CN117603985A - 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用 - Google Patents

水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117603985A
CN117603985A CN202311381906.8A CN202311381906A CN117603985A CN 117603985 A CN117603985 A CN 117603985A CN 202311381906 A CN202311381906 A CN 202311381906A CN 117603985 A CN117603985 A CN 117603985A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
osatg5
gene
rice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311381906.8A
Other languages
English (en)
Inventor
陈秋红
唐文帮
沈梦宇
邓化冰
张桂莲
高芙蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Agricultural University
Hunan Hybrid Rice Research Center
Original Assignee
Hunan Agricultural University
Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University, Hunan Hybrid Rice Research Center filed Critical Hunan Agricultural University
Priority to CN202311381906.8A priority Critical patent/CN117603985A/zh
Publication of CN117603985A publication Critical patent/CN117603985A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用。所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：（1）如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；（2）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80%以上的核苷酸序列；（3）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；所述OsATG5基因片段编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。OsATG5基因在植株中进行过量表达，可显著提高植株对稻瘟病的抗性。

Description

水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用。
背景技术
稻瘟病是造成水稻产量和品质下降的最严重病害之一。使用化学农药防治稻瘟病容易污染环境，不利于发展绿色农业，同时还有时效滞后性；利用生物多样性防治稻瘟病虽不会危害人类健康，但是不利于现代化农业的机械化生产，且防治效果不稳定；而培育自身抗稻瘟病的抗性水稻材料被认为是最经济、有效并环保的稻瘟病防治方法。但一些含有单个抗性基因(R)的抗病品种经过多年种植后容易由于稻瘟菌的无毒(AVR)基因突变造成免疫逃逸，从而丧失对稻瘟病的抗性，挖掘更多的稻瘟病抗性相关基因意义重大。
自噬是一类依赖于液泡行使功能的在进化上相对保守的细胞过程，主要行使降解、代谢物质的功能。自噬具有多种形式。自噬小体的形成需要大约20个基因(或基因家族)参与，这些基因被称为核心自噬相关基因(ATG)。自噬基因在水稻与病原菌相互作用中的功能研究较少。
专利CN 110747209 B发现过量表达第458位碱基由A突变为C的水稻自噬相关基因OsATG1a可提高水稻对稻瘟病的抗性。
本课题组前期研究发现突变水稻自噬相关基因OsATG12可提高水稻对稻瘟病的抗性。
但上述现有技术或为使自噬相关基因功能完全失活来获得抗性，或为单碱基定点突变自噬相关基因来获得抗性。自噬相关基因的功能完全丧失很大程度会对植株的生长发育产生不利影响，而仅单碱基替换的自噬相关基因的抗病效果有限。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻基因OsATG5在水稻抗稻瘟病中的应用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
OsATG5基因片段或OsATG5基因片段编码的蛋白在制备抗稻瘟病制剂中的应用，所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80％以上的核苷酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；
所述OsATG5基因片段编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明涉及在植株中超表达OsATG5基因片段，能显著增强植株对稻瘟病菌所引起的病害的抗性。
根据本发明提供的OsATG5基因片段信息，本领域技术人员可通过以下方法获得与OsATG5基因片段功能相当的核苷酸序列：(1)根据OsATG5基因序列信息设计引物，通过PCR扩增的方法从水稻基因组或cDNA中获取；(2)用化学合成的方法获得基因；(3)利用功能保守区域序列设计探针，再通过DNA杂交的方式获得。
优选的，所述应用包括将所述OsATG5基因片段构建过表达载体，利用农杆菌介导转化导入植株，获得过表达抗稻瘟病植株材料。
所述过表达抗稻瘟病植株材料在农艺性状上与野生型植株相近，不影响其生长和产量，可在生产上大规模应用。
一种重组质粒，所述重组质粒包括所述OsATG5基因片段；所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80％以上的核苷酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列。
一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括所述OsATG5基因片段；所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80％以上的核苷酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列。
一种重组植株细胞，所述重组植株细胞包括所述OsATG5基因片段；所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80％以上的核苷酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列。
优选的，所述植株为水稻、小米、大麦或小麦。
本发明还要求保护所述重组质粒、所述重组大肠杆菌、所述重组植株细胞在制备抗稻瘟病制剂中的应用。
一种抗稻瘟病制剂，活性成分为以下物质中的至少一种：
所述OsATG5基因片段、所述OsATG5基因片段编码的蛋白、所述重组质粒、所述重组大肠杆菌或所述重组植株细胞。
本发明还提供了所述抗稻瘟病制剂在抑制稻瘟病菌中的应用。
本发明还提供了所述抗稻瘟病制剂在预防或治疗植株稻瘟病感染中的应用。
通过转基因技术将该抗稻瘟病制剂导入植株后，植株稻瘟病抗性显著提高。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)将OsATG5基因在植株中进行过量表达，可显著提高植株对稻瘟病的抗性。(2)本实验室对多个水稻自噬核心基因的研究发现，多数自噬相关基因均为水稻稻瘟病抗性负调控基因，即突变后使水稻更抗病，但很多水稻自噬基因突变体存在不育或生长发育方面的缺陷，因此这些自噬相关基因很难直接应用于抗病水稻材料的培育，而OsATG5正调控水稻稻瘟病抗性，在水稻中过表达OsATG5基因不仅显著提高了水稻对稻瘟病的抗性，同时对水稻农艺性状无明显影响。
附图说明
图1为OsATG5基因两轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测的结果；
图2为OsATG5编码蛋白的保守结构域分析结果；
图3为OsATG5超表达载体的酶切验证；
图4为OsATG5超表达转基因苗的阳性鉴定结果；
图5为阳性转基因植株中OsATG5基因的表达水平检测结果；
图6为OsATG5基因过表达水稻材料的稻瘟病抗性鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
自噬相关基因OsATG5过表达水稻材料的创制及其稻瘟病抗性鉴定：以水稻日本晴cDNA为模板，通过PCR扩增、载体构建、水稻遗传转化、转基因植株的分子鉴定及稻瘟病抗性鉴定等过程，明确OsATG5是具有水稻稻瘟病抗性的基因，稻瘟病抗性鉴定实验重复6次以上。
试剂配制方法
LB培养基(200g)的配制方法：在装有合适蒸馏水的烧杯中加入酵母提取物1g、蛋白胨2g、NaCl 2g，加入蒸馏水定容至200ml，120℃高温高压灭菌20min。(固体培养基加琼脂粉3g)
燕麦培养基的配制方法：称取燕麦片15g，放入已加入200ml蒸馏水的破壁机中打碎，用筛子过滤后将残渣倒掉；最后加入10g琼脂粉后定容至500ml；120℃高温高压灭菌20min后倒平板。
DNA提取液2％ CTAB的配方见表1。
表1 2％ CTAB配方
实施例1
水稻自噬相关基因OsATG5的克隆
利用BLAST工具在Genbank数据库中检索获取OsATG5序列信息，并查询获得其序列号(MSU_Locus：LOC_Os02g02570)，全长基因序列如SEQ ID NO.1所示，全长CDS序列如SEQID NO.2所示。由于OsATG5的CDS序列GC含量过高，本实施例通过两轮PCR扩增的方式获得OsATG5基因的全长CDS序列。
两轮PCR扩增具体步骤如下：
1.水稻叶片总RNA的提取及cDNA的反转录合成
(1)待水稻日本晴生长至三叶期，取适量叶片于2.0mL RNase-Free EP管中，液氮速冻，研磨至粉碎，加入1mL TRIzol试剂(TRIzol，购自Thermo Fisher Scientific公司，USA)充分振荡混匀，冰上放置5min裂解细胞；加200ul氯仿(预冷)，振荡混匀，冰上放置5min，置于4℃冷冻离心机(购于Thermo Scientific)，10000×g离心15min；吸取上清液至1.5mL离心管(RNase-free)中，加入等体积异丙醇(预冷)，上下倒置数次混匀，冰上静置10min，置于4℃冷冻离心机，10000×g离心15min；弃去上清，留下管底部的微透明或白色物质，加500μl 75％乙醇(预冷)，轻轻弹起底部物质，置于4℃冷冻离心机，10000×g离心10min；弃上清，吸去或风干残余液滴，加50ul DEPC水溶解RNA，置于-80℃超低温冰箱(美菱)保存备用。上述氯仿、无水乙醇、异丙醇均购于国药集团。
(2)cDNA第一链合成
电泳检测(1)中所提水稻组织总RNA，条带清晰明亮即表明质量良好，可用于后继反转录实验。根据反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(购于Thermo Scientific公司)操作说明，先进行消化反应，以去除总RNA中的基因组DNA，消化体系见表2。
表2总RNA的基因组消化体系
将消化体系样品混匀，放入提前预热好的PCR仪(ABI)中，37℃孵育5min，完成消化反应。之后进行cDNA第一链合成，具体反应体系见表3。
表3cDNA第一链合成反应体系
将上述体系样品混匀，置于已预热好的PCR仪中，进行反转录反应，反应程序为：50℃，30min；80℃，5min。反应完成后，将反转录得到的cDNA保存于-20℃冰箱备用。
2.OsATG5基因的两轮PCR扩增
(1)根据OsATG5基因的mRNA序列，分别设计两轮PCR扩增引物P1-F/R和P2-F/R，引物序列如下：
P1-F：GGGGTACCATGGCCGCCGTCGCCGCCGAG(SEQ ID NO.4)
P1-R：CGGGATCCTCAGCCCCATGCCATCGATGA(SEQ ID NO.5)
P2-F：CGAGCTCATGGCGGCGCAGCGCGACGA(SEQ ID NO.6)
P2-R：CGGGATCCTCATCTACCATCCTTAGGCTCTC(SEQ ID NO.7)
(2)以上述合成的cDNA为模板，以P1-F/R为引物，使用高保真酶(北京全式金生物技术有限公司)进行第一轮PCR扩增，扩增反应体系见表4，扩增反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s、60℃复性20s、72℃延伸1min，此三步循环32次，随后72℃补充延伸5min。
表4PCR反应体系
(3)上述扩增完成后，以第一轮扩增产物为模板，以引物P2-F/R进行第二轮PCR扩增，扩增反应体系和程序见步骤(2)。
(4)将两轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，产物长度分别为1222bp，1158bp(图1A和B)，挖胶回收第二轮扩增产物中1158bp长的目的条带。
挖胶回收操作流程参照Magen HiPure Gel Pure DNA Kits胶回收试剂盒说明书(北京全式金生物技术有限公司)，具体步骤：电泳完成后，蓝光切胶仪(上海生工)下挖取1158bp长的目的条带胶条至1.5ml离心管中；按每100mg凝胶加100μl Buffer GDP的比例加入Buffer GDP，60℃干式恒温器下加热10min直至凝胶完全溶解；冷却至室温，加入1/2体积异丙醇，混匀，静置2min以沉淀DNA；转移700μl液体至套有2ml HiPure DNA Column收集管的吸附柱中，静置1min，12000×g离心1min(液体体积超过700μl时可分重复操作此步骤)；弃去收集管中滤液，将吸附柱套回收集管，加300μl Buffer GDP至吸附柱，12000×g离心1min；弃去滤液，把吸附柱套回收集管，加600μl Buffer DW2至吸附柱，12000×g离心1min，此步骤重复一次；去滤液，把吸附柱套回收集管，12000×g离心2min；打开管盖放置1min；将吸附柱套在一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央加30μl ddH2O，静置2min溶解膜上的DNA，12000×g离心1min，弃吸附柱，保留离心管中回收的DNA溶液；使用超微量紫外分光光度计(ND-1000)测定回收DNA产物的浓度，-20℃保存。
3.OsATG5 PCR产物与载体-Blunt Zero Cloning Vector的连接
(1)为将上述OsATG5基因回收产物连接至克隆载体-Blunt ZeroCloning vector中，参照/>-Blunt Zero Cloning Kit(北京全式金生物技术有限公司)操作说明，配置表5连接反应体系。
表5连接反应体系
(2)将配好的连接反应体系混匀，置于干式恒温器((杭州奥盛)中，25℃连接反应15-30min。
(3)待连接反应完成后，将连接产物加入至50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中(DH5α，购于北京全式金生物技术有限公司)，冰浴25min；42℃热激45s，取出，冰浴2min；加入300μl LB液体培养基，置于恒温振荡培养器(天津欧诺)中，220rpm、37℃震荡培养1h；取100μl菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp+，50μg/ml，购于国药集团)的LB固体培养基平板上，过夜培养；挑取过夜培养后平板上的单克隆菌落，分别置于10μl无菌水中，吹打混匀，取1μl菌液作模板，以M13F/M13R为引物进行菌落PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以鉴定阳性单克隆，M13F/M13R序列如下：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO.8)
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO.9)
菌落PCR反应体系及反应程序分别见表6、表7。
表6菌落PCR反应体系
表7菌落PCR反应程序
(4)将阳性单克隆菌液接种于含Amp+(50μg/ml)的LB液体培养基中，220rpm、37℃恒温振荡培养器中培养10-14h，参照生工生物公司的质粒小提试剂盒操作说明抽提阳性单克隆菌落的质粒；
(5)采用限制性核酸内切酶BamHI和SacI(限制性核酸内切酶，NEW ENGLANDBioLabs公司)对上述抽提的质粒进行双酶切，验证阳性重组质粒，酶切反应体系见表8，将配好的反应体系混匀，置于电热恒温水浴锅(上海森信)中，37℃反应2h以上，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1C所示，酶切产物中的载体条带和OsATG5基因条带大小正确；将酶切验证正确的重组质粒-Blunt-OsATG5进行测序，测序结果显示OsATG5基因无碱基突变，表明该重组质粒中含有正确的水稻OsATG5基因的全长CDS序列(与序列表[2]相同)，OsATG5基因克隆载体构建成功。
表8酶切反应体系
(6)使用NCBI中Conserved Domains对OsATG5蛋白序列进行功能结构域分析发现，OsATG5编码蛋白含有APG5(ATG5)功能结构域(图2)。
实施例2
OsATG5基因过表达水稻材料的创制。
1.pCAMBIA1300s-OsATG5过表达载体的构建
(1)酶切与回收：选用限制性内切核酸酶BamHΙ、SacΙ对实施例1中测序正确的-Blunt-OsATG5质粒及过表达载体pCAMBIA1300s(过表达载体pCAMBIA1300s，购于丰晖生物公司)分别进行双酶切，酶切反应体系见实施例1中的表8，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，挖胶回收/>-Blunt-OsATG5酶切产物中的OsATG5目的条带(1158bp)以及pCAMBIA1300s酶切产物中的载体条带(9945bp)，挖胶回收DNA条带的方法见实施例1步骤2部分。
(2)连接：于离心管中分别加入2μl 10×T4 DNA Ligase Buffer、1μl T4 DNALigase、OsATG5条带约100ng、载体条带约50ng，补充Nuclease-free water至20μl，混匀后置于PCR仪中，16℃连接过夜。
(3)转化及PCR验证阳性菌落：将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态，涂布于含有卡那霉素(Kan+，50μg/ml)的LB固体培养基平板上，待长出单克隆菌落，通过菌落PCR(所用引物为M13F/M13R)鉴定阳性菌落，抽提阳性菌落的质粒，此步骤中所涉及的实验步骤与实施例1中相同实验一致。
(4)阳性菌落质粒的酶切验证：采用BamHI和SacI对(3)中抽提的阳性菌落质粒进行双酶切，酶切体系和步骤同实施例1。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示酶切产物中两条条带的大小与载体pCAMBIA1300s和基因OsATG5条带相同(图3)，即过表达载体pCAMBIA1300s-OsATG5构建成功。
2.OsATG5过表达转基因水稻株系的获得
(1)pCAMBIA1300s-OsATG5过表达载体的遗传转化：将酶切验证正确的pCAMBIA1300s-OsATG5质粒送往武汉天问生物科技有限公司进行水稻遗传转化。公司先将pCAMBIA1300s-OsATG5重组质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞，经农杆菌介导的水稻遗传转化技术获得相应的转基因水稻植株。
(2)T0代转基因水稻植株的PCR阳性检测：将获得的30株T0代转基因植株从1～30进行编号，并分别取叶片样品，提取各自的基因组DNA。以1μl DNA为模板，ATG5-OX-F/R为引物(序列如下)，进行PCR扩增，PCR反应体系同实施例1中菌落PCR反应体系相同，PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性20s、60℃复性30s、72℃延伸30s，此三步循环29次，72℃补充延伸5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，30株转基因植株中有22株阳性转基因植株。
ATG5-OX-F/R引物序列：
ATG5-OX-F：CGTAAGGGATGACGCACAAT(SEQ ID NO.10)
ATG5-OX-F：CAATACCAGGCGGGAGTGT(SEQ ID NO.11)
(3)阳性转基因植株中OsATG5基因表达水平的检测：
随机选取7株阳性转基因植株，分别抽提叶片RNA并进行反转录(方法见实施例1)，随后使用于TakaRa公司购买的试剂盒Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)扩增，检测OsATG5基因的相对表达量，以水稻Ubiquitin基因为内参基因。OsATG5基因和Ubiquitin基因的qRT-PCR扩增引物分别为OsATG5-qRT-F/R和UBQ-F/R。
引物序列如下：
OsATG5-qRT-F：CCGACCATTCGAAGTACGGA(SEQ ID NO.12)
OsATG5-qRT-F：TACGTGATGCCTTCGAGCTG(SEQ ID NO.13)
UBQ-F：CGCAAGAAGAAGTGTGGTCA(SEQ ID NO.14)
UBQ-R：GGGAGATAACAACGGAAGCA(SEQ ID NO.15)
qRT-PCR扩增体系见表9：
表9qRT-PCR扩增体系
qRT-PCR扩增程序见表10：
表10qRT-PCR扩增程序
采用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。图5结果表明，与对照日本晴(NPB)相比，3、10、14、15及17号单株中OsATG5基因的表达量均具有较大程度的提高，且14号单株的表达量最高，约为NPB中表达量的11倍，说明OsATG5过表达转基因水稻创制成功。选取10、14号T0代单株进行繁种，二者的田间编号分别为83-5、83-12，以这两个株系的后代材料作为OsATG5基因的过表达水稻材料，进行后继稻瘟病抗性鉴定。
实施例3
OsATG5基因过表达转基因水稻材料的稻瘟病抗性鉴定
1.稻瘟菌的培养及接种
将中国农业科学院植物保护研究所赠送的长有RB22稻瘟菌生理小种的培养皿进行继代培养。在超净工作台中，用接种环刮取RB22稻瘟菌菌丝接种于一新的含燕麦培养基的培养皿上，用封口膜将培养皿密封后置于恒温培养箱(26℃，光照/14h～黑暗/10h)中培养两周左右，至培养皿中培养基上覆盖满稻瘟菌菌丝。
采用离体叶片打孔接种法进行OsATG5超表达转基因水稻材料的稻瘟菌接种实验，具体操作方法：准备种植于相同环境的2个OsATG5超表达转基因株系(83-5、83-12)及对照日本晴的生长至3叶到5叶且长势基本一致的水稻植株；用蒸馏水配置浓度为0.1mg/ml的苯并咪唑溶液(保绿剂)，过滤灭菌后放置于室温备用；用灭菌双蒸水配制0.02％的吐温水(现配现用)；取覆盖满稻瘟菌菌丝的培养皿，加入适量现配的0.02％吐温水，用灭菌的干净玻璃片将培养皿中的稻瘟菌孢子轻轻刮起；将刮起的孢子倒入离心管中，轻轻振荡使孢子散布于吐温水中，然后用灭菌的双层纱布过滤孢子液，取1μl滤液于显微镜下检察孢子浓度，将孢子浓度调至约50个/μl；选取各材料的倒二叶叶片，先剪去3cm左右叶尖部分，再剪取6cm长的叶片，用打孔器在叶脉附近进行打孔(每片叶可在距离两端1.5cm位置的叶脉处各打一个孔，注意打孔时不能将叶片打穿)；在方形培养皿中铺上用0.1mg/ml苯并咪唑浸湿的滤纸，将各材料叶片放置于同一培养皿中，再用0.1mg/ml苯并咪唑浸湿的灭菌棉条固定住叶片两端；用移液枪吸取5-10μl悬浮的稻瘟菌孢子液滴于打孔器所打的伤口处；用封口膜密封培养皿，置于25℃-28℃培养箱(上海森信)中，先黑暗培养24h，然后再采用光照/14h～黑暗/10h的条件继续培养。
2.各材料的发病情况统计
观察接种稻瘟病菌5天后的培养皿中的水稻叶片，拍照，测量各材料的病斑长度，(多个叶片则取其平均值)，再测量各材料的稻瘟病菌相对生物量。稻瘟病菌相对生物量检测方法参照Kawano等，具体的操作方法为：剪取病斑区域叶片，每片叶片所剪取的面积相同，用CTAB法抽提各样品的DNA；加入适量RNaseI消化DNA中的RNA，使用超微量紫外分光光度计(ND-1000)测定各样品DNA的浓度；将每个样品的DNA浓度稀释至一致，之后进行实时荧光定量PCR(qPCR)扩增，对样品中的稻瘟菌基因MoPot2进行相对定量，使用水稻泛素蛋白基因Ubiquitin为内参，以此结果作为水稻叶片稻瘟菌的相对生物量。Ubiquitin内参基因的扩增引物为gUBQ-F/R，稻瘟菌基因MoPot2的扩增引物为Mopto2-F/R，qPCR反应体系与程序同表9和表10，引物序列如下所示：
gUBQ-F：TTCTGGTCCTTCCACTTTCAG(SEQ ID NO.16)
gUBQ-R:ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA(SEQ ID NO.17)
Mopto2-F：ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG(SEQ ID NO.18)
Mopto2-R：AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT(SEQ ID NO.19)
由图6结果可以看出，接种稻瘟菌后，OsATG5过表达转基因水稻材料的病斑长度显著短于对照材料的病斑长度(图6A、6B)，对照日本晴中的稻瘟菌相对生物量极显著高于OsATG5过表达转基因株系材料中的相对生物量(图6C)，即OsATG5基因在水稻中的过量表达显著提高了水稻对稻瘟病的抗性。本实验室还证实在水稻中敲除OsATG5基因会降低水稻对稻瘟病的抗性(结果未展示)。

Claims (9)

1.OsATG5基因片段或OsATG5基因片段编码的蛋白在制备抗稻瘟病制剂中的应用，其特征在于，所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80%以上的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；
所述OsATG5基因片段编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括将OsATG5基因片段构建过表达载体，利用农杆菌介导转化导入植株，获得过表达抗稻瘟病植株材料。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括OsATG5基因片段；所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80%以上的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列。
4.一种重组大肠杆菌DH5α细胞，其特征在于，所述大肠杆菌DH5α感受态细胞包括OsATG5基因片段；所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80%以上的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列。
5.一种重组植株细胞，其特征在于，所述重组植株细胞包括OsATG5基因片段；所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80%以上的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组植株细胞，其特征在于，所述植株为水稻、小米、大麦或小麦。
7.如权利要求3所述的重组质粒、如权利要求4所述的重组大肠杆菌DH5α细胞、如权利要求5或6所述的重组植株细胞在制备抗稻瘟病制剂中的应用。
8.一种抗稻瘟病制剂，其特征在于，活性成分为以下物质中的至少一种：OsATG5基因片段、OsATG5基因片段编码的蛋白、如权利要求3所述的重组质粒、如权利要求4所述的重组大肠杆菌DH5α细胞或如权利要求5或6所述的重组植株细胞；
所述OsATG5基因片段为以下物质中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列同源性为80%以上的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列功能相当的核苷酸序列；
所述OsATG5基因片段编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求8所述的抗稻瘟病制剂在抑制稻瘟病菌中的应用。
CN202311381906.8A 2023-10-24 2023-10-24 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用 Pending CN117603985A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311381906.8A CN117603985A (zh) 2023-10-24 2023-10-24 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311381906.8A CN117603985A (zh) 2023-10-24 2023-10-24 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117603985A true CN117603985A (zh) 2024-02-27

Family

ID=89946967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311381906.8A Pending CN117603985A (zh) 2023-10-24 2023-10-24 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117603985A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108623665A (zh) GhHUB2蛋白在调控棉花纤维长度和强度中的应用
CN113564181A (zh) 油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT1在调控作物含油量中的应用
CN114317569B (zh) 苹果基因MdBGLU40及在苹果树抗腐烂病中的应用
CN111635904B (zh) 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用
CN114317570A (zh) 一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS及其在抗月季灰霉病中的应用
CN116425847B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-10及其应用
CN113481213A (zh) 油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量中的应用
CN116444636B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-6及其应用
CN116355067B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-12及其应用
CN109666655B (zh) 一种禾谷镰刀菌单链环状DNA病毒FgGMTV1/HB58及其应用
CN116041462A (zh) OsGA2蛋白、编码基因或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用
CN112094845B (zh) 一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用
CN117603985A (zh) 水稻基因OsATG5在抗稻瘟病中的应用
CN114807174A (zh) 一种逆向调控水稻对稻瘟病菌抗性的遗传位点及其应用
CN107723293A (zh) 一种棉纤维发育相关基因GbWRKY32及其表达载体与应用
CN116496372B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-11及其应用
CN116496371B (zh) 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-5及其应用
CN104988176B (zh) 一种提高杜仲含胶量的方法
CN110922463B (zh) 水稻抗病基因rga5-hma5及其在水稻育种中的应用
CN114958866B (zh) 调控大豆分枝数的基因及其用途
CN116064648B (zh) OsGA1蛋白或与其相关的生物材料在调控植物稻瘟病抗性中的应用
CN117304288B (zh) 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用
CN117431256B (zh) 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用
CN118530325A (zh) BnaDR1基因、蛋白及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用
KR100552618B1 (ko) 아그로박테리움(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)을 이용한사과 '후지' 품종의 형질전환

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination