CN111996192A - 创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因编辑技术领域，具体涉及一种通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及应用，更具体地涉及到创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点、引物、表达载体及其应用。本发明针对SlGLK2基因进行进一步的研究，利用CRISPR/Cas9技术快速创制新材料、培育新品种，且可以分离筛选掉转基因载体，不涉及转基因争议，具有一定的商业价值。

Description

创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因编辑技术领域，具体涉及一种通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及应用，更具体地涉及到创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点、引物、表达载体及其应用。

背景技术

番茄作为一种重要的蔬菜作物，因其具有非常高的经济价值和营养价值，在世界各地广泛种植。中国是世界上番茄种植面积最大，产量最多的国家，年产量约5500万吨，占蔬菜总量的7％左右。在产业化、规模化种植的今天，市场对蔬菜产品的品质也提出了更高的要求，其中外观是番茄果实一项非常重要的商品性状。因此，人们更倾向于选择果实大小适中，果面光滑，着色均匀，成熟一致的品种。但是很多番茄品种果实却有绿色青肩，即果实上半部分靠近果柄区域颜色深绿，这种青肩造成番茄果实上半部分成熟进程晚于下半部分，使得整个果实不能一致、均匀地成熟，极大影响了番茄得商品性状。

u突变体是一种未成熟时果实表面呈现均匀淡绿色，而能够成熟一致的材料。目前已研究发现U基因编码一个SlGLK2转录因子，与番茄果实中叶绿体的发育和叶绿素的分布相关。在未成熟的果实中，SlGLK2通过调控叶绿体的分布使果实肩部的叶绿素含量比其他部位的更高，因此果实肩部的绿色比其他部位的更深，即“青肩”。在抑制SlGLK2表达后发现果实整体颜色呈现均匀淡绿色(无“青肩”)，成熟后期果实的色泽也均匀分布，使果实能够一致、均匀地成熟。因此，利用SlGLK2基因培育果实无绿色青肩、成熟一致的番茄材料具有一定的可能性。

基于此，针对该SlGLK2基因进行进一步的研究并利用其创制一种果实无绿色青肩的番茄材料具有一定的商业价值。

发明内容

本发明的目的在于利用SlGLK2基因创制一种果实无绿色青肩的番茄材料的方法。

本发明的目的还在于提供一种创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点，所述靶标位点为：target1:TGGTGTCGATTAAATTCCCA，

target2:TGAATAGCAGGTTCTTCACA。

本发明的目的还在于提供一种创制果实无绿色青肩番茄材料的引物，所述引物根据上述的靶标位点设计。

其中，所述引物的核苷酸序列如下所示：

SlGLK2-CRISPRFw：5’-GAATCTAACAGTGTAGTTTGTGGTGTCGATTAAATTCCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’，

SlGLK2-CRISPR Rv：5’-GCTATTTCTAGCTCTAAAACTGAATAGCAGGTTCTTCACACAAACTACACTGTTAGATT-3’。

本发明的目的还在于提供一种创制果实无绿色青肩番茄材料的表达载体，所述表达载体为含有以043中间载体为模板、上述引物扩增获得的双sgRNA克隆框的PTX041双元表达载体。

本发明的目的还在于提供一种创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点、引物及表达载体在番茄育种中的应用。

本发明的目的还在于提供一种通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法，包括以下步骤：

S1，设计并筛选SlGLK2基因的sgRNA靶位点序列；

S2，针对双元表达载体PTX041和步骤S1中的靶位点设计引物；

S3，构建植物表达载体，并将其转化到大肠杆菌中鉴定；

S4，将步骤S3中得到的阳性克隆抽提得到重组质粒，并转化农杆菌；

S5，采用农杆菌介导的遗传转化法将步骤S4中的农杆菌浸染番茄子叶；

S6，筛选得到无绿色青肩番茄的植株，在T1代中进行自交分离筛选出突变体，并通过检测，确定出无载体的突变体。

其中，步骤S3中所用的大肠杆菌为E.coli Trans1-T1。

其中，步骤S4中所用的农杆菌为农杆菌C58。

其中，步骤S6中无载体的突变体的检测包括载体引物检测和基因引物检测。

其中，载体引物检测所用的引物为：

pTX-FW:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA，

pTX-RV:GCAGGCATGCAAGCTTATTGG；

基因引物检测所用的引物为：

SlGLK2-FW:GATGCTGGCATTTGTGTGATTC，

SlGLK2-RV:TTAATTACGACTAGAACCGTCAACG。

本发明针对SlGLK2基因进行进一步的研究并利用其创制一种果实无绿色青肩的番茄材料，缩短了育种周期，实现了目标性状的精准改良；利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，具有高效、简单、成本低的优点，本发明利用CRISPR/Cas9技术可以快速创制新材料、培育新品种，且可以分离筛选掉转基因载体，不涉及转基因争议。

附图说明

图1为本发明中SlGLK2基因的双sgRNA结构图；

图2为SlGLK2-AC T₀代植株阳性检测结果图；

图3为SlGLK2-AC T₀代转基因材料靶点扩增检测；

图4为SlGLK2-AC T₀代植株靶点分析结果；

图5为SlGLK2-AC转基因植株表型。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

供试材料

栽培番茄Ailsa Craig，简称为AC，购自番茄遗传中心TGRC(https://tgrc.ucdavis.edu/)，果实表型为中小型果实，果实圆形，未成熟时有绿色果肩，成熟时红色。

大肠杆菌E.coli Trans1-T1购自北京全式金生物科技有限公司；

农杆菌菌株C58购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；

PTX041和043载体记载于文献“Deng,L.,Wang,H.,Sun,C.,Li,Q.,Jiang,H.,Du,M.,Li,C.-B.,Li,C.,Efficient generation of pink-fruited tomatoes usingCRISPR/Cas9system,Journal of Genetics and Genomics(2017),doi:10.1016/j.jgg.2017.10.002.”中。

实施例1 SlGLK2基因的sgRNA设计

在SNG网站http://solgenomics.net/中找到SlGLK2基因的cDNA序列，如SEQ IDNO：1所示，并利用在线软件CCTop-CRISP R/Cas9 target online predictor(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)设计sgRNA靶标序列，筛选出第一个外显子上两个特异性高的序列作为靶位点序列，用于后续构建CRISPR/Cas9双元表达载体(如图1所示)。所选择的靶位点序列如下所示：

target1:TGGTGTCGATTAAATTCCCA，

target2:TGAATAGCAGGTTCTTCACA。

本实施例中，基因靶点设计原则如下：

(1)靶点长度为19-21bp，其后紧随“NGG”即PAM；

(2)靶位点和PAM必须完全在外显子上，不能横跨两段外显子；

(3)在第一段外显子上设计靶点，以使编辑后蛋白丧失功能的可能性增大，两个靶点间隔50-200bp，可以提高缺失突变发生的概率；

(4)通过比对选择特异性好的靶位点序列，减少脱靶序列；

(5)选择GC含量相对较高的靶点，可大大提高编辑效率。

实施例2 CRISPR/Cas9系统植物表达载体构建

CRISPR/Cas9系统植物表达载体的构建包括以下步骤：

1、针对PTX041和目的基因的靶位点设计引物，引物序列如下所示：

SlGLK2-CRISPRFw：5’-GAATCTAACAGTGTAGTTTGTGGTGTCGATTAAATTCCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’，

SlGLK2-CRISPR Rv：5’-GCTATTTCTAGCTCTAAAACTGAATAGCAGGTTCTTCACACAAACTACACTGTTAGATT-3’。

2、使用phanta酶，以中间载体043为模板，用上述合成的引物进行PCR扩增获得600bp的双sgRNA克隆框。其中，PCR扩增时的反应体系为：PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase(1U/μL)1μL；2×Phanta Max Buffer 25μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；DNA模板1μL；dNTP Mix 1μL；ddH₂O up to 50μL。反应程序为：预变性95℃3min；变性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃1min，循环35次；终延伸72℃10min。

3、使用限制性内切酶BSaI酶切PTX041载体，凝胶电泳，切胶回收，获得大小约为18kb的酶切产物。其中，酶切反应体系为：质粒5ug，BsaI酶(NEB)2ul，10×Cut SmartBuffer 5ul，ddH₂O up to 50μL，反应条件为：37℃，3h。

4、使用同源重组酶ExnaseII(诺唯赞，南京)将步骤2的双sgRNA克隆框和步骤3的线性化载体进行重组，获得重组载体。其中，重组连接时的反应体系为：线性化载体40ng，双sgRNA克隆框回收产物6ng，ExnaseII1ul，2×CE II Buffer 2ul，ddH₂O to 10ul，反应条件为：37℃，30min。

5、将重组载体热激转化大肠杆菌感受态细胞，并进行菌液PCR检测，菌液PCR检测时所用的引物为：

pTX-FW:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA，

pTX-RV:GCAGGCATGCAAGCTTATTGG。

重组载体大肠杆菌检测，反应体系为：Taq酶(5U/μL)0.1μL；2×TaqBuffer 2μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；dNTPs 0.4μL；ddH2O to 20ul，反应程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min 30s，循环35次；终延伸72℃10min。凝胶电泳检测到1200bp片段的即为转化成功的阳性克隆，随机挑取转化成功的阳性单克隆于含100mg/L Kana的液体LB培养基，37℃摇菌4-5h，经PCR检测及测序鉴定重组质粒，鉴定正确后抽提重组质粒，用于转化农杆菌C58。

实施例3 CRISPR/Cas9系统表达载体的农杆菌电击转化

CRISPR/Cas9系统表达载体的农杆菌电击转化包括以下步骤：

1、分别使用蒸馏水、75％乙醇和无水乙醇将电转杯洗净，置于超净工作台中风干半小时；

2、取30μL农杆菌C58的感受态细胞，加入1-2μL CRISPR/Cas9系统表达载体质粒DNA，混匀，在电转仪下电击转化；

3、马上加入500μL液体LB培养基，28℃下震荡(200r/min)培养3h；

5000r/min离心2min收集菌体，加入LB液体培养基重悬菌液，将100μL菌液涂布于含100mg/L Kana和50mg/L Rif的LB平板上，28℃培养2-3d。待固体LB培养基长出单克隆后，随机挑取单克隆进行培养，鉴定菌液PCR鉴定，鉴定引物

pTX-FW:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA；

pTX-RV:GCAGGCATGCAAGCTTATTGG。

PCR反应体系为：Taq酶(5U/μL)0.1μL；2×Taq Buffer 2μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；dNTPs 0.4μL；ddH2O to 10ul，反应程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min 30s，循环35次；终延伸72℃10min。保存菌液。

实施例4农杆菌介导的番茄遗传转化及PCR阳性鉴定

以栽培番茄AC为实验材料进行接种，接种后长出的子叶切成外植体进行暗培养，用含有SlGLK2的CRISPR/Cas9系统表达载体的农杆菌菌株浸染番茄子叶，外植体经过两次的抗生素筛选培养长出具有生长点的幼苗，将幼苗转入生根培养基中进行生根培养，最后将生根的抗性苗转移到装有营养土的塑料杯中，在绿化间温室中适应培养1个月。提取转基因苗的DNA进行PCR阳性检测，获得9棵SlGLK2-AC转基因植株，将阳性植株转移至玻璃温室，进行温室培养。

具体操作步骤如下：

(1)接种

番茄种子在75％酒精中杀菌40s，50％次氯酸钠杀菌15min，再用灭菌的蒸馏水冲洗3次，之后接入1/2MS培养基，培养约7天,待长出子叶。

(2)摇菌

将经过平板划线活化的农杆菌接入加有0.1mg/ml卡那霉素和0.1mg/ml利福平抗生素的液体LB中，28℃，200转摇16h。

(3)外植体的制备和侵染

外植体制备：将番茄子叶切出伤口，在预培养培养基上暗培养过夜，作为外植体；

侵染：将番茄外植体浸泡于悬浮液中，摇好的农杆菌3000转离心5min收集菌体，并用悬浮液重悬，接着加lml重悬的农杆菌于外植体中，侵染4min，侵染完后吸干外植体表面水渍，将外植体转入预培养培养基中暗培养2天。

(4)外植体的筛选

侵染过的外植体转移到筛选培养基上在16h光照8h黑暗的光照周期下培养约15天。

(5)培养

将筛选培养基上长出愈伤组织的外植体转移到再生培养基上培养30天，期间15天时换一次培养基，换培养基时将多余的愈伤组织切掉使幼苗更好生长。30天后将幼苗转入生根培养基中诱导生根，在生根培养基中培养约20天。

(6)检测

为了确定CRISPR/Cas9载体的转入情况，用Cas9特异性引物对获得的转基因植株进行PCR扩增检测，凝胶电泳结果显示，所有SlGLK2-AC 9棵转基因植株都扩增出一条1200bp的目的条带，证明CRISPR/Cas9双元表达载体已成功转入番茄，阳性转化率均为100％(图2)。具体地步骤为：先用CTAB法提取番茄叶片DNA，并用如下引物和条件进行鉴定，Cas9特异性引物为：正向引物：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’，反向引物：5’-GCAGGCATGCAAGCTTATTGG-3’，PCR鉴定体系为：Taq酶(5U/μL)0.1μL；2×Taq Buffer2μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；dNTPs 0.4μL；无菌双蒸水15.7μL，总体积20μL，反应程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，循环35次；终延伸72℃10min。

为了鉴定9棵转基因植株是否发生基因编辑，我们根据SLGLK2基因组序列(如SEQID NO：2所示)在SlGLK2基因的两个靶点前后设计一对引物，引物序列：

SlGLK2-FW:GATGCTGGCATTTGTGTGATTC，

SlGLK2-RV:TTAATTACGACTAGAACCGTCAACG。

以番茄阳性植株的DNA为模板进行PCR扩增，具体扩增时的反应体系为：Taq酶(5U/μL)0.1μL；2×Taq Buffer 2μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；dNTPs 0.4μL；ddH2O to 20ul，反应程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，循环35次；终延伸72℃10min。2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现SlGLK2-AC-6、7、8出现2-3条带，证明目标基因已经被编辑，但是其余的SlGLK2-AC阳性苗的条带大小基本与对照条带相差不明显，很可能是小片段的缺失、插入或碱基替换，甚至是无编辑靶点(图3)。为了进一步确定靶点的编辑情况，我们将阳性植株靶点处的序列扩增出来连入载体测序，以确定靶标位点的编辑效率和编辑形式。每个阳性植株连载体后送三个克隆测序，经过两个基因的靶位点测序分析发现，SlGLK2-AC 9棵植株均发生编辑，其中靶点1发生编辑的有7株，靶点2发生编辑的有9株(图4)。

(7)获得突变体植株

将9株SlGLK2-AC转基因植株定植于玻璃温室，只有SlGLK2-AC-5和SlGLK2-AC-8结果，可以观察到果实青肩已经消失，整个果实都为浅绿色(图5)。为了得到稳定的纯合突变体，还需要在T1代中进行自交分离筛选出突变体。播种了SlGLK2-AC-5的T1代并统计了表型，发现有29株的果实无青肩，15株果实仍存在青肩，但是果肩部分绿色变浅。通过载体引物和基因引物PCR检测，确定有3株无载体的突变体。至此，获得不含转基因片段的SlGLK2基因编辑材料。其中，载体引物为：

pTX-FW:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA；

pTX-RV:GCAGGCATGCAAGCTTATTGG。

反应体系为：Taq酶(5U/μL)0.1μL；2×Taq Buffer 2μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；dNTPs0.4μL；ddH2O to 20ul，扩增程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min 30s，循环35次；终延伸72℃10min；基因引物为：SlGLK2-FW:GATGCTGGCATTTGTGTGATTC，

SlGLK2-RV:TTAATTACGACTAGAACCGTCAACG。

反应体系为：Taq酶(5U/μL)0.1μL；2×Taq Buffer 2μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；DNA模板1μL；dNTPs0.4μL；ddH2O to 20ul，扩增程序为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，循环35次；终延伸72℃10min。

番茄基因组DNA的提取

采用CTAB法提取番茄基因组DNA，具体步骤如下：

1、将0.1g番茄嫩叶采集到2mL离心管中，加入700μL CTAB，用研磨机研磨至匀浆，然后65℃水浴45min，每15min混匀一次；

2、加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，上下震荡10min，10000r/min离心10min；

3、取上清液转移至新的1.5mL离心管，加入2/3体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置20min；

4、10000r/min离心10分钟，弃上清，用75％乙醇洗涤DNA沉淀两次；

5、晾干，加入双蒸水100μL，溶解DNA，作为后续PCR检测的模板。

培养基：

接种培养基(1/2MS培养基) (1000ml)：

预培养培养基(1000ml)：

农杆菌悬浮液(1000ml)：

筛选培养基(1000ml)：

添加激素和抗生素(500ml)：

再生培养基(1000ml)：

添加激素和抗生素(500ml)：

玉米素(ZR)(1mg/ml) 100ul

卡那(100mg/ml) 500ul

特美汀(300mg/ml) 600ul

生根培养基(1000ml)：

添加激素和抗生素(500ml)：

卡那(100mg/ml) 250ul

特美汀(300mg/ml) 600ul

LB培养基(1000ml)：

培养基灭菌均为121℃、20min，激素和抗生素在灭菌之后添加。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 创制果实无绿色青肩番茄材料的方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1119

<212> DNA

<213> SlGLK2 cDNA序列(Solanum lycopersicum)

<400> 1

cttatatttt ctctcttttg atgtcaccaa attcttcatc ctatattcat caagagaggg 60

taaattgagt tgtttttact tttaagatta cgaattttat attttaagaa ggtttattta 120

tcgatatctt tgagcgattt cattgcctgt tatagcaggt taattatact tatagtattt 180

gaaataatgc ttgctctatc ttcatcattg agctacaaaa atgaaaggga aaattatgat 240

ttattccaag atttttccca tgggaattta atcgacacca tcaatttcga tgactttttc 300

gatgaaatca acggtggaga tttactgcca gatttcgaaa ttttttgtga agaacctgct 360

attcatggaa atatgaaatc taagtcaaaa gaagctaaaa aatcatctag caaaatcaaa 420

aatcctcaag gaaagaaaaa agtaaagttg gattggactc cagagctaca taggaaattt 480

gtaaaagcaa tagagaaatt aggtgttgat aaggcagtcc catcaagaat tttggagctt 540

atggcaactc atggtctcac tagacataac attgctagtc atcttcaaaa atatcgagct 600

catcgaaaac atttactagc gagagaagct gaagcagcga gcttgaacca taggaagcaa 660

atgtatagcg gagccaccac aatcggaggc ggaggaaaga gaattttgat gaacccctgg 720

cccgcaccgc caaccatggg tttcccaccc atggctcatc atgttagacc cttacatgtt 780

tgggggcatc cacatgtaaa taattcattt tggcatccac attatcaaag ggtatcgaat 840

tctcttgtac caggcactcc ttgtttttct gcgccaataa catcagcgag atttgcagca 900

cctctcatgg tcccaggcat cccaccaagc cctgccatca tcaaagttga cacagttgcc 960

tctgatttgc acccctcaaa tgagagcata gatgcagcta ttgaagatgt tttatcaaag 1020

ccacaattgc cacttcccat aggactcaaa cctccatcaa ttgacagtgt gttgaatgaa 1080

ttacaacgtc aagggattac caaaataccc ccaacttga 1119

<210> 2

<211> 4719

<212> DNA

<213> SlGLK2 gDNA序列(Solanum lycopersicum)

<400> 2

cttatatttt ctctcttttg atgtcaccaa attcttcatc ctatattcat caagagaggg 60

taaattgagt tgtttttact tttaagatta cgaattttat attttaagaa ggtttattta 120

tcgatatctt tgagcgattt cattgcctgt tatagcaggt aatttgtctt attttttatt 180

acaaatttta gagtttttaa aagatttatc tatcgatatt tgagtgagtt gtagcagata 240

gcctatctta ttatcgaaat tacaaatctc atattatgag gaagcttagt tgtcaaaatg 300

tttcatgaat gagttaatta tatgttgtag caaataattt atcttatttt taacattaca 360

aatttaagag ttttaaggaa tgaattatag caggtaatct atcttatttt cgaaattaca 420

aatctcatat tatgaggaag cttacatgtt gatgttcttt gaatgagttg attatctgtt 480

gtagcaggta atttgtctta ttttcaacat tacaaaaatt taagagttta aggagagact 540

tatctacaca tttaactaat ttataacaga taatttatct tatttttaaa attacgaatc 600

tcattttacg aaaaggcttg cttgtctata ttctttgaat aattgattat ctgttatatc 660

gagtaattta ggttgattct caatattaca aatctcacat tttaagatgc tggcatttgt 720

gtgattctta tcttttagtg acttgttata gcatgtaatc ttatcttact tttaatatta 780

ctaattaatc ttacattttt attttcttga aggttaatta tacttatagt atttgaaata 840

atgcttgctc tatcttcatc attgagctac aaaaatgaaa gggaaaatta tgatttattc 900

caagattttt cccatgggaa tttaatcgac accatcaatt tcgatgactt tttcgatgaa 960

atcaacggtg gagatttact gccagatttc gaaatttttt gtgaagaacc tgctattcat 1020

ggaaatatga aatctaagtc aaaagaagct aaaaaaatca tctagcaaaa tcaaaaatcc 1080

tcaaggaaag aaaaaagtaa aggtaaactt tttttcttat tattaattat aatttatatt 1140

catcgttatc gtaaaaaatc taattatcgt tgacggttct agtcgtaatt aagattataa 1200

atttcatgtg ttaaaagaac taagtagtaa tatttgtcga tatccttttt aagtgtcttg 1260

atgattacct ctcatataga agataataat ttgtctttat cttttaagat taaaaaatta 1320

ttttaagtgt ctaatgcagt gtcggattca gaattttcat taaagggatt taaaaaaaat 1380

ttagtgattc gaactcctaa atcactaagt caaactctaa tcttttattt aggaagttca 1440

aaatcaatat ataaacatac aaattcttta aaatacctca gatatacaac gtaatttttt 1500

tatcgaagag attcgaatga acccctcgcc cctcggcata ctctaggtct gctcctagtc 1560

taatgatagc ttaaataaac ttgtaatgtt attcatgcaa agtaaacatc atcaacgatt 1620

taattttttc tcaaaaattt aagttatata tgttgatatg acaaaataat gaatttttta 1680

atggataagt tataggttaa tgttttactt acttatttgt ttgtttattt aatttttgtt 1740

tttttattaa taaaatggaa gtttaatttc ttgaattatg tgaagttgga ttggactcca 1800

gagctacata ggaaatttgt aaaagcaata gagaaattag gtgttgataa ggcagtccca 1860

tcaagaattt tggagcttat ggcaactcat ggtctcacta gacataacat tgctagtcat 1920

cttcaagtaa gtttcatccg tgagattttc gaattcgagt tttagatata aaattattta 1980

ttatatttaa tttatatgat atttttcatt ttttcagaac gaaatttatg tatatataga 2040

ctatgtaaaa agtgttatac agtgacaata attaataatt taaaatactt taaagacata 2100

tgaacaactt ttagtcaaag aataacttgt tctcttgaaa tttgaatatc gccatttttg 2160

caatttggga gtactctcca tgatatgaga gttttcaaca agaatcaaaa tcaattacga 2220

atatcgaaca tcaaaaaaaa agaaaaaact tattcaatta gttttgattg aaacgatttt 2280

caaatttata tctcatttaa attttattgt atgagttaat tttattttat ataggtatgt 2340

attattaaat taacgtcagg tacaataaat cttcaagata agcataatat gataacataa 2400

aaagaaaaaa tcaactataa taagttatat tgacttgatg gtgtaagaat tgtgcacatt 2460

ttttactata tgtaatttaa attcttgtta tatatgtgaa gaaatatcga gctcatcgaa 2520

aacatttact agcgagagaa gctgaagcag cgagcttgaa ccataggaag caaatgtata 2580

gcggagccac cacaatcgga ggcggaggaa agagaatttt gatgaacccc tggcccgcac 2640

cgccaaccat gggtttccca cccatggctc atcatgttag acccttacat gtttgggggc 2700

atccacatgt aaataattca ttttggcatc cacattatca aagggtgagt cattttttta 2760

ttttcgattt actcaattct aatctgactc aatatataat tctaagttaa aaataaaatt 2820

ttaaaaaagt tgtaattgac catgacatat ttaacatttg tatgtttata atactttttt 2880

taaaattatt ataatatttg tgtgattaat atatattcat aagaagtatt ataaatttca 2940

tcatgttcaa ttaaataatg ctatataaat tgaaatatat tttgtaggta tcgaattctc 3000

ttgtaccagg cactccttgt ttttctgcgc caataacatc agcggtaact attttatcga 3060

ataattatta ctaatattta atagatgttt gatcatacaa tttgtgaaga gaaaatttta 3120

tttaaaattt tgtaaccaaa actaaaattc ttttatttta taataaatat aataaatgtg 3180

atttaataat ataaaaattg cttctttttt tgttttttga cttatataga caaaataatt 3240

tgatgcagag atttgcagca cctctcatgg tcccaggcat cccaccaagc cctgccatca 3300

tcaaagttga cacagttgcc tctgatttgc accccgtgag ccttctttct attccgattt 3360

atcgtcacat aaatatttta tcgctctatt catatcataa gtttttaaaa gtcatatatg 3420

caaataggaa aagggtctga tatacccctt aattttatca tttagagctg atatgccctt 3480

tgttatgaaa gtgactcata tataccccta cttgtaaaca aatggctcac atataccctt 3540

ttcctctaac ggaaatgaaa aaaataatac ttttaatcta aatttttatt atttttttct 3600

aaaaaatata atcccgtatg agtaaattta atcctcgtca aatatatttt ttttgacttt 3660

ttttgtttca atgactaatt tataattata ttttgataat caaatttatt tatgtttcac 3720

taatattctt gtaaaactta ttatagatga ccaaattttt tcttcgaata cgaaattaaa 3780

ttacaataca cacaaaaaaa attgtttaat tttttattct ttaaattaag gaatgaaaga 3840

aaaaacaaaa taagaataag aaattcaaat aattataata aaagaaaaca agaaataatt 3900

tatgtatgaa aaaaattaaa atataccttg aactttgaaa gaagaatcat atatacccct 3960

aaataatttt taaaaaaatt agaagtaata aatataaatt taaaactaat tttttaactt 4020

ccgttaaatg aagggtattt gtgagccatt ttataacggc aggggtatat gtgagccgtt 4080

tgtataacgg taagggcata tatgagccac ttttataaca agggatatat cagctccaaa 4140

tgacaaagtt gaggggtata tcagactctt ttccctatgc aaatttagac attctaacct 4200

ggtttgattg tgtcatttga atactatttc aacatataaa ataattatct agacgtacat 4260

tttcataatt catatgtcac atcaatatcg aatatttcgt aagacactgt agaaataagt 4320

tagagtgtgt tcacttgtca gttgagatca attgagatat ctaaatacac tacgctctta 4380

atgttggagt gcctacttat taactagcgt gtgctcacgc attaagccag gtaaaatctt 4440

tccttttttt tttagtcaaa atttttcact aaaaaatttc atcttaaaaa atttaacctc 4500

ttatatacaa tataattttt ttataaatta attttttccc cgatttctga catattatct 4560

tgatgttgtt aacagtcaaa tgagagcata gatgcagcta ttgaagatgt tttatcaaag 4620

ccacaattgc cacttcccat aggactcaaa cctccatcaa ttgacagtgt gttgaatgaa 4680

ttacaacgtc aagggattac caaaataccc ccaacttga 4719

Claims (10)

1.创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点，其特征在于，所述靶标位点为：target1:TGGTGTCGATTAAATTCCCA，

target2:TGAATAGCAGGTTCTTCACA。

2.创制果实无绿色青肩番茄材料的引物，其特征在于，所述引物根据权利要求1所述的靶标位点设计。

3.根据权利要求2所述的创制果实无绿色青肩番茄材料的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下所示：

SlGLK2-CRISPRFw：

5’-GAATCTAACAGTGTAGTTTGTGGTGTCGATTAAATTCCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’，

SlGLK2-CRISPR Rv：

5’-GCTATTTCTAGCTCTAAAACTGAATAGCAGGTTCTTCACACAAACTACACTGTTAGATT-3’。

4.创制果实无绿色青肩番茄材料的表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有以043中间载体为模板、权利要求2所述的引物扩增获得的双sgRNA克隆框的PTX041双元表达载体。

5.创制果实无绿色青肩番茄材料的靶标位点、引物及表达载体在番茄育种中的应用。

6.通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，设计并筛选SlGLK2基因的sgRNA靶位点序列；

S2，针对双元表达载体PTX041和步骤S1中的靶位点设计引物；

S3，构建植物表达载体，并将其转化到大肠杆菌中鉴定；

S4，将步骤S3中得到的阳性克隆抽提得到重组质粒，并转化农杆菌；

S5，采用农杆菌介导的遗传转化法将步骤S4中的农杆菌浸染番茄子叶；

S6，筛选得到无绿色青肩番茄的植株，在T1代中进行自交分离筛选出突变体，并通过检测，确定出无载体的突变体。

7.根据权利要求6所述的通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法，其特征在于，步骤S3中所用的大肠杆菌为E.coli Trans1-T1。

8.根据权利要求6所述的通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法，其特征在于，步骤S4中所用的农杆菌为农杆菌C58。

9.根据权利要求6所述的通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法，其特征在于，步骤S6中无载体的突变体的检测包括载体检测和基因检测。

10.根据权利要求9所述的通过基因编辑技术创制果实无绿色青肩番茄材料的方法，其特征在于，载体检测所用的引物为：

pTX-FW:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA，

pTX-RV:GCAGGCATGCAAGCTTATTGG；

基因检测所用的引物为：

SlGLK2-FW:GATGCTGGCATTTGTGTGATTC，

SlGLK2-RV:TTAATTACGACTAGAACCGTCAACG。

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