上記菌の懸濁液を浸透させた葉を、GUS 組織化学的試験を用いて検討中の異な
るプロモーターの誘導を評価するために、接種から24、48および96時間後に採取
した。可能な全身の反応を評価するために、浸透させた葉の下に位置する葉につ
いても同じ組織化学的試験を行った。
【０１００】 2)HR反応条件下のプロモーター誘導の検討 ａ)35S構成性プロモーター 35S 構成性プロモーター (例えば、プラスミドpG3-3)の場合は、P. syringae
による接種は、試験への反応を変化させなかった。この反応は接種から数分後に
明らかとなった。従って、この菌による浸透は、35S プロモーターで得られる構
成的グルクロニダーゼ活性を変化させない。
【０１０１】 ｂ) PRタンパク質遺伝子のプロモーター：Ms PR10-1 プロモーター 表２に示すように、このプロモーターは病原体の攻撃によりすぐに誘導されう
る。HR反応は24時間ではまだ完全に進展していない (効果が十分に示されるのは
48時間) が、GUS 試験はすでに陽性である。得られた形質転換された若いタバコ
植物体の場合は、着色が弱く、主に浸透させた葉の葉身に生じる。
【０１０２】 全身反応、すなわち感染した葉の下の葉における反応、に関しては、着色は葉
身のみに生じる。成体 (発達した茎を有するが、まだ花をつけていない) および
幼時 (ロゼット) のタバコ植物体は、同じ型の反応を有し、組織化学的試験で測
定されるように弱いgus 遺伝子活性をもつ。
【０１０３】 花をつけるか、種子を有する、より成長したタバコ植物体の場合は、この試験
で得られる着色は、特に、感染した葉の葉脈および突起様構造においてより強く
、着色は全身反応の場合はこれらの組織に存在するだけである。
【０１０４】 従って、これらの観察から、植物の年令に応じたレポーター遺伝子の発現にお
ける違いが実証される。植物の発達段階に依存するこの反応は、植物PRタンパク
質について行われたほとんどの検討で見出された。PMs PR10-1プロモーターの誘
導は、レポーター遺伝子の発現が菌の接種後96時間ではもはや明らかではないの
で、一過性の現象である。
【０１０５】 誘導は、また、植物/ 細菌の相互作用において得られるHR反応に対して限定さ
れるものではない。外植片の一つが真菌類に感染した場合、PMs PR10-1-gusイン
トロン構築物で同じ型の反応が得られる。次いで、壊死した雑菌混入部分とは別
の、感染した葉全体にわたり、gus 遺伝子の均質な発現が明らかとなった。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】 表２の説明： 結果は、分析した植物の数と比較したGUS 組織化学的試験に陽性応答した植物
の数として示される。
【０１０８】 Ｂ) 異なるプロモーターの制御下のgus イントロン遺伝子の定量的発現 この方法は酵素試験に基づく。 この方法は以下のものを使用する： ａ) gus 遺伝子によりコードされる酵素の粗抽出物、該酵素は形質転換タバコ
植物体から得たものである、および ｂ) 基質、すなわちP-ニトロフェニル- グルクロニド 基質が加水分解される速度は分光光度計で監視され、抽出物中のタンパク質全
量に関連する。他方、これはあまり感度がよくないので、この方法は、gus 遺伝
子の上流の強力なプロモーターの存在を必要とする。
【０１０９】 従って、組織化学的試験に用いる基質 (Ｘ gluc ：５- ブロモ-4- クロロ-3-
インドリル- β- グルクロニド) と12時間またはそれ以上インキュベーションす
る必要がある分析には用いなかった。
【０１１０】 これらの実験条件下で、プラスミドpG3-3 に位置する35S プロモーターは、プ
ラスミドpPR97 にあるPMs PR10-1プロモーターを用いて行った場合よりも５倍以
上の基質加水分解速度 (不定の単位で表す) を示した。これに対し、PMs PR10-1
プロモーターは、35S プロモーターがプラスミドp35S-gusイントロンに位置する
場合には35S プロモーターよりも、gus 遺伝子のより強い発現を示した。実際に
、後者の場合には基質の加水分解は検出されなかった。
【０１１１】 同様に、その他の構築物が用いられた場合には、分光光度計により検出可能な
値を得ることはできなかった。 実施例５ スチルベンシンターゼ遺伝子に相当するDNA の単離およびスチルベンシンター ゼの発現 ブドウの木のスチルベンシンターゼをコードする遺伝子を取得するために二つ
の方法を用いた。一方では、文献 (WIESE et al.,1994)のデータから遺伝子配列
を得ることができた。他方、約13kbのゲノム挿入断片をBAYER AG (農業部門研究
所/Biotechnology-Pflanzenschutzzentrum、モンハイム、D-51368 、レーベンク
ーゼン) から入手した。
【０１１２】 BAYER 社はドイツのDentsche Sammlung Von Mikroorganismen (DSM) に、ブド
ウの木のスチルベンシンターゼ遺伝子を有するプラスミドを含有するE. coli の
菌株 (EP-464、461 参照) ：E. coli Fier 1 pVst 1 株 (DSM 6000、1990年6 月
18日寄託) 、E.coli Fier 2 pVst 2 株 (DSM 6003 1990 年６月18日寄託) およ
びE.coli Fier pVst 12 〜３株 (DSM 6346,1991 年２月11日寄託) を寄託したこ
とを記載する。 BAYER社は、アメリカホドイモのスチルベンシンターゼ遺伝子を
有するプラスミドpGS828.1を含むE. coli Nurdug 2010 株 (DSM 4243、1997年９
月17日寄託) も寄託した (EP-309,862参照) 。以下に報告する研究を行うのに用
いた挿入断片は実際、二つの完全に機能するスチルベンシンターゼ遺伝子配列 (
vst １およびvst ２遺伝子) および不完全なvst ３配列を含む複合ゲノムクロー
ンに相当する。
【０１１３】 従って、生成した構築物に組み込むのにvst １遺伝子の配列を選択した。これ
は、通常形質転換ベクターとして用いられているプラスミドに直接クローニング
するのに適した制限部位を含まない4.9kb ゲノム断片 (プロモーターを含む機能
性配列) に相当する。従って、pCDNAII と命名されたプラスミドにおいて中間の
クローニングを行うことにより、これに追加の部位を付加した。
【０１１４】 Ａ) プラスミド pCDNAIIにおける中間クローニングによる追加の部位の付加 上記vst1遺伝子のゲノム断片を、EcoRI/PstI断片(2.1kb) の形でクローン化さ
れたもとのプラスミドから分離し、プラスミドpUC19 に再びクローン化した。ク
ローン化されたvst1断片を、制限部位を変更し、遺伝子のターミネーターを削除
してBamHI/BamHI 挿入断片(1.8kb) を分離できるようにするために、プラスミド
pCDNA IIの同じ部位(EcoRI/PstI)に導入した。アルファルファのゲノムライブラ
リーから分離されたものを含む種々のプロモーターを用いて構築物を作製するの
に用いたのは、遺伝子のオープンリーディングフレームに相当するこの断片であ
る (図４参照) 。次いで、この挿入断片を、適宜制限酸素で切断後に得られる種
々の断片の大きさをサザンブロット法を用いて決定した後、pBIN19中にクローン
化した。 Ｂ)vst1 遺伝子の発現の検討 ブドウの木においてスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の発現を実証す
るために、vst1遺伝子を含むプローブ(1.8kb) を、E.coli HＢ101 で増殖させた
プラスミドpCDNAII から調製した。次いで、スチルベンシンターゼをコードする
遺伝子又は転写物が、対照又は形質転換されたブドウの木から抽出した核酸を用
いて行ったサザン及びノーザン・ブロットにおける化学発光により検出されるよ
うに、このプローブをポーラー・プレックス(Polar Plex)キット(Plex 化学発光
キット、millipore)を用いたランダムプライミングによりビオチニル化した。
【０１１５】 1)ブドウの木41Ｂ (V.vinifera Chasselas X V.berlandiseri 雑種; 台木) か
ら抽出したゲノムDNA を分析するためのvst1プローブの使用 ゲノムDNA を抽出し、次いでこれをEcoRI で切断した後、サザンブロット分析
を行った。vst1プローブを用いると、多数のバンド (約15) が得られた。これら
のバンドは実際に、スチルベンシンターゼをコードする配列を含み、多重遺伝子
族(WIESE et al.,1994による６〜８の遺伝子) を構成する断片に相当する。これ
らの中で、vst1、vst2及びvst3は互いに強い相同性を示す。さらに、このプロー
ブにより、その他の遺伝子、特にカルコンシンターゼ多重遺伝子族に相当する遺
伝子を認識することができる。これは、２つの酵素が同じ構造をもち、同じ大き
さである (41〜44kbの大きさのサブユニットの二量体) ためである。それらはま
た、同じ基質を用い、そのアミノ酸配列は高度の相同性を、少なくとも活性部位
については、示す。
【０１１６】 ２つのプラスミドのDNA を、クロスハイブリッド形成が可能かどうかを確かめ
る目的で抽出した。１つのプラスミド、pCDNAII はvst1遺伝子を含み、他方のpP
CV 002は実験室で利用できる、Rosierカルコンシンターゼ遺伝子を含んでいた。
Rosierカルコンシンターゼ遺伝子に対応するビオチニル化プローブも調製した。
クロスハイブリッド形成を行って得られたサザンブロットにより、vst1プローブ
が実際にRosierカルコンシンターゼ断片を認識し、その逆もあったことが示され
た。このクロスハイブリッド形成では発するシグナルはより弱い。
【０１１７】 2)ブドウの木の葉を用いたリスベラトロールの分析 新鮮な植物材料、葉又は茎、を、液体窒素を含む粉砕機で粉末にし、メタノー
ル (新鮮材料(f.m.)100mg につき1ml)で無極性化合物を抽出する。
【０１１８】 遠心分離により破砕物を除いた後、メタノール抽出物を0.45μｍフィルターで
濾過し、次いで窒素下で蒸発乾固する。残渣を純粋なメタノール(100μl/f.m.10
0mg)中にとる。色素 (特にクロロフィル類) を除去するために、試料をメタノー
ルで予め平衡化したC18 カラム(Sep-Pack WATERS) を通す。抽出物の定性及び定
量分析を、ダイオード- アレイ検出器 (モデル990.WATERS) に接続したWATERS H
.P.L.C.(モデル600E) でH.P.L.C. (高圧液体クロマトグラフィー) により行う。
クロマトグラフィーの担体は逆相C18 カラム(C18 ultra base, 205×4.6mm, 5μ
m;Shandon)からなる。抽出化合物の分析はイソクラティック(isocratic) な条件
下で流速１ml／分で行い、移動相は35/65 V/V k アセトニトリル／水混合物から
なる。
【０１１９】 吸収スペクトルを 200〜400nm の間で２秒毎に得て、リスベラトロールを最大
吸収305nm で検出する。 リスベラトロールの定量を、市販のリスベラトロール(Sigma) を用いて行った
５、10、20、50及び100mμg/mlの溶液のクロマトグラフィーにより得られる標準
直線を用いて外挿して行う。リスベラトロールの濃度は、この分子に対応するピ
ーク下の面積から測定して、f.m.又はd.m. (乾燥物) の単位質量、あるいは分析
した試料のクロロフィル質量に関連する。
【０１２０】 実施例６ ブドウの木のスチルベンシンターゼをコードする遺伝子を異なるプロモーター に連結した核酸構築物 1)構成的プロモーターを用いる構築物 構成的発現を可能にする遺伝子構築物を作製するために２つの関連するプロモ
ーターを用いた。
【０１２１】 第１の構築物では、ブドウの木のスチルベンシンターゼのDNA(vst1) を、直列
に配置した (同じ方向に) ２つのCaMV35S プロモーターを含むカセットからなる
制御配列の制御下に置いた。35S ポリアデニル化配列も、vst1遺伝子をコードす
る配列の末端に付加した。したがって、こうして作製されたキメラ構築物は以下
のようにまとめられる。
【０１２２】 (CaMV)p35S-(CaMV)p35S-vst1-(CaMV)35SpolyＡ 第２の構築物では、vst1コーディング配列を、４つのエンハンサー配列の制御
下においた。これらの配列はCaMV35S プロモーターから分離し、CaMV35S プロモ
ーター及びブドウの木の遺伝子(vst1)のプロモーターの本来のエンハンサー配列
の上流に直列に配置した。こうして得られた２つのキメラ配列は、まずプラスミ
ドPMP 90RKに挿入し、次いでアグロバクターGV3101株に導入した。
【０１２３】 これら２つの制御配列は「強力な」構成性プロモーターであるとみなされる。 2)13kb挿入断片 (その本来のプロモーターの制御下のvst 遺伝子) を用いた同
種構築物 約13kbの大きさのブドウの木のゲノムDNA 断片については上に述べた。これは
、詳しくは、スチルベンシンターゼ酵素をコードする２つの機能的遺伝子(vst1
及びvst2) と、１つの不完全 (機能しない) 遺伝子(vst3)を含む。このブドウの
木の配列は、プラスミドpGV3850 に共組み込みされ、これを次いでアグロバクタ
ーの菌株に導入した。従って、この配列はその本来のプロモーターの制御下のvs
t(ブドウの木のスチルベンシンターゼ) 遺伝子のオープンリーディングフレーム
に相当する。
【０１２４】 13kb断片を含むプラスミドで形質転換した41Ｂ植物のいくつかの系列を取得し
、３つの異なるプローブ(nptII遺伝子由来の1.8kb プローブ; アンピシリン耐性
のための遺伝子由来の2.4kb プローブ、及びTDNAの最終組み込み配列を含むプラ
スミドpPBIN19 の左末端由来の１kbのプローブ) を用いたサザンブロット法によ
り検討し、分析した。用いた植物の大部分は、これらのプローブのいずれかと反
応した。これらのクローンは略号により番号をつけられた：構築物に対しては55
、得られた異なる形質転換体には２、３、５、６、７及び９。
【０１２５】 3)誘導性PMs PR10-1プロモーターを用いる構築物 アルファルファPRクローンから分離された、PMs PR10-1プロモーターを含む構
築物を作製した (図５参照) 。
【０１２６】 プラスミドpBin 19-PMs PR10-1−vst1−35S ターミネーター遺伝子の構築物 アルファルファから分離されたPMs PR10-1プロモーター及びvst1遺伝子はそれ
ぞれ翻訳開始ATG コドンを含むので、追加のATG なしにvst1遺伝子を構築物にク
ローン化するために、アダプターを作製した。このアダプターは、それぞれの場
合において、11bpの２つのオリゴヌクレオチドの形で合成され、そのうちの１つ
はBamHI 適合性であり、他方はMunI適合性であった。次いで、アダプターを、プ
ラスミドpUC19 中にクローン化されたvst1遺伝子のMunI部位に導入した。次いで
、挿入断片をBamHI で切断して回収し、その後、これをPMs PR10-1プロモーター
と35S ターミネーターの間のpBIN19にクローン化した。従って、vst1遺伝子の挿
入断片は、そのアダプターと共にPMs PR10-1プロモーターと35S ターミネーター
の間に位置する。これらの条件下では、vst1遺伝子のATG が除去され、３つの追
加コドンが該遺伝子の上流のvst1コーディングフレーム中に含まれた。この遺伝
子のオープンリーディングフレームが該構築物の残部と同じ位相にあることを配
列決定により確認した。
【０１２７】 41Ｂ植物を、挿入断片、とりわけキメラ配列：PMs PR10-1−プロモーター−vs
t1遺伝子35S ターミネーターを含む挿入断片で形質転換した後、上記したnptII
プローブを用いたサザンブロット法で形質転換体を分析した。アグロバクテリウ
ム系ではこの植物のゲノムへの挿入断片が右末端で開始し、左末端で終止するこ
とが認められるので、この方法、特にこのプローブを用いた完全な組込みを実証
することは十分にはできなかった。使用した構築物において、nptII 遺伝子は右
末端近くに位置するので、組込みが部分的でありうる。即ち、nptII 遺伝子は挿
入されるが、その後、左末端に達する前に組込みが阻止される。形質転換体は14
5 と称され、結果を以下に示した形質転換体に対して２、５及び６の番号を付し
た。
【０１２８】 実施例７ ブドウの木の遺伝的形質転換及び検討中のプロモーターの効率の分析 上記のように (実施例６) 、41Ｂ台木(V.vinifera × V.berlandieri) 実験室
モデル系を形質転換するために４つの主要な構築物を製造した。この系を用いる
理由は、アグロバクターを用いた、胚性(embryogenic) 細胞懸濁液の形質転換に
おいて良好な結果を与えるという利点をもつためである。胚性細胞 0.1〜１μl
P.C.V. (充填細胞量) を用いた実験において平均約50の形質転換体を得られる。
さらに、選択、形質転換された胚の発生及び植物への再生はすべて速い。６〜８
枚のよく発達した葉を有する小植物体を培養２ヶ月でインビトロで得ることがで
きた。
【０１２９】 Ａ) 構成性プロモーターの制御下のvst1遺伝子を含むベクターを用いた41Ｂの 遺伝的形質転換 ２つの構築物を試験した。１つはvst1遺伝子の上流に直列に配置した35S ダブ
ルプロモーターを含むものであり、他は、その本来のエンハンサー配列を有する
vst1遺伝子の上流に全体が位置する、CaMV35S プロモーターの上流に直列に配置
した４つのCaMV35S エンハンサー配列から構成される制御配列からなる。ブドウ
の木の胚性細胞を形質転換する目的で、４つの試験を行った (各構築物について
２つずつ) 。植物あるいは胚でさえも再生させることができたものはなかった。
どの場合も、アグロバクターとの培養48時間後に、胚性細胞懸濁液の急速な壊死
が生じた。これらの構築物は、これらの「強力な」プロモーターの制御下でvst1
遺伝子を構成的に発現している形質転換植物を得るのに用いることはできない。
１つの仮説が提唱される：この遺伝子の発現が、スチルベン性フィトアレキシン
の生産に応答して胚性の可能性のある細胞が急速に壊死して胚への再生を阻害す
ることが可能である。
【０１３０】 35S 型の構成性プロモーターを含む構築物で得られたこれらの否定的な結果は
特に病原体により誘導されうる同種又は異種のプロモーターによりvst1遺伝子の
過発現を制御する重要性を証明している。
【０１３１】 これらの結果は、FISHERおよびHAINにより1994年に発表され、CaMV 35Sプロモ
ーターを用いた場合にタバコにおいてアメリカホドイモのスチルベンシンターゼ
遺伝子を高いレベルで構成的に発現させるのに成功しなかったという事実を示す
結果に類似している。これらの著者によれば、上記構築物を用いる場合、植物が
病原体に攻撃されると遺伝子の発現が負に制御されるであろう。彼らの仮説によ
れば、この制御は病原体により通常誘導され (特に、PRタンパク質の合成) 、ウ
イルスのプロモーターを阻害するであろう防御機構の、植物による展開に由来し
うる。
【０１３２】 Ｂ) 非生物的及び／又は生物的ストレスにより誘導されうるプロモーターの制 御下にvst1遺伝子を有するベクターによる41Ｂの遺伝的形質転換 1)生きのびた状態で分離された採取葉において、及び全植物体対照41Ｂブドウ
の木のビトロプラント (vitroplant) 又は13kb挿入断片で形質転換された41Ｂブ
ドウの木のビトロプラントにおける、vst 遺伝子の発現、及びその紫外線による
誘導の動力学の検討 スチルベンシンターゼ酵素により触媒される反応の生成物であるリスベラトロ
ール (ブドウの木の主要フィトアレキシン) の合成が、無生物的ストレスの条件
下である紫外線により誘導されうることが実証された(LANGCAKE et al.,1977; S
BAGHI et al.,1993)。正常な条件下では、ブドウの木はわずかしか、または全く
リスベラトロールを合成しない; 対照的に、紫外線(254nmにおける紫外線への10
分間の暴露、60μW/cm2 のランプ) での誘導、次いで暗中での20時間後に、フィ
トアレキシンが採取された葉で合成される。
【０１３３】 a)使用した方法 葉の照射 −ビトロプラントの葉：254nm 、600 μW/cm2 のランプで13分間、 −254nm において600 μW/cm2 のランプで８分間、ヒドロプラントから分離し
た葉、 −植物材料からのmRNAの抽出及び分析、及び誘導後一定時間での365 nmでの励
起後の蛍光によるリスベラトロールの測定。
【０１３４】 各試料は、同じ植物から分離され、別々に紫外線により誘導されるが、抽出及
び分析のために混合された３つの葉からなる。試験は、ビロトプラントから分離
された採取葉において、または、寒天培地で培養され６〜７枚のよく発達した葉
を有するビトロプラントにおいて行う。各小植物体(plantlet)の３枚の最も古い
葉をとり、試験に用いる。葉の上面を紫外線に暴露する。分析後、得られるリス
ベラトロールの量を、分析した葉の新鮮重量の１ｇあたりか、あるいは乾燥物１
ｇ当たり (遠心分離後及びメタノールで抽出後のペレットで評価) の生成物のμ
g で表わされるか、クロロフィル１ｇ当たりのリスベラトロールのmgで表わされ
る。
【０１３５】 以下に示す表は、２つの遺伝子、即ちvst1とvst2−この両方の遺伝子はそれら
の本来のプロモーターの制御下にある−が挿入断片として用いる配列中に存在す
る13kbのゲノムクローン構築物で形質転換された。41Ｂ及び55−Ｘクローンにつ
いて得られた値を表わす。
【０１３６】 b)採取した葉への非生物的 (紫外線) ストレスの検討 (実験No.1) 構築物55(13kb 挿入断片) とクローン２(55-2)及び3(55-3) に対応する結果を
以上の表３及び４ (リスベラトロールの分析) に示し、図６及び７ (転写物の分
析) に図示する。スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の発現の紫外線によ
る誘導の動力学の検討は、紫外線による誘導を分析から区別し、17時間に固定す
る (表３及び図６参照) か、または誘導後０、８、17、24又は32時間の種々の期
間である一定期間後に行った。
【０１３７】 表３：非誘導対照及び形質転換した葉で、または紫外線での誘導17時間後の対
照および形質転換した葉において検討されるリスベラトロールの量 (新鮮材料の
μg ・ｇ-1で表わす)
【０１３８】
【表３】
【０１３９】 表３の説明：紫外線にる誘導前に41Ｂビトロプラントから葉を採取した。クロ
ーン55-2及び55-3は、スチルベンシンターゼをコードする遺伝子を含む13kbの挿
入断片を組込んだ形質転換植物に相当する。
【０１４０】 約450nm において青／紫バンドでみられる蛍光は、採取した葉の葉脈で非常に
強く、葉の表面全体にわたり均一に分布している。紫外線で誘導しなかった対照
葉では、蛍光はみられない。これらの結果は、スチルベンシンターゼをコードす
る遺伝子の特異的発現を立証する。vst1プローブを用いて行った、ノーザンブロ
ット法による転写物の分析から、紫外線で誘導された葉の場合はその発するシグ
ナルが非常に強いが、非誘導植物の場合にはないか非常に弱い、約1.8kb の大き
さの断片の存在が実証される (図６参照) 。表４ ：紫外線で誘導され、寒天培地で培養されている植物から採取し、分離し、
誘導後種々の時期のリスベラトロール濃度について分析した41Ｂビトロプラント
の葉におけるリスベラトロール濃度の進展の動力学。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】 表４の説明：結果は新鮮材料１ｇ当たりのμg で表わされる。PCT55-2
及びPCT55-3 でそれぞれ形質転換された２つの植物体を対照と比較して分析した
。
【０１４３】 NI：紫外線で誘導されない。 これらの条件下で、紫外線によるストレスを与えた後、対照葉でみられるリス
ベラトロールの量は、誘導後24時間で最大となる (41Ｂについてはf.m.１ｇ当た
り80μg のオーダー) 。しかし、ビトロプラントの継代培養のサイクル：マイク
ロ増殖サイクルにおける分析の時期によってかなり変化がある。
【０１４４】 vst1プローブを用いたノーザンブロット分析後に得られる結果は図７に示す。
非常に似た大きさ (約1.8kb)の少なくとも２種類の転写物が検出された。カルコ
ンシンターゼ転写物とのクロスハイブリッド形成が無視できないにもかかわらず
、認識される異なるメッセンジャーRNA はおそらく、異なるスチルベンシンター
ゼ遺伝子の発現に対応する。このように、ブドウの木では(WIESE et al.,1914;K
INDL私信) スチルベンシンターゼをコードする多重遺伝子族の異なる遺伝子の誘
導の動力学に違いが存在することが示された。
【０１４５】 ノーザンブロット分析により、ブドウの木41Ｂから採取し、次いで、紫外線へ
の暴露がその典型である無生物的ストレスを受けた葉においては、スチルベンシ
ンターゼ転写物は誘導後約17〜32時間で最大の発現を示すことが実証された。
【０１４６】 これらの結果は、ブドウの木の細胞培養で得られる結果に匹敵し、これはまた
、発現の同じパターンを、しかし２つの最大値が存在する(WIESE et al.1994)こ
とを立証した。
【０１４７】 c)分離された生存葉 (実験No.2) における非生物的ストレス (紫外線) 、葉の 分離前のビトロプラントにおける誘導の検討 下の表５は、13kb挿入物が組み込まれた形質転換体の第２の系列について得ら
れた結果を示す。スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の発現の紫外線によ
る誘導の動力学の検討を、紫外線による誘導を分析から区別する20、40又は60時
間の種々の期間後に行った。
【０１４８】 表５：紫外線による誘導及び異なる生存時間で抽出後のブドウの木のビトロプ
ラントの分離した葉におけるリスベラトロールの濃度
【０１４９】
【表５】
【０１５０】 表５の説明：リスベラトロールの濃度は乾燥物１ｇ当たりのμg で表わされる
。41Ｂ台木 雑種V.vinifera Chasselas× V.Berlandierri 表５に表わされる結果から２つの群の植物を区別することができる： −第１のものは、対照及び形質転換体のうちの２つ、即ち55-6及び55-7に対応
する。一般に、それらは、乾燥物１ｇ当たり280 〜410 μg の最大リスベラトロ
ール濃度を示し、この最大値は一般に、誘導後20時間であるが、ただしクローン
55-7は40時間である。
【０１５１】 −第２の群は、より高い最大値、即ち第１の群のほぼ２倍 (乾燥物１ｇ当たり
820 〜930 μg)を示す。この群は形質転換体(55-2 、55-3及び55-9) のみからな
る。最大値は紫外線による誘導後40時間で表われるが、他方、誘導後20時間では
、これらの植物体はしばしば、第１の群よりもずっと低い濃度を有する。これは
、例えばクローン55-2及び55-3 (それぞれ、乾燥物１ｇ当たり135 及び44μg)の
場合である。しかし、クローンの１つ、即ち55-9は、すべての場合 (誘導後20、
40及び60時間後で乾燥物１ｇ当たり386 、823 及び54μg)において対照よりも高
いリスベラトロール濃度を示すので興味深い。
【０１５２】 この生残している葉の系では、誘導されない対照はリスベラトロールを示さず
、ほとんど全ての場合 (異なる挙動を示すクローン55-5は別として) において、
リスベラトロール濃度は誘導後60時間で劇的に低下する。 ｄ) 寒天培地で培養中のビトロプラントについて行った非生物学的ストレス (紫 外線) の検討 寒天培地で成長中の植物について行った本試験は、植物の他の防御メカニズム
、少なくともin vitro培養条件下で発現されることができるメカニズム、が発現
されているかもしれない時に、リスベラトロールの産生を分析することを可能に
するものである。さらに、本試験は、より長期間にわたって (前回の試験では分
離された葉は72時間過ぎに壊死する) リスベラトロールの合成を監視することを
可能にする。
【０１５３】 培養中の４つの形質転換した41B ビトロプラントのクローン(55-2, 3, 5 およ
び6)を前回と同じ条件下 (254 nmで８分間) で紫外線により処理し、この誘導の
20時間後に葉だけを該植物から摘み取った。得られた結果を、形質転換しなかっ
た対照、ならびにVitis rupestris の１クローンおよびVitis vinifera種の３ク
ローン (本技術分野ではその果実 (ベリー) に対するBotrytisによる攻撃への感
受性が比較的高いことが知られている) と比較した。
【０１５４】 実際、文献 (SBAGHI et al., 1993)で、ぶどう畑で評価したBotrytisに対する
ベリーの感受性と、紫外線により誘導されたビトロプラントの葉のリスベラトロ
ール含有量、との間に相関関係が存在することが実証されている。結果を次の表
６に示す。
【０１５５】
【表６】
【０１５６】 表６の説明 紫外線による誘導は、寒天培地で培養されているビトロプラントについて行う
。処理の20時間後に、葉を摘み取って分析のために抽出する。
【０１５７】 Pct 55-2, 3, 5および6 −そのゲノム中に13 kb 挿入断片を組込んだ形質転換
体。結果は３回の平均を示す。 これらの結果は、品種およびブドウの木植物体の中で、Botrytisに対する感受
性と誘導から20時間後の葉のリスベラトロール含有量との間に相関関係が存在す
るというよい表示となる。形質転換していない品種及びブドウの木の植物体は２
つの群に分類することができる。V. ruspestris, V. vinifera×V. berlandieri
(41B)およびUgni-blancにより構成される第１の群は、真菌に比較的耐性のある
群に相当する。Pinot noirおよびFolle blanche からなる第２の群は、適度に耐
性ないし非常に感受性 (例えば、Folle blanche)と見なされる群を表す。
【０１５８】 形質転換体に関する限り、それらは、非形質転換41B 対照に等しいか、それよ
り大きな誘導20時間後のリスベラトロール含有量を平均して有する (クローン55
-6, 55-2および55-3についてそれぞれ乾燥材料の539, 362および236 μg.g-1で あり、対照については237 μg.g-1) 。
【０１５９】 これに対し、形質転換クローン55-5の場合に得られた濃度は、対照の半分であ
る。乾燥重量のμg.g-1で表されたこれらの値を、分離した葉のそれ (表５) と 比べると、対照の場合には類似している一方で、誘導の20時間後に分析した形質
転換体の場合には変化していることがわかる。これらの変化は、時に非常に大き
い (クローン55-2の場合は分離した葉の誘導の135 に対して、ビトロプラントの
誘導は362 ；クローン55-3の場合は236 に対して44；クローン55-5の場合は116
に対して392 ；クローン55-6の場合は540 に対して339)。また、各回の試験の間
の変動も大きい。 ２) 13 kb 挿入断片およびPMs PR10-1の制御下のvst1遺伝子だけを含む構築物に
より形質転換された41B ぶどうの木のビトロプラントにおける生物学的ストレス
によるvst 遺伝子の発現とその誘導速度の比較検討 遺伝子の形質転換により数コピーのスチルベンシンターゼ遺伝子 (２つの機能
的vst1およびvst2配列を含む13 kb 挿入断片の形態) を組み込んだビトロプラン
トで得られた上の結果 (第１章) は、スチルベンシンターゼ酵素により触媒され
る反応から産生するリスベラトロールの過剰産生が、これらの遺伝子がそれら自
身のプロモーターの制御下にあり、紫外線照射のような非生物学的ストレスに反
応している場合に、一部の形質転換体において起こりうることを示している。
【０１６０】 次に、２種類の形質転換体において、これらの結果に関してリスベラトロール
の産生を証明した。第１の形質転換体は13 kb 挿入断片 (それら自身のプロモー
ターの制御下におけるvst1およびvst2スチルベンシンターゼ遺伝子) を組み込ん
だ41B クローンであり、第２の形質転換体は、アルファルファ防御遺伝子調節配
列PMs-PR10-1の制御下でvst1遺伝子のみを組み込んだいくつかのクローンである
。この比較は、Botrytis cinereaにより生じさせた生物学的ストレスによる誘導
後に実施した。 ａ) 使用した方法 α)Botrytis cinerea に対するリスベラトロール分子の真菌毒性作用の実証 この分子の真菌毒性の性質に関する文献のデータは矛盾している。DAI (1994)
によれば、リスベラトロールはPlasmopora viticola(ウドン粉病の病原体) の遊
走子の発現に対し阻害作用を実際に示す；これに対し、PONT and PEZET (1990)
は、リスベラトロールがBotrytis cinerea分生子の発芽を阻止しないと主張して
いる。
【０１６１】 10-1Ｍないし3.7.10-3Ｍの希釈範囲にリスベラトロールを含有する麦芽／寒天
培地で培養中のBotrytis cinereaの菌糸体の菌糸成長に及ぼす該分子の作用の試
験を、菌糸を常温で７日間培養して実施した。結果は、該分子が阻害効果 (IC50 ＝500 μmol.l-1) を有することを示し、125 μmol.l-1より高濃度では該真菌の
平均増殖径が指数的に減少した。一方、37μmol.l-1の濃度は菌糸体の成長に非 常にわずかの阻害活性しか有していない (図９を参照) 。しかし、この阻害は、
これらの条件下で７日間の培養後は漸増する。この培養条件は、それ以外の点で
は該真菌の増殖に非常に有利な条件である。20日後、真菌は最終的に培養表面の
全体に感染した。 β) ブドウの木のビトロプラントのBotrytis cinereaに対する耐性のスクリーニ ング試験 試験の実施は、ミクロ増殖(micropropagation)培地でin vitro培養中の小植物
体の葉を、麦芽／グルコース培地中に1.10-4分生子/ml を含有する分生子懸濁液
20μl を葉の上面に付着させる (１付着当たり分生子200 個) ことにより接種す
るものであった。４枚の違う葉をこうして接種した小植物体を、人工環境室 (照
明時間：昼16時間、夜８時間、温度24℃、湿度70％) 中で栽培した。接種の２日
後、４列目の葉、即ち、最も若い葉を検査し (存在する壊死および解離<macerat
ion>を、テレビモニターに接続したカメラを用いてカウントした) 、Botrytis攻
撃に応答して合成されたリスベラトロールを分析するためにメタノールで抽出し
た。５日目に、２番目の葉を蛍光顕微鏡法により観察するために摘み取った。ま
た、３番目の葉について、肉眼観察 (葉の壊死および解離) と真菌の子実体 (分
生子柄) を示す葉のカウントを行った。最後に、９日目に、３種類の異なる植物
から摘み取られた、真菌と相互作用している葉を、リスベラトロールを分析する
ためにメタノールで抽出した。 γ) Botrytis cinerea胞子を含有する懸濁液をビトロプラントの葉に付着させる ことによる生物学的ストレスの誘導−Botrytisに対する耐性試験 この直接対抗試験は、既に説明した (前節参照) 方法を用いて実施した。同じ
方法を適用して観察を行った。各品種または形質転換クローンに対して４つのビ
トロプラントを使用し、これらのビトロプラントのそれぞれの場合、２、３およ
び４列目に発生した３枚の葉を分生子懸濁液で接種した (20μl の麦芽／グルコ
ース培地中の200 個の分生子) 。従って、各品種またはクローンについて12回の
接種を実施し、下記の分析および観察を行った。 →接種の２日後： −４列目の葉を葉の徴候について検査 (真菌胞子の周囲に位置する小さな黒み
がかった褐色領域からなる真菌解離ゾーンまたは壊死スポット、または肉眼で見
える徴候がない) 、および −同じ葉のリスベラトロールの分析。 →接種の５日後： −３列目の葉を葉の徴候について検査すると共に、分生子柄 (真菌の子実体)
を持つ葉をカウント、および −リスベラトロール合成の領域を位置決定するため２列目の葉の蛍光顕微鏡観
察。 →接種の９日後： −３種類の異なる植物体から得た寄生体と相互作用している３枚の葉のリスベ
ラトロールの分析。
【０１６２】 各実験シリーズについて、その葉のBotrytis攻撃に対する感受性の異なる下記
の３種類のVitis vinifera種： Folle blanche (感受性) 、Pinot noir (やや耐
性) およびUgni blanc (耐性) を、台木 41B (耐性) ならびにその形質転換体の
４つ：１つはスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の余分のコピーが挿入さ
れたもの(13 kb挿入断片) 、即ち、クローン55-3であり、残り３つはPMs PR10-1
プロモーター-vst1 遺伝子構築物を保有する形質転換体、即ち、クローン145-2
、145-5 および145-6 を意味する、と一緒に試験した。 ｂ) 得られた結果 接種の２または５日目に観察された葉の徴候に関する結果を表７および８に、
また、リスベラトロールの分析結果を、乾燥重量またはクロロフィル含有量のい
ずれかに関連させて、表９および10に示す。
【０１６３】
【表７】
【０１６４】 表７の説明 −解離領域：Botrytisが植物細胞を急速に破壊しつつある広く拡散した領域。
これらの領域は淡く褐色味を帯びたベージュ色を呈する。
【０１６５】 −壊死スポット：真菌の周囲に中心を持つ非常に小さい領域。これらのスポッ
トは黒みを帯びた褐色を呈する。
【０１６６】
【表８】
【０１６７】 表８の説明 −解離領域：Botrytisが植物細胞を急速に破壊しつつある広く拡散した領域。
これらの領域は淡く褐色味を帯びたベージュ色を呈する。
【０１６８】 −壊死スポット：真菌の周囲に中心を持つ非常に小さい領域。これらのスポッ
トは黒みを帯びた褐色を呈する。
【０１６９】
【表９】
【０１７０】 表９の説明 −Folle B280: Folle blanche 280; Pinot N386: Pinot noir 386; Ugni B479
: Ugni-blanc 479; 台木41B:台木41B 。
【０１７１】
【表１０】
【０１７２】→接種の２日後 最も若い葉 (列４) に関する観察。解離部分 (真菌による定着) が、41Ｂ及び
クローン145-2 と145-５は別としてほぼすべての場合に見られた。
【０１７３】 感受性のブドウの木の品種は、耐性の品種よりも高程度に解離部分を示した：
Folle blanche とPinot noir は、それぞれ４および３つの部分を示したのに対
し、Ugni blanc 種の場合は１つのみであった。145 形質転換体 (PMs PR10-1プ
ロモーター−vst １遺伝子) とUgni blanc のみが目にみえる徴候のない葉を生
じた。植物の防御反応である壊死部分は、主に41B とその形質転換体、およびブ
ドウの木の品種の場合はPinot noir と Vgni blanc において現れた。
【０１７４】 これらの観察をリスベラトロール分析 (表９) と比較すると、乾燥重量に関す
る場合、これらの葉におけるリスベラトロールの含量は乾燥材料１ｇ当たり約10
0 μｇの値に匹敵するので、何らかの関連を立証することはできない。試験した
すべてのビトロプラントにおいて、含量はクロロフィル１ｇあたり４〜５mgの間
の値に定まる。
【０１７５】 より高い値を有するのは台木41B 、特に形質転換体145-2 のみである。クロー
ン145-5 は低い値を有する (約半分の大きさ) 。 上記でビトロプラントに紫外線で誘導して20時間後に得られたリスベラトロー
ルの含量 (表６) との比較もなしうる。サンプリングの時間は同等ではない (胞
子の発芽に必要な時間を考慮しなければならないが、生物的ストレスの場合の4.
8 時間に比べ、無生物的ストレスの場合は20時間) にもかかわらず、生物的スト
レス後により低含量のリスベラトロールが全般的にみられる。(Ugni blanc の場
合は1/2 または1/3 の量) 。ただし、含量が同等であるPinot noir および含量
が約３倍大きいFoll blancheは別である。
【０１７６】 分析した全試料において、実施された種々の繰り返し分析で得られた値は、著
しいバラツキがあることが強調されるかもしれない。一つの同じ植物の異なる葉
の間のこの変動は、紫外線による誘導をうけた試料で前に観察されたが、後者の
場合も、いくつかの異なる因子によるかもしれない。最もありうる仮説は以下の
通りである。
【０１７７】 一つの同じクローンのビトロプラントの間の、真菌による攻撃にあった際の、
その反応性における大きな変動。Botrytis の胞子を接種した後に得られた種々
の葉の徴候はこれ (感染における各植物の生理学的状態における変化等) を確認
しているようだ。
【０１７８】 葉全体について行われる分析は、葉を形成する各細胞に存在するリスベラトロ
ールの合成における変化を表すものではない。このように、寄生体に対する過敏
反応において、防御分子を合成するのは、葉身のすべての細胞ではないことが一
般に認められる。フィトアレキシンを合成するよう誘導されるのは、真菌の攻撃
部分近くに位置する細胞のみである。従って、この試験で行われた分析は、寄生
体と相互作用する葉の葉身に存在する平均リスベラトロール濃度に対応する値を
表すだけである。従って、フィトアレキシンを合成するように誘導される細胞中
に存在する濃度と、葉全体を分析した場合に見られる値との間に、特に耐性植物
の場合に分類可能な希釈効果が生じうる。この効果は植物の防御反応の発現の初
期段階において、確かにより著しい。 →接種後５日 徴候の観察 (写真No.1および２) ( 図10および11および表８) は、ブドウの木
のすべての品種、台木および検討された形質転換体において解離部分がかなり多
数形成されていることを示している。これらの解離部分は、分生子柄 (真菌の子
実体) の存在に伴うことが多い。ブドウの木の品種と対照の台木41B の中で、Bo
trytis に最も感受性である Folle blanche が、検討したすべての葉への攻撃
、また分生子柄を示す。徴候の重症度の序列が確立されれば、Pinot noirが次で
あり、Ugni blancが続き、最後が41B である。しかし、これらの後者の二つの品
種は、分生子柄は葉の半分に発生するだけであった。形質転換体クローンに関す
る限り、３つのクローンが多かれ少なかれ類似した反応を生じる：55-3、145-2
および145-6 。クローン145-5 のみが、解離部分が葉の半分に発生し、分生子柄
は見えないので、寄生体に対して良好な耐性を示した。
【０１７９】 他方、このクローンの葉のほとんどは、壊死部分を形成することにより攻撃に
反応した。写真２ (図11) にも例が示される。 これらの結果がリスベラトロール合成の誘導における著しい違い、従って、ス
チルベンシンターゼをコードする遺伝子の発現に十分に対応するかどうかを確か
めるために、Botrytis 胞子を接種した葉を蛍光顕微鏡 (フィルターユニットＡ
：340 から380nm への励起フィルター；425nm のストップフィルター) で検査し
た。これらの条件では、クロロフィルは赤色の蛍光を発し、リスベラトロールは
その濃度に応じ、青白いまたはより濃い青色の蛍光を発する。ブドウの木の二つ
の品種、すなわちFolle blanche(感受性) とPinot noir (やや耐性) 、台木41B (耐性) およびその形質転換の一つ、すなわち145-5 (PMs PR10-1 プロモーター
-vst１遺伝子構築物) をこの方法で検討した。これらの観察から得られた写真を
写真３ (図12) に示す。著しい違いがみられる。Folle blanche の場合は、寄生
菌糸体 (写真中黒色) が発達し、組織に定着した。実際上は青味がかった細胞は
見えない。Pinot noir 種の場合は、青っぽい部分が観察され、この部分は接種
部分および周囲に障壁を形成し、真菌による初期のコロニーを形成する。菌糸体
の成長は、組織解離過程がすでに始まっていても、この障壁により阻止されない
としても遅延される。葉脈においてもより強い青色の発色が存在する。対照の台
木41B の場合に検討された部分では、葉身全体に分布した散在した細胞は、薄い
青色の蛍光を発し、葉脈においてはより強い。真菌のコロニー化過程は始まって
おらず、少数の細胞に限定される散在した壊死部分がみられる。PMs PR10-1プロ
モーター-vst１遺伝子構築物で形質転換した41B については、その結果はクロー
ン145-5 の場合において顕著である。真菌による組織の初期のコロニー化が始ま
る (黒色部分) 一方、リスベラトロールを合成している細胞障壁がこの部分の周
囲に急速に形成され、それにより拡がりを防御する。真菌の解離の部分において
依然、青色の細胞が目にみえる。さらに、真菌に接触していない葉の葉片の細胞
の多くは、それら自身でリスベラトロールを合成した。葉脈もまた、強い青の発
色を示す。
【０１８０】 これらの観察は、ビトロプラントをBotrytisの胞子で接種した後に生じる葉の
徴候の強さと葉におけるスチルベン性フィトアレキシンの含量との間に関連が存
在することを証明する。最も耐性の強い植物は、葉片の大部分にわたり分布して
いるリスベラトロールの合成を示す植物である。
【０１８１】 アルファルファから単離されたプロモーターであるPMs PR10-1プロモーターの
制御下にスチルベンシンターゼをコードする遺伝子を有する形質転換体145-5 が
そうである。 →接種の９日後 徴候の観察から、Folle blanche のビトロプラントがこの試験においては同様
にBotrytisの攻撃に特に感受性であることが立証された。９日目に、これらはす
べて真菌に寄生され、そのクロロフィルはほとんどの場合、著しく破壊される。
Ugni-blanc 種および台木41B については、葉の徴候の発現に何ら違いを観察す
ることはできなかった。一般的に言えば、５日目で得られた徴候の観察が再び見
られ、解離部分の場合において多少発達している。他方、分生子柄を示す葉のほ
とんどは壊死した。
【０１８２】 Folle blanche (感受性) 、Ugni-blanc (耐性) 、41B (耐性) および145-5 (P
Ms PR10-1 プロモーター-vst１遺伝子で形質転換された41B)の４つの品種を、そ
のリスベラトロール含有量について分析した。
【０１８３】 接種後９日では、145-5 はまだBotrytis攻撃の徴候はあまり示さなかった。リ
スベラトロール含有量の分析結果を表１０に示す。乾燥重量１ｇ当たりのリスベ
ラトロールのμｇ、またはクロロフィル１ｇ当たりのmgで表される場合、リスベ
ラトロールの濃度は次のようにして品種を等級づけるのに使用できる。最低値か
ら最高値までの順位：Folle blanche ＜41B ＜Ugni-blanc＜形質転換41B 株145-
5 。
【０１８４】 形質転換体145-5 は、41B 対照のほぼ43倍 (乾燥重量１ｇ当たり) で、クロロ
フィル１ｇ当たりで表すと50倍の値を示すので、濃度の違いは非常に大きい。従
って、この分析は、５日目になされた蛍光顕微鏡での評価 (写真３、図12参照)
を十分に確認するものである。
【０１８５】 Ugni-blanc および41B に関しては、表10は、どの単位を選んでも前者が後者の
３倍のリスベラトロールを有することを示す。しかし、これら２つの品種は、葉
の徴候に関しては同じように反応する。耐性におけるこの類似は、リスベラトロ
ールの合成以外の要因により説明できる。この試験条件下では、植物/Botrytis
の対抗が後者に特に有利であることも注意すべきである。インビトロの容器中の
環境条件は、培養の約20日後に、その性質にかかわらず、すべてのビトロプラン
トが真菌に感染することを確実にする。
【０１８６】 Ｃ) ブドウの木の遺伝的形質転換および検討したプロモーターの効率の分析に 関する結論 種々の構築物を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスで形質転換した
、41B ( 雑種台木 V. Vinifera×V. Berlandieri) の胚性細胞についての実験か
ら35S プロモーターまたはその誘導体の制御下のvst １遺伝子を有する構築物を
含む植物を再生することはできなかった。従って、全植物体にわたり強い構成的
活性を得ることはできなかった。
【０１８７】 対照的に、PMs PR10-1-vst１遺伝子および13kb挿入構築物 (それらの本来のプ
ロモーターの制御下のvst １およびvst ２) を導入したブドウの木の植物体が取
得された。これらの遺伝的形質転換植物を、対照 (非形質転換41B)と比較し、マ
イクロ増殖によりそれらを増殖させることは可能であった。
【０１８８】 それらの本来のプロモーターの制御下にある二つの遺伝子、すなわちvst １お
よびvst ２、が挿入断片として用いられる配列中に存在する13kb挿入断片を用い
て製造した異なる形質転換体において、紫外線のストレス (非生物的ストレス)
下で得られたリスベラトロール濃度には、非形質転換対照と比べて、ほとんど違
いはみられなかった。
【０１８９】 対照的に、この結果はキメラPMs PR10-1-vst１遺伝子構築物により、Botrytis
cinereaにより生じる生物的ストレスの存在下、感染９日後に、フィトアレキシ
ンであるリスベラトロール (スチルベンシンターゼにより触媒される反応の生成
物) の約50倍の過発現をさせうることを実証している。そこで、これらの植物は
、対照または、13kb挿入断片を用いて得られた形質転換体と比べた場合に、最も
強い耐性があることを立証している。
【０１９０】 このように、誘導性の、アルファルファのプロモーターPMs PR10-1をスチルベ
ンシンターゼ遺伝子に連結した構築物での形質転換により、スチルベンシンター
ゼ遺伝子を、病原体攻撃などのストレスに応答してブドウ植物体において過発現
させることができる。 参照文献 BEVAN M. 1984 、「植物形質転換のための２つのアグロバクター属菌のベクター
」 Nucl. Acids Res.,12, 8711-8721. BLONDON F. 1964. Contribution a l'etude du developpement des gramines.
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【図面の簡単な説明】
【図１】 IND S1配列に対応する誘導性プロモーターPMs PR10-1を単離する方法における
種々の工程を図示する全体図である。
【図１ａ】 IND S1配列に対応する誘導性プロモーターPMs PR10-1を単離する方法における
種々の工程を図示する全体図である。
【図２】 単離された、サザンブロットに対応する種々のクローンを表わす図である。
【図３】 誘導性の、アルファルファプロモーターPMs PR10-1の単離されたゲノム配列で
あるIND S1配列に対応するDNA 配列を示す図である。
【図４】 アダプターの付加により改変されたブドウの木のスチルベンシンターゼの遺伝
子配列に相当するDNA 配列を示す (改変 vst1)図である。
【図５】 アダプターを付加して改変したブドウの木のスチルベンシンターゼの遺伝子配
列 (改質 vst1 、図４に相当) に連結した、誘導性プロモーターPMs PR10-1配列
(小文字のIND S1配列に相当) を含むDNA 配列を示す図である。
【図６】 スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の紫外線による誘導を立証する図で
ある。
【図７】 紫外線による誘導後のスチルベンシンターゼmRNAの蓄積の動力学を示す図であ
る。
【図８】 紫外線で８分間処理され、誘導後に種々の時期に分析されたビトロプラントの
葉に存在するリスベラトロールの量を示す図である。
【図９】 20℃で７日後の、Botrytis cinerea mycelium.,916T 株の増殖阻害を示す図で
ある。
【図10】 写真１を示す図である。
【図11】 写真２を示す図である。
【図12】 写真３を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月１４日（２０００．４．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シュライアー、ペーター−ヘルムート ドイツ連邦共和国、Ｄ−50674ケルン、ダ ッセルシュトラーセ16 (72)発明者 ブレ、ミッシェル フランス国、Ｆ−77000リブリィ−スール −セーヌ、リュー・ドゥ・ボー、60 (72)発明者 エスノルト、ロベール フランス国、Ｆ−91190ジフ・スール・イ ブット、アレ・デ・クドレ、31 Ｆターム(参考） 2B030 AB03 CA14 CA17 CA19 4B024 AA08 BA07 CA03 CA04 CA09 CA12 DA01 DA05 DA06 EA04 FA02 FA07 FA10 GA11 GA17 GA19 4B065 AA11X AA26X AA89X AA89Y AB01 AC20 BA02 CA27 CA53

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 スチルベンシンターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
    配列に連結したアルファルファPRタンパク質のプロモーター配列を含む核酸。
  2. 【請求項２】 アルファルファPRタンパク質のプロモーターが生物的又は非
    生物的ストレスにより、組織特異的にまたはそうでなく、植物中に誘導されうる
    プロモーターであることを特徴とする、請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】 アルファルファPRタンパク質のプロモーター配列が下記から
    なる群より選択されることを特徴とする、請求項１または２記載の核酸。 ａ) IND S1配列、 ｂ) IND S1配列の断片に相当し、植物におけるプロモーター配列の効果を有す
    る任意の配列。
  4. 【請求項４】 アルファルファPRタンパク質のプロモーター配列が、IND S1
    配列と少なくとも80％の相同性を示すことを特徴とする、請求項３記載の核酸。
  5. 【請求項５】 アルファルファPRタンパク質のプロモーター配列が、IND S1
    配列と少なくとも90％の相同性を示すことを特徴とする、請求項３記載の核酸。
  6. 【請求項６】 アルファルファPRタンパク質のプロモーター配列が、IND S1
    配列と少なくとも95％の相同性を示すことを特徴とする、請求項３記載の核酸。
  7. 【請求項７】 スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の配列が、アメリ
    カホドイモ、ラン、ブドウの木及びマツのゲノムから単離した遺伝子から選択さ
    れることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれかに記載の核酸。
  8. 【請求項８】 スチルベンシンターゼをコードする遺伝子の配列が、ブドウ
    の木のスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の配列であることを特徴とする
    、請求項７記載の核酸。
  9. 【請求項９】 ブドウの木のスチルベンシンターゼをコードする遺伝子の配
    列が下記のものから選択された配列であることを特徴とする請求項８記載の核酸
    。 a)vstI遺伝子、 b)vst2遺伝子。
  10. 【請求項10】 請求項１ないし９のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸
    を含むことを特徴とする、植物においてスチルベンシンターゼ遺伝子を発現させ
    るための系。
  11. 【請求項11】 前記系がベクターであることを特徴とする、請求項10記載の
    、植物においてスチルベンシンターゼ遺伝子を発現させるための系。
  12. 【請求項12】 前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする、請求項
    11記載の発現ベクター。
  13. 【請求項13】 アグロバクター属の菌株中に移行しうることを特徴とする、
    請求項10ないし12のいずれかに記載の発現系。
  14. 【請求項14】 生物的または非生物的ストレスにより植物中に誘導しうるこ
    とを特徴とする、請求項10ないし13のいずれかに記載の発現系。
  15. 【請求項15】 前記生物的ストレスが寄生体の攻撃であることを特徴とする
    、請求項14記載の発現系。
  16. 【請求項16】 前記寄生体が細菌、酵母、真菌またはウイルスであることを
    特徴とする、請求項15記載の発現系。
  17. 【請求項17】 前記寄生体がボトリティス・シネリア(Botrytis cinerea)ま
    たはプラスモポーラ・ビチコラ(Plasmopora viticola) であることを特徴とする
    、請求項16記載の発現系。
  18. 【請求項18】 前記非生物的ストレスが機械系損傷であることを特徴とする
    、請求項14記載の発現系。
  19. 【請求項19】 前記機械的損傷が昆中により生じることを特徴とする、請求
    項18記載の発現系。
  20. 【請求項20】 前記機械的損傷が風や霜のような物理的現象により生じるこ
    とを特徴とする、請求項18記載の発現系。
  21. 【請求項21】 請求項10ないし20のいずれかに記載の系またはベクターで形
    質転換された植物細胞。
  22. 【請求項22】 ブドウの木の細胞であることを特徴とする請求項21記載の細
    胞。
  23. 【請求項23】 植物細胞を、請求項10ないし20のいずれかに記載の系または
    ベクターを含む微生物学的方法を用いて形質転換することを特徴とする、請求項
    21または22記載の細胞を得るための方法。
  24. 【請求項24】 スチルベンシンターゼ遺伝子を発現する植物を得るための方
    法であり、該植物の細胞を、請求項10ないし20のいずれかに記載の系またはベク
    ターを用いて形質転換し、該遺伝子を発現する細胞を選択し、これらの細胞から
    植物を再生することを特徴とする、前記方法。
  25. 【請求項25】 請求項10ないし20のいずれかに記載の発現系を含む植物。
  26. 【請求項26】 請求項21または22記載の細胞を含む植物。
  27. 【請求項27】 請求項23または24記載の方法を実施することにより得られる
    植物。
  28. 【請求項28】 農業上有用な植物であることを特徴とする、請求項25ないし
    27のいずれかに記載の植物。
  29. 【請求項29】 植物がブドウの木であることを特徴とする、請求項28記載の
    植物。
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