CN110863006B

CN110863006B - 一种提高水稻分蘖和再生的方法

Info

Publication number: CN110863006B
Application number: CN201911124317.5A
Authority: CN
Inventors: 李庆顺; 林俊城; 洪礼伟; 余定天; 马慧; 胡伟
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110863006A

Abstract

本发明公开了一种提高水稻分蘖和再生的方法，包括如下步骤：(1)将如SEQ ID NO.01中的第26至第527位所示的miRNA序列插入到植物表达载体中，获得可表达出靶向水稻OsCPSF30 RNA 5’端非翻译区的重组植物表达载体；(2)将上述重组植物表达载体通过农杆菌介导法转化入水稻中，获得增强分蘖和再生能力的水稻种质。

Description

一种提高水稻分蘖和再生的方法

技术领域

本发明属于作物基因工程技术领域，具体涉及一种提高水稻分蘖和再生的方法。

背景技术

水稻是世界主要粮食作物之一，世界上有近一半的人口以稻米为主食。由于人口增长、耕地面积减少、环境污染和自然灾害影响等因素的影响，世界粮食安全所面临的挑战日益严峻。我国作为世界上人口最多，而人均耕地面积匮乏的国家，这一现象尤为突出。再生稻是在头季水稻收割后利用水稻稻头的再生能力直接延续一茬的水稻耕种方式，对合理安排耕作制度、节约农业生产资源、减少人力投入和增加水稻年度产量具有重要的作用，在南方地区(如四川、福建省等)推广盛行。目前仅数个水稻品种适合再生稻生产，缺乏专一的良种。因此，创制水稻再生能力强的种质资源对于提高再生稻产量具有举足轻重的作用。

由于基因组的变化需要很长时间，在面对不断变化的环境下，植物不能逃避但能就地响应变化。在表观上，这些应答功能大多反映为生理形态的改变，而实际是先从分子水平调控开始的。这种调控主要是从对发育和环境因子的感应及诱导，进而对mRNA转录表达的调控，再到对植株在蛋白质活性、基因表达、激素、代谢产物及其分布等水平上进行调整。多聚腺苷化(polyadenylation，简称poly(A))是真核生物功能基因转录成mRNA的必经加工过程。采用不同的多聚腺苷化位点，导致基因转录产物的改变并产生不同的基因表达效果的调控方式被称为选择性多聚腺苷化(Alternative Polyadenylation，APA)。在水稻中，80％的基因有多个poly(A)位点。APA与植物基因表达有关并导致一系列性状的改变，如植物表观遗传调控、开花时间、抗病抗逆、自交不亲和及氨基酸代谢等。通过调节选择性多聚腺苷化，有可能形成广谱、对多基因具有调控作用的技术，用于农业生产。

APA的产生是由于识别多聚腺苷化信号的蛋白质(或称多聚腺苷化因子)的调控的结果。改变起关键作用的多聚腺苷化因子的表达就有可能改变APA。然而，由于所有植物的mRNA都需要有poly(A)尾巴，改变多聚腺苷化因子的表达有可能通过APA从而导致许多基因表达的改变。这可能成为一种广谱的基因调控的方法。我们的发明就在于找到了这种用于控制APA的广谱的基因调控方法，以致产生特异的效果，如提高水稻分蘖和再生。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种提高水稻分蘖和再生的方法。

本发明的技术方案如下：

一种提高水稻分蘖和再生的方法，包括如下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.01中的第26至第527位所示的miRNA序列插入到植物表达载体中，获得可表达出靶向水稻OsCPSF30 RNA5’端非翻译区的重组植物表达载体；

(2)将上述重组植物表达载体通过农杆菌介导法转化入水稻中，获得增强分蘖和再生能力的水稻种质。

在本发明的一个优选实施方案中，所述植物表达载体为pCAMBIA1300S。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)包括：

a、将所述重组植物表达载体通过冻融法转化到农杆菌中，获得重组农杆菌；

b、将上述重组农杆菌侵染水稻的胚性愈伤组织，经过抗性愈伤组织的筛选、分化和生根培养，及进一步的筛选培育，获得所述增强分蘖和再生能力的水稻种质。

进一步优选的，所述农杆菌为EHA105。

本发明的另一技术方案如下：

一种水稻，其内具有可表达出靶向水稻OsCPSF30 RNA 5’端非翻译区的重组植物表达载体，该重组植物表达载体内插入有如SEQ ID NO.01中的第26至第527位所示的miRNA序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组植物表达载体通过农杆菌介导法转化其中。

本发明的再一技术方案如下：

一种重组植物表达载体，其内插入有如SEQ ID NO.01中的第26至第527位所示的miRNA序列，达到调控OsCPSF30基因表达的结果。

本发明的有益效果是：本发明获得的水稻种质具有较强的分蘖和再生能力。

附图说明

图1为本发明实施例1中的重组植物表达载体p1300S-kd5C30-hpt的图谱。其中，a，表达载体框架；b，载体示意图；MCS：多克隆位点；Hpt：潮霉素抗性基因。

图2为本发明实施例1中的转基因植株PCR鉴定电泳图。其中，1-21，转基因植株样品；22，阳性质粒对照；23，阴性对照；24，100bp maker。

图3为本发明实施例1中的培养的转基因植株。其中，TS9128，转p1300S-kd5C30-hpt的植株；TS9129，转p1300S空载体的对照植株。

图4为本发明实施例1获得的转基因水稻第一茬分蘖数量分析图。其中，**表示p＜0.01。

图5为本发明实施例1获得的转基因水稻再生茬再生蘖数量分析图。其中，**表示p＜0.01。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：分子克隆实验指南(第三版)(Sambrook等著，黄培堂译，2002)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

(1)p1300S-kd5C30-hpt植物表达载体的构建

a、OsCPSF30的miRNA靶位点设计

在线miRNA设计网站WMD3是针对拟南芥的设计工具，因为水稻和拟南芥CPSF30高度同源，序列相似度很高，因此在高度保守的区域内使用WMD3设计了水稻CPSF30miRNA位点(具体方法为：用拟南芥CPSF30基因设计miRNA位点后，将得到的miRNA序列反向互补得到DNA序列，用拟南芥基因组中包含这两个位点的片段在水稻CPSF30序列中进行同源比对，找到水稻的相应miRNA靶位点)。设计的miRNA靶位点位于5’端前233bp处(5’UTR内)。

b、表达载体构建

使用在线设计网站WMD3-oligo设计水稻miRNA引物，以质粒pNW55为模板，用引物A和引物II、引物B和引物III、引物I和引物IV分别PCR扩增获得三DNA片段。以该三DNA片段的混合物为模板，用引物A和引物B扩增得到水稻目的基因miRNA发卡结构(具体序列如SEQ IDNO.01中的第26至第527位所示)，长度为544bp；使用SmaI酶切pCAMBIA1300S质粒，将如SEQID NO.01所示的核苷酸序列正向连接到pCAMBIA1300S上，获得如图1所示的重组植物表达载体p1300S-kd5C30-hpt。

上述各引物如下表所示：

名称	序列5’-3’
		引物A	CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC(SEQ ID NO.02)
引物B	GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG(SEQ D NO.03)
		引物I	agTAACGGCTTAAGATGAGTCTGcaggagattcagtttga(SEQ ID NO.04)
引物II	tgCAGACTCATCTTAAGCCGTTActgctgctgctacagcc(SEQ ID NO.05)
		引物III	ctCAGACACATGTTAAGCCGTTAttcctgctgctaggctg(SEQ ID NO.06)
引物IV	aaTAACGGCTTAACATGTGTCTGagagaggcaaaagtgaa(SEQ ID NO.07)

(2)miRNA表达载体转化水稻

a、愈伤诱导与继代

挑选成熟水稻种子(当年新收种)，剥离颖壳，倒入50mL离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，倒掉，再加入30％次氯酸钠溶液消毒20min，倒掉次氯酸钠溶液后用无菌水冲洗5-6遍。吸去多余的水份(可用灭菌过的滤纸吸干)，将种子转移到诱导培养基上，每皿诱导培养基20-25颗种子。愈伤长出后挑取到新鲜的诱导培养基上进行继代培养，长到适宜的大小时进行转化。

b、农杆菌培养和侵染

将通过冻融法转化上述重组植物表达载体p1300S-kd5C30-hpt的农杆菌EHA105于含有相对抗生素的平板上划线，28℃黑暗培养2天，调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

挑选足够数量的愈伤组织放入100mL无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3天。

c、筛选培养

共培养3天后的愈伤组织要进行清洗步骤，用1mL的蓝枪头将共培养基上的愈伤播到已灭菌的三角瓶中加入无菌水冲洗两遍，第三遍用含有500μg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30min左右，待愈伤吹干后转移到筛选培养基上进行筛选培养，培养条件28-30℃，暗培养。筛选时长3-4周。

d、分化培养

筛选结束后，可见颜色鲜黄、直径1-2mm的阳性愈伤长出，将阳性愈伤挑到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗，置于28-30℃温室中光照培养。10天左右愈伤冒出绿点，在经过10天左右会有幼苗分化出。

(3)转基因水稻的获得及其检测分析

a、转基因水稻的PCR鉴定

用软件Primer 3.0设计一对正反向特异引物XP2158(5′-CCCCAATGTCAAGCACTTCC-3′，SEQ ID NO.08)和XP2159(5′-CCAACCACGTCTTCAAAGCA-3′，SEQ ID NO.09)，用于含潮霉素抗性基因的转基因水稻植株的PCR鉴定，其PCR产物大小445bp。

取抗性水稻植株的叶片，用液氮研磨充分后，利用Edward buffer(200mM TrispH7.5；250mM NaCl；25mM EDTA；0.5％SDS)提取DNA，用引物XP2158和XP2159进行PCR扩增，结果表明：成功获得了一批阳性水稻植株(图2、图3)。

b、转基因水稻分蘖和再生能力分析

转基因T0代植株结实成熟收种后获得T1代种子，播种T1代种子并在28℃、12h光照/12h黑暗条件下育秧1个月，通过PCR鉴定携带有HYG抗性基因的转基因苗(排除分离的阴性苗)，移栽至种植盆中，株距为15cm，行距为15cm。调查转基因苗的分蘖数量(图4)。首茬成熟后割茬进行再生培养，并调查再生蘖的数量。结果表明，干扰OsCPSF30表达的转基因植株的首茬分蘖数量和再生蘖数量均显著高于空载体对照(图5)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种提高水稻分蘖和再生的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 555

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 2

ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 60

cggccagtga attgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctccac cgcggtggcg 120

gccgctctag aactagtgga tccccctcgg atcccagcag cagccacagc aaaatttggt 180

ttgggatagg taggtgttat gttaggtctg gttttttggc tgtagcagca gcagtaacgg 240

cttaagatga gtctgcagga gattcagttt gaagctggac ttcacttttg cctctctcag 300

acacatgtta agccgttatt cctgctgcta ggctgttctg tggaagtttg cagagtttat 360

attatgggtt taatcgtcca tggcatcagc atcagcagcg gtaccgaggg ctgcaggaat 420

tcgatatcaa gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt 480

ccctttagtg agggttaatt tcgagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 540

gaaattgtta tccgc 555

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 2

ctgcaaggcg attaagttgg gtaac 25

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 3

gcggataaca atttcacaca ggaaacag 28

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 4

agtaacggct taagatgagt ctgcaggaga ttcagtttga 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 5

tgcagactca tcttaagccg ttactgctgc tgctacagcc 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 6

ctcagacaca tgttaagccg ttattcctgc tgctaggctg 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 7

aataacggct taacatgtgt ctgagagagg caaaagtgaa 40

Claims

1.一种提高水稻分蘖和再生的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将如SEQ ID NO.01中的第26至第527位所示的miRNA序列插入到植物表达载体中，获得可表达出靶向水稻OsCPSF30 RNA 5’端非翻译区的重组植物表达载体；

（2）将上述重组植物表达载体通过农杆菌介导法转化入水稻中，获得增强分蘖和再生能力的水稻种质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为pCAMBIA1300S。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）包括：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述农杆菌为EHA105。

5.一种重组植物表达载体，其特征在于：其内插入有如SEQ ID NO.01中的第26至第527位所示的miRNA序列。