CN104744577A - 球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用；所述Bbafp具有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列；所述Bbafp的酵母表达载体包括Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列和酵母表达载体；所述Bbafp的植物表达载体包括Bbafp的全部核苷酸序列和植物表达载体；含有Bbafp基因的转基因植物的制备方法，通过将上述Bbafp的植物表达载体转化入根癌农杆菌感受态细胞获得转化子，并进行植物遗传转化获得；所述Bbafp对植物病原真菌具抑菌作用；通过实验验证Bbafp使植物抗病能力显著提高，具有巨大的应用前景。

Description

球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用。
背景技术
在农业生产中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制农作物产量提高的重要因素。目前主要采用化学农药作为防治病害的主要手段，但长期使用化学农药不仅导致病原菌产生抗药性，同时还造成生态环境的破坏。因此，抗病品种选育越来越受关注，成为植物病害的有效防治措施之一。然而，由于常规育种周期长、育种资源有限、病原菌变异迅速，因此不易获得抗性植株，难以满足生产的需要。随着生物工程技术发展，研究者开始利用转基因技术，将外源抗病基因转入植物以提高植株的抗病性；这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗病性植株的主要手段。但目前由于缺乏高效、广谱、持久的抗病基因，植物抗病基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制；因此，获得高效、广谱的抗病基因，并分析其对植物抗病能力的影响是植物抗病基因工程的研究重点。
昆虫病原真菌，如球孢白僵菌与金龟子绿僵菌，是控制自然界昆虫种群数量的主要因子，已被开发成生物农药，广泛用于农林害虫及城市卫生昆虫的防治。球孢白僵菌是我国应用范围较广的生防真菌，具有寄主范围广、毒力高等特点；目前的研究显示，球孢白僵菌除能致病昆虫外，还能寄生于植物，拮抗植物病原真菌的生长，为植物提供保护。我们通过前期研究，将来自球孢白僵菌的水解酶基因，如Bbchit1导入番茄及棉花中，显著提高了植株的抗病能力；这一研究表明，球孢白僵菌可能是筛选获得高效抗病基因的重要来源。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的抗菌蛋白Bbafp，解决目前植物抗病基因工程缺乏有效抗病基因的问题；该抗菌蛋白具有抑制植物病原真菌生长的活性，并能提高植物材料的抗病性的功效。
本发明的另一个目的是提供含有上述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列的酵母表达载体及其构建方法。
本发明的再一个目的是提供球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达菌株的制备方法。
本发明的又一个目的是提供含有上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的核苷酸序列的植物表达载体及其构建方法。
本发明还提供含有上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的转基因植物的制备方法。
本发明又提供上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案：球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp，该抗菌蛋白氮端为含有19个氨基酸的信号肽序列，羧基端为70个氨基酸的成熟蛋白区域；该抗菌蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，包括上述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列和酵母表达载体。
上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤：
1）Bbafp的克隆：
以球孢白僵菌的cDNA为模版，利用引物P1和P2，扩增Bbafp的成熟蛋白序列；所述成熟蛋白序列不包含信号肽；
其中，PCR反应体系如下：2.5 μL 10×LA buffer，2 μL dNTP Mix，2.5 μL 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模板，加水补至总体积为25 μL；其中P1为上游引物，P2为下游引物；LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL；所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L；PCR反应参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后72℃延伸5 min；
PCR反应后，回收Bbafp片段，约227bp，克隆进pEASY-T1载体；经测序正确的载体命名为pEASY-Bbafp；
所述引物P1和P2序列如下：
P1：5′- gaattcacccctgagcaatttgaggc-3′；
P2：5’- gcggccgcctagtggcacacgacagctcggc -3′；
其中，P1的下划线部分为EcoRI序列，P2的下划线部分为NotI序列；
2）Bbafp的酵母表达：
   用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切步骤1）构建的pEASY-Bbafp载体，回收Bbazf片段，克隆进相同EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的酵母表达载体，获得上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体。
球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达菌株的制备方法，将上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，转化入酵母中，经筛选获得表达Bbafp的酵母表达菌株。
球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体，包括上述抗菌蛋白Bbafp的全部核苷酸序列和植物表达载体。
   上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：以野生型球孢白僵菌的cDNA为模板，引物PBbafp-pex1和PBbafp-pex2，扩增出Bbafp的全长片段，包括其氮端的信号肽序列；
    PCR反应体系：2.5 μL 10×LA buffer，2 μL dNTP Mix，2.5 μL 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 μmol/L的PBbafp-pex1和PBbafp-pex2各1 μL，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模板，加水补至总体积为25 μL；所述LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL；所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L；PCR反应参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后72℃延伸5 min；
   扩增反应后，回收Bbafp片段，克隆进pEASY-T1载体，获pEASY-fBbafp；用BamHI与EcoRI酶切pEASY-fBbafp，回收Bbafp片段，并克隆进相同BamHI与EcoRI酶切的植物表达载体，获得上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体；
   所述引物PBbafp-pex1和PBbafp-pex2的序列如下：
   PBbafp-pex1：cgggatccatgcagattatttccatcgc；
   PBbafp-pex2：cggaattcctagtggcacacgacagctc；
   其中，PBbafp-pex1的下划线序列为BamHI序列，PBbafp-pex2的下划线序列为EcoRI序列。
  含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的转基因植物的制备方法，将上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体转化入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，经验证获得Bbafp的根癌农杆菌转化子，并进行植物遗传转化，获得含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的转基因植物。
   球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的应用，上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
   1、本发明发现球孢白僵菌在受到植物病原真菌拮抗时会产生一种抗菌蛋白，将其命名为Bbafp，并将该蛋白在毕赤酵母中表达后，通过抑菌实验，研究该蛋白的抑菌能力，实验结果表明该蛋白对植物病原菌，如白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）及番茄早疫病菌(Alternaria solani sorauer)具有明显的抑制生长作用；本发明通过进一步实验分析，发现Bbafp可以抑制白菜黑斑孢子的萌发，并导致菌丝的膨大及畸变，进一步证明了Bbafp具有抑菌能力。
   2、本发明将Bbafp导入番茄植株组成性表达，获得的转基因番茄材料，并通过实验，发现获得的转基因番茄材料的抗病能力得到显著的提高，表明Bbafp在植物抗病基因工程的应用上具有巨大的前景。
   3、本发明为植物抗病基因工程提供了一个高效的抗病基因，并为进一步在昆虫病原真菌中筛选抗病基因奠定了基础；长期以来，昆虫病原真菌，如球孢白僵菌及金龟子绿僵菌除可以致病昆虫外，还被发现可以寄生植物，提高植株对抗植物病原菌能力，但一直不清楚其分子机制；我们的研究显示，昆虫病原真菌球孢白僵菌在受到植物病原真菌的拮抗时，会高水平表达一个抗菌蛋白Bbafp，并通过本发明证实了该抗菌蛋白对植物病原真菌的抑制活性，进而利用该抗菌蛋白去提高植株的抗病能力；这是我们首次发现来自昆虫病原真菌的抗菌蛋白在植物抗病基因工程上的应用。
附图说明
  图1为pPIC9K-Bbafp的酶切验证图；
  图2为pPIC9K-Bbafp的载体图谱；
  图3为酵母表达Bbafp的平板抑菌活性分析-番茄早疫病菌；
  图4为酵母表达Bbafp的平板抑菌活性分析-白菜黑斑病菌；
  图5为对照组处理18 h对白菜黑斑菌孢子萌发的影响（标尺为0.01mm）；
  图6为对照组处理24 h对白菜黑斑菌孢子萌发的影响（标尺为0.01mm）；
  图7 为酵母表达Bbafp处理18 h对白菜黑斑菌孢子萌发的影响（标尺为0.01mm）；
  图8为酵母表达Bbafp处理24 h对白菜黑斑菌孢子萌发的影响（标尺为0.01mm）；
  图9为Bbafp的植物表达载体；
  图10为BbAFP转基因番茄GUS染色结果；
  图11为Bbafp番茄转化子的PCR验证；1-17为不同的番茄植株，3为阴性植株。
  图12为野生型番茄与表达Bbafp番茄的叶片抗病性分析；
  图13为野生型番茄与Bbafp转基因番茄的抗病性分析。
具体实施方式
    下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售。
一种来自昆虫病原真菌球孢白僵菌的抗菌蛋白Bbafp，N端为含有19个氨基酸的信号肽，C端为含有70个氨基酸的成熟蛋白区域，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。该蛋白在球孢白僵菌拮抗植物病原真菌时高水平表达。
进一步，构建了Bbafp的酵母表达载体，经转化获得了Bbafp的毕赤酵母菌株。
另外，本实施例还构建了Bbafp的植物表达载体，并转化进根癌农杆菌。经转化番茄，获得了表达Bbafp的转基因番茄。
   一、Bbafp抗菌肽的克隆及毕赤酵母表达
实施例1  Bbafp基因的克隆及酵母表达载体构建：
Bbafp的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；经对氨基酸序列分析发现，该序列具有明显的胞外信号肽序列，预测的切割位点在19与20位氨基酸之间。以球孢白僵菌（CGMCC7.34，中国普通微生物菌种保藏管理中心）的cDNA为模板（经植物病原菌胁迫处理），利用引物P1和P2（P1：5′- gaattcacccctgagcaatttgaggc-3′；P2：5’- gcggccgcctagtggcacacgacagctcggc -3′，其中，P1的下划线部分为EcoRI序列，P2的下划线部分为NotI序列；P1为上游引物，P2为下游引物）；扩增Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列（不包含信号肽）。
PCR反应体系：2.5 μL 10×LA buffer（TAKARA公司），2μL dNTP Mix，2.5 μL 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 mmol/L的上下游引物各1 μL，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶（5U/uL，TAKARA公司），1 μL cDNA模版，加水补至总体积为25 μL；所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L；
PCR反应参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后72℃延伸5 min；
PCR反应后，回收Bbafp片段，约227bp，克隆进pEASY-T1载体（全式金公司产品）；经测序正确的载体命名为pEASY-Bbafp。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切上述构建的pEASY-Bbafp载体，回收Bbazf片段，克隆进相同EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K载体，利用EcoRI和NotI进行酶切验证（图1），获得pPIC9K-Bbafp载体（图2）；图1中，M为DNA Marker2000，1-7为7个不同的转化子，结果显示均切出预期大小的目标条带。
    实施例2  Bbafp酵母遗传转化及蛋白表达：
提取pPIC9K-Bbafp质粒，电转化进毕赤酵母。挑取转化子于BMGY中培养至OD600约为3时，于4℃下1500 g/min离心5 min收集菌体，重悬于BMMY中，使OD600达到约为1；每隔24h添加终质量浓度1%的甲醇诱导，诱导72 h后，于4℃下8000 g/min离心10 min；收集上清液，进行SDS-PAGE分析；结果表明，表达产物（即酵母表达的Bbafp）存在于上清液中；留存上清液，在后续试验中使用。
其中，所用培养基BMGY/BMMY的配方如下：
BMGY：每升含13.4 g YNB，0.0004 g生物素，10 g酵母粉，20 g蛋白胨，10 mL的甘油，100 mmol/L pH6.0的磷酸钾；
BMMY：每升含13.4 g YNB，0.0004 g生物素，10 g酵母粉，20 g蛋白胨，5 mL的甲醇，100 mmol/L pH6.0的磷酸钾。
   实施例3  Bbafp抑菌活性验证：
采用平板抑菌法分析Bbafp的抑菌效果，将植物病原菌白菜黑斑（Alternaria brassicae）及番茄早疫病菌(Alternaria solani sorauer)接种于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）平板，28℃培养至菌落直径大小2 cm左右，将过滤除菌的Bbafp接种于菌落边缘1cm处，平板于28℃培养48 h，观察抑菌效果。结果如图3和图4所示，其中图3为番茄早疫病菌，图4为白菜黑斑病菌，C为对照，1-3为3个重复。结果显示，Bbafp对白菜黑斑及番茄早疫病菌均有很好的抑菌效果。
实施例4   Bbafp对白菜黑斑孢子萌发的影响：
将Bbafp加入到白菜黑斑菌的孢悬液中，分析Bbafp对白菜黑斑孢子萌发的影响。在灭菌处理的90 mm培养皿内铺上一层大小合适的滤纸，加灭菌水湿润。在滤纸上放上两根牙签，放上灭菌处理的载玻片。载玻片中央滴加6 μL马铃薯培养基PDB（马铃薯葡萄糖肉汤培养基）、3 μL白菜黑斑菌孢子（107个/mL）及3 μL酵母表达的Bbafp（150 μg/mL），混匀后于26℃的培养箱中培养，分别在18 h和24 h后观察孢子的萌发情况。结果如图5~8所示，其中图5为对照组处理18 h，图6为对照组处理24 h，图7为Bbafp实验组处理18 h，图8为Bbafp实验组处理24 h，图5~8中标尺均为0.01 mm；试验结果显示，Bbafp会抑制白菜黑斑菌孢子的萌发，并导致萌发孢子的畸形。
二、Bbafp的植物遗传转化：
实施例5  Bbafp植物表达载体的构建：
为分析Bbazf是否能提高植株的抗病能力，构建Bbafp的植物表达载体。以野生型球孢白僵菌（CGMCC7.34，中国普通微生物菌种保藏管理中心）的cDNA为模板（植物病原真菌胁迫处理），引物PBbafp-pex1和PBbafp-pex2，（PBbafp-pex1:cgggatccatgcagattatttccatcgc；PBbafp-pex2: cggaattcctagtggcacacgacagctc，其中，PBbafp-pex1的下划线序列为BamHI序列，PBbafp-pex2的下划线序列为EcoRI序列）扩增出Bbafp的全长核苷酸片段（包括其N端的信号肽序列）；
PCR反应体系：2.5 μL 10×LA buffer，2 μL dNTP Mix，2.5 μL 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 μmol/L的PBbafp-pex1和PBbafp-pex2各1 μL，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模版，加水补至总体积为25 μL；所述LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL；所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L；PCR反应参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后72℃延伸5 min；
扩增反应后，回收Bbafp片段，并克隆进pEASY-T1载体，获pEASY-fBbafp。测序结果显示，所获目标基因与预期完全一致，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
BamHI与EcoRI酶切pEASY-fBbafp，回收Bbafp片段，克隆进本发明优选的经相同BamHI与EcoRI酶切的植物表达载体pCambia，获得pCambia-35s-Bbafp（图9）。其中，GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Nosterm：Nos终止子；CaMV 35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界(图9)。
利用电击法将pCambia-35s-Bbafp转入根癌农杆菌LBA4404感受态，验证获得Bbafp的农杆菌转化子，并用于下一步的番茄遗传转化子。
实施例6  番茄的遗传转化：
番茄遗传转化用培养基：
基本培养基: MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖，pH5.8。固体培养基加入2 g/L的Gelrite（固化剂）（Murashige和Skoog，1962；Gamborg等，1968）；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度；
共培养培养基：MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖 （pH5.8）+2.0 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤）+0.2 mg/L NAA（吲哚乙酸）+100 umol/L AS(乙酰丁香酮) +2 g/L的Gelrite；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度或摩尔浓度；
筛选培养基：MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖 （pH5.8）+2.0 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤）+0.2 mg/L NAA（吲哚乙酸）+100 umol/L AS(乙酰丁香酮) +500 mg/L cb（羧苄青霉素）+ 75 mg/L Km（卡那霉素）+2 g/L的Gelrite；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度或摩尔浓度；
继代培养基：MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖（pH5.8）+200 mg/L cb+ 75 mg/L Km+2 g/L的Gelrite；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度；
    生根培养基：MS无机+B5有机+30 g/L蔗糖（pH5.8）+200 mg/L Cef（头孢噻肟钠）+50 mg/L Km+2 g/L的Gelrite；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。
   （1）转化用农杆菌浸染液的制备：
挑取实施例6制备的含pCambia-35s-Bbafp载体的根癌农杆菌菌株单菌落，接种于10 mL YEB（5 g/L蔗糖，1 g/L细菌用酵母抽提物，10 g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5 g/L MgSO4·7H2O，pH7.0；50 mg/L Km，125 mg/L Sm（链霉素），上述浓度均为所述物质在YEB中的质量浓度）中，于28℃、200 rpm/min 培养过夜，然后按5%体积比例将菌液接种入20 mL不含抗生素的液体YEB中，于28℃、200 rpm/min培养至OD600约为0.5；再取5 mL菌液于6000 rpm/min离心5 min，倾去上清液，用10 mL MSB0（基本培养基）液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。
（2）番茄遗传转化：
参考Cortina等(Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，76 (3) : 269 - 275)的方法，以生长约10天无菌苗的子叶为外植体，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。
具体操作为: 番茄种子用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液消毒10-15 min，再用无菌自来水冲洗5-6次后，在25℃下，用16 h光照/8 h黑暗的光周期，于固体MSB0（基本培养基）中萌发约10 d，生长健壮的无菌幼苗子叶作为农杆菌介导遗传转化的外植体。用步骤（1）制得的农杆菌浸染液浸染外植体10 min后倾去菌液，用无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌液，然后接种入铺有一层无菌滤纸的共培养培养基MSB1，25℃暗共培养2 d。共培养完成后，将外植体接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，在25℃下，用16 h光照/8 h黑暗的光周期，培养2周；然后将外植体继代入MSB3（继代培养基）培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次；待产生Km抗性幼芽后，将幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株。根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温室生长成苗。
最终，获得24株番茄幼苗。GUS染色结果显示，22株为阳性，仅有两株为阴性，图10为GUS染色结果。进一步利用PCR技术对番茄植株进行验证。引物为PBbafp-pex1和PBbafp-pex2，采用标准的PCR扩增程序，PCR结果如图11所示，图中1-17为不同的番茄植株，3为阴性植株，结果显示仅有3号没有扩增出目标条带，其余植株均有预期大小的目标条带。
实施例7  转基因番茄叶片抗病性分析
按照下述方法分析转基因番茄叶片的抗病性：
1）将番茄早疫病菌接种于PDA平板，于26℃培养10 d，待菌体长满整个平板，用紫外光连续照射上述平板三个晚上诱导产孢；用0.5%的吐温80配制番茄早疫病菌孢悬液，浓度约为105个/mL。
2）取新鲜的Bbafp转基因番茄叶片和野生型番茄叶片，将上述孢悬液均匀喷洒在叶片上；同时，用吸饱水的吸水纸包住叶柄部位；将处理后的叶片置于塑料筐中，并覆盖上一层透明薄膜以保持湿度，将塑料筐置于28℃温室中，每隔24 h观察叶片发病情况。
试验结果如图12所示，图12为接种后4 d的叶片发病情况，其中图12左侧为WT组（即野生型番茄叶片），图12右侧为Bbafp转基因番茄叶片；结果显示，接种后4 d，野生型叶片出现了明显的病症，叶片开始萎蔫、发黄，而转基因植株叶片还未有明显病症；试验结果证明Bbafp转基因番茄对植物病原菌具有良好的抗菌性。
实施例8 转基因番茄植株抗病性分析
    利用0.05%的吐温-80准备大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的孢悬液107个/mL，按50 mL的分装量均匀分装在广口瓶中；将野生型及Bbafp转基因番茄小苗浸泡于孢悬液中，于28℃处理过夜后，将处理后的野生型及Bbafp转基因番茄苗种植于腐殖土中；结果如图13所示，图13为4 d后野生型及Bbafp转基因番茄植株的图片，其中图13左数第一盆为WT组（即野生型番茄），其余3盆均为Bbafp转基因番茄组；结果显示，接种病原菌后4 d，野生型番茄植株已经萎蔫，但表达Bbafp的植株仍生长旺盛，表明Bbafp导入植株后显著提高了植株的抗病能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>  西南大学；
 
<120>  一种球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用；
 
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
 
 
<210>  1
<211>  270
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的核苷酸序列
 
<400>  1
atgcagatta tttccatcgc cctctccctc ctcgctgcga ccggcgccgt cgctgccgcc    60
acccctgagc aatttgaggc cagagatggg gccggcgcca tgatcaagta ccacggaatt   120
tgcaccaagg ccaagaacga atgcaagttc aagggccaga atggcaggga tacctttgtc   180
aagtgcccca actttgccaa caagagatgc accaaggact acaacgaatg ttcatatgac   240
agcgtcagcc gagctgtcgt gtgccactag                                    270
 
 
<210>  2
<211>  89
<212>  PRA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的氨基酸序列
 
<400>  2
MQIISIALSL LAATGAVAAA TPEQFEARDG AGAMIKYHGI CTKAKNECKF KGQNGRDTFV     60
KCPNFANKRC TKDYNECSYD SVSRAVVCH                                       89
 
<210>  3
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物P1的序列
 
<400>  3
gaattcaccc ctgagcaatt tgaggc                                           26
 
<210>  4
<211>  31
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物P2的序列
 
<400>  4
gcggccgcct agtggcacac gacagctcgg c                                     31
 
 
<210>  5
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PBbafp-pex1的序列
 
<400>  5
cgggatccat gcagattatt tccatcgc                                         28
 
 
<210>  6
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PBbafp-pex2的序列
 
<400>  6
cggaattcct agtggcacac gacagctc                                          28

Claims (10)

1.球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp，其特征在于，所述抗菌蛋白Bbafp氮端为含有19个氨基酸的信号肽序列，羧基端为70个氨基酸的成熟蛋白区域；所述抗菌蛋白Bbafp具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列和酵母表达载体。
3.根据权利要求2所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，其特征在于，所述酵母表达载体优选毕赤酵母表达载体pPIC9K载体。
4.如权利要求2或3所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）Bbafp的克隆：
以球孢白僵菌的cDNA为模版，利用引物P1和P2，扩增Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列；所述成熟蛋白核苷酸序列不包含信号肽的核苷酸序列；
其中，PCR反应体系如下：2.5 μL 10×LA buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，2.5 μL 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模板，加水补至总体积为25 μL；其中P1为上游引物，P2为下游引物；LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL；所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L；PCR反应参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后72℃延伸5 min；
PCR反应后，回收Bbafp片段，克隆进pEASY-T1载体；经测序正确的载体命名为pEASY-Bbafp；
所述引物P1和P2序列如下：
P1：5′- gaattcacccctgagcaatttgaggc-3′；
P2：5’- gcggccgcctagtggcacacgacagctcggc -3′；
其中，P1的下划线部分为EcoRI序列，P2的下划线部分为NotI序列；
2）Bbafp的酵母表达：
   用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切步骤1）构建的pEASY-Bbafp载体，回收Bbazf片段，克隆进相同EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的酵母表达载体，获得权利要求2或3所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体。
5.球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达菌株的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，转化入酵母中，经筛选获得表达Bbafp的酵母表达菌株。
6.球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述抗菌蛋白Bbafp的全部核苷酸序列和植物表达载体。
7.根据权利要求6所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体优选pCambia载体。
8.如权利要求6或7所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以野生型球孢白僵菌的cDNA为模板，引物PBbafp-pex1和PBbafp-pex2，扩增出Bbafp的全长核苷酸片段，包括其氮端的信号肽核苷酸序列；
   PCR反应体系：2.5 μL 10×LA buffer，2 μL dNTP Mix，2.5 μL 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 μmol/L的PBbafp-pex1和PBbafp-pex2各1 μL，0.2 μL LA Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模板，加水补至总体积为25 μL；所述LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL；所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L；PCR反应参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后72℃延伸5 min；
   扩增反应后，回收Bbafp片段，克隆进pEASY-T1载体，获pEASY-fBbafp；用BamHI与EcoRI酶切pEASY-fBbafp，回收Bbafp片段，并克隆进相同BamHI与EcoRI酶切的植物表达载体，获得权利要求6或7所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体；
   所述引物PBbafp-pex1和PBbafp-pex2的序列如下：
   PBbafp-pex1：cgggatccatgcagattatttccatcgc；
   PBbafp-pex2：cggaattcctagtggcacacgacagctc；
   其中，PBbafp-pex1的下划线序列为BamHI序列，PBbafp-pex2的下划线序列为EcoRI序列。
9.含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的转基因植物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求6或7所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体转化入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，经验证获得Bbafp的根癌农杆菌转化子，并进行植物遗传转化，获得含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的转基因植物。
10.球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的应用，其特征在于，权利要求1所述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。
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