CN111635904B - 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用 - Google Patents

一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111635904B
CN111635904B CN202010602799.7A CN202010602799A CN111635904B CN 111635904 B CN111635904 B CN 111635904B CN 202010602799 A CN202010602799 A CN 202010602799A CN 111635904 B CN111635904 B CN 111635904B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cucumber
gene
cswrky10
target spot
breeding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010602799.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111635904A (zh
Inventor
任仲海
刘梦雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN202010602799.7A priority Critical patent/CN111635904B/zh
Publication of CN111635904A publication Critical patent/CN111635904A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111635904B publication Critical patent/CN111635904B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

本发明公开了一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10，所述基因CsWRKY10的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因可在选育抗靶斑病黄瓜品种中得到应用。本发明提供的黄瓜基因CsWRKY10可作为目的基因导入到黄瓜植株中，通过所述基因在黄瓜植株中的过表达，提高黄瓜植株对靶斑病的抗性。因此，本发明可应用于黄瓜育种，通过基因检测手段，筛选出黄瓜基因CsWRKY10过表达的植株，实现抗靶斑病黄瓜品种的选育。该方法安全、可靠，具有很强的农业应用价值。

Description

一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体地说是一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用。
背景技术
黄瓜（Cucumis sativus L.）葫芦科草本植物，是国际上普遍栽培的蔬菜作物，黄瓜具有多种保健作用，深受人们的喜爱。目前，我国主要以温室和大棚栽培为主，由于温室、大棚内特殊的气候条件和连作种植，黄瓜易受到各种病害的侵袭，其中最为严重的病害有靶斑病、霜霉病、白粉病等。这些病害发病及蔓延速度快，造成产量大幅度地下降、品质变劣、植株早衰等一系列问题。为了解决这些问题，人们通常依靠喷洒大量化学农药来防治黄瓜作物的病害侵袭。但是，众所周知，喷洒农药不仅会使病菌产生抗药性，而且会导致黄瓜果实残留大量农药，进而严重威胁食用人群的健康。因此，构建和选育抗病的优质品种是黄瓜高效生产更经济、环保的途径。
黄瓜靶斑病主要危害黄瓜叶片，黄瓜中部叶片最先受害，随后逐渐向下扩展，再向上部叶片发展，叶柄、茎和果实偶有发病。黄瓜叶片发病初期症状为水渍状斑点，后期病斑变为黄褐色，病斑直径4-10 mm。叶片正面病斑粗糙不平，隐约有轮纹，湿度大时会有黑色霉层产生；干燥则会穿孔。多数情况，病斑合并，大面积干枯，叶片脱落。叶柄、茎和果实发病会有棕色病斑产生，果实还会伴有凹陷、开裂等症状。发病严重时，田间减产60%~70%，使黄瓜产量及品质受到严重影响，黄瓜生产遭受巨大经济损失。
目前，在解决靶斑病的问题上，行业内的研究人员行之有效的方法是通过挖掘重要的抗逆基因，并应用现代分子生物学技术将抗逆基因与其它优良性状聚合，进而获得耐逆性强、抗病性强以及高产、优质的黄瓜品种。因此，积极深入研究相关潜在的重要的抗逆基因以及调控特定靶基因，开发其在黄瓜中的新功能，并将其应用于实际生产，是提高黄瓜产量和促进农业经济发展的重要途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用，以解决目前黄瓜作物在栽培中容易受到靶斑病侵袭从而造成产量下降、施用农药污染严重的问题。
本发明是这样实现的：一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10，所述基因CsWRKY10的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
本发明还提供了一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用。
所述的增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，利用转基因技术，将所述基因CsWRKY10在黄瓜植株中进行过表达，培育得到含有过表达黄瓜基因CsWRKY10的转基因抗靶斑病黄瓜植株，所述基因CsWRKY10的核苷酸序列如SEQ IDNO : 1所示。
所述的增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，方法为：
（a）构建含基因CsWRKY10的过表达载体；
（b）将含基因CsWRKY10的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含基因CsWRKY10的过表达载体的农杆菌工程菌；
（c）将所述农杆菌工程菌转入到黄瓜植物体内，培育得到含有过表达黄瓜CsWRKY10基因的转基因抗靶斑病黄瓜植株。
步骤（a）所述基因CsWRKY10的过表达载体为pROKII-35S:: CsWRKY10。
所述的增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，是指在选育抗靶斑病黄瓜品种时，利用PCR技术手段检测其各个黄瓜植株中基因CsWRKY10的表达情况，选择基因CsWRKY10表达量相对较高的植株作为育种的亲本植株。
利用PCR技术手段检测是指以待测黄瓜植株的cDNA为模板，以特异性定量引物进行检测，用β-actin基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR方法检测基因CsWRKY10在不同株系中的表达量；所述特异性定量上游引物和下游引物分别为：
引物名称 引物序列
CsWRKY10-RT-F 5'- ATGGCCAGCTTCCCTTAT -3'
CsWRKY10-RT-R 5'- CACTATCAACTCCTCCAC -3
PCR反应体系20 μL：
组分 体积
模板 1 μL
上游引物CsWRKY10-RT-F（10 μM） 0.4 μL
下游引物CsWRKY10-RT-R（10 μM） 0.4 μL
2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O to 20 μL
反应程序为：
94℃ 30 s
94℃ 5 s
50-60℃ 15 s 40×
72℃ 10 s
本发明通过构建黄瓜基因CsWRKY10过表达载体在黄瓜植株中过表达，增强了黄瓜对靶斑病的抗性，通过靶斑病菌接种实验数据统计分析证明，在接种6天后，野生型和转基因株系逐渐开始观察到明显的病斑，但是转基因植株病斑面积小于野生型；随着病原菌侵染时间的增长，接种9天后，野生型每一处接种病菌悬浮液的位置都已有明显的病斑且病斑面积相对于接种6天时显著扩大，叶片失绿情况比较严重，而观察转基因CsWRKY10过表达植株叶片发现，发病情况与接种6天时没有显著变化，且病斑面积也没有进一步扩大。本发明的创造性贡献在于首次在黄瓜中克隆了基因CsWRKY10，并发现该基因CsWRKY10在黄瓜中过表达可以显著提高黄瓜对靶斑病的抗性，这对黄瓜安全生产具有非常重要的意义。因此，本发明提供的基因CsWRKY10可作为目的基因导入黄瓜植株中，通过改变黄瓜基因CsWRKY10在黄瓜植株中的表达量，增加了抗性基因的表达，提高了对黄瓜靶斑病的抗性，还可在黄瓜育种中，通过PCR技术检测手段，筛选黄瓜基因CsWRKY10表达相对高的黄瓜植株，从而选育出对抗靶斑病较强的黄瓜品种。其应用方法安全、可靠，具有很强的农业应用价值。
附图说明
图1为本发明黄瓜基因CsWRKY10的扩增目的片段图。
图2为本发明的遗传转化过程状态图。
图3为本发明筛选的株系与非转基因对照植株表达量的差异图。
图4为本发明与非转基因对照植株的叶片感靶斑病后不同时间下的表型状态对比图。
图5为本发明与非转基因对照植株的叶片感靶斑病后不同时间下的表型量化统计图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: alaboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 黄瓜基因CsWRKY10的克隆和过表达载体的构建
（1）黄瓜品种选新泰密刺为试材。该品种为生长势强，第4～5节着生根瓜，瓜形棒状，匀称，青绿色，刺瘤密，有纵棱，但不明显。将黄瓜种子播于日光温室中，进行普通的栽培管理，待植株开始结瓜时，取嫩叶液氮速冻，采用Trizol（购自Life Technologies公司）提取液的方法提取黄瓜幼嫩叶片的RNA，用Thermo Fisher公司的反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，存于-20℃保存备用。
（2）设计基因CsWRKY10带酶切位点的扩增引物，引物序列及所携带的酶切位点如下（带有下划线的为酶切位点序列）：
引物名称 引物序列 酶切位点
CsWRKY10-F 5'- <u>TCTAGA</u>ATGGCCAGCTTCCCTTAT -3' XbaI
CsWRKY10-R 5'- <u>GGTACC</u>CTAGGTGGGAGTAGAGGC -3' KpnI
（3）以黄瓜叶片的cDNA为模板，采用KD-Plus高保真聚合酶，扩增带酶切位点的基因CsWRKY10的编码区序列。反应体系如下：
组分 体积
5× KD-Plus Buffer 5 μL
dNTPs（2.5 mM） 2 μL
CsWRKY10-F（10 µM） 1 μL
CsWRKY10-R（10 µM） 1 μL
KD-Plus 0.5 μL
模板 2 μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 25 μL
PCR扩增条件如下：
94℃ 5 min
94℃ 30 s
58℃ 30 s 35×
68℃ 1 min
68℃ 10 min
得到了基因CsWRKY10的PCR扩增片段，如图1所示，进行回收。
（4）回收目的片段：取25 μL的PCR扩增产物在质量体积比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶中电泳检测，切割目的片段，参照凝胶回收试剂盒（康为世纪）附带的说明书进行操作，得目的基因片段，连接pEASY克隆载体上，体系如下：
组成成分 使用量
目的基因片段 4 μL
pEASY克隆载体 1 μL
加入反应液，混匀，于PCR仪中25℃连接30 min，得连接产物。
（5）转化及筛选：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置冰上解冻，无菌操作台中将25 μL大肠杆菌感受态细胞和5 μL的所述连接产物移入1.5 mL离心管中，轻轻混匀，冰浴30 min；打开水浴锅在42℃水浴中热激90 s后立即冰浴2-5 min，该操作过程中保持离心管绝对静止；在无菌操作台中加入800 μL液体LB，放置于37℃，200 rpm摇床上培养45 min；12000 rpm离心1 min，弃上清，用80 μL的液体LB悬浮沉淀，将菌液均匀的涂布于含Kan（50 mg•L-1）的LB平板培养基上，37℃倒置过夜培养至长出单克隆菌落；挑取阳性单克隆送至济南铂尚公司测序，测序得到黄瓜基因CsWRKY10的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示，分子量大小为618 bp。
（6）提取质粒：应用小型质粒提取试剂盒提取阳性质粒（pEASY-CsWRKY10）。分别使用限制性内切酶XbaI和KpnI将阳性质粒（pEASY-CsWRKY10）和植物表达载体pROKII载体进行双酶切；37℃恒温酶切30 min后回收目的片段。酶切体系如下：
组成成分 使用量
阳性质粒DNA 6.5 μL
pROKII载体回收片段 2 μL
10×T4 DNA ligase Buffer 1 μL
T4 DNA ligase 0.5 μL
于PCR仪中22℃连接2 h。
（7）转化及筛选阳性克隆：采用与步骤（5）相同的方法对连接产物转化及筛选，摇菌，提取，质粒酶切验证，结果得到618 bp的如图1大小基本相同的条带，说明pROKII-35S:: CsWRKY10过表达载体构建成功。
（8）制备农杆菌感受态细胞：将农杆菌感受态细胞用接种环于固体LB（含Rif 50mg•L-1）平板培养基中，培养12 h；挑取农杆菌LBA4404的单菌落，接种于5 mL液体LB（含Rif50 mg•L-1）中，28℃，220 rpm培养过夜；向大的离心管中加入2 mL菌液和50 mL液体LB（含Rif 50 mg•L-1）中继续培养，至OD600约为0.5；将菌液冰浴30 min，5000 rpm 4℃，离心5min，弃上清液；加入10 mL冷的灭菌超纯水使菌液悬浮；在4℃下5000 rpm离心5 min，弃上清液；加入1 mL冷的灭菌超纯水使菌液悬浮，分装（50 μL/管），得农杆菌感受态细胞，液氮速冻，-70℃保存。
（9）电击转化农杆菌：电转杯首先用质量比浓度为75%的酒精浸泡20-30 min，然后在60℃烘箱中30 min，紫外灭菌，置于冰上；取出农杆菌感受态细胞，在冰上解冻，向50 μL农杆菌感受态细胞菌液中加入10 μL的pROKII-35S::CsWRKY10过表达载体，轻轻混匀；将混合物转移到冰上预冷的电转杯的两电极之间，擦干电转杯外壁，置于管槽中，盖上盖子；打开电转仪电源，设置电击参数（1800V，2 s），电击两次；电击完成后，取出电转杯，并加入800μL液体LB混匀，转移到1.5 mL离心管中，28℃，220 rpm培养1.5 h；将菌液于12000 rpm离心1 min，倒掉上清液；加入100 μL液体LB充分悬浮，并均匀涂布于LB平板培养基上（含50 mg•L-1 Rif；50 mg•L-1 Kan），28℃倒置培养2 d。
（10）阳性克隆的鉴定：挑取单克隆菌落用PCR检测阳性克隆；把阳性克隆单菌落加入含Rif 50 mg•L-1和Kan 50 mg•L-1相应抗生素的5 mL液体LB中，28°C，220 rmp振荡培养24 h，做菌液PCR；得含有pROKII-35S::CsWRKY10过表达载体的农杆菌工程菌LBA4404，再将其置于400 μL甘油中，-70℃保存。
实施例2 黄瓜基因CsWRKY10的遗传转化及转基因植株的获得
1、农杆菌介导的黄瓜基因遗传转化
利用含有pROKII-35S::CsWRKY10过表达载体的农杆菌工程菌LBA4404侵染黄瓜子叶并经过分化培养基和生根培养基的筛选后，对得到的再生植株用35S上游引物和基因下游引物进行PCR检测。具体的步骤如下：
（1）选取饱满的黄瓜种子，在水中浸泡1 h，其状态如图2中a所示，在无菌台上先用质量比浓度为75 %的乙醇消毒30 s，再用质量比浓度为4.0 %的NaClO灭菌13 min，最后用灭菌超纯水冲洗3~4次。用高温灭菌镊子将种子播在MS培养基板上，暗培养2天。待发芽长出根，进行子叶的侵染。
（2）切取黄瓜子叶，用镊子分开两片子叶（不带生长点），放置MS液体中，震荡培养（28℃，220 rpm）含有pROKII-35S::CsWRKY10过表达载体的农杆菌工程菌LBA4404；大约12h，离心分离农杆菌，悬浮于MS液体培养基中，进行侵染，时间为13 min，放置共培养板，其状态如图2中的b所示，暗培养2天。
（3）培养2天后，其状态如图2中的c所示，然后将黄瓜子叶转入分化培养板中（含Kan 50mg•L-1，Cef 400 mg•L-1）筛选抗性愈伤，7~10天更换一次培养基。
（4）大约15天左右在子叶的一头有绿色愈伤长出，其状态如图2中的d所示，当在愈伤上生出小苗后，进行生根培养，直至大约20~30天根系发育完全，其状态如图2中的e所示。
（5）待根系发育良好后，且长势较好时，打开培养瓶盖往瓶内稍稍倒入一点灭菌水保湿，后套上一透明的塑料袋进行炼苗，得到转基因苗。再按照实施例1所述的步骤提取植株叶片DNA进行转基因验证。
（6）将转入基因CsWRKY10的转基因植株移出炼苗，非转基因植株可留取适量作为对照，移入灭菌基质中炼苗，在基质中炼苗时，注意为防止失水，可套上一透明的塑料袋，两天后在塑料袋顶上撕一小口，撕口要逐渐扩大，直至7~10天后炼苗完毕，如图2中的f所示，后移至大田中，常规管理。
2、转基因植株的验证
（1）CTAB溶液在70℃水浴锅预热；
（2）研钵中放少许黄瓜叶片，加入液氮后充分均匀研磨，将研磨后的样品转入1.5mL离心管中；
（3）加入1 mL预热好的CTAB提取液，上下颠倒混匀，放入70℃水浴锅中30 min，8-10 min上下颠倒混匀一次；
（4）12000 rpm离心10 min，取650 μL上清液至另一新的1.5 mL离心管中，加入等体积抽提液（氯仿:异戊醇体积比为24:1），剧烈震荡混匀；
（5）12000 rpm离心10 min，取500 μL上清液至另一新的1.5 mL离心管中，加等体积预冷的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，-20℃放置至少30 min；
（6）12000 rpm离心15 min，弃上清，用体积比浓度为75%的乙醇洗涤，将沉淀轻轻打起，12000 rpm离心5 min；
（7）重复步骤6；
（8）室温晾干，加入50-100 μL灭菌水，-20℃保存。
（9）转基因植株PCR验证（包含阳性和阴性对照）反应体系如下：
成分 体积
10× EasyTaq Buffer 2.5 μL
dNTPs（2.5 mM） 2 μL
DNA模板 1 μL
35S-F（10 µM） 1 μL
CsWRKY10-R（10 µM） 1 μL
EasyTaq 0.5 μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 25 μL
反应程序为：
94℃ 5 min
94℃ 30 s
58℃ 30 s 35×
72℃ 1 min
72℃ 10 min
通过筛选得到转入CsWRKY10的转基因黄瓜植株，选取转入CsWRKY10的转基因植株的T2代作为下一步实验植株、非转基因植株同等条件下作为对照植株。
实施例3 黄瓜靶斑病抗性试验
（1）黄瓜靶斑病病菌的获得：黄瓜靶斑病菌菌株（Corynespora cassiicola），由山东农业大学植物保护学院保存，在本实验室进行接种、培养、继代。培养及继代所用培养基为PDA培养基，培养条件为25 °C避光。
（2）按照上述转基因植株的筛选方法对转基因植株进行筛选并得到转基因T2代植株。提取株系的总RNA，用Thermo Fisher公司的反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，并以之为模板，以特异性半定量引物进行检测，用β-actin基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR方法检测CsWRKY10基因在不同株系中的表达量。试剂为北京全式金公司生产的TipGreen qPCR SuperMix，荧光定量PCR仪为Bio-Rad（美国）公司的iCyclerQ5实时定量PCR仪。选取表达量高的两个株系分别为OE1和OE2，进行接种试验。
引物名称 引物序列
CsWRKY10-RT-F 5'- ATGGCCAGCTTCCCTTAT -3'
CsWRKY10-RT-R 5'- CACTATCAACTCCTCCAC -3
20 μL反应体系如下：
组分 体积
模板 1 μL
上游引物CsWRKY10-RT-F（10 μM） 0.4 μL
下游引物CsWRKY10-RT-R（10 μM） 0.4 μL
2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O to 20 μL
反应程序为：
94℃ 30 s
94℃ 5 s
50-60℃ 15 s 40×
72℃ 10 s
对转基因的各株系的幼嫩叶片取样，检测基因CsWRKY10的表达量，发现转基因株系OE1、OE2的表达量均显著高于野生型，如图3所示。
（3）分别选取株系OE1和OE2的T2植株各3株和野生对照植株3株，采摘同一节位的功能叶，将各处理的叶片放入垫有三层润湿纱布的大培养皿中，叶茎部用棉花缠绕，进行培养。用点滴法将靶斑病菌孢子悬浮液（1×105孢子mL-1）进行接种，在每片叶片背面滴30 μL的孢子悬浮液，滴6处，放回培养箱（20-26℃，光强1600-1800 lx）进行培养，前24 h进行暗培养，以有利于病原菌的发育，始终进行保湿处理。
发病后第3天、6天、9天观察，并拍照。其结果见图4。图4是本发明与对照植株的黄瓜叶片接种靶斑病后发病的表型对比图；图5为本发明与非转基因对照植株的发病菌斑面积量化图，图4和图5中横坐标的dpi为days post inoculation，表示接种病菌后的天数；纵坐标为病斑的平均面积，用Image J进行测量叶片病斑面积并进行统计分析。其具体方法为：首先，将黄瓜感病叶片及标尺置于黑布上拍照，使用Image J软件，使用的参数默认，其步骤为：（1）首先双击打开软件，进入File菜单，点击Set Sale，设定实际大小和照片中的大小，Distance inpixels为照片中的直线长度，Known distance为实际的直线长度；（2）选择圆形，通过Ctrl+M来统计所选择的病斑图形面积；（3）统计后另存为.xlsx文件，进行数据处理，算出平均数和标准误差来作图。由图4和图5统计数据可知，在接种6天后，WT和转基因株系逐渐开始观察到明显的病斑，但是转基因植株病斑面积小于WT；随着病原菌侵染时间的增长，接种9 天后，WT每一处接种病菌悬浮液的位置都已有明显的病斑且病斑面积相对于接种6天时显著扩大，叶片失绿情况比较严重；而观察CsWRKY10过表达植株叶片发现，发病情况与接种6 天时没有显著变化，且病斑面积也没有进一步扩大。表明过表达基因CsWRKY10增强了黄瓜对靶斑病的抗性。此实验设有三次重复，实验结果基本一致。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> CsWRKY10
<400> 1
atggccagct tcccttatga agattcaaac cttaacccta accctaaccc taataactat 60
actcattttc ctccgattct cgatcccgct tctttctttg attttgagct ctctgatttc 120
cttttgtttg gcgatgacaa caatatcgtc gtcgaccaag ttgcatcgtc ctcgccaagt 180
atgacttcgt ccgagaagat caccagtgga ggagttgata gtggtggtag ctctactgta 240
attgataccg gatctagcgt agtagtttct tcgtcgggag cgtcaacgac atctataaga 300
agcaaaaatg gagagaagaa aaggaaaggg gaaatgggat gtagagttgc atttagaacc 360
aaatcagagc aagaaatcat ggatgatggc tacaagtgga ggaagtatgg gaaaaaatct 420
gtgaagaata gtcccaatcc cagaaattac tataaatgtt caagtgaagg atgcaatgtg 480
aagaagaagg tggaaagaga cagagaggat gcaaactatg tgattactac ttatgaggga 540
attcacaacc atgaaagccc cttcgttgtg tattacaatc aattgccatc ctttacctct 600
gcctctactc ccacctag 618

Claims (4)

1.一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，其特征在于，利用转基因技术，将所述基因CsWRKY10在黄瓜植株中进行过表达，培育得到含有过表达黄瓜基因CsWRKY10的转基因抗靶斑病黄瓜植株，所述基因CsWRKY10的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
2.根据权利要求1所述的增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，其特征在于，方法为：
（a）构建含基因CsWRKY10的过表达载体；
（b）将含基因CsWRKY10的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含基因CsWRKY10的过表达载体的农杆菌工程菌；
（c）将所述农杆菌工程菌转入到黄瓜植物体内，培育得到含有过表达黄瓜CsWRKY10基因的转基因抗靶斑病黄瓜植株。
3.根据权利要求2所述的增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，其特征在于，步骤（a）所述基因CsWRKY10的过表达载体为pROKII-35S::CsWRKY10。
4.根据权利要求1所述的增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10 在选育抗靶斑病黄瓜品种中的应用，其特征在于，在选育抗靶斑病黄瓜品种时，利用PCR技术手段检测黄瓜植株中基因CsWRKY10的表达情况，选择基因CsWRKY10表达量高的植株作为育种的亲本植株。
CN202010602799.7A 2020-06-29 2020-06-29 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用 Active CN111635904B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010602799.7A CN111635904B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010602799.7A CN111635904B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111635904A CN111635904A (zh) 2020-09-08
CN111635904B true CN111635904B (zh) 2022-04-22

Family

ID=72328029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010602799.7A Active CN111635904B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111635904B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058449B (zh) * 2022-06-24 2023-05-16 西南大学 一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法
CN116064586B (zh) * 2022-11-01 2024-04-02 广东省农业科学院果树研究所 一种番木瓜CpWRKY50基因及其提高番木瓜炭疽病抗性的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763688A (zh) * 2020-05-21 2020-10-13 四川大学 一种提高经济作物对黄瓜花叶病毒抗性的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7238860B2 (en) * 2001-04-18 2007-07-03 Mendel Biotechnology, Inc. Yield-related polynucleotides and polypeptides in plants
US20020076775A1 (en) * 2000-03-17 2002-06-20 Crane Virginia C. WRKY transcription factors and methods of use
EP1670916A4 (en) * 2003-09-25 2007-03-14 Univ Queensland BANANA RESISTANCE AND USES THEREOF
WO2013050611A1 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Basf Plant Science Company Gmbh Method of producing plants having increased resistance to pathogens
CN108486149B (zh) * 2018-04-02 2020-03-10 山东农业大学 一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用
CN108893557A (zh) * 2018-08-21 2018-11-27 山东农业大学 一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法
CN109852618A (zh) * 2018-12-17 2019-06-07 广东省农业科学院蔬菜研究所 一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其应用
CN110184382A (zh) * 2019-06-28 2019-08-30 山东农业大学 多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测引物及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763688A (zh) * 2020-05-21 2020-10-13 四川大学 一种提高经济作物对黄瓜花叶病毒抗性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
不同杀菌剂对黄瓜靶斑病菌的毒力作用特性比较;禾丽菲等;《农药学学报》;20180105(第01期);全文 *
植物WRKY转录因子家族基因研究进展;卜华虎等;《山西农业科学》;20200713(第07期);全文 *
空气净化杀菌器对设施环境及黄瓜生长的影响;刘星辰等;《中国蔬菜》;20170601(第06期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111635904A (zh) 2020-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210269816A1 (en) Method of Obtaining Multileaflet Medicago Sativa Materials by Means of MsPALM1 Artificial Site-Directed Mutants
WO2022135246A1 (zh) 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用
CN111635904B (zh) 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用
CN109423492B (zh) SlTOE1基因在调控番茄开花时间和产量中的应用
CN108486149B (zh) 一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用
CN109735538B (zh) 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
US11365423B2 (en) Method of obtaining multileaflet Medicago sativa materials by means of MsPALM1 artificial site-directed mutants
CN111996192A (zh) 创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及其应用
CN112094845B (zh) 一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用
CN112225790B (zh) 水稻抗盐胁迫相关基因onac103及编码蛋白与应用
CN112342235A (zh) GmDGAT2A在提高大豆油含量并增加亚油酸含量中的应用
CN104911198B (zh) 蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2及其编码的蛋白及应用
CN110129322A (zh) Bna-miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育过程中的应用
CN114591984B (zh) OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用
CN114807174B (zh) 一种逆向调控水稻对稻瘟病菌抗性的遗传位点及其应用
CN117431256B (zh) 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用
CN109097388B (zh) GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用
CN116004647B (zh) 一种烟草NtSWEET12基因及其应用
CN109762833B (zh) 一种易变山羊草苯丙氨酸解氨酶基因及其应用
CN109384835B (zh) 一种与抗虫相关蛋白及其编码基因的应用
CN117384917A (zh) 一种烟草果胶甲酯酶抑制子基因NtPMEI及其应用和方法
CN106754968B (zh) 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用
CN116024230A (zh) 番茄SlCab12基因在增强对番茄褪绿病毒抗病性中的应用
CN117603985A (zh) 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用
CN115948451A (zh) LsARF3蛋白或其编码基因在调控叶用莴苣的高温抽薹性能中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant