CN113564170B

CN113564170B - 一种水稻OsmiR156前体及其在大豆中的成熟体在提高大豆产量性状中的应用

Info

Publication number: CN113564170B
Application number: CN202110986593.3A
Authority: CN
Inventors: 郭葳; 曹东; 陈李淼; 杨红丽; 张婵娟; 单志慧; 袁松丽; 郝青南; 邱徳珍; 黄毅; 陈水莲; 杨中路; 陈海峰; 周新安
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-08-26
Also published as: CN113564170A

Abstract

本发明公开了一种水稻OsmiR156前体及其在大豆中的成熟体在提高大豆产量性状中的应用。具体地公开了OsmiR156及其前体在调控植物产量性状中的应用。本发明通过将来源于水稻的编码成熟miRNA OsmiR156的前体基因Pre‑OsmiR156导入到受体大豆中，得到了大豆转基因株系，转基因株系中Pre‑OsmiR156、成熟的miRNA的转录水平均显著提高。同时转基因大豆株系的产量也均显著提高，表现在产量性状主茎节数显著增加、叶片面积显著减少以及单株籽粒数显著增加，说明本发明miRNA及其前体可以调控植物的产量相关性状，在大豆育种中具有广泛的应用前景，对于保证大豆的高产稳产具有重要意义。

Description

一种水稻OsmiR156前体及其在大豆中的成熟体在提高大豆产量性状中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻OsmiR156前体及其在大豆中的成熟体在提高大豆产量性状中的应用。

背景技术

大豆(Glycinemax)是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子富含蛋白质，是世界上70％可食用蛋白质的来源，同时也是生物柴油的新兴原料。大豆起源于中国，目前为我国仅次于油菜的第二大油料作物。目前大豆和其他高产作物相比，相对产量偏低，提高大豆产量潜力是大豆育种的重要任务。利用分子生物学和基因工程手段提高大豆产量相关性状，通过分子育种培育高产大豆可以缓解在有限土地上发展大豆生产的矛盾，是提高作物亩产的有效途径，对于保证大豆的高产稳产具有重要的经济意义和社会意义。

microRNA(miRNA)是一类真核生物中广泛存在的约20-24个核苷酸长度的内源单链非编码RNA分子，具有转录后调控基因表达的功能。其生物学特性主要表现为：高度保守性、时序表达特异性和组织表达特异性。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区。其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起到多种调控作用。在植物中，细胞核内编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成初级转录物pri-miRNA，然后在一种类Dicer酶DCL1的作用下形成成熟茎环结构前体——miRNA前体pre-miRNA，DCL1继续作用于pre-miRNA而形成双链miRNA(miRNA/miRNA^*)，最后，双链miRNA在miRNA甲基转移酶HENI的作用下，使3'端最后一个核苷酸发生甲基化修饰。以上过程均在细胞核中完成。成熟的miRNA或者是在细胞核中与类似RISC的核糖核蛋白结合形成miRNP，然后被Exportin 5的同源物HASTY运送到细胞质中，或者是先被HASTY运送到细胞质中，再与核糖核蛋白结合形成miRNP(miRNA核糖核蛋白复合体，又称为miRNA介导的RISC，简称miRISC)。RISC是miRNA参与靶基因调控过程中不可或缺的载体。在miRISC复合体中，Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联进行的。通常，只有一条链进入miRNA，具体选择双链中哪一条链取决于碱基热动力学稳定性因素等因素。不进入RISC的miRNA链被称之为伴随链(passenger)，并被冠以星号(*)，具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。目前研究表明植物miRNA通过剪切靶mRNA或抑制靶mRNA翻译来负调控基因表达，在细胞增殖分化、个体生长发育和抵御逆境胁迫等生理过程中发挥重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控或提高植物产量性状和/或如何培育高产植物。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了miRNA的应用，所述应用可为下述任一种：

A1)所述miRNA在调控或提高植物产量性状中的应用；

A2)所述miRNA在制备调控或提高植物产量性状的产品中的应用；

A3)所述miRNA在培育高产植物中的应用；

A4)所述miRNA在制备培育高产植物的产品中的应用；

A5)所述miRNA在植物育种中的应用；

所述miRNA名称为OsmiR156，可为如下B1)或B2)

B1)核苷酸序列为SEQ ID No.1的miRNA；

B2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的miRNA具有90％以上的同一性，且具有相同功能的miRNA。

上述miRNA可人工合成，也可先合成编码其前体的DNA，再进行生物表达得到。

本文中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastn作为程序进行检索，并对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

上述应用中，所述miRNA可来源于水稻(Oryza sativa)。

上述应用中，所述植物可为F1)或F2)或F3)：

F1)单子叶植物或双子叶植物；

F2)豆科植物或禾本科植物；

F3)大豆或水稻。

本发明还提供了与所述miRNA相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

C1)与所述miRNA相关的生物材料在调控或提高植物产量性状中的应用；

C2)与所述miRNA相关的生物材料在制备调控或提高植物产量性状的产品中的应用；

C3)与所述miRNA相关的生物材料在培育高产植物中的应用；

C4)与所述miRNA相关的生物材料在制备培育高产植物的产品中的应用；

C5)与所述miRNA相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述D1)至D7)中的任一种：

D1)编码所述miRNA的核酸分子或编码所述miRNA的前体的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，D1)所述核酸分子可为下述任一种：

E1)SEQ ID No.2所示的编码所述miRNA OsmiR156的核酸分子；

E2)SEQ ID No.3所示的编码所述miRNA OsmiR156的前体的核酸分子。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。具体可为大肠杆菌DH5α或根癌农杆菌EHA105。

上述应用中，所述产量性状可为主茎节数、叶片面积或单株籽粒数。

所述调控植物产量性状可为：增加或减少主茎节数、增加或减少叶片面积或增加或减少单株籽粒数。

所述提高植物产量性状可为：增加主茎节数、减少叶片面积或增加单株籽粒数。

本发明还提供了一种培育高产植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述miRNA的表达量或含量，和/或，提高目的植物中所述miRNA的前体的表达量或含量，得到产量高于所述目的植物的高产植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述miRNA的表达量或含量，和/或，提高目的植物中所述miRNA的前体的表达量或含量，通过将SEQ ID No.3所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述植物可为G1)或G2)或G3)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)豆科植物或禾本科植物；

G3)大豆或水稻。

上述方法中，所述高产植物可为主茎节数高于所述目的植物的高产植物、叶片面积小于所述目的植物的高产植物、单株籽粒数高于所述目的植物的高产植物。

本发明还提供了所述培育高产植物的方法在创制高产植物和/或植物育种中的应用。

本发明中，所述高产植物理解为不仅包含将所述OsmiR156基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述高产植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明通过将来源于水稻的编码成熟miRNA OsmiR156(SEQ ID No.1)的前体Pre-OsmiR156基因(SEQ ID No.3)导入到受体植物大豆(天隆一号(TL1))中，得到了转基因大豆植株，实验证明，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，大豆转基因株系中，Pre-OsmiR156、成熟的GmmiR156a型miRNA、成熟的GmmiR156k型miRNA的转录水平均显著提高。本发明所得的转基因大豆株系的产量均显著提高，表现在产量性状主茎节数显著增加、叶片面积显著减少以及单株籽粒数显著增加。说明miRNA OsmiR156及其前体可以调控植物的产量相关性状，在大豆育种中具有广泛的应用前景，对于保证大豆的高产稳产具有重要意义。

附图说明

图1为大豆转基因T3代株系#311前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平。

图2为大豆转基因T3代株系#311成熟miRNA GmmiR156a的转录水平。

图3为大豆转基因T3代株系#311成熟miRNA GmmiR156k的转录水平。

图4为大豆转基因T3代株系#311产量相关性状叶片面积的统计图。

图5为大豆转基因T3代株系#311产量相关性状主茎节数的统计图。

图6为大豆转基因T3代株系#311产量相关性状单株籽粒数的统计图。

图7为大豆转基因T3代株系#317前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平。

图8为大豆转基因T3代株系#317成熟miRNA GmmiR156a的转录水平。

图9为大豆转基因T3代株系#317成熟miRNA GmmiR156k的转录水平。

图10为大豆转基因T3代株系#317产量相关性状叶片面积的统计图。

图11为大豆转基因T3代株系#317产量相关性状主茎节数的统计图。

图12为大豆转基因T3代株系#317产量相关性状单株籽粒数的统计图。

图13为大豆转基因T3代株系#226前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平。

图14为大豆转基因T3代株系#226成熟miRNA GmmiR156a的转录水平。

图15为大豆转基因T3代株系#226成熟miRNA GmmiR156k的转录水平。

图16为大豆转基因T3代株系#226产量相关性状叶片面积的统计图。

图17为大豆转基因T3代株系#226产量相关性状主茎节数的统计图。

图18为大豆转基因T3代株系#226产量相关性状单株籽粒数的统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的miRNA156OE质粒(Jiao,Y.,Wang,Y.,Xue,D.et al.Regulationof OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.Nat Genet 42,541–544(2010).https://doi.org/10.1038/ng.591)公众可以从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的载体pGWC(Chen,Q.J.,Zhou,H.M.,Chen,J.,&Wang,X.C.(2006).Using a modified TA cloning method to create entry clones.Analyticalbiochemistry,358(1),120-125.)公众可以从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的载体pB2GW7(Vector ID:1_02，VIB-UGent Center for Pla ntSystems Biology)公众可以从VIB-UGent Center for Plant Systems Biolog y获得，以重复本申请实验，也可商购：http://www.biovector.net/product/303631.html。

实施例1OsmiR156及其前体在调控大豆产量性状中的应用

OsmiR156的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的miRNA，来源于水稻(Oryzasativa)；

OsmiR156基因的编码序列为SEQ ID No.2；

OsmiR156前体(Pre-OsmiR156)基因的编码序列为SEQ ID No.3。

一、OsmiR156过表达载体的构建

1、中间载体构建

设计OsmiR156前体基因扩增引物(156OE-fw与156OE-rw)，以miRNA156OE质粒为模板，采用Primer Star Max(Takara,Japan)试剂盒进行扩增，如表1所示体系配制反应液(Total 50ul)

表1 PCR反应体系

PCR扩增反应程序为：98℃10sec变性，58℃退火15sec，72℃延伸1min，共计35个循环，用Bio-Rad PTC-100PCR仪扩增。

OsmiR156前体基因扩增引物(156OE-fw与156OE-rw)如下所示：

156OE-fw：5’-aggctttgactttaggtc ATCCAAATCAACAGTAATGTTCTACAGTTAGTG-3’

156OE-rw：5’-gtctagagactttaggtc AACTGAAAGCCTAAATTGATTTATCAATTATATG-3’

PCR反应结束后，得到的PCR产物(约1.3kb)用琼脂糖凝胶电泳进行检测分离，并切胶回收1.3kb左右目标片段，使用凝胶回收试剂盒FastPure Gel DNA Extraction MiniKit(Vazyme,China)对目的条带进行回收，得到OsmiR156前体扩增片段，该OsmiR156前体扩增片段含有编码序列为SEQ ID No.3的OsmiR156前体(Pre-OsmiR156)基因。

使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme,China)将上述OsmiR156前体扩增片段克隆入用AhdI酶切回收的载体pGWC中，得到中间载体OsmiR156-pGWC。

连接反应如表2所示体系配制反应液(Total 20ul)：

表2连接反应体系

连接反应条件为：37℃30min，于冰上冷却，获得连接产物(即中间载体OsmiR156-pGWC)。

2、中间载体转化大肠杆菌

取10μl连接产物(中间载体OsmiR156-pGWC)加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞后，用化学法转化：即将上述大肠杆菌DH5α感受态细胞与连接产物的混合样(混合感受态细胞)于冰上放置30min，置于42℃水中温浴90sec，再立即放入冰上3min，加1ml LB培养基后于37℃230rpm摇菌1hr，3000rpm离心4min去上清后，用剩余培养基重悬菌液，涂布含有氯霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基圆皿，37℃培养24hr，长出菌斑经过扩大培养并测序，测序正确的为阳性克隆。

3、最终载体构建

阳性克隆在5ml含氯霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基中于37℃培养过夜，用快速质粒小提试剂盒(Tiangen,China)提取质粒。使用Gateway^TMLR Clonase^TMEnzyme mix(ThermoFisher Scientific,USA)试剂盒，将中间载体OsmiR156-pGWC上插入的片段(SEQ ID No.3)通过LR反应重组入载体pB2GW7中，得到最终载体OsmiR156-pB2GW7。OsmiR156-pB2GW7是OsmiR156前体基因的重组表达载体。

LR反应体系如表3所示：

表3 LR反应体系(Total 20ul)

LR反应条件为：25℃1hr，加入2μl Proteinase K solution并于37℃温浴10min终止反应。获得最终载体OsmiR156-pB2GW7。

4、最终载体转化大肠杆菌和农杆菌

取10μl连接产物(OsmiR156-pB2GW7)加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞后，用化学法转化：即将上述大肠杆菌DH5α感受态细胞与连接产物的混合样(混合感受态细胞)于冰上放置30min，置于42℃水中温浴90sec，再立即放入冰上3min，加1ml LB培养基后于37℃230rpm摇菌1hr，3000rpm离心4min去上清后，用剩余培养基重悬菌液，涂布含有卡那霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基圆皿，37℃培养24hr，长出菌斑经过扩大培养并测序，测序正确的为阳性克隆(含有编码序列为SEQ ID No.3的OsmiR156前体(Pre-OsmiR156)基因)。

阳性克隆在5ml卡那霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基中于37℃培养过夜，用快速质粒小提试剂盒(Tiangen,China)提取质粒。用化学法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞。将感受态细胞EHA105(100μl)置于冰上，加入1μg质粒DNA(OsmiR156-pB2GW7)，混匀后于冰上放置30min，再置于液氮中速冻5min后迅速转移到37℃水浴5min，再置于冰上5min。随后加入1ml LB培养基，于28℃230rpm培养4hr。随后用3000rpm离心2min收集菌体，去上清后用剩余培养基重悬菌体，涂布含卡那霉素(30μg/ml)的LB培养基平板，于28℃培养48hr。将长出的克隆进行PCR鉴定，阳性克隆(含有编码序列为SEQ ID No.3的OsmiR156前体(Pre-OsmiR156)基因)命名为重组根癌农杆菌EHA105/OsmiR156-pB2GW7用于大豆稳定转化。

二、大豆稳定转化及基因表达水平分析

1、大豆稳定转化

以大豆栽培品种天隆一号为受体材料，用子叶节法(Paz,M.M.,Martinez,J.C.,Kalvig,A.B.,Fonger,T.M.,&Wang,K.(2006).Improved cotyledonary node methodusing an alternative explant derived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation.Plant cell reports,25(3),206-213.)进行稳定转化重组根癌农杆菌EHA105/OsmiR156-pB2GW7。获得植株用1:1000稀释的Basta(Bayer CropScience,Germany)喷施筛选。阳性苗于温室加代，温室为25℃，16hr光照/8hr黑暗条件。T2代稳定转化植株所收种子(T3代转基因株系)用于主茎节数和叶片面积测定。

2、基因表达水平分析

在大豆中的成熟microRNA(miRNA)序列有两个：

1)GmmiR156a型miRNA基因的编码序列为：TGACAGAAGAGAGTGAGCACA

2)GmmiR156k型miRNA的编码序列为：TGACAGAAGAGAGTGAGCAC

用实时荧光定量PCR的方法进行T3代转基因株系中OsmiR156前体以及成熟体miRNA的表达水平分析。用TRIzol(Thermo Fisher Scientific,USA)提取T3代转基因株系miR156box-1(株系311，#311)，miR156box-2(株系317，#317)，miR156box-3(株系226，#226)和天隆一号(TL1)茎尖中总RNA。

检测OsmiR156前体(Pre-OsmiR156)：使用M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒(Promega,USA)对提取的总RNA样品进行反转录，反转为cDNA作为模板，再使用Takara SYBR Premix Ex Taq(Takara,Japan)构建反应体系，并在ABI Q3或Q5仪器上进行实时荧光定量PCR(Applied Biosystems,USA)。每个样本有3个生物学重复，并用于统计分析。GmSKIP16作为内参基因，用-△C(t)法进行分析。

内参基因的引物如下所示：

qSKIP16-fw:5’-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3’，

qSKIP16-rw:5’-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3’；

OsmiR156前体基因的引物如下所示：

qpre-OsmiR156-fw:5’-CACACACGGTGCTTTCTTAGC-3’，

qpre-OsmiR156-rw:5’-TATTGGGCATGGTGAACGGC-3’。

荧光定量PCR扩增程序为：95℃15min；95℃10sec,60℃退火15sec，72℃延伸20sec，共计40个循环。

检测GmmiR156成熟体(GmmiR156a型miRNA和GmmiR156k型miRNA)：使用All-in-One^TMmiRNA qRT-PCR试剂盒(Genecopoeia,USA)对提取的总RNA样品进行反转录，反转为cDNA作为模板，并构建反应体系，在ABI Q3或Q5仪器上进行实时荧光定量PCR(AppliedBiosystems,USA)。每个样本有3个生物学重复，并用于统计分析。U6作为内参基因，用-△C(t)法进行分析。

下述3个基因的通用反向引物如下所示：

universal-qrw：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

GmmiR156a型miRNA编码序列的正向引物如下所示：

qGmmiR156a-fw:5’-TGACAGAAGAGAGTGAGCACA-3’；

GmmiR156k型miRNA编码序列的正向引物如下所示：

qGmmiR156k-fw:5’-TGACAGAAGAGAGTGAGCAC-3’；

内参基因的正向引物如下所示：

U6-qfw：5’-GGAACGATACAGAGAAGATTGCA-3’。

三、转基因大豆产量相关性状考察

将T3代转基因株系miR156box-1(株系311，#311)，miR156box-2(株系317，#317)，miR156box-3(株系226，#226)和天隆一号(TL1)，于5月底种植于湖北省汉川转基因基地，实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置4个小区，分别为#311处理区(种植#311)、#317处理区(种植#317)、#226处理区(种植#226)和TL1处理区(种植TL1)。每个小区播种5行，间距20cm种植，行距50cm，每行12株。实验收获时统计主茎节数、叶片面积与单株产量(单株籽粒数)。叶片面积为主茎尖往下数第三片完全展开叶的面积，用浙江托普仪器有限公司的YMJ-D叶面积仪测定，单位为平方毫米。主茎节数为子叶痕上一节开始到植株顶端的节数。单株籽粒数是指一株籽实的数量。

每个株系测量3个单株的叶片用于统计叶片面积,主茎节数与单株产量(单株籽粒数)。显著性差异统计采用EXCEL软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

四、结果分析

1、大豆转基因T3代株系miR156box-1(又称line 311，株系311，#311)

在转基因株系#311中：

前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平如图1所示，转基因株系#311中的前体miRNAPre-OsmiR156的转录水平极显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.01)。

在大豆中成熟的GmmiR156a型miRNA(GmmiR156a)的转录水平如图2所示，转基因株系#311中的GmmiR156a的转录水平极显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.01)。

在大豆中成熟的GmmiR156k型miRNA(GmmiR156k)的转录水平如图3所示，转基因株系#311中的GmmiR156k的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

叶片面积如图4所示，天隆一号(TL1)为受体对照，叶片面积为3881.52mm²；转基因株系#311的叶片面积为2584.34mm²，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，叶片面积显著减少(P<0.05)，减少了33.42％。

主茎节数如图5所示，天隆一号(TL1)为受体对照，主茎节数为14.67节；转基因株系#311的主茎节数为29.33节，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，主茎节数极显著增加(P<0.01)，增加了99.9％。

单株籽粒数如图6所示，天隆一号(TL1)为受体对照，单株籽粒数为59.33粒；转基因株系#311的单株籽粒数为80粒，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，单株籽粒数显著增加(P<0.05)，增加了34.84％。

2、大豆转基因T3代株系miR156box-2(又称line 317，株系317，#317)

在转基因株系#317中：

前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平如图7所示，转基因株系#317中的前体miRNAPre-OsmiR156的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

在大豆中成熟的GmmiR156a型miRNA(GmmiR156a)的转录水平如图8所示，转基因株系#317中的GmmiR156a的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

在大豆中成熟的GmmiR156k型miRNA(GmmiR156k)的转录水平如图9所示，转基因株系#317中的GmmiR156k的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

叶片面积如图10所示，天隆一号(TL1)为受体对照，叶片面积为3881.52mm²；转基因株系#317的叶片面积为1668.53mm²，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，叶片面积极显著减少(P<0.01)，减少了57.01％。

主茎节数如图11所示，天隆一号(TL1)为受体对照，主茎节数为14.67节；转基因株系#317的主茎节数为34.67节，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，主茎节数极显著增加(P<0.01)，增加了136.33％。

单株籽粒数如图12所示，天隆一号(TL1)为受体对照，单株籽粒数为59.33粒；转基因株系#317的单株籽粒数为112.67粒，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，单株籽粒数显著增加(P<0.05)，增加了89.90％。

3、大豆转基因T3代株系miR156box-3(又称line 226，株系226，#226)

在转基因株系#226中：

前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平如图13所示，转基因株系#226中的前体miRNA Pre-OsmiR156的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

在大豆中成熟的GmmiR156a型miRNA(GmmiR156a)的转录水平如图14所示，转基因株系#226中的GmmiR156a的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

在大豆中成熟的GmmiR156k型miRNA(GmmiR156k)的转录水平如图15所示，转基因株系#226中的GmmiR156k的转录水平显著高于未转基因受体对照天隆一号(TL1)(P<0.05)。

叶片面积如图16所示，天隆一号(TL1)为受体对照，叶片面积为3881.52mm²；转基因株系#226的叶片面积为950.98mm²，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，叶片面积极显著减少(P<0.01)，减少了75.5％。

主茎节数如图17所示，天隆一号(TL1)为受体对照，主茎节数为14.67节；转基因株系#226的主茎节数为38.33节，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，主茎节数极显著增加(P<0.01)，增加了161.28％。

单株籽粒数如图18所示，天隆一号(TL1)为受体对照，单株籽粒数为59.33粒；转基因株系#226的单株籽粒数为112粒，与未转基因受体对照天隆一号(TL1)相比，单株籽粒数极显著增加(P<0.01)，增加了88.77％。

以上结果说明miRNA OsmiR156及其前体可以调控植物的产量相关性状。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种水稻OsmiR156前体及其在大豆中的成熟体在提高大豆产量性状中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

ugacagaaga gagugagcac a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

tgacagaaga gagtgagcac a 21

<210> 3

<211> 1277

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

atccaaatca acagtaatgt tctacagtta gtgagatgta gagagagata tggctagcta 60

atccatgaga gaggtctaga tagagagagg gagagatgat cagttcttca gaagaggcta 120

ctactagcta tctagcttca tgtttaactc ttcttggttt gtgtttttgt gtgcttgttg 180

gagttgttag gaggaagaga ggggtgagag gtgaggctga cagaagagag tgagcacaca 240

tggtgacttt cttgcatgct gaatggactc atgcttgaag ctatgtgtgc tcacttctct 300

ctctgtcagc catttgatct ctctttctct ctttctccct catgtgttat actgttctct 360

catatctatc ttctttgagg tagtaatata cttgagcaaa ttaagctgct taattatttg 420

tgtatgatga tcagctgctg atccggcctc atttcttgca tatatgacca caaccacata 480

catgcttgtt catttttttt cacaaagaaa gagaacagtt taatttaatt tcttggggtt 540

tttggatcag ttaattcgtc ttgagagggg aagagatctc tatgggtttt ggaggtctga 600

cagaagagag tgagcacaca cggtgctttc ttagcatgca agagccatgc tgggagctgt 660

gcgtgctcac tctctatctg tcagccgttc accatgccca atatgattaa tctccttctc 720

tcagttgaca gtaatttctt tgccagatct cctgttaaat tttctgccta gctagctatt 780

atgcacatgc ttattatgat gagcctgcca atatcatctc cacggcaaaa cacaaactag 840

ctatgatttg attcattata tttcttttcg ctgtttaatt aattatatgc aggcatacac 900

tagctagttt ccagctagta caaagacgag acgaggtcgt tctgacgatt ttcatagtcg 960

tcagaagaag gtgtgcattg gtttaatttt tgttcttggc tgtcagacta gatcatctct 1020

gaatgatcaa gagccggatc aaataattat tgtgagcacc gaaatcgatc atgcgtactc 1080

tctctgtgaa gtatttctga gaaataatat gagtgtagct agtatatata ctcttgaagg 1140

gtgtctaatt aattggggtc tctagctagc tccttctctg aatctgtcca tgaattgaat 1200

ctactatgta tgtgctggtg cttactgtta tttcatgtac tacatataat tgataaatca 1260

atttaggctt tcagttt 1277

Claims

1.DNA分子的下述任一种应用：

A1）在增加大豆主茎节数或单株籽粒数中的应用；

A2）在减少大豆叶片面积中的应用；

A3）在制备增加大豆主茎节数、减少大豆叶片面积或增加大豆单株籽粒数的产品中的应用；

所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

2.生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

C1）在增加大豆主茎节数或单株籽粒数中的应用；

C2）在减少大豆叶片面积中的应用；

C3）在制备增加大豆主茎节数、减少大豆叶片面积或增加大豆单株籽粒数的产品中的应用；

所述生物材料为下述任一种：

D1）含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；

D2）含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、或含有D1）所述表达盒的重组载体；

D3）含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、或含有D1）所述表达盒的重组微生物、或含有D2）所述重组载体的重组微生物；

D4）含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有D1）所述表达盒的转基因植物细胞系；

D5）含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物组织、或含有D1）所述表达盒的转基因植物组织；

D6）含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物器官、或含有D1）所述表达盒的转基因植物器官。

3.一种培育产量性状改变的植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1中所述DNA分子的表达量或含量，得到产量性状改变的植物，所述产量性状改变为主茎节数增加、叶片面积减少或单株籽粒数增加，所述植物为大豆。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1中所述DNA分子的表达量或含量，通过将SEQ ID No.3所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

5.权利要求3或4所述的方法在创制高产大豆和/或大豆育种中的应用。