CN110117314B - 人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、其表达载体及其应用 - Google Patents
人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、其表达载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab‑GM1、其表达载体及其应用，旨在解决抗虫基因在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。本发明设计了一种人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab‑GM1，还设计了一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体包含上述基因序列。构建了一种用于植物遗传转化的工程菌，该工程菌包含上述基因序列。并将人工合成Bt杀虫蛋白基因、其真核表达载体、其工程菌在转基因植物中应用。本发明首次提供人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab‑GM1基因能够在玉米种表达，并能够显著提供玉米叶片的抗虫性，在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab- GM1、其表达载体及其应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）属于原核生物细菌纲芽孢杆菌科芽孢杆菌属，是一种革兰氏阳性菌。1901年从染病的家蚕体液中被分离出来，发现其对部分鳞翅目昆虫具有毒杀作用。其杀虫原理是：在形成芽孢的过程中，产生了一系列对昆虫具有高度特异性毒杀作用的杀虫蛋白晶体，由于杀虫蛋白晶体自身没有生物活性，被称为原毒素，敏感性昆虫摄取原毒素后，在中肠碱性条件下，原毒素被水解为多肽，这些多肽具有特异的杀虫活性，可与中肠肠道上皮的柱状细胞的特异性受体结合，不可逆地插入质膜中，使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡。因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。
随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始从Bt菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，转基因生物得到迅猛发展。自1987年来，Bt的抗虫基因现已成功转化多种植物中，获得了抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，甚至有的已经开始大面积种植。
但是，早先获得的转基因植物的抗虫性很低，毒蛋白的含量也很低，不能满足农业生产当中的实际需求，大多难以普及应用。而且随着抗虫基因的大范围应用，自然选择的结果也使得昆虫对杀虫蛋白产生抗性，此外，还有抗虫基因的抗虫谱窄、外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。上述转Bt毒蛋白基因的抗虫植物在应用中的潜在问题日益显露，影响其持续利用，因此，当前需要不断开发新的更多的Bt毒蛋白基因。
随着植物抗虫基因工程的不断深入，目前在基因修饰与改造、表达载体的构建、植物组织的转化方式、抗虫植物的培育等方面成为重点研究方向，以期能够培育出含Bt杀虫蛋白基因丰富多样的抗虫作物，以应对昆虫日益增加对抗虫蛋白的免疫作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、其表达载体，并应用于转基因植物中，以解决抗虫基因易在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
依据长期大量试验和实践，设计一种人工合成Bt杀虫蛋白基因，命名为Cry1Ab- GM1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步开发了用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体包含所述人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1。
构建一种用于植物遗传转化的工程菌，该工程菌包含所述的人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1。
将所述人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、所述的真核表达载体、所述的工程菌在转基因植物中应用。
优选的，所述植物为单子叶植物。
优选的，所述单子叶植物为玉米。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明提供了一种新的人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1基因的核苷酸序列，丰富了Bt杀虫蛋白基因的多样性，以应对日益增多的昆虫抗性。
2.本发明Cry1Ab-GM1基因能够在玉米种表达，并能够显著提高玉米叶片的抗虫性。
3. 本发明Cry1Ab-GM1基因、重组表达载体和重组菌在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。
4. 本发明将人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1导入玉米后，可以得到稳定遗传的转化体。
5．本发明基因同样的也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低化学农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组表达载体图谱；
图2为农杆菌介导法获得的转Cry1Ab-GM1基因玉米的愈伤组织图；
图3为农杆菌介导法获得的转Cry1Ab-GM1基因玉米的再生植株图；
图4为农杆菌介导法获得的转Cry1Ab-GM1基因玉米植株移栽到盆情景图；
图5为PCR检测Cry1Ab-GM1基因的电泳图；
图6为PCR检测bar基因的电泳图；
图5和6中，M为DL2000 Marker；1为空白对照（双蒸水）；2为阴性对照（非转基因玉米）；3为阳性对照（质粒pCAMBIA3300-Cry1Ab-GM1）；4～6为转基因材料；
图7为玉米转化植株免疫试纸条检测结果图；
图7中，1～4 为Bt-Cry1Ab/Ac试纸条；1为阴性材料；2～4为转基因材料；5～8为PAT试纸条；5为阴性材料；6～8为转基因材料；
图8为转基因植株及对照植株田间抗虫性检测对比图之一；
图9为转基因植株及对照植株田间抗虫性检测对比图之二；
图8和9中，左图为对照植株，右图为转基因植株。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的培养基或载体如无特别说明，均为市售常规培养基或载体；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：改造抗虫基因Cry1Ab基因
发明人依据其长期大量试验和实践经验，在原始Cry1Ab（GenBank序列号为AY847289.1）抗虫基因的基础上进行密码子进行综合升级改造，按照单子叶植物编码特征设计了密码子优化的抗虫基因Cry1Ab-GM1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Cry1Ab-GM1基因，与原始Cry1Ab基因的序列相比较，具有以下显著特点：
（1）综合考虑多种因素，改造后的基因设计了特定的缺失和DNA序列改变，大大增强了其在植物中的表达；
（2）使用植物偏爱性密码子，减少了原始Cry1Ab基因DNA序列中存在的反向重复序列和富含AT序列，并且减少了不明确的真核DNA序列内含子序列；
（3）对于改造后的Cry1Ab-GM1基因，去掉了Cry1Ab基因原始核苷酸序列3’端1623bp的一段碱基序列；
（4）在剩余的1845个碱基中，A碱基含量为19.62，G碱基含量为28.51，T碱基含量为16.64，C碱基含量为35.23从而使G+C含量由36.26%提高到63.74%；
（5）改造后的Cry1Ab-GM1基因与原始Cry1Ab基因DNA序列的同源性仅为65.56%；
（6）对于改造后的Cry1Ab-GM1基因的氨酸，在氨基酸第243位置和385位置，氨基酸分别从苏氨酸（T）改变为异亮氨酸（I）和谷氨酸（E）改变为甘氨酸（G）。
实施例二：构建重组表达载体和重组表达菌，具体操作步骤如下：
（1）将人工改造合成的抗虫基因Cry1Ab-GM1基因设计XbaI、SacI酶切位点（5’端加XbaI酶切位点、3’端加SacI酶切位点），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
（2）用XbaI和SacI双酶切合成的Cry1Ab-GM1基因，再回收基因片段；
（3）连入已经用XbaI 、SacI双酶切处理的遗传转化高效植物表达载体pCAMBIA3300上，得Cry1Ab-GM1基因的重组表达载体，重组质粒命名为pCAMBIA3300-Cry1Ab-GM1；
其中，pCAMBIA3300载体的T-DNA来源于Ti质粒pti37的T-DNA区，但已去除了致瘤基因和与T-DNA转移无关的序列，只保留了T-DNA转移所必须的右边界序列（RB）和左边界序列（LB）；pCAMBIA3300- Cry1Ab-GM1作为用于遗传转化的表达载体，在pCAMBIA3300质粒基础上构建的含有目的基因Cry1Ab-GM1基因插入盒（35S启动子-多克隆酶切位点-Tnos）；T-DNA以外的质粒骨架包括质粒在大肠杆菌中复制和保持的复制起点OR-ori和质粒骨架序列等没有被整合入基因组。pCAMBIA3300- Cry1Ab-GM1的载体图谱如图1所示；
（4）将重组质粒pCAMBIA3300-Cry1Ab-GM1转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌株，得Cry1Ab-GM1基因的重组表达菌，低温保藏，用于后续试验。
实施例三：重组农杆菌介导转化玉米幼胚和愈伤组织
1. 剥离玉米幼胚
（1）去除玉米苞叶；
（2）切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，以镊子当作把手，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可在同一个烧杯里放4～6个果穗；
（3）向烧杯里加约700mL的消毒液（50%的漂白剂或5.25%的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20）浸泡果穗，消毒20min；在消毒期间，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果；
（4）消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚；
（5）把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部（1.5～1.8mm），在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等；用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2×2cm（30个/皿）；
（6）封口膜封住培养皿，28℃暗培养2～3天。
2. 重组农杆菌侵染
（1）取实施例二构建的重组农杆菌在YEP（含Kan 50 mg/L 和Str100 mg/L抗生素）培养基上活化培养；
（2）划线接种在YEP培养基（含Kan 50 mg/L 和Str 50 mg/L抗生素）中在19℃培养3天；
（3）挑取重组农杆菌放入含有5 mL浸染培养基的50 mL离心管中，同时加100 uMAS（inf+AS），在室温（25℃）转速75 rpm摇菌2～4 h；
（4）把剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基（2 mL）的离心管中，每管约20～100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1～1.5 mL OD550=0.3～0.4的重组农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5 min，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。
3. 共培养
侵染后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时用无菌滤纸吸干，驱除培养基表面多余的农杆菌；用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。
4. 静息
共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。
5. 选择
7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面（35个/皿），培养两周，选择培养基含有1.5 mg/L的双丙氨磷，两周后再进行亚培养，双丙氨磷的浓度可以上升到3 mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的II型愈伤组织，如图2所示。
6. 转基因植株的再生
在光照培养室，取愈伤组织在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽；待转基因再生苗生长出3～4片叶时（如图3所示），将其转移到温室，并进行检查，阳性植株保留。待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。
实施例四：检测Cry1Ab-GM1基因在玉米植株中的表达
1. PCR检测
待实施例三培养的转基因植株生长到5～6叶期时（如图4所示），CTAB法提取植株的叶片基因组DNA，设计引物进行PCR扩增Cry1Ab-GM1基因和质粒pCAMBIA3300上的抗草铵膦基因bar基因。
依据Cry1Ab-GM1基因和bar基因内部序列设计的PCR检测引物序列如下：
Cry1Ab-GM1-F：GTGGAGGTGCTGGGCGGCGAG；
Cry1Ab-GM1-R：GCGTGAGGTCATTGTACCGCG；
bar-F：TGTACGTCTCCCCCCGCCA；
bar-R：TCAAATCTCGGTGACGGGC。
PCR的反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
PCR的反应条件如表2所示：
表2 PCR反应条件
检测结果如图5和图6所示：
玉米转基因植株PCR均为阳性结果，分别扩增出大小532bp的片段和大小 281 bp的片段。对照非转基因植株没有显示对应条带。证明了PCR扩增出的目的片段确实为目的基因内部序列，证明外源基因Cry1Ab-GM1基因和bar基因已整合到玉米基因组中。
2. 试纸条检测
利用Bt-Cry1Ab/Ac、PAT免疫试纸条对转基因材料进行测试，以分析抗虫基因Cry1Ab-GM1和选择标记蛋白PAT编码基因bar的遗传稳定性和目标蛋白表达。
抗虫试纸条使用购自美国Agdia公司生产的Cry1Ab/Ac试纸条（货号STX 06200/0050）检测Cry1Ab蛋白表达，具体操作同产品说明书。
Bar试纸条使用购自美国E美国Agdia公司司生产的pat/bar试纸条（货号AS013LS013）检测标记基因bar基因蛋白表达，具体操作同产品说明书。
检测结果如图7所示：用抗虫蛋白Cry1Ab-t和选择标记蛋白PAT试纸条进行检测，玉米转化体植株均在质控线的下方很快出现红色的检测线，而相应的对照非转基因植株仅出现一条红色质控线。
由图7可知：Cry1Ab-GM1和bar基因的目的蛋白在玉米转化体均有表达，而对照非转基因植株未表达。证明外源基因Cry1Ab-GM1已整合到玉米基因组中。转基因植株材料抗虫蛋白有高水平表达，在转基因植株材料中表现高度稳定性，对照非转基因植株未表达。
实施例五：鉴定转基因玉米植株中的抗虫性
在玉米生长一个月后，一般为6～8叶期，株高在30公分左右，开始人工接虫玉米螟。每个离心管放2～3枚卵块，将装好虫卵的离心管放入28℃的培养箱中培养；接种时，打开刚刚孵化出幼虫的离心管，将离心管插入非转基因和转基因玉米心叶中。苗期接虫鉴定标准：于接虫后20～25天调查食叶级别。食叶级别的记载方法参照农业部行业标准 NY/T720.1~720.3-2003 进行。
玉米心叶受玉米螟危害程度的分级标准如表3所示：
表3 玉米心叶受玉米螟危害程度的分级标准
玉米对玉米螟的抗性评价标准如表4所示：
表4 玉米对玉米螟的抗性评价标准
结果如图8和图9所示：
非转基因对照材料虫食严重，转基因材料抗虫效果显著。非转基因玉米材料部分叶片上有大量中等数量大于2mm的虫孔，食用级别达到9级，虫害级别达到感或高感，而转基因材料没有虫孔或仅个别新叶上有少量针刺状(≤1 mm)虫孔，虫害级别达到高抗。
进一步对该转化体进行抗虫性比较，分析转基因材料及其相应对照食叶级别和虫害级别，并对转基因材料进行抗虫性进行抗性评价。
结果如表5所示：
表5 叶片抗虫性比较
表中不同小写字母间5%水平上差异显著，表中数值为Mean±SE。
由表5可知，通过转基因玉米和非转基因玉米材料叶片抗虫性鉴定看出，非转基因对照材料虫食严重，表现为感病；而转基因材料抗虫效果明显，均达到高抗水平，田间抗虫性表现稳定。对照材料的虫害级别达到9级，其食叶级别在0.05水平上，显著高于相应的转基因材料。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州小草农业科技有限公司
<120> 人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、其表达载体及其应用
<130> 2019
<160> 5
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1845
<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggacatca tctggggcat cttcggcccc tcccagtggg acgcgttcct cgtccagatc 240
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Claims (4)
1.一种人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，其特征在于，该载体包含权利要求1所述的人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1。
3.一种用于植物遗传转化的工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求1所述的人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1。
4.权利要求1所述的人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、权利要求2所述的真核表达载体、权利要求3所述的工程菌在玉米抗虫中的应用。
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| CN201910238664.4A Active CN110117314B (zh) | 2019-03-27 | 2019-03-27 | 人工合成Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab-GM1、其表达载体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| CN (1) | CN110117314B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818157A (zh) * | 2009-12-02 | 2010-09-01 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用 |
| CN102010873A (zh) * | 2010-11-22 | 2011-04-13 | 河南省农业科学院 | 人工合成Bt抗虫基因Cry1Ab-t及其应用 |
| WO2011084622A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Combined use of cry1ca and cry1ab proteins for insect resistance management |
| CN104313036A (zh) * | 2014-09-19 | 2015-01-28 | 中国农业大学 | 抗虫基因mCry2Ab及其应用 |
-
2019
- 2019-03-27 CN CN201910238664.4A patent/CN110117314B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818157A (zh) * | 2009-12-02 | 2010-09-01 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Structural insights into Bacillus thuringiensis Cry, Cyt and parasporin toxins;Xu C等;《Toxins》;20140916;第06卷(第09期);2732-2770 * |
| 杀虫基因Cry1Ab的合成、表达及其抗虫性鉴定;岳润清;《华北农学报》;20141228;第29卷(第06期);131-135 * |
| 转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉幼虫的安全风险评估;高欣欣;《植物保护学报》;20180815;第45卷(第04期);663-669 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110117314A (zh) | 2019-08-13 |
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