CN102120997A - 葡萄病程相关蛋白pr10-1水解rna与抑菌活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法，根据中国野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10-1基因，分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中，使其与GST标签处于同一读码框，PR10-1及其突变体融合蛋白与烟草赤星病菌的培养结果表明，PR10-1与Y151H对烟草赤星病菌的抑制效果比突变体K55N及E149G融合蛋白显著的多，这也是由于K55N及E149G中RNA酶活性有关的保守氨基酸残基被突变其RNA酶活性被降低所致。本发明所通过对所克隆的葡萄病程相关蛋白PR10-1体外RNA酶活性与抑菌活性的检测，快速验证出此葡萄病程相关基因PR10-1具有很强的抗病功能，这将加速筛选葡萄重要抗病基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及一个来源于葡萄的病程相关蛋白基因PR10-1，其体外融合蛋白水解RNA，及抑制病原菌生长的方法。属于植物基因工程领域。
背景技术
在长期自然进化过程中，植物体内形成一套很好的防御机制对外界环境的生物和非生物胁迫做出反应，这种防御机制是由许多正调控基因的表达来完成的，其中主要包括植物木质素、羟脯氨酸糖蛋白、裂解酶、蛋白酶抑制剂和一类小分子量PR蛋白。病程相关蛋白(PR)是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质，是植物防卫体系的重要组分部分。近年来，根据PR蛋白一级序列结构、血清学关系和生物学活性将已发现的PR蛋白分为17个亚类，基中一类具有类RNA酶的蛋白定义为第十类PR蛋白，即PR10。PR10基因开放读码框编码的氨基酸中都具有一个高度保守的“P-LOOP”结构域，这是一类广泛存在于磷酸化激酶和核酸结合蛋白的结构域，该区域的磷酸化与其RNA酶活性相关，而RNA酶活性则在防御病原体感染中起作用。PR10最先是在用激发子处理过的欧芹培养细胞中发现的。Flores等在2002年《植物生理学》128：1291-1302中报道，酢浆草PR10在体外有抑制细菌和真菌的作用，而Chen等在2010年《分子植物病理学》11(1)：69-81中报道，玉米PR10蛋白有体外抑制黄曲霉的作用。此外，从桦树、棉花、花生等植物中分离纯化的PR10均证实有体外RNA酶活性。
葡萄白粉病是遍布世界各葡萄生产区的严重真菌病害。葡萄白粉菌可以侵染葡萄的叶片、果实及新梢等幼嫩组织。葡萄白粉病流行年份对果实品质和产量往往造成很大的损失，同时还影响枝条的生长发育及葡萄第二年的生长发育。目前各葡萄产区栽培的葡萄优良品种多数对白粉病抗性较低，防治的主要方法是化学防治方法，这种防治方法不仅对土壤、水质等造成污染，而且影响葡萄及其加工产品的品质。长期使用抗病药物还会使病原菌产生抗药性。我国是世界葡萄属植物最重要的原产地之一，拥有丰富多样的野生葡萄资源。这些资源不仅丰产性好，对主要真菌病害具有极强的抗性，是重要的抗病基因资源。然而，传统的抗病基因功能验证需要将基因首先转入葡萄，而葡萄遗传转化效率低下，一直是其基因功能验证的瓶颈，这个过程相当耗费人力、财力与时间，其结果未必能筛选出大量真正抗病的基因。
发明内容
为加快筛选出中国野生葡萄抗病基因资源，以高抗葡萄白粉病的中国野生华东葡萄白河-35-1为实验材料，获得一个葡萄病程相关蛋白基因PR10-1cDNA全长序列827bp(GenBank登陆号DQ336289)，其中80bp-559bp的480bp开放阅读框构建GST融合载体，将融合载体导入原核系统表达出的PR10-1融合蛋白能水解酵母tRNA、并体外抑制烟草赤星病菌的生长，为此，本发明提供葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌的方法。
本发明是通过以下方法实现的：
根据中国野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10-1基因及其突变体K55N、E149G、Y151H四个基因，分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中，使其与GST标签处于同一读码框，将构建好各重组质粒导入大肠杆菌BL21中，在BL21中经IPTG诱导表达出融合蛋白，通过超声破碎法从BL21细胞中分离并纯化出PR10-1和突变体融合表达蛋白，将纯化好的融合蛋白加入到酵母tRNA液中，以煮沸变形的融合蛋白为阴性对照，以来源于大肠杆菌RNase为阳性对照，检测各融合蛋白的RNA酶活性，将加入不同量的融合蛋白到PDA培养基培养的烟草赤星病菌中，黑暗培养5天后观测赤星病病菌生长情况，用无菌去离子水从培养基表面洗下病菌后，在紫外分光光度计595nm测定病菌孢子悬浮液OD值，量化融合蛋白对赤星病菌生长的抑制。
本发明运用重叠嵌套延伸PCR法对葡萄病程相关蛋白PR10-1中三个与RNA酶活性和抗真菌活性有关的保守氨基酸残基进行点突变，分别构建获得PR10-1及其突变体K55N、E149G、Y151H的原核表达载体，其中，K55N的55位点赖氨酸突变成天冬酰胺、E149G的149位点谷氨酸突变成甘氨酸、Y151H的151位点酪氨酸突变成组氨酸，这四个基因在大肠杆菌中都能被IPTG诱导表达出与GST标签融合的蛋白，经过GST亲和介质分离纯化出各融合蛋白，用未经煮沸处理和已经煮沸处理的各融合蛋分别水解酵母tRNA结果表明，PR10-1及Y155H融合心蛋白具有RNA酶活性，K55N和E149G的RNA酶活性几乎检测不到，同时阳性对照RNA酶经100℃沸水煮沸15分钟不足以使其变性，其活性不丧失，而PR10-1及Y155H融合蛋白经100℃沸水煮沸15分钟处理后，蛋白变性致活性丧失，通过对蛋白的煮沸和不煮沸的对比，排除外界RNA酶干扰。K55N和E149G没有RNA酶活性缘自其中与RNA酶活性相关的保守氨基酸残基被突变致所致。此外，PR10-1及其突变体K55N、E149G、Y151H融合蛋白与烟草赤星病菌的培养结果表明，PR10-1与Y151H对烟草赤星病菌的抑制效果比突变体K55N及E149G融合蛋白显著的多，这也是由于K55N及E149G中RNA酶活性有关的保守氨基酸残基被突变其RNA酶活性被降低所致。本发明所通过对所克隆的葡萄病程相关蛋白PR10-1体外RNA酶活性与抑菌活性的检测，快速验证出此葡萄病程相关基因PR10-1具有很强的抗病功能，这将加速筛选葡萄重要抗病基因资源。
附图说明
附图1是本发明PR10-1及其突变体融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图示a泳道1：蛋白分子标准；泳道2：PR10-1重组蛋白；泳道3：突变体Y151H重组蛋白；b泳道1：突变体K55N重组蛋白；泳道2：突变体E149G重组蛋白；泳道3：蛋白分子标准。
附图2是本发明PR10-1及其突变体融合蛋白的RNA酶活性分析图。
图示a泳道1：酵母tRNA；泳道2：酵母tRNA与RNA酶H；泳道3：酵母tRNA与煮沸过的RNA酶H；b泳道4：PR10-1融合蛋白与酵母tRNA；泳道5：煮沸过的PR10-1融合蛋白与酵母tRNA；泳道6：Y155H融合蛋白与酵母tRNA；泳道7：煮沸过的Y155H融合蛋白与酵母tRNA；c泳道8：E149G融合蛋白与酵母tRNA；泳道9：煮沸过的E149G融合蛋白与酵母tRNA；泳道10：K55N融合蛋白与酵母tRNA；泳道11：煮沸过的K55N融合蛋白与酵母tRNA。
附图3是本发明不同浓度融合蛋白与烟草赤星病孢子共培养效果图。
图示赤星病孢子40ul孢子浓度为1.2×105个/ml的，在28℃于PDA培养基共培养5天后的效果。CK：空白对照，即80ml即谷胱甘肽缓冲液与烟草赤星病孢子；WT-1：20μg PR10-1融合蛋白；WT-2：40μg PR10-1融合蛋白；WT-3：60μg PR10-1融合蛋白；WT-4：80μg PR10-1融合蛋白。
附图4是本发明80μg PR10-1及其突变体融合蛋白与烟草赤星病孢子共培养效果图。
图示赤星病孢子40ul孢子浓度为1.2×105个/ml的，在28℃于PDA培养基共培养5天后的效果。CK：空白对照，即谷胱甘肽缓冲液与烟草赤星病孢子。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步详细描述：
a.PR10-1融合蛋白的表达与纯化
a.1根据中国野生华东葡萄白河-35-1病程相关蛋白基因PR10-1全长序列827bp中的480bp开放阅读框，分别设计含有NdeI和XhoI内切酶位点的野生型和点突变型引物：
PR10F：5’gggcatatgatgggtgttttcacttacgag3’；
附图2是本发明PR10-1及其突变体融合蛋白的RNA酶活性分析图。
图示a泳道1：酵母tRNA；泳道2：酵母tRNA与RNA酶H；泳道3：酵母tRNA与煮沸过的RNA酶H；b泳道4：PR10-1融合蛋白与酵母tRNA；泳道5：煮沸过的PR10-1融合蛋白与酵母tRNA；泳道6：Y155H融合蛋白与酵母tRNA；泳道7：煮沸过的Y155H融合蛋白与酵母tRNA；c泳道8：E149G融合蛋白与酵母tRNA；泳道9：煮沸过的E149G融合蛋白与酵母tRNA；泳道10：K55N融合蛋白与酵母tRNA；泳道11：煮沸过的K55N融合蛋白与酵母tRNA。
附图3是本发明不同浓度融合蛋白与烟草赤星病孢子共培养效果图。
图示赤星病孢子40ul孢子浓度为1.2×105个/ml的，在28℃于PDA培养基共培养5天后的效果。CK：空白对照，即80ml即谷胱甘肽缓冲液与烟草赤星病孢子；WT-1：20μg PR10-1融合蛋白；WT-2：40μg PR10-1融合蛋白；WT-3：60μg PR10-1融合蛋白；WT-4：80μg PR10-1融合蛋白。
附图4是本发明80μg PR10-1及其突变体融合蛋白与烟草赤星病孢子共培养效果图。
图示赤星病孢子40ul孢子浓度为1.2×105个/ml的，在28℃于PDA培养基共培养5天后的效果。CK：空白对照，即谷胱甘肽缓冲液与烟草赤星病孢子。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步详细描述：
a.PR10-1融合蛋白的表达与纯化
a.1根据中国野生华东葡萄白河-35-1病程相关蛋白基因PR10-1全长序列827bp中的480bp开放阅读框，分别设计含有NdeI和XhoI内切酶位点的野生型和点突变型引物：
PR10F：5’gggcatatgatgggtgttttcacttacgag3’；
PR10R：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgc 3’；
K55NF：5’ggaaccatcaacaagattcac3’；
K55NR：5’gtgaatcttgttgatggttcc 3’；
E149GR：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgcaatgatgtaggctccaat 3；’
Y151HR：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgcaatgatgtgggc 3’，
运用重叠嵌套延伸PCR方法对PR10-1蛋白中三个与RNA酶活性和抗真菌活性有关的保守氨基酸残基lys55、glu149和tyr151分别进行点突变，替换为asn55、gly149和his151；将上述所获得的PCR产物用NdeI和XhoI内切酶酶切后，用T4DNA酶连接到pGEX-4T-1原核表达载体上，转化大肠杆菌BL21菌株、克隆、测序；
a.2PR10-1及突变体原核表达，分别挑取PR10-1野生型，及其突变体Y151H、K55N和E149G单菌接种于6ml含100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养16小时；从培养好的菌液中吸取200μL接于新鲜6ml含100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养3小时，至其OD值为0.6；从上述菌液中吸取1ml于离心管中作为空白对照，并向剩余菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，于30℃继续培养4小时诱导融合蛋白的表达；导后的菌液中吸取1ml于离心管中，收集为A组、B组；然后将空白对照组及收集后的A组、B组分别于12,000rpm离心2分钟，弃上清；向B组加入大肠杆菌蛋白提取液200μL并涡旋30分钟，然后13,000rpm离心5分钟，取上清100μL于新的离心管中；加入10μL 1M DTT和90μL 2×SDS；向对照组和A组中加入20μL 1M DTT和180μL 1×SDS，涡旋混匀；所有样品于沸水中煮沸5分钟，13000rpm离心5分钟，每个样品取30μL进行SDS-PAGE；
a.3PR10-1及突变体融合蛋白的纯化，收集50ml诱导后的菌液，8,000rpm离心5分钟，倾去上清，在沉淀中加入3ml PBS，超声波破碎后，8000rpm离心10分钟，将上清转移到新的离心管中待用；轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆；取1ml匀浆放入50ml离心管中，4℃10000rpm离心5分钟，吸去上清；在树脂中加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒数次，混合均匀，4℃10000rpm离心5分钟，吸去上清；在上述树脂中加入8ml预冷的PBS，制成50％的匀浆，轻轻颠倒数次，混合均匀，匀浆冰上放置；超声破碎的细胞裂解物加入到准备好的树脂匀浆中，4℃轻摇30分钟，使树脂上的谷胱甘肽与融合蛋白上的GST充分结合；将混合物于4℃以8000rpm离心10分钟，吸去上清；沉淀中加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒离心管5次，洗去未与树脂结合的蛋白；在4℃，8000rpm离心10分钟，吸去上清，再加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒离心管5次，在4℃，8000rpm离心10分钟；在沉淀中加入800μL预冷的谷胱甘肽洗脱缓冲液，4℃轻轻摇动30分钟，洗脱树脂上结合的蛋白；在4℃，8000rpm离心10分钟，收集上清，转移至干净的离心管，再向在沉淀中加入800μL预冷的谷胱甘肽洗脱缓冲液，4℃轻轻摇动30分钟，在4℃，8000rpm离心10分钟，将上清转移至前次的收集离心管中；取20μL二次收集的混匀的上清进行SDS-PAGE，检测融合蛋白的纯化情况，剩余上清于-20℃保存待用；
b.运用纯化所得PR10-1及突变体融合蛋白分别对RNA进行水解与体外抑菌，
b.1PR10-1及突变体融合蛋白对RNA的水解，取11支无RNase的离心管，加入450μg从Sigma公司购得酵母tRNA和150μL pH7.0的Tris-Hcl，分别加入未处理过的蛋白样品PR10-1、Y151H、K55N、E149G和预先煮沸过的蛋白样品，使蛋白样品终浓度为0.27μg/μL，加入未处理过的RNase和煮沸过的RNase终浓度为0.27μg/μL，加入还原型谷胱甘肽缓冲液终浓度为50mM，37℃水浴1小时后，加入等体积氯仿，震荡摇匀后冰上静置10分钟，琼脂糖电泳检测；
b.2PR10-1及突变体融合蛋白的体外抑菌，在PDA固体培养基上接种烟草赤星病病菌，28℃黑暗培养7天，用无菌水将表面孢子冲洗下来，并用灭菌后的三层纱布过滤得孢子悬浮液，血球计数板法计孢子数，确定孢子悬液浓度为1.2×105孢子/ml，取24孔的细胞培养板，在75％的乙醇中浸泡30分钟，再用无菌水冲洗干净，最后紫外线照射30分钟，在灭菌后的细胞培养板中，每孔中分别加入40ul孢子悬浮液，和纯化后的各种蛋白，蛋白终浓度为0.67μg/ul，28℃黑暗条件培养5天，观察结果并照相，细胞培养板中每一孔的菌体均用1ml无菌水冲洗下来，收集于1.5ml的离心管中，用无菌水稀释10倍后，在595nm下测定孢子液OD值。
Claims (2)
1.葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法，其特征在于：根据中国野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10-1基因及其突变体K55N、E149G、Y151H四个基因，分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中，使其与GST标签处于同一读码框，将构建好各重组质粒导入大肠杆菌BL21中，在BL21中经IPTG诱导表达出融合蛋白，通过超声破碎法从BL21细胞中分离并纯化出PR10-1和突变体融合表达蛋白，将纯化好的融合蛋白加入到酵母tRNA液中，以煮沸变形的融合蛋白为阴性对照，以来源于大肠杆菌RNase为阳性对照，检测各融合蛋白的RNA酶活性，将加入不同量的融合蛋白到PDA培养基培养的烟草赤星病菌中，黑暗培养5天后观测赤星病病菌生长情况，用无菌去离子水从培养基表面洗下病菌后，在紫外分光光度计595nm测定病菌孢子悬浮液OD值，量化融合蛋白对赤星病菌生长的抑制。
2.根据权利要求1所述的葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法，其特征在于：
2.a PR10-1融合蛋白的表达与纯化
2.a.1根据中国野生华东葡萄白河-35-1病程相关蛋白基因PR10-1全长序列827bp中的480bp开放阅读框，分别设计含有NdeI和XhoI内切酶位点的野生型和点突变型引物：
PR10F：5’gggcatatgatgggtgttttcacttacgag3’；
PR10R：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgc 3’；
K55NF：5’ggaaccatcaacaagattcac3’；
K55NR：5’gtgaatcttgttgatggttcc 3’；
E149GR：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgcaatgatgtaggctccaat3；’
Y151HR：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgcaatgatgtgggc 3’，
运用重叠嵌套延伸PCR方法对PR10-1蛋白中三个与RNA酶活性和抗真菌活性有关的保守氨基酸残基lys55、glu149和tyr151分别进行点突变，替换为asn55、gly149和his151；将上述所获得的PCR产物用NdeI和XhoI内切酶酶切后，用T4DNA酶连接到pGEX-4T-1原核表达载体上，转化大肠杆菌BL21菌株、克隆、测序；
2.a.2PR10-1及突变体原核表达，分别挑取PR10-1野生型，及其突变体Y151H、K55N和E149G单菌接种于6ml含100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养16小时；从培养好的菌液中吸取200μL接于新鲜6ml含100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养3小时，至其OD值为0.6；从上述菌液中吸取1ml于离心管中作为空白对照，并向剩余菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，于30℃继续培养4小时诱导融合蛋白的表达；导后的菌液中吸取1ml于离心管中，收集为A组、B组；然后将空白对照组及收集后的A组、B组分别于12,000rpm离心2分钟，弃上清；向B组加入大肠杆菌蛋白提取液200μL并涡旋30分钟，然后13,000rpm离心5分钟，取上清100μL于新的离心管中；加入10μL 1M DTT和90μL 2×SDS；向对照组和A组中加入20μL 1M DTT和180μL 1×SDS，涡旋混匀；所有样品于沸水中煮沸5分钟，13000rpm离心5分钟，每个样品取30μL进行SDS-PAGE；
2.a.3PR10-1及突变体融合蛋白的纯化，收集50ml诱导后的菌液，8,000rpm离心5分钟，倾去上清，在沉淀中加入3ml PBS，超声波破碎后，8000rpm离心10分钟，将上清转移到新的离心管中待用；轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆；取1ml匀浆放入50ml离心管中，4℃10000rpm离心5分钟，吸去上清；在树脂中加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒数次，混合均匀，4℃10000rpm离心5分钟，吸去上清；在上述树脂中加入8ml预冷的PBS，制成50％的匀浆，轻轻颠倒数次，混合均匀，匀浆冰上放置；超声破碎的细胞裂解物加入到准备好的树脂匀浆中，4℃轻摇30分钟，使树脂上的谷胱甘肽与融合蛋白上的GST充分结合；将混合物于4℃以8000rpm离心10分钟，吸去上清；沉淀中加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒离心管5次，洗去未与树脂结合的蛋白；在4℃，8000rpm离心10分钟，吸去上清，再加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒离心管5次，在4℃，8000rpm离心10分钟；在沉淀中加入800μL预冷的谷胱甘肽洗脱缓冲液，4℃轻轻摇动30分钟，洗脱树脂上结合的蛋白；在4℃，8000rpm离心10分钟，收集上清，转移至干净的离心管，再向在沉淀中加入800μL预冷的谷胱甘肽洗脱缓冲液，4℃轻轻摇动30分钟，在4℃，8000rpm离心10分钟，将上清转移至前次的收集离心管中；取20μL二次收集的混匀的上清进行SDS-PAGE，检测融合蛋白的纯化情况，剩余上清于-20℃保存待用；
2.b运用纯化所得PR10-1及突变体融合蛋白分别对RNA进行水解与体外抑菌，
2.b.1PR10-1及突变体融合蛋白对RNA的水解，取11支无RNase的离心管，加入450μg从Sigma公司购得酵母tRNA和150μL pH7.0的Tri s-Hcl，分别加入未处理过的蛋白样品PR10-1、Y151H、K55N、E149G和预先煮沸过的蛋白样品，使蛋白样品终浓度为0.27μg/μL，加入未处理过的RNase和煮沸过的RNase终浓度为0.27μg/μL，加入还原型谷胱甘肽缓冲液终浓度为50mM，37℃水浴1小时后，加入等体积氯仿，震荡摇匀后冰上静置10分钟，琼脂糖电泳检测；
2.b.2PR10-1及突变体融合蛋白的体外抑菌，在PDA固体培养基上接种烟草赤星病病菌，28℃黑暗培养7天，用无菌水将表面孢子冲洗下来，并用灭菌后的三层纱布过滤得孢子悬浮液，血球计数板法计孢子数，确定孢子悬液浓度为1.2×105孢子/ml，取24孔的细胞培养板，在75％的乙醇中浸泡30分钟，再用无菌水冲洗干净，最后紫外线照射30分钟，在灭菌后的细胞培养板中，每孔中分别加入40ul孢子悬浮液，和纯化后的各种蛋白，蛋白终浓度为0.67μg/ul，28℃黑暗条件培养5天，观察结果并照相，细胞培养板中每一孔的菌体均用1ml无菌水冲洗下来，收集于1.5ml的离心管中，用无菌水稀释10倍后，在595nm下测定孢子液OD值。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |