CN115927237B - 一种油菜海藻糖-6-磷酸合成酶基因在调控含油量与脂肪酸组成中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了油菜海藻糖‑6‑磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因及其编码的蛋白在调控种子含油量与脂肪酸组成中的用途，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。通过获得超表达和突变体材料，分析了转化材料的种子含油量和脂肪酸组成，发现BnaC02.TPS8基因正调控油菜种子含油量的积累和油酸含量，在油菜分子育种中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，涉及一种油菜海藻糖-6-磷酸合成酶基因的新用途，尤其是BnaC02.TPS8基因在调控作物含油量与脂肪酸组成中的用途。
背景技术
油菜是我国重要的油料作物及动物饲料，播种面积约1亿亩。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是植物食用油的主要来源之一，在我国油料作物中占重要地位。虽然我国是菜籽油生产大国，但已持续十年以上产量低于消费量，主要依靠进口弥补供应缺口。因此，筛选高产、高油优异性状聚合的突破性种质，挖掘利用优良基因，通过加强转基因育种研究，进一步提高油菜产量和含油量对保障我国食用油安全具有重大意义。
我国人民对高品质食用油需求逐年提升，高端食用油在国内食用油市场中的份额不断增加。优质菜籽油的油酸等不饱和脂肪酸含量高、必需脂肪酸含量丰富且组成合理，对提高国民脂质营养健康水平也具有重要的意义。种子含油量与植物光合作用、种子发育、物质转运、脂质合成、积累和降解等多个生物学途径密切相关。研究表明，拟南芥中有超过700个基因参与上述生理过程。因此，开发高含油量材料是油菜高油育种的分子基础。
本发明从油菜中克隆了一个海藻糖-6-磷酸合成酶基因BnaC02.TPS8(该基因尚未被报道参与产量和种子油脂合成)。研究表明，将BnaC02.TPS8基因在油菜中超表达，可以显著提高植株产量和种子的含油量。而利用CRISPR/Cas9技术创建的BnaC02.TPS8突变体油菜产量和种子含油量显著下降。此外，过表达及突变体油菜种子中油酸含量与其对应的野生型(WT)比较，均有显著差异。此结果表明BnaC02.TPS8基因在调控油菜种子含油量及脂肪酸组成方面有重要作用，可以为油菜高产高油育种及油脂品质改良提供新的种质资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油菜海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其编码蛋白的新用途。
申请人发现一种与调控种子含油量和脂肪酸组成相关的油菜海藻糖-6-磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因，该基因编码海藻糖-6-磷酸合成酶，定位在油菜C02染色体上，基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，由2445bp组成；基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示，编码814个氨基酸。
接着，申请人采用PCR技术从油菜基因组中扩增得到上述基因并构建重组植物超表达载体，使用农杆菌介导的遗传转化方法将超表达载体转化到油菜的基因组中，获得BnaC02.TPS8基因超表达的油菜品种，同时还利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了BnaC02.TPS8基因功能缺失的油菜品种。
通过比较过表达和突变体材料，分析了转化材料种子含油量和脂肪酸组成，发现BnaC02.TPS8基因正调控油菜种子含油量的积累和油酸的形成。因此，BnaC02.TPS8基因及其编码的蛋白，以及由此衍生的表达载体、重组菌能应用于调控油菜种子含油量与脂肪酸组成。
本发明进一步提供一种提高油菜种子含油量和油酸含量的方法，该方法是：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜海藻糖-6-磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因的超表达载体转化到油菜的基因组中，获得BnaC02.TPS8基因超表达的油菜品种。
本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，pCAMBIA2300(Abcam公司购买)、PHSE401(中国农业大学陈其军课题组提供)等。
本发明获得的BnaC02.TPS8基因超表达油菜，该遗传资源在油菜分子育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1：BnaC02.TPS8基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2：构建的植物超表达载体35S-pCAMBIA2300-BnaC02.TPS8的质粒图谱。
图3：油菜BnaC02.TPS8超表达和突变体的获得和鉴定。(a)油菜CRISPR-Cas9突变体鉴定，sgRNA位于基因BnaC02.TPS8的第一个外显子，获得的两个突变体的靶点编辑情况：a-44是33bp缺失，b-153是9bp缺失。(b)油菜BnaC02.TPS8的CRISPR-Cas9突变体和超表达株系定量鉴定。a-44和b-168是BnaC02.TPS8的CRISPR-Cas9突变体，OE-10、OE-21、OE-33和OE-38是超表达株系。**表示在Student’s t test中P<0.01。
图4：油菜BnaC02.TPS8超表达和突变株系产量。OE-10、OE-21、OE-33和OE-38是超表达株系，a-44和b-168是BnaC02.TPS8的CRISPR-Cas9突变体。每个株系有10个不同单株，*和**分别表示在Student’s t test中P<0.01和P<0.05。
图5：油菜BnaC02.TPS8超表达株系种子的含油量和脂肪酸鉴定。利用近红外分析油菜种子品质性状，OE-10、OE-21、OE-33和OE-38是超表达株系。每个株系有10个不同单株，*表示在Student’s t test中P<0.05。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory,2017)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法。
实施例1 BnaC02.TPS8基因的克隆
油菜TPS8基因编码海藻糖-6-磷酸合成酶，定位在C02染色体上，命名为BnaC02.TPS8。CDS序列为序列表SEQ ID NO:1所示的序列，含有完整的ORF阅读框及起始密码子ATG，编码814个氨基酸(见序列表SEQ ID NO:2所示)。
(1)RNA的提取
总RNA的提取采用艾德莱公司的Trizol(目录号RN0402)，取0.1g左右油菜样品，在液氮中磨碎，转移到2mL离心管中，加入1mL Trizol，震荡混匀后，室温孵育5min；加0.2mL氯仿，盖紧离心管盖，激烈震荡15s，室温孵育5min；12,000×g 4℃离心15min；将水样层转移至无RNase的离心管中，加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育10min；12,000×g 4℃离心10min，弃上清；加1mL 75％的乙醇(用DEPC水配置)洗涤RNA沉淀，6,000×g 4℃离心5min，弃上清，晾干RNA沉淀；加入30-50μL无RNase的DEPC水溶解。取1μL抽提的RNA原液在Nano Drop 2000分光光度计下测定RNA浓度，Ratio值(OD260/OD280)在1.8-2.2时，RNA的纯度较高可用于后续实验。同时取2μL抽提的RNA原液进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测RNA完整性。
(2)cDNA的合成
反转录使用的是Takara(Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-)，按照如下体系配制Mixture I和Mixture II。将Mixture I在65℃下变性5min，冰上放置5min；将Mixture I和Mixture II混合并离心，42℃延伸1小时。将逆转录所得的cDNA第一链稀释5倍并分装，存于-20℃备用。Mixture I和Mixture II配制体系如下：
(3)BnaC02.TPS8基因的扩增
以上述cDNA为模板，用正向引物TPS8-F1序列为5’-ACGCGTCGACATGACCGTTCCAGGAATCATCTC-3’，反向引物TPS8-R1序列为5’-GGGGTACCTTAAATGATGCTTTCAAATGC-3’，扩增得到含有BnaC02.TPS8全长CDS的片段。采用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix(TSINGKEBiologica technology)进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：
| 2×I-5TM2×High-Fidelity Master Mix | 25μL |
| Primer Forward(10μmol/L) | 2μL |
| Primer Reverse(10μmol/L) | 2μL |
| cDNA | 4μL |
| ddH2O | 17μL |
| Total | 50μL |
PCR扩增程序：98℃总变性1min；98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃总延伸5min。
扩增后产物通过琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，获得2445bp的BnaC02.TPS8全长，扩增产物挖胶后使用天根生化科技有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒(http://www.tiangen.com/)回收。
实施例2 BnaC02.TPS8基因过表达转化载体的构建
(1)对上述获得的BnaC02.TPS8片段用快速限制性内切酶SaI I和Kpn I进行双酶切，双酶切体系如下：
| 5×Fastdigestion buffer | 10μL |
| Restriction Enzyme 1 | 1μL |
| Restriction Enzyme 2 | 1μL |
| 回收产物 | 25μL |
| ddH2O | 13μL |
| Total | 50μL |
酶切反应在37℃水浴锅中孵育1h。酶切产物用天根生化科技有限公司的DNA纯化试剂盒回收。
(2)酶切产物连接到载体pCAMBIA2300，该载体含组成型启动子35S和抗生物标记物，连接方法如下：
| 酶切后的BnaC02.TPS8片段 | 7.5μL |
| 酶切后的pCAMBIA2300片段 | 1μL |
| T4 DNA ligase(Thermo) | 0.5μL |
| 10×T4 ligase buffer | 1μL |
| Total | 10μL |
连接反应条件：22℃孵育3h。
(3)转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，选取2个阳性克隆送样测序，分析结果显示，BnaC02.TPS8基因的CDS序列成功连接上载体，即成功构建了转化植株的植物表达载体35S-pCAMBIA2300-BnaC02.TPS8(如图2所示)。
(4)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株GV3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。导入方法如下：电转杯分别用纯水和无水乙醇清洗，置于超净工作台吹干，冰上预冷；加20μL农杆菌感受态于电转杯中，加1μL质粒。电转仪1800V电击，加300μL不含抗生素的LB培养基到电转杯，用1mL枪头吸打3次，菌液转移到1.5mL离心管中；28℃摇床(180r/min)复苏2h，均匀涂于三抗(利福平、庆大霉素和卡那霉素)的LB平板。28℃恒温培养48h，挑取单克隆，检测筛出阳性克隆，保存阳性农杆菌菌液备用。
实施例3BnaC02.TPS8-CRISPR载体的构建
利用中国农大大学生物学院陈其军团队的sgRNA-Cas9系统创建油菜BnaC02.TPS8突变体。实验操作步骤如下：
(1)登录到网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，筛选靶点。靶点1序列为5’-CATGGGTAGACTTGAGTCT-3’，靶点2序列为5’-GCAACAAGGGAACTTGTCC-3’。2个靶位点均位于基因的第1个外显子区。
(2)设计引物
DT1-BsF:ATATATGGTCTCGATTGCATGGGTAGACTTGAGTCTGTT
DT1-F0:TGGCATGGGTAGACTTGAGTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
DT2-R0:AACGCAACAAGGGAACTTGTCCGAATCTCTTAGTCGACTCTAC
DT2-BsR:ATTATTGGTCTCGAAACGCAACAAGGGAACTTGTCCG AA
(3)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板进行四引物PCR扩增。DT1-BsF和DT2-BsR为正常引物浓度；DT1-F0和DT2-R0稀释20倍。扩增体系为：
| 2×I-5TM2×High-Fidelity Master Mix | 25μL |
| DT1-BsF | 2μL |
| DT2-BsR | 2μL |
| DT1-F0 | 2μL |
| DT2-R0 | 2μL |
| pCBC-DT1DT2质粒 | 3μL |
| ddH2O | 14μL |
| Total | 50μL |
PCR扩增程序：98℃总变性1min；98℃变性15s，55℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；72℃总延伸5min。
(4)纯化回收PCR产物，建立如下酶切-连接体系
| PCR片段(626bp) | 2μL |
| pHSE401 | 2μL |
| 10×NEB T4 buffer | 1.5μL |
| 10×BSA | 1.5μL |
| BsaI(NEB) | 1μL |
| T4 ligase(NEB)/高浓度 | 1μL |
| ddH2O | 6μL |
| Total | 15μL |
反应条件：37℃5h，50℃5min，80℃10min。
(5)连接产物转化大肠杆菌DH5α，取5μL转化大肠杆菌感受态，卡那板筛选。阳性克隆筛选，U626-IDF+U629-IDR＝726bp菌落PCR鉴定，U626-IDF和629-IDF测序，测序正确的载体即为BnaC02.TPS8的CRISPR载体。
(6)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株GV3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存，转化方法同实施例2中所示。
实施例4油菜遗传转化实验
(1)对构建好的BnaC02.TPS8超表达载体和CRISPR-Cas9载体进行油菜的遗传转化，使用农杆菌介导的遗传转化方式，本发明中用于超表达载体的油菜转化受体为甘蓝型油菜中双11号，用于CRISPR载体油菜转化受体为Westar。
转化流程如下：挑选籽粒饱满的种子，70％酒精浸泡杀菌1min，倒掉酒精，无菌水冲洗一遍；0.15％升汞(HgCl2)消毒15min，无菌水清洗5遍，每次浸泡5min；播种于M0培养基，25℃暗培养6d；挑取实施例2和3转化后的农杆菌，接种100μL菌液到含100mL双抗LB培养基中，28℃培养至OD600≈0.3-0.5(约14h)；6,000×g离心10min收集菌液，加入等体积的DM培养基(AS终浓度为0.05mM)悬浮，28℃摇床(180r/min)培养2-3h，倒入培养皿中备用；取出暗培养的油菜幼苗，用经高温杀菌的镊子和解剖刀切下下胚轴，长度在0.8-1厘米为好；外植体置于农杆菌菌液中，浸染30min；倒出菌液，外植体铺于灭菌的滤纸上，吸取表面过多的菌液；将外植体均匀摆到M1培养基上，暗培养48h；将共培养后的外植体从暗处取出，转到选择及诱导愈伤的M2培养基；外植体培养2周诱导愈伤；外植体转到分化培养基M3上，每2周继代一次，期间淘汰褐化死亡的外植体，其中两端膨大并有绿点的外植体为佳；待分化出来的芽苗建成植株形态后，用手术刀切下芽苗，插入M4培养基中生长4周；待生根后经光照培养箱炼后，转到温室培养。遗传转化步骤中所用的培养基配方及编号如下：
表1的说明：MS全称为Murashige and Skoog Stock。
(2)过表达转化单株的鉴定
提取获得的油菜超表达转化单株的基因组DNA，通过PCR检查外源基因片段的插入，本发明中过表达的骨架载体为pCAMBIA2300，在骨架载体上设计引物pCAMBIA2300-R(ACTGGCCGTCGTTTTAC)，通过载体骨架引物与外源片段引物搭配来进行PCR扩增(BnaC02.TPS8-F和序列如实施例1所示)，PCR体系为：
| Taq MIx | 5μL |
| Primer Forward(10μmol/L) | 0.4μL |
| Primer Reverse(10μmol/L) | 0.4μL |
| cDNA | 1μL |
| ddH2O | 3.2μL |
| Total | 10μL |
PCR扩增程序：94℃总变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，34个循环；72℃总延伸5min。
对PCR获得的油菜基因阳性苗进行qRT-PCR，以检测基因表达量。提取转化单株叶片的RNA并进行cDNA的合成(方法同实施例1)，定量引物利用Primer 3软件设计，产物大小在100-200bp之间，设计好后用参考序列进行比对，确保BnaC02.TPS8引物的特异性(F:5’-TCGGTGTCCACATGGGTAGAC-3’,R:5’-ATGTCGTCGATGCCGAGAACC-3’)。油菜qRT-PCR的内参引物为：BnaC02.Actin7(F:5’-ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC-3’,R:5’-TGCCTCATCATACTCAGCCTTG-3’)和BnaC05.EF1-α(F:5’-GCCTGGTATGGTTGTGACCT-3’；R:5’-GAAGTTAGCAGCACCCTTGG-3’)。利用SYBR Green real-time PCR Master Mix Kit(TOYOBO,Osaka,Japan)配制荧光定量PCR体系，其体系组分及用量如下表所示：
| SYBR GreenI | 5μL |
| Primer-F | 0.4μL |
| Primer-R | 0.4μL |
| 稀释10倍后的cDNA | 2μL |
| ddH2O | 2.2μL |
| Total | 10μL |
使用CRF96TM Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行荧光定量PCR反应，反应程序：95℃总变性3min；95℃变性3s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；绘制溶解曲线。
根据内参引物进行标准化，不同重复定量变异用2-ΔΔCT(delta-deltathresholdcycle relative quantification)方法计算。最后获得油菜超表达转化单株OE-10、OE-21、OE-33和OE-38(图3b)。
(3)CRISPR-Cas9转化单株的鉴定
对获得的油菜CRISPR-Cas9转化单株进行测序筛选突变体。利用引物Cas9-F(5’-AGACCGTGAAGGTTGTGGAC-3’)和Cas9-R(5’-TAGTGATCTGCCGTGTCTCG-3’)鉴定Cas9蛋白，对含有Cas9蛋白的阳性单株进行目的基因的特异扩增及测序。目的基因的特异扩增引物为：BnaC02.TPS8-CR-F(5’-TCTCAGCCAACAAGATCTTCT-3’)和BnaC02.TPS8-CR-R(5’-ATACTCAATTTTTCATATACTTTGAATGG-3’)。扩增方法同实施例4(2)。
对扩增的目的片段进行PCR产物测序，用DSDecode在线网站(http://sk1.scau.edu.cn/dsdecode/)分析靶位点的编辑情况。测序结果表明，获得BnaC02.TPS8两个突变体独立株系(a-44和b-153)。其中，a-44是33bp缺失，造成11个氨基酸缺失；b-153是9bp缺失，造成3个氨基酸缺失和1个氨基酸突变(图3a)。
(4)转化所得植物的产量和含油量分析
对转基因株系开展大田小区种植实验，对成熟期收获的油菜产量进行考察，利用近红外分析仪，对成熟期收获的油菜种子进行品质分析，获得种子含油量数据，测定仪器由华中农业大学国家油菜工程技术研究中心提供。
产量结果显示，超表达材料受体背景材料中双11号的单位面积产量(g/m2)是312.20±9.40，4个超表达株系OE-10、OE-21、OE-33和OE-38的产量分别是340.38±15.81、346.59±15.28、387.64±19.46和416.36±20.50，显著增加了9％-33％(图4a)。突变体材料受体背景材料Westar的单位面积产量(g/m2)是233.07±21.82，两个突变体株系产量分别是161.49±14.90和180.37±7.83，显著降低了22％-30％(图4b)。这表明，BnaC02.TPS8正调控油菜产量。
含油量结果显示，超表达材料受体背景材料中双11号的种子含油量(％)是42.02±0.74，4个表达株系OE-10、OE-21、OE-33和OE-38的产量分别是45.15±0.77、45.48±0.74、45.21±0.72和45.69±0.57，显著增加了7.4-8.7个百分点(图5a)。脂肪酸组成结果显示，与野生型比较，超表达材料C18:0(饱和脂肪酸)和C18:2(亚油酸)含量下降，C18:1含量上升(图5b-d)。这表明，BnaC02.TPS8参与调控种子含油量和脂肪酸组分的形成。
综上所述，基因BnaC02.TPS8在调控油菜种子含油量与脂肪酸组成中发挥重要的作用。
Claims (6)
1.油菜海藻糖-6-磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因所编码的蛋白在提高油菜种子含油量与油酸含量中的用途，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.编码权利要求1中所述蛋白的油菜海藻糖-6-磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因在提高油菜种子含油量与油酸含量中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.含有权利要求2或3中所述基因的表达载体在提高油菜种子含油量与油酸含量中的用途。
5.含有权利要求4中所述表达载体的重组菌在提高油菜种子含油量与油酸含量中的用途。
6.一种提高油菜种子含油量和油酸含量的方法，其特征在于：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜海藻糖-6-磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因的超表达载体转化到油菜的基因组中，获得BnaC02.TPS8基因超表达的油菜品种，所述油菜海藻糖-6-磷酸合成酶BnaC02.TPS8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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