CN104313036A - 抗虫基因mCry2Ab及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗虫基因mCry2Ab及其应用，本发明提供了Cry2Ab蛋白、其编码基因或含有其编码基因的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗虫性中的应用；所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明，本发明的抗虫基因mCry2Ab更适合在植物细胞中高效稳定的表达；将mCry2Ab导入玉米后，可以得到稳定遗传的mCry2Ab转化体，使其具备相应的抗粘虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景；3)还可以将本发明mCry2Ab基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产Bt蛋白，并将其制备成杀粘虫剂，用于农作物害虫的防治。

Description

抗虫基因mCry2Ab及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗虫基因mCry2Ab及其应用。

背景技术

随着人口不断增长，耕地面积日益减少，粮食安全问题日显突出，持续提高粮食产量显得的尤为迫切，而虫害是造成农业减产、品质下降的重要因素之一，所以，很早以前，人们就致力于寻找一种理想的害虫防治方法。20世纪40年代，由于化学工业的发展，人工合成了有机杀虫剂，一时间化学农药就成为了农作物有害生物防治的主要手段。但经长期大量不合理使用后，不但未彻底控制害虫的危害，反而产生了害虫抗性(Resistance)、害虫再猖獗(Resurgence)、农药残留(Residue)的3R问题，甚至污染了环境。因此，人们开始积极探索新的害虫防治方法和综合治理体系。20世纪80年代发展起来的分子生物学技术为人类有效防治农作物害虫开拓了新的途径。

1983年美国华盛顿大学宣布成功将卡那霉素抗性基因导入烟草细胞，以及同年4月美国威斯康星大学宣布成功将大豆基因转入向日葵共同标志着植物转基因技术的诞生。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。随后，转基因技术开始迅猛发展，大量转基因植物陆续研制开发成功。

玉米遗传转化起步于上世纪90年代，1990年Gordon-Kamm首次报道用基因枪转化玉米悬浮细胞系获得了可育的转化体，Koziel(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达Cry1Ab抗虫基因。Ishida(1996)等首次利用超双元载体建立了根癌农杆菌转化玉米自交系的幼胚。Frame(2002)等成功实现了根癌农杆菌利用普通的双元载体转化幼胚。我国在转基因玉米研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系，中国农业大学较早的开展了玉米遗传转化的工作，1994年在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株。同时，在无选择标记、选择标记基因删除和目标基因产物定时降解、植物组织特异性优势表达等核心技术创新方面已具有较强的创新能力。张秀君(1999)等用基因枪法将两个含高赖氨酸蛋白质基因导入玉米的胚性愈伤组织。刘大文(2000)等将Zm13-Barnase基因转化玉米胚性愈伤组织，经过除草剂筛选得到阳性植株。张艳贞(2002)等对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。Huang和Wei(2005)利用根癌农杆菌成功转化了常规玉米自交系。

截止目前，全球已有27个国家种植转基因作物，种植面积从1996年的170万公顷增加到2013年的1.75亿公顷，增加了100倍以上，使转基因作物成为现代农业史上采用最为迅速的作物技术。从农民和消费者的收益来讲，其采用率不言而喻。利用植物转基因技术培育的抗虫植物具有以下优点：(1)抗虫基因资源丰富；(2)缩短了育种时间，且可同时导入多个优良基因；(3)转基因植物只杀死靶标害虫，对其它生物无毒害或毒害作用小，目的性强；(4)在植株内部表达杀虫蛋白，不易被环境因素所破坏，同时也不污染环境。因此，转基因植物具有良好的应用前景。

在培育转基因作物时关键是针对目标害虫筛选到优良的Bt抗虫基因，并使其在作物中高表达。Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌为革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。1981年Schenpf和Whiteley从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了第一个编码δ-内毒素的cry基因Cry1Aa1。1989年Widner W.R和Whiteley H.R从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了Cry2Ab基因。目前已分离的抗虫基因很多，主要的抗虫基因有：①细菌来源的抗虫基因，主要是Bt毒蛋白基因(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2、Cry3等)；②植物来源的蛋白酶抑制剂基因，特点在于抗虫谱广、来源于植物本身易于被公众接受；③细菌来源的营养杀虫蛋白(Vip1、Vip2、Vip3等)，广谱抗鳞翅目，特别是对小地老虎、甜菜夜蛾具有较强作用。

随着高通量测序技术的发展，确定某核苷酸序列为Bt基因将越来越容易，截止到目前，已确定千余种抗虫基因，但大部分并没有在实际生产中应用，如何利用抗虫基因将成为关键。首先，在利用抗虫基因前要确定其对某种害虫的抗性，因为一种抗虫基因往往只对一种或几种靶标害虫起作用，明确其作用对象是利用该基因的前提条件；其次，要使抗虫基因适合在受体细胞中高表达，抗虫基因大多来源于细菌等微生物，其密码子与植物有较大差异，在转化前需根据受体的密码子特征进行优化。

粘虫Mythimnaseparata(Walker)属鳞翅目夜蛾科，又称剃枝虫，行军虫，主要危害玉米、水稻、小麦、粟、高粱、甘蔗等作物，是我国及亚洲其他国家粮食作物的重大害虫，曾给我国的粮食生产带来了重大的经济损失(李光博等，1964；李光博，1979；Sharma and Davies，1983；Hirai，1995；Lee and Uhm，1995)。粘虫每年由南到北的季节性迁飞，不仅使得其危害十分严重，而且危害范围十分广阔(李光博，1979，1995；常雪等，2007)。东北春玉米区和华北夏玉米区常遭受二、三代粘虫的危害。粘虫是一种暴食性害虫，尤其在幼虫成群结队迁移时，更是饥不择食，除极少数几种植物外，几乎所有绿色作物均被掠食一空，造成大幅减产，甚至颗粒无收。粘虫的5、6龄幼虫进入暴食期，食量剧增，取食量分别占全幼虫期的14.3％和75％，常造成作物叶片被大量取食。目前，在北美及欧洲，粘虫危害发生较轻，国外对粘虫抗性基因的报道较少。国内主要进行了Cry1Ab蛋白对粘虫的抗性研究，王冬研等(2004)和王振营等(2005)利用MON810和Bt11对初孵幼虫和5龄幼虫进行抗性研究，结果表明Cry1Ab蛋白对粘虫有很好的控制效果，喂食3天后初孵幼虫全部死亡，喂食12天后5龄幼虫全部死亡，目前还没有其他基因对粘虫抗性的研究。鉴定对粘虫有抗性的基因并在玉米中高表达对保证玉米产量有着重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供Cry2Ab蛋白、其编码基因或含有其编码基因的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌的用途。

本发明提供了Cry2Ab蛋白、其编码基因或含有其编码基因的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗粘虫性中的应用；

所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

上述应用中，所述Cry2Ab蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位核苷酸或序列表中序列3自5’末端第1114-3015位核苷酸。

上述应用中，所述重组载体为将所述Cry2Ab蛋白编码基因插入表达载体得到的重组载体；

所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。

上述表达载体为pCAMBIA3301或pEASY-E1，在本发明的实施例中，所述重组载体为pEASY-E1-mCry2Ab、pCAMBIA3301+Cry2Ab或pCAMBIA3301+mCry2Ab；

pEASY-E1-mCry2Ab为将序列表中序列1自5’末端第1114-3015位所示mCry2Ab基因插入pEASY-E1原核表达载体(直接TA连接)得到的重组载体；

pCAMBIA3301+Cry2Ab为将序列表中序列3所示的核苷酸插入pCAMBIA3301(北京鼎国昌盛生物技术有限公司货号MCV039)的Spe1和BstEII酶切位点得到的载体，表达Cry2Ab蛋白。

pCAMBIA3301+mCry2Ab为将序列表中序列1所示的核苷酸插入pCAMBIA3301的Spe1和BstEII酶切位点得到的载体。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。

Cry2Ab蛋白、其编码基因或含有其编码基因的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备抗粘虫或灭粘虫产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述产品为药品。

本发明另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将Cry2Ab蛋白编码基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物抗虫性高于所述目的植物；所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

上述方法中，所述虫为粘虫；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。

所述Cry2Ab蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位核苷酸或序列表中序列3自5’末端第1114-3015位核苷酸。

本发明的第三个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，命名为mCry2Ab，其为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位核苷酸；

2)在严格条件下与1)杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

3)与1)具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围；

所述重组载体具体为将上述的DNA分子插入表达载体得到的重组载体；所述表达载体尤其具体为pCAMBIA3301。重组载体pCAMBIA3301+mCry2Ab为将序列表中序列1所示的核苷酸插入pCAMBIA3301的Spe1和BstEII酶切位点得到的载体。

上述技术方案表明，

首先，在利用抗虫基因前要确定其对某种害虫的抗性，因为一种抗虫基因往往只对一种或几种靶标害虫起作用，明确其作用对象是利用该基因的前提条件，而这并不能通过同源比对等生物信息技术实现，必须通过田间或室内的抗虫性鉴定才能确定。

其次，要使抗虫基因适合在受体细胞中高表达，抗虫基因大多来源于细菌等微生物，其密码子与植物有较大差异，在转化前需根据受体的密码子特征进行优化。遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响(尤其在异源表达系统中)。某一基因利用的密码子可能不是其正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，将会影响目标蛋白的获得。

在同源表达系统中，同较低水平表达的基因相比，较高表达的基因可能有很不同的密码子偏爱。通过对密码子利用的归类分析，可以真正预测任何基因在某一物种中的表达水平。通过对玉米不同组织RNA-seq数据分析发现，大量高表达基因强烈偏爱以G或C结尾的密码子，这为在玉米中表达外源基因提供了指导。

本发明的实验证明，

1)本发明对Cry2Ab密码子进行了改造，改造后的mCry2Ab核苷酸序列与原始的Cry2Ab同源性仅为66％，G+C含量也由原来的34.23％变为62.99％，使用植物偏爱性密码子，减少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列，本发明的抗虫基因mCry2Ab更适合在植物细胞中高效稳定的表达；

2)本发明将mCry2Ab导入玉米后，可以得到稳定遗传的mCry2Ab转化体，使其具备相应的抗粘虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景；

3)还可以将本发明mCry2Ab基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产Bt蛋白，并将其制备成杀粘虫剂，用于农作物害虫的防治。

附图说明

图1为Cry2Ab基因与mCry2Ab基因核苷酸序列比较分析图

图2为原核表达Cry2Ab蛋白

图3为Cry2Ab及mCry2Ab基因的植物表达载体图谱

图4为利用免疫检测试纸检测Bt Cry2Ab蛋白表达

图5为转Cry2Ab玉米和转mCry2Ab玉米不同事件表达量检测

图6为转mCry2Ab玉米植株田间抗虫性鉴定

图7为T0代转mCry2Ab玉米株系目的基因的PCR检测

图8为T0代转空载体玉米选择标记基因的PCR检测

图9为T0代转Cry2Ab玉米目的基因的PCR检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、通过密码子优化得到mCry2Ab基因

本发明对Cry2Ab蛋白(氨基酸序列为序列表中序列2，其编码基因Cry2Ab的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1114-3015位核苷酸)的活性区域进行了细致的分析，在保证进一步提高其表达水平的前提下，按照玉米高表达基因编码特征对Cry2Ab基因进行了基因密码子改造，得到mCry2Ab基因，该基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位核苷酸，表达的蛋白仍然是序列表中序列2所示的Cry2Ab蛋白。

Cry2Ab与mCry2Ab核苷酸序列比对如图1所示，改造前后密码子使用率见下表1，二者仅有66％同源性，G+C含量也由原来的34.23％变为62.99％，密码子使用率发生了明显变化。

表1为改造前后密码子使用率

实施例2、mCry2Ab基因的抗虫性研究

1、原核表达载体构建

以人工合成序列1所示的mCry2Ab为模板，用如下引物序列：2Ab1F:5'ATGAATAGTGTATTGAATAGCGGAA 3',2Ab1R:5'TTAATAAAGTGGTGAAATATTAGTT 3'进行PCR扩增，得到1902bp的PCR产物(序列1自5’末端第1114-3015位核苷酸)。

PCR条件：95℃预变性5min，95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸2min，32个循环后72℃延伸10min，10℃保存。反应体系：DNA 2ul,2Ab1F 0.5ul,2Ab1R 0.5ul,Taq 0.3ul,10×buffer 2ul,dNTP 1.6ul,ddH2O 13.1ul,total 20ul。

将上述PCR产物连接到北京全式金生物技术有限公司生产的pEASY-E1原核表达载体中，检测阳性克隆的质粒，在对阳性克隆的质进行测序，该质粒为将序列表中序列1自5’末端第1114-3015位所示mCry2Ab基因插入pEASY-E1原核表达载体(直接TA连接)得到的重组载体，命名为pEASY-E1-mCry2Ab。

序列1自5’末端第1-538位核苷酸为CaMV 35S启动子、539-1113位核苷酸为adh1增强子、1114-3015位核苷酸为mCry2Ab编码框、3016-3276位核苷酸为nos polyA终止子；

将重组载体pEASY-E1-mCry2Ab转化原核表达大肠杆菌transetta(北京全式金生物技术有限公司货号CD801-02)，得到转化子，菌液PCR鉴定，引物为2Ab1F和2Ab1R，得到1902bp为阳性转化子，命名为BL21/pEASY-E1-mCry2Ab。

以pEASY-E1为对照，采用同样的方法转入大肠杆菌中，得到BL21/pEASY-E1。

将BL21/pEASY-E1-mCry2Ab和BL21/pEASY-E1挑取单克隆，在含有Amp的LB培养基中培养37℃过夜，第二天，取500ul，加入50mlAmp中37℃继续培养，每隔30min测定一次OD 600值，当OD600达到0.6时，进行1mM的IPTG诱导表达。37℃220rpm诱导表达4h，以不加IPTG的作为对照。

将诱导后的菌液进行SDS-PAGE胶电泳检测，结果如图2所示，泳道1为空载体BL21/pEASY-E1诱导前，泳道2为空载体BL21/pEASY-E1诱导后，泳道3为BL21/pEASY-E1-mCry2Ab诱导前，泳道4为BL21/pEASY-E1-mCry2Ab诱导后，泳道5为Marker；可以看到mCry2Ab诱导后70KD位置有明显的条带，说明表达得到目的蛋白Cry2Ab。

纯化目的蛋白Cry2Ab，冻干保存。

2、mCry2Ab基因或其表达的Cry2Ab蛋白对粘虫毒性检测

将上述得到的目的蛋白Cry2Ab冻干后与剪碎的玉米叶片按照重量比1:10000混合，分别喂食初孵粘虫和5龄粘虫，未混合Cry2Ab蛋白的玉米叶片作为对照。每个实验组用200只粘虫，实验重复3次，结果取平均值。

观察粘虫生长，统计存活率，结果表明，取食混有Cry2Ab蛋白玉米叶片的初孵幼虫到第3天全部死亡，而取食对照玉米叶片的初孵幼虫3天后的存活率为90.68％，差异极显著；取食混有Cry2Ab蛋白玉米叶片的5龄幼虫到第10天全部死亡，而取食对照玉米叶片的5龄幼虫10天后的存活率为96.00％，差异极显著。表明Cry2Ab蛋白对粘虫有显著的致死作用。

实施例3、转mCry2Ab玉米抗虫性研究

一、转mCry2Ab玉米的获得

1、Cry2Ab及mCry2Ab基因的植物表达载体构建

第一步：PCR扩增adh1Intron，5’端加Nco1，3’端加Spe1+BstEII酶切位点，连接到Promega的T载体上，测序，获得阳性克隆T+adh1Intron；

第二步：分别人工合成Cry2Ab和mCry2Ab基因，5’端添加Spe1酶切位点，3’端添加BstEII酶切位点；

第三步：利用Nco1、BstEII分别双酶切T+adh1Intron和pCAMBIA3301，回收目标片段进行连接，获得pCAMBIA3301+adh1Intron；

第四步：利用Spe1、BstEII双酶切pCAMBIA3301+adh1Intron、Cry2Ab和mCry2Ab，分别连接，获得pCAMBIA3301+adh1Intron+Cry2Ab和pCAMBIA3301+adh1Intron+mCry2Ab，分别简称pCAMBIA3301+Cry2Ab和pCAMBIA3301+mCry2Ab，构建好的载体图谱见图3(A为pCAMBIA3301+Cry2Ab载体图谱，B为pCAMBIA3301+mCry2Ab载体图谱)。

经过测序，

pCAMBIA3301+Cry2Ab为将序列表中序列3所示的核苷酸插入pCAMBIA3301(北京鼎国昌盛生物技术有限公司货号MCV039)的Spe1和BstEII酶切位点得到的载体，表达Cry2Ab蛋白。

序列3自5’末端第1-538位核苷酸为CaMV 35S启动子序列、539-1113位核苷酸为adh1增强子、1114-3015位核苷酸为mCry2Ab编码框、3016-3276为nos polyA终止子，表达Cry2Ab蛋白。

pCAMBIA3301+mCry2Ab为将序列表中序列1所示的核苷酸插入pCAMBIA3301的Spe1和BstEII酶切位点得到的载体。

2、转Cry2Ab玉米和转mCry2Ab玉米的获得

将上述pCAMBIA3301+Cry2Ab和pCAMBIA3301+mCry2Ab分别转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+Cry2Ab和重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+mCry2Ab。

重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+Cry2Ab和重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+mCry2Ab侵染玉米(品种为综31，以下也称为野生型玉米)幼胚，获得转Cry2Ab玉米和转mCry2Ab玉米，具体的转基因方法如下：

实验室在转基因过程中所用受体为自交系HiIIA和HiIIB的杂交F1代。首先在田间种植自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，有两种授粉方式：HiIIA作母本，HiIIB作父本；HiIIA作父本，HiIIB作母本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，然后在室内分别进行重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+Cry2Ab和重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+mCry2Ab侵染，将被农杆菌侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤再生成苗，得到转基因T0代植株。利用T0代植株与骨干玉米自交系杂交及回交，获得农艺性质优良的抗虫转基因玉米自交系。

采用农杆菌侵染法将目标基因导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法为：

第一步：剥离幼胚

1)去除苞叶。切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗。

2)向烧杯里加约700ml的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。

3)把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1.5-1.8mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等。

4)用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间,然后轻轻向上撬出幼胚,用小的手术刀尖轻轻托起幼胚,确保幼胚不受到任何的损伤,把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基,胚的密度大约是2×2cm(30个/皿)。

5)用封口膜封住培养皿，28度暗培养2-3天。

第二步：农杆菌浸染

1)农杆菌要在YEP(含Kana33mg/L和Str100mg/L抗生素)培养基上提前一周培养，并在4度冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80度甘油保存。

2)农杆菌要在YEP培养基上在19℃培养3天，同时加Kana(33mg/L),Str(50mg/L)。

3)3天以后，挑取农杆菌放入含有5mL浸染培养基的50ml离心管中,同时加100uMAS(inf+AS),在室温(25度)转速75rpm摇菌2-4个小时。

4)浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基(2ml)的离心管中，每管约20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5ml特定浓度(OD550＝0.3-0.4)的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

第三步：共培养

1)浸染以后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基(co-cultivation medium),使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌。

2)用封口膜封住培养皿，在20度条件下暗培养3天。

第四步：Resting

1)共培养3天后，把幼胚转移到resting medium上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28度条件下暗培养7天。

第五步：选择

1)7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面(35per plate)，培养两周，选择培养基含有bialaphos 1.5mg/L,两周后再进行亚培养bialaphos的浓度可以上升到3mg/L。

2)浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的Ⅱ型愈伤。

第六步：转基因植株的再生

1)在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)(Frame etal,2000)。

2)待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

分别利用重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+Cry2Ab和重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301+mCry2Ab侵染了约1万个玉米幼胚，分别获得了112株T0代转Cry2Ab玉米和136株T0代转mCry2Ab玉米。

采用同样的方法将pCAMBIA3301转染玉米中，得到转空载体玉米。

3、分子鉴定

提取T0代转mCry2Ab玉米叶片基因组DNA，如下引物进行PCR扩增:

mCry2AbF：5'GAGTGGACCGAGTGGAAGAAGAAC 3'

mCry2AbR：5'TGCCACGAGCGGTGAAGG 3'

PCR条件：95℃预变性5min，95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环后72℃延伸10min，10℃保存。

反应体系：DNA 2ul，P10.5ul，P20.5ul，Taq 0.3ul，10×buffer 2ul，dNTP1.6ul，ddH2O 13.1ul，total 20ul

目的基因mCry2Ab的PCR检测结果如图7所示，M:DL2000plus、CK+:以质粒pCAMBIA3301+mCry2Ab为模板扩增产物、CK-:以野生型玉米基因组DNA为模板扩增产物、空白:以双蒸水为模板扩增产物；1到20分别是：T0代转mCry2Ab玉米基因组DNA为模板扩增产物，结果T0代转mCry2Ab玉米均得到1132bp目的产物，为阳性。

提取转空载体玉米叶片基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：

Bar1891F:5'AACATGGTGGAGCACGACACG 3'

Bar1891R:5'CATTGCGGACGTTTTTAATGTACTG 3'

PCR条件：95℃5min，95℃45s，59℃45s，72℃1min45s，35个循环，72℃10min，10℃forever

反应体系：DNA 2ul，Bar1891F 0.5ul，Bar1891R 0.5ul，Taq 0.3ul，10×buffer2ul，dNTP 1.6ul，ddH2O 13.1ul，total 20ul

结果如图8所示，M:DL2000plus、CK+:以质粒pCAMBIA3301为模板扩增产物；、CK-:以野生型玉米基因组DNA为模板扩增产物；、空白:以双蒸水为模板扩增产物；、1到20分别是：T0代转空载体玉米基因组DNA为模板扩增产物，得到目的片段大小1891bp。

提取T0代转Cry2Ab玉米叶片基因组DNA为模板，用如下检测引物进行PCR扩增。

Cry2AbF:5'TGTAAATGCGGAATTGACAGGG 3'

Cry2AbR:5'CTCGTGCTCCACCAGGTGTTC 3'

PCR条件：95℃预变性5min，95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环后72℃延伸10min，10℃保存。

反应体系：DNA 2ul，P10.5ul，P20.5ul，Taq 0.3ul，10Xbuffer 2ul，dNTP1.6ul，ddH2O 13.1ul，total 20ul

结果如图9所示，M:DL2000plus、CK+:以质粒pCAMBIA3301+Cry2Ab为模板扩增产物、CK-:以野生型玉米基因组DNA为模板扩增产物、空白:以双蒸水为模板扩增产物、1到20分别是：T0代转Cry2Ab玉米基因组DNA为模板扩增产物，T0代转Cry2Ab玉米得到1049bp产物，为阳性。

3、比较Cry2Ab和mCry2Ab基因在转化植株中的阳性转化率

采用Bt Cry2A免疫检测试纸检测Cry2Ab蛋白表达情况。

第一步：检测样本处理及准备

取0.1g新鲜的T0代转Cry2Ab玉米、T0代转mCry2Ab玉米和转空载体玉米叶片，放入2ml离心管中，加入600微升PBST缓冲液和0.2g石英砂研磨，取上清液检测。

第二步：样本检测

使用前将试纸恢复至室温(15-30℃)，取500微升研磨上清液至微量离心管中，将检测试纸垂直插入微量离心管中，样品端淹没入样品液的深度约为0.5cm。10秒钟后，取出放平阅读检测结果。

第三步：结果判断

检测线及对照线一般可在3-5min内出现，见图4，A为阳性植株检测结果，B为阴性植株检测结果。

阳性结果：在检测条上出现两条紫红色条带，一条检测线和一条质控线。

阴性结果：在检测条上仅出现一条紫红色质控线。

无效结果：在质控线位置未出现一紫红色条带，表明操作不正确或试纸变质。

通过对112株T0代转Cry2Ab玉米和136株T0代转mCry2Ab玉米幼苗检测确定，112个T0代转Cry2Ab玉米幼苗中，Cry2Ab蛋白阳性的为37个，得到27个阳性转Cry2Ab玉米株系；136株T0代转mCry2Ab玉米幼苗中，Cry2Ab蛋白阳性的为68个，得到68个阳性转mCry2Ab玉米株系。结果说明转Cry2Ab玉米阳性率低于转mCry2Ab玉米，主要原因是转Cry2Ab基因表达量过低，达不到免疫检测试纸能够识别的最低值。

转空载体玉米阴性。

4、比较转Cry2Ab玉米和转mCry2Ab玉米不同事件基因表达量检测

利用美国Agdia公司生产的Bt Cry2A ELISA检测试剂盒进行检测不同转化体的表达量。

(1)准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量0.1克磨好的样品加入1mlPBST样品提取缓冲液，同时用2ml样品提取缓冲液稀释试剂盒自带的正对照，充分混匀后低速离心30秒，准备加样。

(2)用酶联缓冲液按照100:1的比例稀释抗体，将稀释的抗体加入到酶标板中，每孔加入100μl。分别将不同的样品各取5μl加入到相应的样品孔中，同时取100μl、100/2μl、100/4μl、100/8μl、100/16μl、100/32μl、100/64μl、0μl正对照加入相应的样品孔中，用样品抽提缓冲液PBST将各样品孔补至200μl，室温潮湿环境下孵育1小时。

(3)洗板：用1×PBST洗板7次，每次加洗板缓冲液300μl，加满一板后倒掉，洗完后将酶联板倒置，充分去除内部残留液体。

(4)显色：每孔加入100μlTMB显色缓冲液，室温潮湿环境下孵育20分钟。

检测：通过Thermo MK3酶标仪在650nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线进行目标蛋白定量。

分别随机检测了16个阳性转Cry2Ab玉米和16个阳性转mCry2Ab玉米，结果显示，16个阳性转Cry2Ab玉米，表达量OD650超过2.0的只有5个，而16个阳性转mCry2Ab玉米，表达量OD650超过2.0的则有12个，见图5，图中列1、2为标准对照，每个对照2个重复，如A1、A2为4ng Cry2Ab蛋白的2个重复，B1、B2为2ng Cry2Ab的2个重复，以此类推；列3-6为转Cry2Ab玉米不同事件表达量检测结果，列7-10为转mCry2Ab玉米不同事件表达量检测结果，每个事件2个重复，如A3、A4为同一转化事件的2个重复，以此类推。

综上所述，与转Cry2Ab基因的转化体相比，优化的mCry2Ab基因适合在玉米中高表达。

二、转mCry2Ab玉米植株田间抗虫性鉴定

1、抗粘虫性

阳性转Cry2Ab玉米和阳性转mCry2Ab玉米的心叶部位接种初孵幼虫后，仅在接虫部位形成针眼大小危害。每个株系20株，每株20只幼虫，以野生型玉米和转空载体玉米为对照，实验重复3次，结果取平均值。

结果，阳性转Cry2Ab玉米2天后幼虫存活率为51.5％；

阳性转mCry2Ab玉米2天后幼虫基本死亡，存活率为2.5％。

野生型玉米和转空载体玉米2天后幼虫仍然都存活。

说明，野生型玉米和转空载体玉米不能合成Bt杀虫蛋白，接种初孵幼虫后，幼虫能在植株上成活，并对整株玉米叶片产生危害，而阳性转mCry2Ab玉米合成Bt杀虫蛋白Cry2Ab，接种初孵幼虫后，幼虫不能在植株上成活，且阳性转mCry2Ab玉米的杀虫小姑显著高于阳性转Cry2Ab玉米。

表型见图6，A为野生型玉米，B为阳性转mCry2Ab玉米。

因此，阳性转mCry2Ab玉米具有抗粘虫特性，其叶片、茎秆、苞叶等组织中含有BtCry2Ab杀虫蛋白(由于是35S启动子，因此各个组织都含有目标蛋白)。

2、mCry2Ab抗性特异性

将阳性转mCry2Ab玉米分别对玉米螟、棉铃虫、桃柱螟、粘虫、菜青虫、二化螟等鳞翅目昆虫进行了抗性鉴定，方法同上，以野生型玉米为对照。

结果发现这些昆虫虽然都是鳞翅目昆虫，但对Cry2Ab蛋白的敏感性有着明显差别，玉米螟、棉铃虫、桃柱螟、菜青虫、二化螟对阳性转mCry2Ab玉米的危害与对照无明显差别，说明玉米螟、棉铃虫、桃柱螟、菜青虫、二化螟对Cry2Ab蛋白不敏感，Cry2Ab蛋白不能够有效抑制玉米螟、棉铃虫、桃柱螟、菜青虫、二化螟害虫对作物的危害。

从上述实验可以看出，mCry2Ab仅对粘虫的杀虫效果达到高抗水平，是特异性抗粘虫基因。

三、转mCry2Ab玉米在育种中的应用

将稳定高表达阳性转mCry2Ab玉米与郑58、WK858、9058等目前国内大面积应用的自交系回交、自交，获得农艺性质与轮回亲本一致，并含有mCry2Ab基因的自交系。再用获得的转mCry2Ab玉米自交系与相应的父本材料杂交，获得生产上应用的抗虫杂交组合。

Claims (10)

1.Cry2Ab蛋白、其编码基因或含有其编码基因的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗粘虫性中的应用；

所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Cry2Ab蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位或序列表中序列3自5’末端第1114-3015位。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述重组载体为将所述Cry2Ab蛋白编码基因插入表达载体得到的重组载体；

所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。

5.Cry2Ab蛋白、其编码基因或含有其编码基因的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备抗粘虫或灭粘虫产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。

7.一种培育转基因植物的方法，为将Cry2Ab蛋白编码基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物抗虫性高于所述目的植物；所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述虫为粘虫；

所述Cry2Ab蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位或序列表中序列3自5’末端第1114-3015位；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。

9.一种DNA分子，其为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1自5’末端第1114-3015位核苷酸；

2)在严格条件下与1)杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

3)与1)具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

10.含有权利要求9所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌；

所述重组载体具体为将权利要求9所述的DNA分子插入表达载体得到的重组载体；所述表达载体尤其具体为pCAMBIA3301。