CN113481213A

CN113481213A - 油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量中的应用

Info

Publication number: CN113481213A
Application number: CN202110918701.3A
Authority: CN
Inventors: 郭亮; 鲁少平; 洪越; 夏慧
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2021-10-08

Abstract

本发明公开了油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的核苷酸序列如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。通过获得过表达和突变体材料分析转化材料的含油量，发现BnNTT2基因促进甘蓝型油菜种子含油量的积累，同时还调控脂肪酸组成，因此可使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有BnNTT2基因的过表达载体转化到作物中，获得BnNTT2基因过表达的作物品种。

Description

油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和作物育种技术领域，具体涉及油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用。

背景技术

人体所需的大部分脂肪酸都来源于植物食用油，植物油脂还广泛应用于制造化妆品、油漆、润滑剂等化工产品，此外，植物油还是生物柴油这一重要“绿色能源”的原料。正是因为植物油脂具有如此重要的作用，全球植物油的消费量在不断增加。油菜是世界范围内最重要的油料作物之一，据研究表明，油菜种子含油量每提高1个百分点，单位面积油菜的产量就能提高2.3-2.5百分点，因此提高种子含油量是提高油菜单位面积产油量的关键措施之一。通过生物工程技术手段寻求促进油菜油脂积累的关键基因，对促进油菜高产具有重要意义。

脂肪酸的生物合成是一个非常复杂的生理生化过程，需要多种酶的催化和转录因子的调控。ACCase是脂肪酸从头合成反应中起重要作用的关键酶，它在ATP的作用下催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A，这一反应是脂肪酸合成的限速步骤。在脂肪酸合成代谢中，除了酶，还有一些转录因子也起到了非常重要的调控作用，包括LEC1、WRI1和Dof等。此外，ABI3、FUS3和LEC2还是种子成熟过程的主要调控因子。关键酶ACCase和很多转录因子都以不同程度影响着脂肪酸的合成代谢，共同调控种子发育过程中油脂的合成与积累。

本发明从油菜中克隆了一个保守的三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2，研究表明，在组成型启动子35S的作用下将这个基因在油菜中过表达可以显著提高种子的含油量；而利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建的突变体油菜种子的含油量有所下降。结果表明BnNTT2基因在调控油菜种子含油量和脂肪酸组成中发挥重要作用，因此本发明可以为培育高含油量的油菜新品种提供理论参考依据和新的基因资源，同时为油脂合成这一研究提供新思路。

发明内容

本发明的目的在于提供油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，该基因定位于叶绿体中，功能是与ATP/ADP结合，将胞浆内的ATP转运到质体中，并交换出等量的ADP到细胞质中。该基因在油菜C5、A6、A8和C8染色体上各有一个拷贝，分别是BnaC05.NTT2(BnaC05g11870D)、BnaA06.NTT2(BnaA06g10210D)、BnaA08.NTT2(BnaA08g23810D)和BnaC08.NTT2(BnaC08g16710D)，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，其中BnaC05.NTT2由1845bp组成、BnaA06.NTT2由1833bp组成、BnaA08.NTT2由1839bp组成，BnaC08.NTT2由1830bp组成；该基因编码的蛋白质序列分别如序列表SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示，其中BnaC05.NTT2编码614个氨基酸、BnaA06.NTT2编码610个氨基酸、BnaA08.NTT2编码612个氨基酸，BnaC08.NTT2编码609个氨基酸。可以采用PCR技术从植物基因组、mRNA和cDNA中扩增得到此基因。

本发明在构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前加了一种组成型启动子花椰菜花叶病毒CaMV 35S，构建含有三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的重组表达载体，在表达载体上加入了抗生素标记物以筛选转基因植株。

本发明提供一种获得高含油量作物的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的过表达载体转化到作物的基因组中，获得基因BnNTT2超表达的油菜品种。

本发明的一个特点在于通过获得过表达和突变体材料，分析了转化植株的含油量和脂肪酸，发现BnaC08.NTT2正调控含油量的积累，同时还调控脂肪酸组成。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本发明所述的表达载体包括但不限于p35S-FAST、PHSE401(中国农业大学陈其军课题组提供)等。

本发明获得的高含油量过超表达油菜植株，在其营养生长与生殖生长时期比正常植株发育更好，因此该遗传资源在油菜高油育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：BnaC08.NTT2基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2：构建的植物表达载体p35S-FAST-BnaC08.NTT2的质粒图谱。

图3：油菜转化单株的qRT-PCR检测。OE65和OE68是基因BnaC08.NTT2的超表达株系，每个株系有3个不同的单株，**表示在Student’s t test中P<0.01。

图4：油菜BnNTT2突变体的获得和鉴定。两个sgRNA分别位于基因BnaA08.NTT2和BnaC08.NTT2的第二个外显子区和第四个外显子区，获得的2个突变体的靶位点的编辑情况：M85和M86为BnaA08.NTT2和BnaC08.NTT2均被编辑的双突。

图5：BnaC08.NTT2在油菜的表型鉴定。利用GC-MS分析油菜种子的含油量，M85和M86为BnaA08.NTT2和BnaC08.NTT2的CRISPR双突变体。OE65和OE68是基因BnaC08.NTT2的超表达株系。每个株系有5个不同的单株，根据方差分析，不同的字母表示P<0.05的显著差异。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法。

实施例1BnaC08.NTT2基因的克隆

NTT2基因在油菜C5、A6、A8和C8染色体上各有一个拷贝，分别命名为BnaC05.NTT2(BnaC05g11870D)、BnaA06.NTT2(BnaA06g10210D)、BnaA08.NTT2(BnaA08g23810D)和BnaC08.NTT2(BnaC08g16710D)，核苷酸序列分别为序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示，含有完整的ORF阅读框及起始密码子ATG，它们分别编码614、610、612和609个氨基酸(分别见SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)。在发育中的种子和除根以外的其他组织中，BnaA08.NTT2和BnaC08.NTT2的表达水平远高于BnaC05.NTT2和BnaA06.NTT2。此外，BnaC08.NTT2在这些组织中的表达水平略高于BnaA08.NTT2；并且BnaA08.NTT2和BnaC08.NTT2具有相似的氨基酸序列以及基因和蛋白质结构。因此，为了便于操作我们挑选了基因BnaC08.NTT2作为我们的候选基因进行了克隆。

(1)RNA的提取

总RNA的提取采用全式金公司的TransZol(目录号ET101)，提取方案遵从试剂盒使用说明书。需要提前准备的试剂有RNase-free水、氯仿、异丙醇和75％乙醇(由DEPC处理的水配制)。所用试剂和实验用品均经过DEPC灭活RNA酶处理。具体步骤如下：

a.取甘蓝型油菜的叶片于液氮中充分研磨直至粉末状，取100mg研磨好的样品转移到1.5ml离心管中，加入1ml TransZol，之后上下剧烈震荡使之充分混匀，进行匀浆处理，之后室温静置5分钟；

b.向离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；

c.10，000×g 4℃离心15分钟；

d.将上层无色的水相转移至新的离心管中(体积大约为0.6mL)，加入0.5ml经过预冷的异丙醇并颠倒混匀，室温孵育10分钟；

e.10，000×g 4℃离心10分钟，倒去上清，离心管侧壁和底部形成沉淀；向离心管中加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，剧烈涡旋；

f.7，500×g 4℃离心5分钟，去上清，室温晾干沉淀15分钟左右；

g.将沉淀溶于50μl-100μl RNA溶解液中，55-60℃孵育10分钟，将样品保存于-80℃冰箱中备用。

h.取1μl抽提的总RNA在Nanodrop下测定RNA浓度和质量，依据1.8<OD260/OD280<2.0鉴定RNA纯度。同时取2μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测完整性和质量。

(2)RNA反转录

本实验所用的反转录试剂盒是全式金

One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix(目录号AE311-03)。具体实验操作遵从使用说明书，反应体系如下：

将以上反应体系轻轻混匀后置于42℃孵育30min，进行合成第一链cDNA和去除gDNA；之后，85℃加热5秒钟失活

RT/RI和gDNA Remover。最后，加入180μlRNase-free Water溶解合成的cDNA。

(3)BnaC08.NTT2基因的扩增

以上述cDNA为模板，用正向引物5’-GCGGGTACCATGGAAGGTCTAATCCAAC C-3’和反向引物5’-GCGGGATCCGAATGCTACTCGGGGAAG-3’扩增得到含有BnaC08.NTT2全长CDS的片段。采用I-5^TM 2×High-Fidelity Master Mix(TSINGKE Biologica technology)进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为:

按照上述反应体系配置好反应液于PCR管中，在Bio-Rad PCR仪上进行扩增，PCR扩增程序为：

扩增后产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，扩增获得1830bp的BnaC08.NTT2全长，PCR扩增产物的挖胶回收使用天根琼脂凝胶DNA回收试剂盒(DP130227)。

实施例2 BnaC08.NTT2基因过表达转化载体的构建

(1)对上述获得的BnaC08.NTT2片段用快速限制性内切酶KpnI和BamHI进行双酶切，本实验所用的限制性内切酶为上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。双酶切体系如下:

酶切反应在37℃水浴1.5小时。酶切产物利用北京天根生物工程有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(DP130227)进行回收。

(2)酶切产物连接到载体p35S-FAST，连接反应体系如下：

连接反应条件：22℃3小时。

(3)转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，选取3个阳性克隆送样测序，分析结果显示，BnaC08.NTT2基因的CDS序列成功连接上载体，即成功构建并转化植株的植物表达载体p35S-FAST-BnaC08.NTT2(如图2所示)。

(4)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株GV3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。使用电击法转化农杆菌GV3101感受态，具体实验步骤如下：

a.用纯水、超纯水、无水乙醇分别清洗电转杯，置于超净台晾干；

b.将重组质粒和农杆菌GV3101感受态置于冰上解冻；

c.取构建正确的重组质粒1μl，加入到25μl农杆菌GV3101感受态中，轻轻吸打混匀，避免产生气泡；

d.将上述混合液沿着杯壁迅速转入已经预冷的电转杯中；

e.将电转仪调至1800V，之后用吸水纸擦干电转杯外壁，在1800V电压条件下电击；

f.电击成功后，向电转杯中加入200μl无抗LB液体培养基，轻轻吸打几下，之后将溶液转移至1.5ml无菌离心管中，28℃150r/min活化2小时左右；

g.将复苏的菌株涂到含有抗生素的LB固体培养基上，于28℃培养箱中倒置培养48小时；

h.在平板上挑取单菌落，用载体前引物和目的基因后引物对其进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。

i.取阳性菌液加入抗性的LB液体培养基，于28℃，150r/min摇床中扩大培养至OD值达到0.8，加入等体积的50％(v/v)的甘油混匀，将其保存于-80℃冰箱。

实施例3 BnaNTT2-CRISPR载体的构建

利用中国农业大学陈其军实验室的sgRNA-Cas9系统创建突变体。实验操作步骤如下:

(1)登录到网站http://www.cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR，筛选靶点。构建两个靶点同时编辑BnaA08.NTT2(BnaA08g23810D)和BnaC08.NTT2(BnaC08g16710D)两个基因的载体，两个靶点设计在两个基因的第二个外显子区和第四个外显子区，sgRNA1的碱基序列为5’-AAAAAGTTCTATCCTTTGTTTGG-3’，5’端距离第二个外显子起始点21bp，sgRNA2碱基序列为5’-CTGAGTACTCGTTCGGACTAGG-3’。BnaC08.NTT2基因中两靶点相距706bp。

(2)设计引物：

DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGAAAAGTTCTATCCTTTGTTGTT

DT1-F0:TGAAAAGTTCTATCCTTTGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

DT2-R0:AACAGTCCGAACGAGTACTCAGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC

DT2-BsR:ATTATTGGTCTCGAAACAGTCCGAACGAGTACTCAGCAA

(3)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板进行四引物PCR扩增。DT1-BsF和DT2-BsR为正常引物浓度；DT1-F0和DT2-R0稀释20倍。PCR扩增体系为:

PCR扩增程序为：

(4)纯化回收PCR产物，建立如下酶切-连接体系：

(5)取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态，在Kana抗性的LB培养基上筛选阳性克隆。U626-IDF+U629-IDR＝726bp菌落PCR鉴定，U626-IDF和U629-IDF测序，测序正确的载体即为构建成功的CRISPR载体。

(6)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株GV3101感受态中，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存，继续油菜遗传转化工作的开展。

实施例4遗传转化实验

(1)油菜的遗传转化

对构建好的过表达载体和CRISPR载体采用下胚轴暗光培养进行油菜的遗传转化，本发明中用于油菜转化的受体为甘蓝型油菜Westar，具体方法如下：

a.种子的灭菌：

将经过挑选的成熟饱满的甘蓝型油菜‘Westar’种子倒入培养盒中，用75％的酒精浸泡种子1min左右，时间不能超过5分钟；使用无菌水清洗浸泡后的种子1-2次；加入能够淹没种子的0.15％-0.2％升汞溶液(保存于实验室的棕色瓶中，可用实验室5％的母液稀释)，消毒15min；用无菌水清洗种子5-6次。

b.播种：

用灭过菌的镊子将种子播种于M0培养基，每个培养皿均匀播种40-50粒种子；播完种后将培养皿放在暗光条件下培养7天左右，温度25℃。

c.农杆菌的培养：

播种五天后，在抗性平板上接种细菌，用经过消毒的接种环蘸取含有目的基因的农杆菌菌液在抗性LB平板上划线；2天后在抗性平板上用牙签或枪头吸取阳性单菌落，置于抗性LB液体培养基中吹打，于28℃，150r/min摇菌。

d.外植体的制备和侵染：

检测菌液在600nm吸收光条件下的浓度(分光光度计)，测出菌液的OD值，OD值在0.6-0.8之间为最佳，此时将菌液6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液等体积的DM(Dilution Medium)液体重悬，6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液相同体积的DM溶液悬浮。之后取2mL菌液于灭菌的培养皿中，20mL DM溶液对其进行稀释(1：10)；用无菌解剖刀和镊子将暗光培养7天后的幼苗下胚轴切下，切取长度为0.8-1.0cm，切取外植体时尽量一刀切下，保持其切口整齐；将切取下来的外植体放到已配好浓度的菌液中，侵染30min(时间不能过长)，用移液器隔段时间吸打一次，使得切口充分接触菌液。

e.愈伤组织的培养：

用已灭菌的吸水纸吸干外植体上的菌液，再将外植体转移到M1培养基中，每皿50-60个外植体，暗光条件下培养2天左右，温度25℃；两天后，将外植体转移到诱导愈伤的M2培养基中，光照条件下进行培养(白天16h/夜晚8h)，温度22℃，之后都在光照条件下进行培养；三周后，将生长正常，两端膨大的外植体转到分化培养基M3中，每2-3周继代一次，长出绿芽为止；切下已经有明显基节的绿芽并将其转入培养基M4中进行生根，需要2-4周，待生根后将其移栽至室外大田里，观察植株田间生长表型(本发明中培养基配方见表1)。

表1下胚轴暗光培养的培养基配方

(2)过表达转化单株的鉴定

提取获得的油菜过表达转化单株的基因组DNA，通过PCR检测外源基因片段的插入，本发明中过表达的骨架载体为p35S-FAST，在骨架载体上设计引物FAST-F(5’-AAAGGCCATCGTTGAAGATG-3’)和FAST-R(5’-TCGAACTCAGTAGGATTCTG-3’)，通过载体骨架引物与外源片段引物搭配来进行PCR反应(FAST-F和BnaC08.NTT2-R或者BnaC08.NTT2-F和FAST-R)，外源片段引物BnaC08.NTT2-F(5’-GCGggtaccATGGAAGGTCTAATCCAACC-3’)，BnaC08.NTT2-R(5’-GCGggatccGAATGCTACTCGGGGAAG-3’)，在PCR水平检测转基因苗。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

对PCR获得的油菜转基因阳性苗进行qRT-PCR，以检测基因表达量。利用TransZol试剂盒提取转化单株种子的RNA并进行反转录合成cDNA(方法同实施例1)，最后用全氏金的PerfectStart^TM Green qPCR SuperMix试剂对样品进行荧光定量PCR分析。

定量引物利用Primer 5软件设计得到，产物大小在100bp-200bp之间，设计好后用参考序列进行BLAST比对，确保引物BnaC08.NTT2-F(5’-GGTAGCGTTGTGGTTTCAGTT-3’)和BnaC08.NTT2-R(5’-AACCATCAACTCCAGGACCAA-3’)的特异性。BnACTIN7-L(5’-CGCGCCTAGCAGCATGAA-3’)和BnACTIN7-R(5’-GTTGGAAAGTGCTGAGAGATGCA-3’)作为油菜qRT-PCR的内参引物。qRT-PCR反应体系为:

qRT-PCR反应程序为：

qRT-PCR反应在Bio-Rad CFX96 Real-Time System中进行。

根据内参引物进行标准化，不同重复间定量变异用delta-deltathreshold cyclerelativequantification(2-ΔΔCT)的方法计算。最后分析选择油菜过表BnaC08.NTT2的两个单株OE65和OE68进行进一步分析(图3)。

(3)CRISPR转化单株的鉴定

对获得的油菜CRISPR转化单株进行测序筛选油菜突变体。首先利用引物Cas9-F(5’-CGCACAATCCCACTATCCT-3’)和Cas9-R(5’-CCAGGTCATCGTCGTATGTG-3’)鉴定Cas9蛋白，对于Cas9蛋白阳性单株进行目的基因的特异扩增以及测序鉴定。目的基因的特异扩增的方法为：分别用引物NTT2-A8-F(5’-GGGTCCTCTCGCGATTTTGA-3’)和NTT2-A8-R(5’-CCAGCGGTGCGAACGGGCC-3’)特异扩增BnaA08.NTT2；NTT2-C8-F(5’-GGGCCCTCTCGCGATCCTGA-3’)和NTT2-C8-R(5’-CCAGTGGCGCAAATGGGCC-3’)特异扩增BnaC08.NTT2。扩增方法同实施例4(2)所示。

对扩增的目的片段进行PCR产物测序，分析靶位点的编辑情况。测序结果显示，获得了BnaA08.NTT2和BnaC08.NTT2同时被编辑的双突变体株系M85和M86，编辑造成了靶点处不同程度的碱基插入和缺失(图4)。

(4)遗传转化所得转基因植株的含油量分析

采用气相色谱-火焰离子化检测器法测定油菜种子含油量：

a.称取4粒形状大小一致的油菜成熟种子，保证总质量在15mg-18mg范围内，记录下称取的质量，每株材料进行5个重复。

b.将称取好对油菜种子放入干净的提脂管中，加入4.5mL甲醇提取液(95％甲醇，5％浓硫酸，0.01％BHT)。

c.利用玻璃棒研破提脂管中种子的种皮并使种子露出胚。

d.用玻璃针(100μL)量取配好的十七烷酸100μl(C17：0，16.2μmol/ml，分子量270.45)于提脂管中，用力旋紧管盖，上下颠倒混匀。

e.将提脂管置于85℃水浴锅中，水浴2h，让其充分反应。

f.2h后，将提脂管拿出并冷却至室温，之后加入3mL的ddH₂O和3mL的正己烷，注意要缓慢加液防止液体溅出，涡旋混匀。

g.1000r/min 25℃离心10min，用胶头滴管吸取1mL左右的上清液于进样瓶中，用于之后的GC-MS分析，暂时不用可放置-20℃冰箱储存。

(以上提取脂肪酸过程用的有机试剂均是色谱纯级别。)

h.设置高效气相色谱气质联用分析仪(GC-MS)参数：将分流比设成10：1，选择Rtx-Wax(0.25mm×30m)色谱柱，设置GC进样口温度为230℃，柱箱初始温度为170℃并保持2min，之后温度以5℃/min的速率上升至230℃保持5min。MS进样口温度设置为230℃，调谐电压为0.2kV。之后GC-MS自动进样进行分析。

i.利用GC-MS的峰图结果对物质进行定性分析。利用GC-MS的峰图结果对物质进行定量分析：结合物质的分子量和质量，根据内标计算脂肪酸组成和含油率。

含油量结果显示，与WT(41.59±0.78)相比，BnaC08.NTT2基因的过表达材料含油量分别为OE65(44.21±0.41)和OE68(44.64±0.57)，显著上升2.6-3.0个百分点(图5a)；而突变体材料的含油量分别为M85(41.86±0.42)和M86(41.34±0.35)，低于过表达材料含油量(图5a)。另外，脂肪酸组成结果显示，与WT相比，过表达材料的C18:1和C18:3含量均显著增加(图5b)。

这些结果表明，BnaC08.NTT2在调控甘蓝型油菜种子含油量和脂肪酸组成中确实发挥重要作用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因 BnNTT2在调控作物含油量中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1845

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 1

atggaaggtc tgattcaacc cagagggatt ctctctctac cgaccaaacc catcggagcg 60

agaagaactc ttcttctcca accctctcac gccttaaagc aaagactttt caccagaaac 120

ctccctccct tgtcgatttc ctctaatggg cattccaaat ttcaatcctt tcacccaaac 180

ccacacaaga ttttgatttc ccacagggag agaaacagag gcttcatctg caaggcggag 240

gccgccgccg ccggagaagg aggagactcg acggccttaa cgcctcctaa ggttttcggc 300

gtggaggtca cgactctgaa gaagattatc cctttggggc taatgttctt ctgcattctc 360

ttcaactaca cgatcctcag agacaccaag gacgtcttgg tggttacggc gaaaggaagc 420

tctgctgaga ttataccgtt tctcaagaca tgggtgaatc ttcccatggc tattggcttc 480

atgttgcttt acaccaaact ctccaatgtt ttgtccaaaa aggctctctt ttacactgtt 540

atcgtcccgt tcattgccta cttcggagcc tttggttttg ttatgtaccc tctcagcagc 600

ttgattcacc ctgaggctct tgctgataag ctccttgcaa cgctcggccc taggttcatg 660

ggtcctctcg ctatcatgcg gatttggagt ttctgtttgt tctatgtcat ggctgagctt 720

tggggtagcg ttgtggtctc agttctcttc tggggctttg ccaatcagat cacaactgtt 780

gatgaagcca aaaagttcta tccattgttt ggactaggtg ccaatgttgc acttatattc 840

tcaggaagaa ctgtgaaata tttctctaac atgagaaaga atcttggccc tggagttgat 900

ggttgggctg tctcattaaa agccatgatg agtattgtcg ttgggatggg cctcgccatc 960

tgtttcctct actggtgggt caatagatac gtcccactcc caacacgtag caagaagaag 1020

aaggcgaaac cacagatggg gacgatggag agcttgaagt tcttggtgtc atcaccatac 1080

atcagggatc tagctacttt ggttgtcgcc tatgggatta gtatcaacct tgttgaagtc 1140

acatggaaat caaaacttaa agctcagttc cctagcccga acgaatactc agcgtttatg 1200

ggtgacttct caacctgcac gggtattgca acattcacaa tgatgcttct aagtcaatac 1260

gtattcgaca agtatggatg gggagtagct gcaaagatca ctccaaccgt tctgctggtg 1320

accggagttg cattcttctc tctgatactc tttggtggcc cgttcgcgcc actggttgcc 1380

aagcttggta tgacaccgct gctcgcagct gtctacgttg gagctctcca gaatatcttt 1440

agcaagagtg ctaagtacag cttgtttgat ccttgcaaag aaatggctta tatcccatta 1500

gatgaagaca ccaaggttaa aggcaaagct gcaattgatg ttgtctgcaa cccattgggg 1560

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<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

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<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

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Ser Pro Tyr Ile Arg Asp Leu Ala Thr Leu Val Val Ala Tyr Gly Ile

355 360 365

Ser Ile Asn Leu Val Glu Val Thr Trp Lys Ser Lys Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Phe Pro Ser Pro Asn Glu Tyr Ser Ala Phe Met Gly Asp Phe Ser Thr

385 390 395 400

Cys Thr Gly Ile Ala Thr Phe Thr Met Met Leu Leu Ser Gln Tyr Val

405 410 415

Phe Asn Lys Tyr Gly Trp Gly Val Ala Ala Lys Ile Thr Pro Thr Val

420 425 430

Leu Leu Leu Thr Gly Val Ala Phe Phe Ser Leu Ile Leu Phe Gly Gly

435 440 445

Pro Phe Ala Pro Leu Val Ala Lys Leu Gly Met Thr Pro Leu Leu Ala

450 455 460

Ala Val Tyr Val Gly Ala Leu Gln Asn Ile Phe Ser Lys Ser Ala Lys

465 470 475 480

Tyr Ser Leu Phe Asp Pro Cys Lys Glu Met Ala Tyr Ile Pro Leu Asp

485 490 495

Glu Asp Thr Lys Val Lys Gly Lys Ala Ala Ile Asp Val Val Cys Asn

500 505 510

Pro Leu Gly Lys Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Gln Phe Met Ile Leu

515 520 525

Thr Phe Gly Ser Leu Ala Ser Ser Thr Pro Tyr Leu Gly Val Ile Leu

530 535 540

Leu Gly Ile Val Thr Ala Trp Leu Ala Ala Ala Lys Ser Leu Glu Gly

545 550 555 560

Gln Phe Asn Thr Leu Met Ser Glu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Met Glu

565 570 575

Arg Ala Ala Ser Leu Lys Ile Pro Val Val Ser Ser Glu Glu Ala Ala

580 585 590

Ser Gly Glu Ser Thr Ser Gln Leu Pro Glu Thr Ser Ser Pro Ser Ser

595 600 605

Ile

Claims

1.油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2在油菜C5、A6、A8和C8染色体上各有一个拷贝，分别命名为BnaC05.NTT2(BnaC05g11870D)、BnaA06.NTT2(BnaA06g10210D)、BnaA08.NTT2(BnaA08g23810D)和BnaC08.NTT2(BnaC08g16710D)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

2.油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2所编码的蛋白在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8所示。

3.含有油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的表达载体在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

4.含有油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的重组菌在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述重组菌为重组农杆菌。

6.一种提高作物含油量的方法，其特征在于：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2且由组成型启动子启动的过表达载体转化到作物的基因组中，获得油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2超表达的作物品种，所述油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示。

7.如权利要求6所述提高作物含油量的方法，其特征在于：所述组成型启动子为CaMV35S。

8.如权利要求6所述提高作物含油量的方法，其特征在于：所述作物为油菜。