CN110055263B

CN110055263B - 编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用

Info

Publication number: CN110055263B
Application number: CN201910190603.5A
Authority: CN
Inventors: 岳润清; 铁双贵; 刘璐; 许蒙蒙; 陈娜; 傅晓雷; 郭新海; 卢董华
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: CN110055263A

Abstract

本发明公开了一种种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab‑MR、其表达载体及其应用，旨在解决抗虫基因在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。本发明设计了一种抗虫基因Cry1Ab‑MR及其克隆引物；进一步设计了一种用于遗传转化的含有抗虫基因Cry1Ab‑MR的原核和真核表达载体；同时构建了出了用于遗传转化的原核和真核表达工程菌。并将抗虫基因、真核表达载体、工程菌在转基因植物中的应用。本发明首次提供的抗虫基因Cry1Ab‑MR能够在玉米种表达，并能够显著提供玉米叶片的抗虫性，且可避免基因沉默现象的发生，其在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）属于原核生物细菌纲芽孢杆菌科芽孢杆菌属，是一种革兰氏阳性菌。1901年从染病的家蚕体液中被分离出来，发现其对部分鳞翅目昆虫具有毒杀作用。其杀虫原理是：在形成芽孢的过程中，产生了一系列对昆虫具有高度特异性毒杀作用的杀虫蛋白晶体，由于杀虫蛋白晶体自身没有生物活性，被称为原毒素，敏感性昆虫摄取原毒素后，在中肠碱性条件下，原毒素被水解为多肽，这些多肽具有特异的杀虫活性，可与中肠肠道上皮的柱状细胞的特异性受体结合，不可逆地插入质膜中，使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡。因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。

随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始从Bt菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，转基因生物得到迅猛发展。自1987年来，Bt的抗虫基因现已成功转化多种植物中，获得了抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，甚至有的已经开始大面积种植。

但是，早先获得的转基因植物的抗虫性很低，毒蛋白的含量也很低，不能满足生产上的实际需求，大多难以应用；随着抗虫基因的大范围应用，昆虫对杀虫蛋白产生抗性；抗虫基因的抗虫谱窄；外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。上述转Bt毒蛋白基因的抗虫植物在应用中的潜在问题日益显露，影响其持续利用。

随着植物抗虫基因工程的不断深入，目前在基因修饰与改造、表达载体的构建、植物组织的转化方式、抗虫植物的培育等方面成为重点研究方向，以期能够培育抗虫作物，减少环境污染，保护人类健康。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用，以解决抗虫基因易在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于长期大量试验和实践经验，设计一种抗虫基因Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

综合考虑抗虫基因Cry1Ab-MR的各种特性及引物的灵敏度，设计了其克隆引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

结合实用特性设计出了一种包含上述抗虫基因的原核表达载体。

构建一种用于遗传转化的原核表达工程菌，该工程菌包含所述抗虫基因序列。

进一步构建了一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体包含所述的抗虫基因序列。

构建一种用于植物遗传转化的工程菌，该工程菌包含所述抗虫基因序列。

将所述抗虫基因、所述的真核表达载体、所述的工程菌在转基因植物中的应用。

优选的，所述植物为单子叶植物。

优选的，所述单子叶植物为玉米。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明首次提供了一种抗虫基因Cry1Ab-MR基因的核苷酸序列。

2.本发明Cry1Ab-MR基因能够在玉米种稳定表达，克服了外源基因在植物体内表达存在的基因沉默现象，并能够显著提高玉米叶片的抗虫性。

3. 本发明Cry1Ab-MR基因、重组表达载体和重组菌在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。

4. 本发明将抗虫基因Cry1Ab-MR导入玉米后，可以得到稳定遗传的转化体。此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低化学农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为重组表达载体构建验证电泳图；

图1中，1为PET28b Nde I/Hind III双酶切， 2为pETCry1Ab-MR Nde I/Hind III双酶切，3为DNA mark SM0331，4为pETCry1Ab-MR质粒；

图2为虫试试验玉米螟大小对比图；

图2中，A为试验组，B为对照组，C为空白组；

图3为转基因玉米植株Cry1Ab-MR基因PCR产物电泳图；

图4为转基因植株Bar基因PCR产物电泳图；

图3和4中，M为DL2000 Marker；CK1为阳性对照（质粒pCAMBIA3300-Cry1Ab-MR）；CK2为阴性对照（非转基因玉米）；空白为空白对照（双蒸水）；1～6为转基因玉米；

图5为玉米转化植株免疫试纸条检测结果图；

图5中，1～4 为Bt-Cry1Ab/Ac试纸条；1为阴性材料；2～4：转基因材料；5～8为PAT试纸条；5为阴性材料；6～8为转基因材料；

图6为转基因玉米植株室内抗虫对比图；

图6中，1～2 为普通玉米植株叶片；2～4为转Cry1Ab-MR基因玉米植株叶片；

图7为转基因植株及对照植株田间抗虫性检测对比图之一；

图8为转基因植株及对照植株田间抗虫性检测对比图之二；

图7和8中，左图为对照植株，右图为转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的菌株或载体如无特别说明，均为市售常规菌株或载体；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：改造抗虫基因Cry1Ab基因

发明人基于长期大量的试验研究和实践经验，在原始Cry1Ab（GenBank序列号为AY847289.1）抗虫基因的基础上进行了大幅的改进设计，主要包括密码子改造，确认并排除原始抗虫基因DNA序列中多处ATTTA、AATGAA等AT富集区和基因序列中存在的反向重复序列，去掉部分常用限制性内切酶识别位点序列（XbaI），减少了不明确的真核DNA序列内含子的序列和可能引起该基因转录提前终止或引起mRNA不稳定的序列，并在3’端加上终止密码子TAG，最终获得按照单子叶植物编码特征设计了密码子优化的抗虫基因Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Cry1Ab-MR基因，与原始Cry1Ab基因的序列相比较，具有以下特点：

（1）改造后的抗虫基因序列消除了原始DNA序列中多处ATTTA、AATGAA等AT富集区和基因序列中存在的反向重复序列。

（2）在改造后Cry1Ab-MR基因的1848个碱基中，A碱基含量为19.64 %，T碱基含量为16.40%，C碱基含量为34.74%，G碱基含量为29.22%，从而使G+C含量由36.26%提高到63.96%，G+C含量在原来的基础上增加了27.70%；

（3）通过DNAMAN软件Multiple Alignment对改造前后抗虫基因进行同源比对分析发现改造的新Bt基因Cry1Ab-MR基因核苷酸序列与原始Bt基因序列同源性仅为65.45%。

实施例二：Cry1Ab-MR基因在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达

1. 原核表达载体的构建

（1）以pUC载体为框架，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含Cry1Ab-MR基因的重组载体，命名为pUC -Cry1Ab-MR；

（2）设计克隆引物：

上游引物F1：5’-CATATGGACAACAACCCGAACATC-3’；

下游引物R1：5’-AAGCTTCTAGTACTCAGCCTCGAACGT-3’；

在上游引添加Nde I内切酶识别位点序列CATATG，下游引物添加Hind III内切酶识别位点序列AAGCTT；

（3）以pUC-Cry1Ab-MR质粒为模板，利用上述引物扩增Cry1Ab-MR基因序列；

（4）将所得到PCR产物用NdeⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切酶进行双酶切，酶切完成后，采用凝胶回收试剂盒回收纯化酶切后的Cry1Ab-MR基因片段；

（5）用NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切原核表达载体pET28b，凝胶回收试剂盒回收纯化5.3kb片段；

（6）纯化酶切后的Cry1Ab-MR基因片段与回收纯化5.3kb载体片段进行连接反应，构建原核表达重组质粒，命名为pET-Cry1Ab-MR；

如图1所示，通过NdeⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切酶的酶切验证，表明载体构建正确。

2. 重组大肠杆菌的构建

将重组质粒pET-Cry1Ab-MR转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，筛选出阳性转化子。提取质粒酶切验证后，挑选阳性转化子接种至抗性培养基中，37℃过夜培养，以2%的接种量转接，培养至OD₆₀₀值约为0.5～0.6，4℃保存备用。

3. 检测重组菌表达产物室内抗虫性

（1）试验处理分为三组：

将重组大肠杆菌经IPTG诱导后，进行超声波破碎，收集的上清作为试验组；相同条件下培养含空载体pET28b E.coli BL21(DE3)，进行超声波破碎，收集的上清作为对照组；以清水作为空白组。

（2）取等量的三组液体加入到配置的玉米螟饲料中作为试验饲料，饲养玉米螟进行虫试。

具体步骤为：

每个试管放入一条饲料，并分别接入10头玉米螟幼虫；每个处理各接10个试管；放入温度26～28℃，相对湿度70%左右的环境中培养8天，检测平均死亡率和活虫单只重量。

具体结果见表1：

表1 虫试试验结果

。

表1统计结果表明：Cry1Ab-MR基因编码的Bt杀虫蛋白具有很强的杀虫效果，玉米螟的死亡率高达91.67%，且对玉米螟的生长有明显的抑制作用，活虫单只重仅有0.1426mg。

培养8天后，挑取隐藏在人工饲料里的玉米螟，收集放入培养皿中观察玉米螟大小。

如图2所示：可清晰发现空白组的玉米螟虫子大小均超过1厘米；对照组里的玉米螟大小1厘米左右；而试验组的玉米螟虫子大小和刚孵出几乎无差别。

由以上原核表达虫试实验可知：Cry1Ab-MR基因编码的Bt杀虫蛋白具有很强的杀虫效果，说明Cry1Ab-MR基因改造可表达出具有强生物活性的杀虫毒蛋白。

实施例三：构建Cry1Ab-MR基因的重组表达载体和重组表达菌

具体步骤如下：

（1）以T载体为框架，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含Cry1Ab-MR基因的重组载体，命名为T -Cry1Ab-MR；

（2）以T-Cry1Ab-MR为模板，利用扩增引物克隆Cry1Ab-MR基因；

上游引物含XbaI酶切位点，引物序列为：

Cry1Ab-MR-F：TCTAGAATGGACAACAACCCGAACATC；

下游引物含SacI酶切位点，引物序列为：

Cry1Ab-MR-R：GAGCTCCTAGTACTCAGCCTCGAACG；

（3）用XbaI和SacI双酶切克隆的Cry1Ab-MR产物，再回收基因片段；

（4）连入已经用XbaI 、SacI双酶切处理的遗传转化高效植物表达载体pCAMBIA3300上，得Cry1Ab-MR基因的重组表达载体，重组质粒命名为pCAMBIA3300-Cry1Ab-MR；

（5）将重组质粒pCAMBIA3300-Cry1Ab-MR转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌株，得Cry1Ab-MR基因的重组表达菌，低温保藏，用于后续试验。

实施例四：重组农杆菌介导转化玉米幼胚和愈伤组织

1. 剥离玉米幼胚

（1）去除玉米苞叶；

（2）切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，以镊子当作把手，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可在同一个烧杯里放4～6个果穗；

（3）向烧杯里加约700mL的消毒液（50%的漂白剂或5.25%的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20）浸泡果穗，消毒20min；在消毒期间，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果；

（4）消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚；

（5）把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部（1.5～1.8mm），在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等；用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2×2cm（30个/皿）；

（6）封口膜封住培养皿，28℃暗培养2～3天。

2. 重组农杆菌侵染

（1）取实施例三构建的重组农杆菌在YEP（含Kan 50 mg/L 和Str100 mg/L抗生素）培养基上活化培养；

（2）划线接种在YEP培养基（含Kan 50 mg/L 和Str 50 mg/L抗生素）中在19℃培养3天；

（3）挑取重组农杆菌放入含有5 mL浸染培养基的50 mL离心管中，同时加100 uMAS（inf+AS），在室温（25℃）转速75 rpm摇菌2～4 h；

（4）把剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基（2 mL）的离心管中，每管约20～100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1～1.5 mL OD₅₅₀=0.3～0.4的重组农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5 min，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

3. 共培养

侵染后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时用无菌滤纸吸干，驱除培养基表面多余的农杆菌；用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。

4. 静息

共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

5. 选择

7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面（35个/皿），培养两周，选择培养基含有1.5 mg/L的双丙氨磷，两周后再进行亚培养，双丙氨磷的浓度可以上升到3 mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的II型愈伤组织。

6. 转基因植株的再生

在光照培养室，取愈伤组织在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽；待转基因再生苗生长出3～4片叶时，将其转移到温室，并进行检查，阳性植株保留。待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实施例五：检测Cry1Ab-MR基因在玉米植株中的表达

1. PCR检测

待实施例四培养的转基因植株生长到5～6叶期时，CTAB法提取植株的叶片基因组DNA，设计引物进行PCR扩增Cry1Ab-MR基因和质粒pCAMBIA3300上的抗草铵膦基因bar基因。

依据Cry1Ab-MR基因和bar基因内部序列设计的PCR检测引物序列如下：

Cry1Ab-MR-F’：CGAGGGAGATTTACACGAAC；

Cry1Ab-MR-R’：GGTTGCTGCTGGTGCCGTAC；

bar-F：ATGAGCCCAGAACGACGCC；

bar-R：TTAGATCTCGGTGACGGGC。

PCR的反应体系为：2ul 的DNA 模板，2uL10×PCR Buffer缓冲液，2ul的dNTP(10mM each)，1ul上游引物(10mM)，1uL下游引物(10mM)，0.3uL Tap酶，无菌水补足20 ul。

PCR的反应程序如表2所示：

表2 PCR反应程序

。

检测结果如图3和图4所示：

玉米转基因植株PCR均为阳性结果，分别扩增出大小396bp的片段和大小552 bp的片段。阴性对照和空白对照没有显示对应条带，证明了PCR扩增出的目的片段确实为目的基因内部序列，证明外源基因Cry1Ab-MR基因和bar基因已整合到玉米基因组中。

2. 试纸条检测

利用Bt-Cry1Ab/Ac、PAT免疫试纸条对转基因材料进行测试，以分析抗虫基因Cry1Ab-MR和选择标记蛋白PAT编码基因bar的遗传稳定性和目标蛋白表达。

抗虫试纸条使用购自美国Agdia公司生产的Cry1Ab/Ac试纸条（货号STX 06200/0050）检测Cry1Ab蛋白表达，具体操作同产品说明书。

Bar试纸条使用购自美国E美国Agdia公司司生产的pat/bar试纸条（货号AS013LS013）检测标记基因bar基因蛋白表达，具体操作同产品说明书。

检测结果如图5所示：用抗虫蛋白Cry1Ab-t和选择标记蛋白PAT试纸条进行检测，玉米转化体植株均在质控线的下方很快出现红色的检测线，而相应的对照非转基因植株仅出现一条红色质控线。

由图5可知：Cry1Ab-MR和bar基因的目的蛋白在玉米转化体均有表达，而对照非转基因植株未表达。证明外源基因Cry1Ab-MR已整合到玉米基因组中，能避免基因“沉默”现象的出现。转基因植株材料抗虫蛋白有高水平表达，在转基因植株材料中表现高度稳定性，对照非转基因植株未表达。

实施例五：鉴定转基因玉米植株中的抗虫性

1. 转Cry1Ab-MR抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟抗性室内生测鉴定

取转玉米植株幼苗生长至5～8叶期玉米植株地上部分带回室内，取未展开的幼嫩心叶，用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在24孔细胞培养板中，每孔接3头初孵幼虫。以普通玉米植株叶片为对照组，转Cry1Ab-MR基因植株叶片为试验组，培养1周后观察转基因玉米的抗虫效果。

如图6所示：

对照组的普通玉米叶片几乎被玉米螟吃尽，抗性级别为高感；而转Cry1Ab-MR基因植株叶片抗性效果好，植株表现出高度的抗性。

2. 转Cry1Ab-MR抗虫基因玉米叶片人工接虫田间玉米螟抗性鉴定

在玉米生长一个月后，一般为6～8叶期，株高在30公分左右，开始人工接虫玉米螟。每个离心管放2～3枚卵块，将装好虫卵的离心管放入28℃的培养箱中培养；接种时，打开刚刚孵化出幼虫的离心管，将离心管插入非转基因和转基因玉米心叶中。于接虫后20～25天调查食叶级别。食叶级别的记载方法参照农业部行业标准 NY/T 720.1~720.3-2003进行。

如图7和图8所示：

非转基因对照材料叶片虫食严重，转基因材料抗虫效果显著。

进一步对玉米转基因材料进行抗虫性比较，分析转基因及其相应对照食叶级别和虫害级别，玉米转基因材料抗虫性进行抗性评价。

玉米心叶受玉米螟危害程度的分级标准如表3所示：

表3玉米心叶受玉米螟危害程度的分级标准

。

玉米对玉米螟的抗性评价标准如表4所示：

表4 玉米对玉米螟的抗性评价标准

。

结果如表5所示：

表5叶片抗虫性鉴定

表中不同小写字母间5%水平上差异显著，表中数值为Mean±SE。

如表5所示：非转基因材料部分叶片上有比较多的数量大于2mm的虫孔，食用级别达到9级，其食叶级别在0.05水平上显著高于相应的转基因材料，达到高感水平；而转基因材料没有虫孔或仅个别新叶上有少量针刺状(≤1 mm)虫孔，虫害级别达到高抗水平，田间抗虫性表现稳定。

分析结果如下：对照材料虫食严重，虫害级别达到9级，而玉米转基因材料抗虫效果明显。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用

<130> 2019

<160> 9

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtcgaggtcc tcggaggcga gcggatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

tcgctcacgc agttcctcct gtccgaattc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtcgacatca tctgggggat cttcgggccg agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcaactca tcaaccagcg gatcgaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gaggggctct ccaacttgta ccagatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

ccgacgaatc cggcgttgag ggaagagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctcacgacgg cgatcccgct cttcgcggtc cagaattacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tatgtccagg cggcgaacct ccatttgtcg gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctgggggt tcgacgcggc gacgatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

gggaactaca cggatcacgc ggtccggtgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

ccggactcca gggactggat ccgctacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctcgatatcg tcagcttgtt ccctaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

tcgcagctca cgagggagat ttacacgaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgggggtccg cgcaggggat cgaggggtcg atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aactcgatca cgatctacac ggacgcgcac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcgt cgccggtggg cttctcgggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atggggaacg cggccccgca gcagcggatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

acgctcagca gcacgctcta ccgccgcccg ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

tcggtcctcg atgggacgga gttcgcgtac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccggaagt cagggacggt cgactcgctc gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccgccgcggc aggggttctc gcaccggctc agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

tcgaactcgt cggtctcgat catccgcgcg cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gaattcaaca acatcattcc gtcgtcgcag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctcgggt cggggacgtc ggtcgtcaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cggcggacga gcccggggca gatctcgaca ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gggtgcgaat ccggtacgcg agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggtc ggccgatcaa ccagggaaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctccagtcgg gttcgttccg gacggtaggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

tcgtcggtct tcacgctctc ggcgcacgtc ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

aggatcgagt tcgtcccggc ggaggtcacg ttcgaggctg agtactag 1848

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

catatggaca acaacccgaa catc 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aagcttctag tactcagcct cgaacgt 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tctagaatgg acaacaaccc gaacatc 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gagctcctag tactcagcct cgaacg 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cgagggagat ttacacgaac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggttgctgct ggtgccgtac 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgagcccag aacgacgcc 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ttagatctcg gtgacgggc 19

Claims

1.一种抗虫基因Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种克隆权利要求1所述抗虫基因Cry1Ab-MR的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，或其核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

3.一种用于遗传转化的原核表达载体，其特征在于，该载体包含权利要求1所述的抗虫基因Cry1Ab-MR。

4.一种用于遗传转化的原核表达工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求1所述的抗虫基因Cry1Ab-MR。

5.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，其特征在于，该载体包含权利要求1所述的抗虫基因Cry1Ab-MR。

6.一种用于植物遗传转化的工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求1所述的抗虫基因。

7.权利要求1所述的抗虫基因或权利要求5所述的真核表达载体或权利要求6所述的工程菌在培育转基因玉米中的应用，其特征在于，所述抗虫基因整合到所述玉米基因组中。