CN104725516B - 重组抗虫蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

重组抗虫蛋白及其制备方法和应用，涉及抗虫蛋白及生物安全领域，解决了现有技术存在的问题。用pMAL算法从蛋白质自然进化的角度对Cry蛋白家族部分成员进行预测确定定向改造区域；用MP法建树选定拟改造蛋白构建64个重组蛋白；通过抗虫活力测试鉴定、密码子改造合成抗虫基因NGc，表达后得到重组抗虫蛋白NGc。将NGc构建至ubi为启动子、bar为筛选标记的植物表达载体上；农杆菌介导侵染将抗虫基因NGc转到玉米自交系，转基因后代经室内/田间抗虫鉴定为高抗免疫级别，抗虫效果明显高于转Cry1Ab、Cry1Gc的玉米植株；与非转基因水稻主栽品种吉粳88相比，转基因水稻具有明显的高抗二化螟虫特性；重组抗虫蛋白具有在单子叶植物中高效表达和高抗鳞翅目昆虫的生物特性。

Description

重组抗虫蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗虫蛋白及生物安全技术领域，具体涉及一种重组抗虫蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)，Bt基因即是苏云金芽胞杆菌基因，其编码的Bt毒蛋白能被苏云金芽胞杆菌分泌到菌体外，20世纪50年代中期，科学家发现Bt毒蛋白对鳞翅目、鞘翅目等昆虫的毒性来自于孢子形成过程中产生的晶体蛋白质，1981年，科学家提纯了这种蛋白质并命名为Cry，随后他们克隆出了Cry的基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry(以下简称为Cry蛋白)是根据氨基酸同源性的不同进行分类的：同源性在45％以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45％～78％之间，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78％～95％之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95％以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示，例如Cry1Ac10蛋白。

不同Cry蛋白特异性毒杀昆虫的种类不同，这主要取决于Cry蛋白与昆虫中肠道上皮细胞膜上的受体相互作用的结果(KnowlesB.等，1993)。相关的研究表明，Cry蛋白的毒性与毒性肽和膜受体的结合力呈正相关(HofmannC.等，1989)，一般是Cry蛋白以原毒素的形式存在，在碱性条件下溶解，在蛋白酶作用下水解掉C端非活性部位而变成活性毒性肽，此活化的毒性肽与昆虫中肠道膜上的受体结合，毒性区结构域I的α螺旋使膜穿孔，从而破坏膜细胞的渗透平衡；结构域II具有与中肠道上皮细胞膜结合的能力，与受体结合以及决定靶标昆虫特异性；结构域III为稳定与毒素受体的结合、决定特异性以及门控离子通道，可应用于人为的Cry蛋白分子改造，改造可能会影响到对毒素受体的识别，改变亲代毒蛋白的抗虫谱及抗虫活力。

1991年，Perlak等人通过两种方法对Cry1Ab蛋白进行改造，其一是在不改变Cry1Ab蛋白氨基酸顺序的基础上，通过点突变方法对Cry1Ab蛋白进行部分改造，即改变3％碱基序列，其二是在保持Cry1Ab蛋白活性中心与结构的前提下，按照高等植物所偏爱密码子的原则，通过人工合成方法对Cry1Ab蛋白进行完全改造，即改变21％碱基序列。1995年，Ballcster等人发现对甜菜夜蛾没有毒性的Cry1E蛋白和Cry1Ab蛋白，两者的结构域III分别被具有毒性的Cry1C蛋白的结构域III取代后都具有了毒性；对烟芽夜蛾低毒的Cry1Aa蛋白的结构域III被毒性更高的Cry1Ac蛋白的结构域III置换后，能够增加Cry1Aa蛋白的毒性。2006年，郭青云等人通过体外重组的方法实现了Cry1Aa蛋白和Cry1Ca蛋白的功能性结构域I、II、III互换，得到了6株苏云金芽孢杆菌重组菌株，经过对各杂交杀虫晶体蛋白独立测定，发现比野生型杀虫晶体蛋白毒力减弱，从而证明了杀虫晶体蛋白不同结构域的相互作用会影响杂交杀虫晶体蛋白的表达、晶体形态和杀虫活性。

Cry蛋白家族中，Cry1Ab蛋白、Cry1Ac蛋白和Cry9C蛋白对亚洲玉米螟的杀虫活性最强，商品化转基因抗虫玉米中主要应用编码上述三种蛋白的Cry1Ab基因、Cry1Ac基因和Cry9C基因。目前，Cry基因的获得主要是从天然苏云芽孢杆菌或自然宏基因组文库中克隆，并进一步利用大肠杆菌表达、抗虫性鉴定等研究策略高通量筛选抗虫基因。物种之间通过不断的加速进化竞争性生存，以病毒蛋白进化为例，进化率越快的病毒蛋白具有越高的与宿主蛋白结合的能力，即：侵染能力越强。但由于自然界菌株变异速率相对较慢，获得更高抗虫性的Cry蛋白越来越困难，因此，获得进化率快的Cry基因对于高抗虫材料的获得至关重要。

通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。因此，应用新的高抗昆虫蛋白、提高杀虫蛋白的表达量以及培育转基因抗虫玉米是解决上述问题的最有效途径之一。美国的科学家把Cry基因转入玉米和棉花中，转基因玉米和棉花在美国成功地上市，至今未发现它们对人类有任何负面影响，这种转基因作物对于环境的贡献是巨大的。在中国，也有许多科学家在致力于转Bt基因玉米的研究。中国农业大学的王国英教授研究的转Bt基因玉米已经在国内进行了环境释放。转Bt基因玉米在中国的商业推广将给玉米生产和种植者带来极大的收益。中国自2008年国家启动《转基因生物新品种培育科技重大专项》后，在转基因抗虫玉米品种培育方面虽有些报道，但却没有能够最终商业化，这主要归结于Bt基因的抗虫效果及转化植株的稳定性。

发明内容

为了获得更高抗虫活性的抗虫蛋白，本发明提供一种重组抗虫蛋白及其制备方法和应用。

本发明提供的一种重组抗虫蛋白，该蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的抗虫基因NGc的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种含有上述抗虫基因NGc的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，该载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示。

进一步的，通过对载体pTF101进行改造来构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc：在载体pTF101原有架构的基础上，选择除草剂抗性基因bar为筛选标记基因，由启动子2XP35S驱动，由终止子Tvsp终止筛选标记基因bar转录；由启动子ubi启动抗虫基因NGc表达，由终止子nos终止抗虫基因NGc转录，通过启动子ubi驱动将抗虫基因NGc分别连接入载体pTF101的SmaI位点和SacI位点，构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc。

进一步的，所构建的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc包括：

启动子ubi，为玉米基因组基因ubi，长2022bp，负责启动抗虫基因NGc表达；

终止子nos，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因，长268bp，负责终止抗虫基因NGc转录；

筛选标记基因bar，为除草剂抗性基因bar，来源于吸水链霉素，编码区552bp，编码184个氨基酸；

启动子2XP35S，来自花椰菜花叶病毒CaMV，长663bp，负责启动筛选标记基因bar表达；

终止子Tvsp，长650bp，负责终止筛选标记基因bar转录。

本发明还提供了上述重组抗虫蛋白的制备方法，该方法通过以下步骤实现：

步骤一、Cry蛋白家族改造区域的确定

从NCBI数据库中查找Cry蛋白家族中Cry1A105蛋白、Cry1Aa1蛋白、Cry1Ab1蛋白、Cry1Ab5蛋白、Cry1Ab14蛋白、Cry1Ac1蛋白、Cry1Ah1蛋白、Cry1Ba1蛋白、Cry1Bb1蛋白、Cry1Be1蛋白、Cry1Bf1蛋白、Cry1Fa1蛋白、Cry1Gc蛋白、Cry1Ia1蛋白、Cry1If1蛋白、Cry1Ja1蛋白、Cry1Jb1蛋白、Cry1Jc1蛋白、Cry2Ab1蛋白、Cry2Ac1蛋白、Cry2Ae1蛋白、Cry9Aa1蛋白、Cry9Ca1蛋白、Cry9Ec1蛋白的氨基酸序列；利用pMAL算法和perl编程语言，采用进化率分析方法，确定在分子进化过程中Cry蛋白氨基酸序列的高进化活性区域；

将分析得到的高进化活性区域分为区域A～F，区域A为氨基酸位点在36～120之间，区域B为氨基酸位点在121～254之间，区域C为氨基酸位点在255～360之间，区域D为氨基酸位点在361～461之间，区域E为氨基酸位点在462～539之间，区域F为氨基酸位点在540～606之间，Cry蛋白的氨基酸序列中共有150个位点的氨基酸残基具有进化活性，即位点Ka/Ks>1，Ka为氨基酸突变率，Ks为同义突变率，其中进化活性较高的位点有45个，即位点Ka/Ks>1.45，这45个位点的氨基酸残基分布为：区域A有1个高进化活性的氨基酸残基，区域B有2个高进化活性的氨基酸残基，区域C有12个高进化活性的氨基酸残基，区域D有3个高进化活性的氨基酸残基，区域E有16个高进化活性的氨基酸残基，区域F有11个高进化活性的氨基酸残基，因此，区域A和区域B均为保守区域，区域C、区域D、区域E和区域F为高进化活性区域；

步骤二、构建抗虫基因库

(1)选取NCBI数据库中具有抗鳞翅目虫活性的基因建立数据集，通过BLAST进行局部相似性比对；

根据四级核苷酸同源性差异选择Cry基因：

Cry1Ab1基因、Cry1Ab5基因、Cry1Ab14基因：核苷酸同源性大于95％；

Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ah基因：核苷酸同源性在78％～95％之间；

Cry1A基因、Cry1B基因、Cry1F基因、Cry1G基因、Cry1I基因、Cry1J基因：核苷酸同源性在45％～78％之间；

Cry1基因、Cry2基因、Cry9基因：核苷酸同源性低于45％；

(2)采用最大简约法建立系统进化树：首先采用Clustalx2.0软件对所选的Cry基因进行多重比对，再利用MEGA5软件建立取代模型，同时建立Cry蛋白氨基酸序列系统进化树并评估系统进化树；

(3)根据系统进化树上显示的氨基酸序列进化亲缘关系，选择核苷酸同源性在78％～95％之间的基因，即选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因作为代表，从NCBI数据库中查找Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因的编码序列；

(4)区域A和区域B均为保守区域，将区域A和区域B合成为一个区域A+B，选取Cry1Ab基因作为区域A+B的供体，合成Cry1Ab基因N端区域A+B的编码序列，获得长度为1～1410bp的基因片段，编码N端1～470个氨基酸；

区域C、区域D、区域E和区域F均为高进化活性区域，将区域C和区域D合成为一个区域C+D，将区域E和区域F合成为一个区域E+F，选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因分别作为区域C+D、区域E+F的供体，分别合成Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域C+D、区域E+F的编码序列，共获得16个基因片段；

(5)将上述合成的多个基因片段分别进行连接，构建64个基因，如下表所示：

步骤三、构建重组Cry蛋白

将质粒pET28和64个基因采用NcoI内切酶和BamHI内切酶分别进行双酶消化；将经双酶消化的64个基因分别连接质粒pET28，构建64个载体；通过菌落PCR、双酶水解和测序对64个载体进行逐级验证；将验证正确的载体转入表达宿主E.coliBL21(DE3)plysS中进行诱导表达，获得64个重组Cry蛋白；

步骤四、重组Cry蛋白突变体抗虫活力测试

将亚洲玉米螟卵泡于培养皿中，加入不含毒蛋白的人工饲料，待亚洲玉米螟卵孵化成幼虫后分成三组进行测试，即实验组，阴性对照组和空白对照组，每组接亚洲玉米螟幼虫50头，即每组有10个培养皿，每个培养皿中接亚洲玉米螟幼虫5头，同时，将实验组饲料换成含纯化重组Cry蛋白溶液的人工饲料，将阴性对照组饲料换成含有空表达载体pET28的纯化表达宿主菌全蛋白溶液的人工饲料，将空白对照组饲料换成蒸馏水，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度为同一数量级，且纯化重组Cry蛋白溶液与纯化表达宿主菌全蛋白溶液的加入量相同，实验组饲料总用量与阴性对照组饲料总用量也相同，72小时后观测抗虫效果，测定64个重组Cry蛋白的抗虫活性；

结果显示：重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白对亚洲玉米螟幼虫的毒性高，幼虫死亡率高，抗虫效果优于阴性对照组、空白对照组和其他试验组；

步骤五、合成抗虫基因NGc

根据步骤四的测试结果，按照单子叶植物编码特征，利用基因编码框、消除稀有密码子、二级结构最小化、调整GC含量方法对编码重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白的Cry1Ab-1Ab-1Gc基因进行密码子改造，合成抗虫基因NGc，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示，改造后的抗虫基因NGc与Cry基因的核苷酸序列最大同源性为77％；

对合成的抗虫基因NGc进行表达后得到重组抗虫蛋白NGc，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

进一步的，步骤四中，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度均为100μg/mL。

本发明还提供了上述重组抗虫蛋白NGc在提高转基因植物抗虫性中的应用。

进一步的，所述转基因植物为转基因玉米、转基因水稻、转基因棉花、转基因大豆、转基因高粱、转基因小麦、转基因大麦、转基因燕麦、转基因烟草、转基因马铃薯、转基因番茄、转基因水果、转基因树木或转基因蔬菜等作物。

本发明的有益效果是：

本发明涉及采用pMAL算法从蛋白质自然进化的角度对Cry蛋白家族部分成员进行数据分析，确定定向改造区域；采用MP法来建树，选定拟改造的蛋白，最终构建64个重组Cry蛋白；通过抗虫活力测试方法鉴定出对亚洲玉米螟幼虫毒性最高、幼虫死亡率最高的重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白；对Cry1Ab-1Ab-1Gc基因进行密码子改造，合成抗虫基因NGc，表达该抗虫基因NGc得到最优重组抗虫蛋白NGc，获得的重组抗虫蛋白NGc包含由Cry1Ab和Cry1Gc毒素片段组成的嵌合肽。改造后NGc构建至ubi为启动子、bar为筛选标记的植物表达载体上。农杆菌介导侵染的方法把NGc基因转到具有高效转化效率的玉米自交系。转基因后代经室内/田间抗虫鉴定为高抗免疫级别，抗玉米螟虫效果明显高于转Cry1Ab基因、Cry1Gc基因的玉米植株；与非转基因水稻主栽品种吉粳88相比，转基因水稻具有明显的高抗二化螟虫特性。重组抗虫蛋白NGc具有可以在单子叶植物中高效表达和高抗鳞翅目昆虫的生物特性。

本发明人工合成的抗虫基因NGc与已报道的Cry基因最大同源性为77％。本发明人工合成的抗虫基因NGc与Cry1Ab基因、Cry1Gc基因相比，大大增强了其在植物中的表达，在心叶期、吐丝期高密度人工接亚洲玉米螟均显现出突出的抗玉米螟活性，且抗玉米螟级别为高抗免疫级别，为抗虫基因的推广及商业化奠定基础。此外，该抗虫基因NGc可以转化玉米、水稻、棉花、大豆、高粱、小麦、大麦、燕麦、烟草、马铃薯、番茄、水果、树木或蔬菜等作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染和生产成本，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

本发明转基因植物产生的外源蛋白NGc没有毒性，与Bt毒蛋白(CAA70124)的同源性为39.7％；与麻风树毒蛋白(ABZ04128)的相似性为7.87％。本发明转基因植物产生的外源蛋白NGc不是抗营养因子，与大豆胰蛋白酶抑制因子(CAE17614)相似性为6.07％，与玉米胰凝乳蛋白酶抑制因子(NP_001105449)相似性为1.48％。

附图说明

图1为Cry蛋白家族部分成员的氨基酸序列进化分析结果图。图中：Ka/Ks：氨基酸突变率/同义突变率；虚线位置：Ka/Ks＝1.45；A：氨基酸位点在36～120之间区域；B：氨基酸位点121～254之间区域；C：氨基酸位点255～360之间区域；D：氨基酸位点在361～461之间区域；D：氨基酸位点在361～461之间位置；E：氨基酸位置在462～539之间位置；F：氨基酸位点在540～606之间位置。

图2为Cry蛋白氨基酸序列系统进化树。

图3为亚洲玉米螟幼虫喂食重组Cry蛋白死亡率。

图4为亚洲玉米螟幼虫喂食重组Cry蛋白死亡情况。

图5为植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc的构建图。

图6为PCR检测电泳图。图中：M：DL2000Marker；1：空白对照(水)；2：非转基因玉米植株；3：阳性对照(质粒)；4：转NGc基因玉米植株。

图7为转NGc基因玉米植株表达产物的检测结果图。图中：A：非转基因玉米植株；B：转NGc基因玉米植株。

图8为心叶期玉米植株抗虫性检测结果图。图中：A：非转基因玉米植株；B：转NGc基因玉米植株；C：转Cry1Ab基因玉米植株。

图9为抽丝期玉米植株花丝抗虫性检测结果图。图中：A：非转基因玉米植株接虫0天；B：非转基因玉米植株接虫5天；C：转Cry1Gc基因玉米植株接虫0天；D：转Cry1Gc基因玉米植株接虫5天；E：转Cry1Ab基因玉米植株接虫0天；F：转Cry1Ab基因玉米植株接虫5天；G：转NGc基因玉米植株接虫0天；F：转NGc基因玉米植株接虫5天。

图10为吐丝期抛开玉米植株抗虫性调查结果图。图中：A：非转基因玉米植株；B：转Cry1Gc基因玉米植株；C：转NGc基因玉米植株；D：转Cry1Ab基因玉米植株。

图11为分蘖期水稻植株抗虫性检测结果图。图中：A：转NGc基因水稻植株；B：非转基因水稻植株。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1 Cry蛋白家族改造区域的确定

(1)从NCBI数据库中获取Cry蛋白家族部分成员的氨基酸序列，选用的24个Cry蛋白分别为Cry1A105蛋白、Cry1Aa1蛋白、Cry1Ab1蛋白、Cry1Ab5蛋白、Cry1Ab14蛋白、Cry1Ac1蛋白、Cry1Ah1蛋白、Cry1Ba1蛋白、Cry1Bb1蛋白、Cry1Be1蛋白、Cry1Bf1蛋白、Cry1Fa1蛋白、Cry1Gc蛋白、Cry1Ia1蛋白、Cry1If1蛋白、Cry1Ja1蛋白、Cry1Jb1蛋白、Cry1Jc1蛋白、Cry2Ab1蛋白、Cry2Ac1蛋白、Cry2Ae1蛋白、Cry9Aa1蛋白、Cry9Ca1蛋白、Cry9Ec1蛋白。

(2)利用pMAL算法和perl编程语言，采用进化率分析方法对上述24个Cry蛋白进行统计学分析，预测在分子进化历程中上述24个Cry蛋白氨基酸序列的高进化活性区域，确定导致进化率最快的氨基酸位点，即最可能发生突变的氨基酸位点。理论上，这些高进化活性区域或者说最可能发生突变的氨基酸位点在蛋白质的功能方面也起到关键性作用，甚至可能增强蛋白质功能，因此，可以通过突变这类在分子进化过程中最可能发生突变的氨基酸位点来增强重组抗虫蛋白的活性。

预测的结果如图1所示：采用上述进化率分析方法分析出24个Cry蛋白氨基酸序列的的高进化活性区域，将这些高进化活性且差异性显著的区域分成区域A至区域F；其中区域A为氨基酸位点在36～120之间，区域B为氨基酸位点在121～254之间，区域C为氨基酸位点在255～360之间，区域D为氨基酸位点在361～461之间，区域E为氨基酸位点在462～539之间，区域F为氨基酸位点在540～606之间，上述24个Cry蛋白的氨基酸序列中共有约150个位点的氨基酸残基具有进化活性，即位点Ka/Ks>1，Ka为氨基酸突变率，Ks为同义突变率，其中进化活性较高的位点有45个，即位点Ka/Ks>1.45，这45个位点的氨基酸残基在分子进化过程中具有较高可变活性，一定程度的突变有益于蛋白质功能进化，上述进化活性较高的45个位点的氨基酸残基分布为：氨基酸位点在36～120之间(区域A)有1个高进化活性的氨基酸残基，氨基酸位点在121～254之间(区域B)有2个高进化活性的氨基酸残基，氨基酸位点在255～360之间(区域C)有12个高进化活性的氨基酸残基，氨基酸位点在361～461之间(区域D)有3个高进化活性的氨基酸残基，氨基酸位点在462～539之间(区域E)有16个高进化活性的氨基酸残基，氨基酸位点在540～606之间(区域F)有11个高进化活性的氨基酸残基。区域C、区域D、区域E、区域F中容纳了较多的高进化活性的氨基酸位点，表明区域C、区域D、区域E、区域F在Cry蛋白进化过程中为高进化活性区域，具有较高的改造潜力，预示对区域C、区域D、区域E和区域F进行改造，会创制出杀虫效果更好的、表达更稳定的重组抗虫蛋白；位点Ka/Ks<1，该位点在分子进化过程中相对保守，即区域A和区域B均为保守区域。

Cry基因的获得主要是从天然苏云芽孢杆菌或自然宏基因组文库中克隆，并进一步利用大肠杆菌表达、抗虫性鉴定等研究策略高通量筛选抗虫基因。物种之间通过不断的加速进化竞争性生存，以病毒蛋白进化为例，进化率越快的病毒蛋白具有越高的与宿主蛋白结合的能力，即：侵染能力越强。但由于自然界菌株变异速率相对较慢，获得更高抗虫性的Cry蛋白越来越困难，因此，获得进化率快的Cry基因对于高抗虫材料的获得至关重要。本实施例以NCBI数据库中现有的Cry蛋白家族为实验基础数据，采用进化率分析的方法，自主开展Cry蛋白进化区段分析，并进一步开展分子定向设计和改造工作。利用上述策略人工定向进化设计相比现有筛选策略，目标性更强，筛选获得重组抗虫蛋白的概率更大。

实施例2构建抗虫基因库

(1)选取NCBI数据库中具有抗鳞翅目虫活性的基因建立数据集，通过BLAST进行局部相似性比对，即BLAST比对。

根据四级核苷酸同源性差异选择了来源于不同亚家族的Cry基因：

Cry1Ab1基因、Cry1Ab5基因、Cry1Ab14基因：核苷酸同源性大于95％；

Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ah基因：核苷酸同源性在78％～95％之间；

Cry1A基因、Cry1B基因、Cry1F基因、Cry1G基因、Cry1I基因、Cry1J基因：核苷酸同源性在45％～78％之间；

Cry1基因、Cry2基因、Cry9基因：核苷酸同源性低于45％。

(2)由于所选的Cry基因为近缘基因，选用最大简约法(Maximum parsimony，MP法)来建立系统进化树：首先采用Clustalx2.0软件对所选的Cry基因进行多重比对，再利用MEGA5软件建立取代模型，同时建立Cry蛋白氨基酸序列系统进化树并评估系统进化树，MEGA5软件能对DNA、mRNA、氨基酸序列以及遗传距离进行系统发生分析。

(3)如图2所示，根据系统进化树上显示的氨基酸序列进化亲缘关系，选择第三级进化差异(核苷酸同源性在78％～95％之间)的基因，即选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因作为代表，这八个Cry基因可以充分代表具有抗鳞翅目虫活性的基因。

(4)从NCBI数据库中查找Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因的编码序列(coding sequence，CDS)。

(5)通过实施例1可知，区域A(氨基酸位点在36～120之间)和区域B(氨基酸位点在121～254之间)均为保守区域，将区域A和区域B合成为一个区域即区域A+B(氨基酸位点在36～254之间)，选取Cry1Ab基因作为区域A+B的供体，合成Cry1Ab基因N端区域A+B的编码序列，获得长度为1～1410bp的基因片段，编码N端1～470个氨基酸。Cry1Ab基因是商品化转基因抗虫玉米中主要应用的基因，具有明确的抗鳞翅目虫特点，选取Cry1Ab基因作为区域A和区域B的供体可以确保基因具有抗鳞翅目虫的特点。

通过实施例1可知，区域C(氨基酸位点在255～360之间)、区域D(氨基酸位点在361～461之间)均为具有较高活性的区域，选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因作为区域C+D(即将区域C和区域D合成一个区域，氨基酸位点在255～461之间)的供体，分别合成Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域C+D的编码序列，获得8个基因片段。

通过实施例1可知，区域E(氨基酸位点在462～539之间)、区域F(氨基酸位点在540～606之间)均为具有较高活性的区域，选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因作为区域E+F(即将区域E和区域F合成一个区域，氨基酸位点在462～606之间)的供体，分别合成Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域E+F的编码序列，获得8个基因片段。

(6)将步骤(5)中合成的Cry1Ab基因N端区域A+B的基因片段，合成的Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域C+D的8个基因片段，合成的Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域E+F的8个基因片段分别进行连接，构建64个基因。

如表1所示，所构建的64个基因的核苷酸序列可以根据Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因的编码序列推导得到。通过构建抗虫基因库，期望不同杀虫蛋白之间构建的融合Cry蛋白可以提高重组抗虫蛋白的杀虫效率，扩大抗虫谱，并提高抗虫性。

表1

实施例3构建重组Cry蛋白

将质粒pET28和实施例2构建的64个基因采用NcoI内切酶和BamHI内切酶分别进行双酶消化；将经双酶消化的64个基因分别连接质粒pET28，完成64个载体构建；通过菌落PCR、双酶水解和测序对构建的64个载体进行逐级验证；将验证正确的载体转入表达宿主E.coliBL21(DE3)plysS中进行诱导表达，获得64个重组Cry蛋白。

实施例4重组Cry蛋白突变体抗虫活力测试

(1)将亚洲玉米螟卵泡于培养皿中，加入不含毒蛋白的人工饲料，将亚洲玉米螟卵孵化成亚洲玉米螟幼虫。

(2)待亚洲玉米螟卵孵化成幼虫后分成三组进行测试，即实验组，阴性对照组和空白对照组，每组接亚洲玉米螟幼虫50头，即每组有10个培养皿，每个培养皿中接亚洲玉米螟幼虫5头，同时，将实验组饲料换成含纯化重组Cry蛋白溶液的人工饲料，将阴性对照组饲料换成含有空表达载体pET-28的纯化表达宿主菌全蛋白溶液的人工饲料，将空白对照组饲料换成蒸馏水，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度为同一数量级，即100μg/mL，且纯化重组Cry蛋白溶液与纯化表达宿主菌全蛋白溶液的加入量相同，实验组饲料总用量与阴性对照组饲料总用量也相同，72小时后观测抗虫效果，测定64个重组Cry蛋白的抗虫活性。

结果如图3和图4所示：以重组Cry1Ab-1Ab-1Ab蛋白(简写1Ab)、重组Cry1Ab-1Ab-1Ac蛋白(简写1Ac)、重组Cry1Ab-1Ab-1Ba蛋白(简写1Ba)、重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白(简写1Gc)、重组Cry1Ab-1Ab-1Ia蛋白(简写1Ia)、重组Cry1Ab-1Ab-1Jb蛋白(简写1Jb)、重组Cry1Ab-1Ab-2Ae蛋白(简写2Ae)、重组Cry1Ab-1Ab-9Ca蛋白(简写9Ca)为例进行说明：重组Cry1Ab-1Ab-1Gc(简写1Gc)蛋白对亚洲玉米螟幼虫的毒性较高，幼虫死亡率较高，抗虫性明显高于阴性对照组(纯化表达宿主菌全蛋白)、空白对照组(蒸馏水)和其他试验组(1Ab、1Ac、1Ba、1Ia、1Jb、2Ae、9Ca)，特别是高于商业化的Cry1Ab蛋白。

实施例5合成抗虫基因NGc

根据实施例4的测试结果，在保证进一步提高植物表达水平的前提下，按照单子叶植物编码特征，利用基因编码框、消除稀有密码子而利用最佳化密码子、二级结构最小化、调整GC含量等方法对编码重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白的Cry1Ab-1Ab-1Gc基因进行密码子改造，并最终合成抗虫基因，将其命名为NGc，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示。改造后的抗虫基因NGc与已报道的Cry基因的核苷酸序列最大同源性为77％。对合成的抗虫基因NGc进行表达后得到本发明的最优重组抗虫蛋白NGc，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。本发明的重组抗虫蛋白NGc包含由Cry1Ab和Cry1Gc毒素片段组成的嵌合肽。

实施例6构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc

通过对载体pTF101进行改造来构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc：如图5所示，在载体pTF101原有架构的基础上，选择除草剂抗性基因bar为筛选标记基因，由启动子2XP35S驱动，由终止子Tvsp终止筛选标记基因bar转录；由启动子ubi启动抗虫基因NGc表达，由终止子nos终止抗虫基因NGc转录，通过启动子ubi驱动将实施例5合成的抗虫基因NGc分别连接入载体pTF101的SmaI位点和SacI位点，构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，所构建的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

构建的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc包括：

启动子ubi，为玉米基因组基因ubi，长2022bp，负责启动抗虫基因NGc表达；

终止子nos，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因，长268bp，负责终止抗虫基因NGc转录；

筛选标记基因bar，为除草剂抗性基因bar，来源于吸水链霉素(StreptomycesHygroscopicus)，编码区552bp，编码184个氨基酸。筛选标记基因bar编码草铵膦(phosphinothricin，PPT)乙酰转移酶(acetyltransferase)，通过催化乙酰辅酶A与草胺膦游离氨基结合，使草胺膦失去活性，转bar基因的供体生物表现出对除草剂草铵膦产生抗性；筛选标记基因bar，可以作为目的基因转入受体植株的鉴定，有利于转化体的筛选；

启动子2XP35S，来自花椰菜花叶病毒CaMV，长663bp，负责启动筛选标记基因bar表达；

终止子Tvsp，长650bp，负责终止筛选标记基因bar转录。

所构建的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc能整合到植物染色体上，能比较稳定遗传；质粒均不带有致病基因，不含有毒素合成基因，对动植物安全，无演变为有致病性质粒的可能性。

实施例7转NGc基因玉米植株的获得

采用农杆菌介导法将插入序列导入受体植株的胚性愈伤组织细胞，经除草剂双丙氨膦筛选后获得转基因植株。

(1)将带有实施例6构建的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc的根瘤农杆菌EHA105在附加抗生素的YEP培养基中28℃震荡培养，使细菌处于对数生长期；然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液；菌体用改良的N6液体培养基洗涤，离心收集；再将菌体用添加有100mmol/L乙酰丁香酮和400mg/L改良的N6液体培养基悬浮，调OD₅₅₀在0.3左右获得菌体悬浮液，用于转化。

(2)收获授粉后9～12天的玉米植株幼穗，除掉苞叶，灭菌后用无菌水洗涤，剥取长轴大小在1.5～2.0mm的幼胚，经愈伤组织诱导获得胚性愈伤组织细胞，浸于菌体悬浮液5分钟，取出沥干菌液，转接至共培养基，28℃暗培养3天。

(3)将共培养结束后的胚性愈伤组织细胞转移到添加有抗生素的静息培养基恢复培养1周，再转入带有一定浓度的除草剂双丙氨膦的筛选培养基中进行筛选培养，每2周更换一次培养基，直到筛选出抗性愈伤组织。

(4)将抗性愈伤组织转移到分化培养基，再生植株；将再生植株进行炼苗移栽，待植株生长到7～8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。设计引物序列如下：

P1：ATGGACAACAATCCGAACATAAACG

P2：TCAGTCCGCGGGCACAAACTCG

扩增条件为：95℃5min；95℃30sec、58℃45sec、72℃90sec，共30cycles；72℃10min；扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果，结果如图6所示，已将抗虫基因NGc转入到玉米植株中。

实施例8转NGc基因玉米植株中重组抗虫蛋白NGc的表达及表达产物的检测

采用Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条检测转NGc基因玉米植株、非转基因玉米植株表达情况。首先取约1cm²左右新鲜幼嫩的转NGc基因玉米植株叶片和非转基因玉米植株叶片放在2mL的Eppendorf管中，然后将放有叶片的Eppendorf管插在冰盒中，以保持新鲜度；取液氮，将叶片速冻，用钻头将叶片研磨成粉，向Eppendorf管中迅速加入500μL～lmLSEB4样品提取缓冲液；取出Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条，手持检测试纸条顶端，做好检测标记，注意不要去掉保护膜，保持检测试纸条垂直，将标记的检测试纸条末端插入至Eppendorf管中，插入部分不要超过0.5cm，在检测过程中始终保持插入状态；3～5分钟内出现质控线。

结果如图7所示：阳性结果：在检测试纸条上转NGc基因玉米植株出现两条条带，一条为检测线，另一条为质控线，说明检测出重组抗虫蛋白NGc，表明在转NGc基因玉米植株中有抗虫基因NGc表达；阴性结果：在检测试纸条上非转基因玉米植株仅出现一条质控线而无检测线，说明未检测出重组抗虫蛋白NGc，表明在非转基因玉米植株中无抗虫基因NGc表达。

实施例9心叶期转NGc基因玉米植株的表达产物田间抗虫性检测

心叶期，将已经黑头的、即将孵化的亚洲玉米螟卵块接于非转基因玉米植株、转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株玉米心叶中，每株接2～3个中等大小的亚洲玉米螟卵块，接虫14～21天后调查食叶级别，参照国家行业标准(NY/T1248.5-2006)分级标准。

结果如图8显示：非转基因玉米植株为感(S)，转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株均为高抗(HR)，但转NGc基因玉米植株抗虫性明显优于转Cry1Ab基因玉米植株。

实施例10抽丝期转NGc基因玉米植株的表达产物室内抗虫性检测

抽丝期，取非转基因玉米植株、转Cry1Gc基因玉米植株、转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株花丝分别放入不同平皿中，每个平皿接5只初孵亚洲玉米螟幼虫，重复3次接虫三次，接虫5天后观察花丝损伤情况。

结果如图9所示，非转基因玉米植株花丝已全部吃光，只剩深褐色的粪便和废屑；转基因组花丝损伤程度相对较小，其中损伤严重从大到小分别为转Cry1Gc基因玉米植株、转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株，即转NGc基因玉米植株抗虫性明显优于非转基因玉米植株、转Cry1Gc基因玉米植株、转Cry1Ab基因玉米植株。

实施例11吐丝期转NGc基因玉米植株的表达产物田间抗虫性检测

(1)吐丝期，将已经黑头的、即将孵化的亚洲玉米螟卵块接于非转基因玉米植株(PB*PA)、转Cry1Gc基因玉米植株、转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株花丝丛中，每株接2～3个中等大小的卵块，接虫14～21天后调查雌穗损伤程度及植株损伤情况。

如图10所示，参照国标(农业部953公告-10.1-2007)分级标准，调查抛开非转基因玉米植株(PB*PA)、转Cry1Gc基因玉米植株、转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株的玉米蛀孔数、蛀孔隧道长度以及存活幼虫数量，采用SPSS统计软件进行分析，采用单因素方差分析方法进行差异显著性分析，采用Tukey法和Duncan法进行各玉米植株指标的多重比较，抗虫性比较结果如表2(表2中，1表示转Cry1Ab基因玉米植株，2表示转NGc基因玉米植株，3表示转Cry1Gc基因玉米植株，4表示非转基因玉米植株(PB*PA)，*表示不同小写字母间5％水平上差异显著，表中数值为Mean±SE所示，非转基因玉米植株为感(S)，转Cry1Gc基因玉米植株为抗(R)，转Cry1Ab基因玉米植株、转NGc基因玉米植株均为高抗(HR)。

表2

名称	重复数	蛀孔数(n)	隧道长度(cm)	活虫数(n)	材料抗性
						1	28	1.86±0.50a*	6.07±2.05a	0.64±0.27ab	HR
2	11	1.91±0.68a	11.73±5.48ab	1.00±0.38abc	HR
						3	34	4.35±0.44bc	16.63±1.78abc	1.97±0.23abcd	R
4	28	7.50±0.52ef	37.53±2.87ef	3.75±0.45e	S

实施例12分蘖期转NGc基因水稻植株的表达产物抗虫性检测

分蘖期将已经黑头的、即将孵化的二化螟卵块接于非转基因水稻植株、转NGc基因水稻植株中，每株接2～3个中等大小的二化螟卵块，接虫14～21天后调查水稻植株损伤情况。

结果如图11所示：非转基因水稻植株经二化螟危害后造成枯心苗，最终成熟期非转基因水稻整株死亡，而转NGc基因水稻植株生长健康，并未受到损伤。

Claims (6)

1.重组抗虫蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的抗虫基因NGc的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

2.植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，其特征在于，该载体中含有抗虫基因NGc，该载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，其特征在于，通过对载体pTF101进行改造来构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc：在载体pTF101原有架构的基础上，选择除草剂抗性基因bar为筛选标记基因，由启动子2XP35S驱动，由终止子Tvsp终止筛选标记基因bar转录；由启动子ubi启动抗虫基因NGc表达，由终止子nos终止抗虫基因NGc转录，通过启动子ubi驱动将抗虫基因NGc分别连接入载体pTF101的Sma I位点和Sac I位点，构建植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc。

4.根据权利要求2所述的植物表达NGc蛋白载体pTF101.1-ubi-NGc，其特征在于，该载体包括：

启动子ubi，为玉米基因组基因ubi，长2022bp，负责启动抗虫基因NGc表达；

终止子nos，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因，长268bp，负责终止抗虫基因NGc转录；

筛选标记基因bar，为除草剂抗性基因bar，来源于吸水链霉素，编码区552bp，编码184个氨基酸；

启动子2XP35S，来自花椰菜花叶病毒CaMV，长663bp，负责启动筛选标记基因bar表达；

终止子Tvsp，长650bp，负责终止筛选标记基因bar转录。

5.制备权利要求1所述的重组抗虫蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、Cry蛋白家族改造区域的确定

从NCBI数据库中查找Cry蛋白家族中Cry1A105蛋白、Cry1Aa1蛋白、Cry1Ab1蛋白、Cry1Ab5蛋白、Cry1Ab14蛋白、Cry1Ac1蛋白、Cry1Ah1蛋白、Cry1Ba1蛋白、Cry1Bb1蛋白、Cry1Be1蛋白、Cry1Bf1蛋白、Cry1Fa1蛋白、Cry1Gc蛋白、Cry1Ia1蛋白、Cry1If1蛋白、Cry1Ja1蛋白、Cry1Jb1蛋白、Cry1Jc1蛋白、Cry2Ab1蛋白、Cry2Ac1蛋白、Cry2Ae1蛋白、Cry9Aa1蛋白、Cry9Ca1蛋白、Cry9Ec1蛋白的氨基酸序列；利用pMAL算法和perl编程语言，采用进化率分析方法，确定在分子进化过程中Cry蛋白氨基酸序列的高进化活性区域；

将分析得到的高进化活性区域分为区域A～F，区域A为氨基酸位点在36～120之间，区域B为氨基酸位点在121～254之间，区域C为氨基酸位点在255～360之间，区域D为氨基酸位点在361～461之间，区域E为氨基酸位点在462～539之间，区域F为氨基酸位点在540～606之间，Cry蛋白的氨基酸序列中共有150个位点的氨基酸残基具有进化活性，即位点Ka/Ks>1，Ka为氨基酸突变率，Ks为同义突变率，其中进化活性较高的位点有45个，即位点Ka/Ks>1.45，这45个位点的氨基酸残基分布为：区域A有1个高进化活性的氨基酸残基，区域B有2个高进化活性的氨基酸残基，区域C有12个高进化活性的氨基酸残基，区域D有3个高进化活性的氨基酸残基，区域E有16个高进化活性的氨基酸残基，区域F有11个高进化活性的氨基酸残基，因此，区域A和区域B均为保守区域，区域C、区域D、区域E和区域F为高进化活性区域；

步骤二、构建抗虫基因库

(1)选取NCBI数据库中具有抗鳞翅目虫活性的基因建立数据集，通过BLAST进行局部相似性比对；

根据四级核苷酸同源性差异选择Cry基因：

Cry1Ab1基因、Cry1Ab5基因、Cry1Ab14基因：核苷酸同源性大于95％；

Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ah基因：核苷酸同源性在78％～95％之间；

Cry1A基因、Cry1B基因、Cry1F基因、Cry1G基因、Cry1I基因、Cry1J基因：核苷酸同源性在45％～78％之间；

Cry1基因、Cry2基因、Cry9基因：核苷酸同源性低于45％；

(2)采用最大简约法建立系统进化树：首先采用Clustalx2.0软件对所选的Cry基因进行多重比对，再利用MEGA 5软件建立取代模型，同时建立Cry蛋白氨基酸序列系统进化树并评估系统进化树；

(3)根据系统进化树上显示的氨基酸序列进化亲缘关系，选择核苷酸同源性在78％～95％之间的基因，即选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因作为代表，从NCBI数据库中查找Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因的编码序列；

(4)区域A和区域B均为保守区域，将区域A和区域B合成为一个区域A+B，选取Cry1Ab基因作为区域A+B的供体，合成Cry1Ab基因N端区域A+B的编码序列，获得长度为1～1410bp的基因片段，编码N端1～470个氨基酸；

区域C、区域D、区域E和区域F均为高进化活性区域，将区域C和区域D合成为一个区域C+D，将区域E和区域F合成为一个区域E+F，选取Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因分别作为区域C+D、区域E+F的供体，分别合成Cry1Ab基因、Cry1Ac基因、Cry1Ba基因、Cry1Gc基因、Cry1Ia基因、Cry1Jb基因、Cry2Ae基因、Cry9Ca基因区域C+D、区域E+F的编码序列，共获得16个基因片段；

(5)将上述合成的多个基因片段分别进行连接，构建64个基因，如下表所示：

步骤三、构建重组Cry蛋白

将质粒pET28和64个基因采用Nco I内切酶和BamH I内切酶分别进行双酶消化；将经双酶消化的64个基因分别连接质粒pET28，构建64个载体；通过菌落PCR、双酶水解和测序对64个载体进行逐级验证；将验证正确的载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS中进行诱导表达，获得64个重组Cry蛋白；

步骤四、重组Cry蛋白突变体抗虫活力测试

将亚洲玉米螟卵泡于培养皿中，加入不含毒蛋白的人工饲料，待亚洲玉米螟卵孵化成幼虫后分成三组进行测试，即实验组，阴性对照组和空白对照组，每组接亚洲玉米螟幼虫50头，即每组有10个培养皿，每个培养皿中接亚洲玉米螟幼虫5头，同时，将实验组饲料换成含纯化重组Cry蛋白溶液的人工饲料，将阴性对照组饲料换成含有空表达载体pET28的纯化表达宿主菌全蛋白溶液的人工饲料，将空白对照组饲料换成蒸馏水，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度为同一数量级，且纯化重组Cry蛋白溶液与纯化表达宿主菌全蛋白溶液的加入量相同，实验组饲料总用量与阴性对照组饲料总用量也相同，72小时后观测抗虫效果，测定64个重组Cry蛋白的抗虫活性；

结果显示：重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白对亚洲玉米螟幼虫的毒性高，幼虫死亡率高，抗虫效果优于阴性对照组、空白对照组和其他试验组；

步骤五、合成抗虫基因NGc

根据步骤四的测试结果，按照单子叶植物编码特征，利用基因编码框、消除稀有密码子、二级结构最小化、调整GC含量方法对编码重组Cry1Ab-1Ab-1Gc蛋白的Cry1Ab-1Ab-1Gc基因进行密码子改造，合成抗虫基因NGc，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示，改造后的抗虫基因NGc与Cry基因的核苷酸序列最大同源性为77％；

对合成的抗虫基因NGc进行表达后得到重组抗虫蛋白NGc，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

6.根据权利要求5所述的重组抗虫蛋白的制备方法，其特征在于，步骤四中，纯化重组Cry蛋白溶液浓度和纯化表达宿主菌全蛋白溶液浓度均为100μg/mL。