CN104046636A - 一种密码子植物化改造的pmi基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种密码子植物化改造的PMI(phosphomannose isomerase，磷酸甘露糖异构酶)基因，本发明利用水稻优化密码子设计合成了PMI基因。并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在遗传转化方面的应用。本发明利用改造的PMI基因构建植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，将外源基因导入水稻细胞中。本发明实现了水稻的高效遗传转化，这是因为经过密码子植物化改造的plant PMI的转化效率显著提高。

Description

一种密码子植物化改造的PMI基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种密码子经过植物化改造的PMI基因，及其作为筛选标记，在植物遗传转化方面的应用。

背景技术

转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。

但现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记，该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。

而PMI是一种糖代谢基因，广泛存在于藻类和一些豆科植物中。水稻等高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏PMI，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此PMI可以作为筛选标记基因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达PMI基因，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，甘露糖是广泛存在于海藻、蕨类等植物中的己糖，且PMI的催化产物为6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。

但现在使用的PMI是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，而原核生物和真核生物存在不同的密码子偏好和碱基组成。例如以水稻为代表的单子叶植物，其GC含量高，较细菌及双子叶植物等物种，密码子偏好性强。因此直接使用未经人工优化设计的PMI，会影响其在真核细胞中的表达效率，并影响其作为筛选标记的使用效果。此外，由于PMI来自于大肠杆菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

发明内容

针对上述问题，本发明希望对PMI进行密码子植物化改造。本发明旨在将PMI基因对密码子经过植物化改造，并作为筛选标记，应用于植物遗传转化。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种密码子植物化改造的PMI基因，命名为plant PMI，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该序列是以模式作物水稻密码子偏好进行优化，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，用水稻偏好密码子替换原有密码子，得到植物化改造的plantPMI序列，再经过化学合成而来。

在第二个方面，本发明提供一种含有所述plant PMI基因的植物表达载体。构建方法是利用Xho I酶切位点，用Xho I酶切pCAMBIA1381载体并回收，由于合成的plant PMI序列两端加有Xho I酶切位点，可以利用T₄连接酶将plant PMI连接到pCAMBIA1381载体，得到植物表达载体pCAMBIA1381-plant PMI。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的PMI基因。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述密码子植物化改造的PMI基因作为筛选标记，获得转基因植物或植物部分。

优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。

优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。

在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-plant PMI表达载体(其含有所述密码子植物化改造的PMI基因)，将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带plant PMI筛选标记基因的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO₃ ^-]/[NH₄ ⁺]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述plant PMI标记基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，具体为：

ATGCAGAAGCTCATCAACAGCGTGCAGAACTATGCCTGGGGGAGCAAGACAGCCCTGACCGAGCTGTACGGCATGGAAAACCCGTCCTCCCAACCGATGGCCGAGCTCTGGATGGGGGCCCATCCGAAGTCCAGCAGCAGGGTGCAAAATGCGGCGGGGGACATTGTGTCCCTCAGGGACGTCATCGAGTCCGATAAGAGCACCCTGCTCGGGGAAGCCGTGGCCAAACGCTTCGGGGAACTCCCGTTCCTCTTCAAAGTGCTCTGCGCCGCCCAACCGCTCAGCATTCAGGTCCACCCGAACAAGCACAACAGCGAGATCGGCTTCGCCAAGGAGAATGCCGCGGGCATCCCAATGGATGCCGCGGAAAGGAACTACAAGGACCCGAACCACAAGCCGGAGCTCGTGTTCGCCCTCACACCGTTTCTGGCGATGAACGCCTTCCGCGAGTTCAGCGAGATCGTGTCCCTGCTGCAACCAGTGGCGGGCGCCCATCCAGCCATTGCCCACTTCCTCCAGCAGCCAGACGCCGAGAGGCTGAGCGAACTGTTCGCCTCCCTGCTCAACATGCAAGGCGAGGAAAAGTCCAGGGCGCTCGCGATTCTGAAGTCCGCCCTCGATAGCCAGCAAGGCGAGCCGTGGCAGACCATCCGCCTGATCTCCGAGTTTTACCCAGAGGACTCCGGGCTCTTCTCCCCACTGCTCCTCAACGTCGTCAAGCTCAACCCAGGGGAGGCGATGTTTCTCTTCGCCGAAACACCGCATGCCTATCTGCAGGGGGTCGCGCTCGAAGTGATGGCGAACAGCGACAATGTCCTCCGCGCCGGCCTCACACCGAAGTACATTGACATCCCGGAGCTCGTCGCCAACGTGAAGTTTGAAGCGAAGCCGGCGAACCAGCTCCTCACACAGCCGGTGAAACAGGGCGCCGAACTGGACTTCCCGATCCCGGTCGACGACTTCGCCTTCTCCCTCCACGACCTCTCCGACAAGGAGACCACAATCAGCCAACAGTCCGCCGCGATCCTCTTTTGCGTGGAAGGGGATGCCACCCTGTGGAAAGGGTCCCAGCAGCTCCAGCTCAAACCGGGCGAATCCGCGTTCATCGCGGCCAATGAATCCCCGGTCACAGTGAAGGGCCATGGCAGGCTCGCCAGGGTGTACAACAAACTGTGA

附图说明

图1为经过密码子植物化改造的plant PMI与原始PMI核苷酸序列比对。其中Optimized为优化后的plant PMI的核苷酸序列，Original为原始PMI的核苷酸序列。

图2为经过密码子植物化改造的plant PMI与原始PMI基因编码蛋白的氨基酸序列比对。Optimized为优化后plant PMI基因编码的氨基酸序列，Original为原始PMI编码的氨基酸序列。

图3为pCAMBIA1381-plant PMI载体质粒示意图。

图4为水稻愈伤组织，经过农杆菌介导转化后，在甘露糖筛选压下，抗性愈伤生长情况。

图5为抗性愈伤组织，在分化再生培养基中，再生成苗。

图6为转基因植株的PCR检测电泳图。扩增片段为PMI基因，片段大小为490bp。M为DL2kb marker；PC为阳性对照；NC为阴性对照；1-8为随机挑选的转基因植株。

具体实施方式

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook andDavid Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,PlantTransformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——PMI基因的密码子植物化改造

本申请的发明人根据GENBANK数据库中的信息，收集水稻92188条CDS序列，共计34132283个密码子，在网站http://www.kazusa.or.jp/codon/，分析这些密码子在水稻中的使用情况。同一物种同一氨基酸，不同密码子被使用的频率有差异，有的密码子使用频率高，有的密码子使用频率低。如在水稻中，亮氨酸(L)密码子使用频率最高的为CUC，达到28.51％，使用频率最低的为UUA，只有6.79％。

选用水稻偏好密码子，对来自大肠杆菌的PMI基因进行植物化改造，获得一条新的DNA序列，并给这个DNA序列末端加上水稻偏好的终止密码子TGA，形成一个新基因，该基因被命名为plant PMI，序列如SEQID NO:1所示，与PMI序列比对见图1。

进一步分析其碱基组成，结果见表2。由表2知：plant PMI的GC含量高达61.31％，明显高于PMI的50.77％。这样基因结构更加稳定，因为因为GC间可形成3个氢键，而AT间2个。

表2plant PMI和PMI的基因碱基组成分析

分析plant PMI和PMI基因所编码的蛋白氨基酸序列，比对结果见图2。从图2可看出，二者氨基酸序列完全一致。

GENBANK数据库中Blast比对结果显示：无与plant PMI基因序列一致的记录，最高同源序列为ref|XM_004528288.1，同源性仅为76％。可见，plant PMI是一个全新的基因。

将设计好的plant PMI基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-plant PMI载体，并装载入大肠杆菌JM110菌株中。

实施例2——plant PMI基因植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面含有PUC57-AMP-plant PMI载体的大肠杆菌JM110，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用Xho I酶切，回收plant PMI片段。同时利用Xho I酶对pCAMBIA1381进行线性化处理，回收pCAMBIA1381，将上述的plant PMI片段和pCAMBIA1381片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pCAMBIA1381-plant PMI(图3)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例3——以plant PMI为筛选标记基因的水稻遗传转化方法

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5d。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pCAMBIA1381-plant PMI载体的农杆菌菌株EHA105，和含有未经改造PMI基因的pCAMBIA1381-PMI(安徽省农业科学院水稻研究所保存)在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5d。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增密码子植物化改造的plant PMI的PCR引物为5’-CGGCGGGGGACATTGTGTCCCTC-3’及5’-CACGGCTCGCCTTGCTGGCTATC-3’，产生长度为490bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。随机挑选8棵转基因植株，经鉴定，均为阳性，阳性率达到100％。

实施效果与转化效率

本发明通过分离胚诱导愈伤组织，相比用完整种子诱导愈伤，不仅愈伤组织生长的较快、状态较好，而且能有效减少细菌、真菌污染，减少浪费，节约成本。此外种子清洗后，用无菌水30℃浸泡过夜，能使种子充分吸胀，促进种胚的新陈代谢，提高愈伤组织诱导率，改善愈伤组织状态。

本发明通过LB固体平板两次活化培养，再制备悬浮液，而不是挑单菌落再用液体培养和扩大培养，可以简化操作，便于批量应用，同时减少污染的可能，节约成本。农杆菌菌液浓度对转化效率影响较大。过高的农杆菌菌液浓度，不仅无必要，而且会使农杆菌过度繁殖，增加农杆菌对愈伤组织的伤害，降低转化效率。

本发明选择50mL离心管，而不是培养皿进行侵染，既方便操作，同时有利于愈伤组织和农杆菌的充分接触，从而提高转化效率。选择在三张无菌滤纸上加入悬浮培养基的方式，而不是固体培养基方式共培养；选择23℃黑暗培养，而不是更高的温度如28℃；可以避免农杆菌过度生长，明显改善愈伤组织状态，从而显著提高转化效率。

由于侵染时菌液浓度较低，共培养温度较低，滤纸共培养方式，共培养结束后几乎没有农杆菌过度生长的情况，因而不需要对愈伤组织进行洗菌操作。不仅节约了成本，减少了污染可能，还避免了洗菌过程对愈伤组织的伤害，提高了转化效率，也便于规模化操作。采取一轮筛选，而不是两轮筛选，可以缩短实验周期，节约成本。

采取直接分化，而不是先预分化，可以减轻工作量，同时有效节约成本。选择培养皿作为分化再生的组培容器，而不是三角瓶，便于操作，同时最大程度利用光照培养架的空间，便于规模化应用。

在生根培养基中加入适量的NAA(0.4mg/L)，能够促进根系生长，从而提高移栽成活率。

通过上述发明，结合发明人对诱导、农杆菌悬浮、前筛选、筛选和分化再生培养基中的氮源优化([NO₃ ^-]/[NH₄ ⁺]＝40mM/10mM)，筛选培养基中蔗糖和甘露糖配比(5g/L蔗糖和12.5g/L甘露糖)，分化再生培养基中的激素配比(1.5mg/L NAA、1mg/L6-BA)，本发明实现了水稻的高效遗传转化，并且经过密码子植物化改造的plant PMI的转化效率更高，具体结果见表3。

表3密码子植物化改造的PMI的转化效率

应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (7)

1.一种密码子植物化改造的PMI基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的PMI基因。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的PMI基因或权利要求2所述的表达盒。

4.一种权利要求1-3所述的基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述密码子植物化改造的PMI基因作为筛选标记，获得转基因植物或植物部分。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。

7.一种利用含有权利要求1中所述的密码子植物化改造的PMI基因的表达载体pCAMBIA1381-plant PMI，将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述表达载体，所述表达载体中携带所述密码子植物化改造的PMI基因；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。