CN103772495B - 一个棉花长纤维高表达基因（GhLFHE1）及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离的棉花长纤维高表达基因GhLFHE1、含有所述基因的表达载体、宿主和转化体以及所述基因在制备转基因植物中的应用，所述GhLFHE1基因可促进棉花纤维伸长，提高棉花纤维长度，增加纤维品质和产量，可用于改良棉花品种。

Description

一个棉花长纤维高表达基因（GhLFHE1）及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及一种棉花长纤维高表达基因及其应用。

背景技术

棉花是世界上主要的纤维作物之一。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期：纤维细胞起始期、纤维细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。每个时期都有各自的特点，但相邻发育时期又有所重叠。纤维发育的每个时期对纤维的产量和/或品质都有影响，纤维的分化起始决定了单粒胚珠中纤维的数量，纤维细胞伸长速率和持续时间主要决定了纤维的长度，次生壁沉积的方式和持续时间主要决定了成熟纤维的强度和次生壁厚度。纤维伸长期是（初生壁合成期）从开花当天开始，可以持续到开花后25天（25DPA），主要进行细胞极性伸长和初生细胞壁的合成，这时期的纤维伸长速率和持续时间决定纤维的最终长度，陆地棉纤维长径比可达1000-3000。但迄今为止，我们对调控其发育过程的分子机制仍知之甚少。

棉花ligonlintless-1（li-1）突变体是棉花栽培种TM-1的一个自然突变体，该突变体具有极短的纤维，而纤维细胞的分化和起始与野生型没有明显差异，因此li-1突变体是研究纤维细胞伸长的良好材料。利用2-DE和本地化EST数据库支持的MS/MS技术，zhao等人在li-1和TM-1的12DPA纤维细胞中发现81个差异表达的蛋白质，而在6DPA纤维中没有发现明显的差异表达蛋白（ZhaoPM,WangLL,HanLB,WangJ,YaoY,WangHY,DuXM,LuoYM,XiaGX(2010)ProteomicidentificationofdifferentiallyexpressedproteinsintheLigonlintlessmutantofuplandcotton(GossypiumhirsutumL.).J.ProteomeRes9:1076-1087）。但是2-DE技术难以检测低丰度蛋白质，因此可能漏检对纤维伸长有重要调控作用的蛋白。Liu等人通过转录组分析证实，有577个转录本在6DPA的li-1和TM-1纤维中差异表达，而在0DPA胚珠和3DPA纤维中仅有少许基因的差异表达（LiuK,SunJ,YaoLY,YuanYL(2012)TranscriptomeanalysisrevealscriticalgenesandkeypathwaysforearlycottonfiberelongationinLigonlintless-1mutant.Genomics100:42-50）。这些结果说明突变体的纤维变短的确与纤维伸长期相关基因的表达变化有密切关系。

油菜素类固醇（Brassinosteroids，BRs）是广泛存在于植物体中的一类具有类似于动物甾醇结构的激素。油菜素类固醇在植物生长发育的许多生理过程中都具有重要的作用，而且浓度极低（nmol·L^-1）的油菜素类固醇就能表现出极高的生理活性，因此油菜素类固醇被认为是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后的第六大植物激素。近年来研究表明外施BRs改善棉花纤维产量和品质，Kasukabe(Y.Kasukabe,Y.Fujisawa,K.Nishiguchi,S.Maekawa,Y.Allen,R,Dale,ProductionofCottonFiberwithImprovedFiberCharacteristics,(2001)UnitedStatesPatentApplicationnumber20010018773)报道大田施用油菜素内酯（Brassinolide，BL），一种生物活性最高的BRs，可以使纤维长度提高6.1%，纤维强度提高9.5%；在棉花胚珠离体培养体系中，BL处理的Coker312纤维长度比对照增加30%-38%，BL处理的li-1突变体纤维长度比对照增加16.5%，处理胚珠的纤维重量平均增加26.1%。这些结果表明，使用BL不仅可以增加棉花纤维的长度，提高纤维的强度，而且可以增加纤维的产量。国内棉花生产上大面积推广使用BL（如棉花专用云大120）也证明了BL对棉纤维产量和品质的作用。最近的报道显示不仅施用BL可以促进纤维的生长，相反，施用BRs合成抑制剂（BZR220）可以阻止纤维细胞的发育（Y.Sun,M.Fokar,T.Asami,S.Yoshida,R.D.Allen.(2004)CharacterizationoftheBrassinosteroidinsensitive1genesofcotton,PlantMol.Biol.54:221-232；Y.Sun,S.Veerabomma,H.A.Abdel-Mageed,M.Fokar,T.Asami,S.Yoshida,andR.D.Allen.(2005)BrassinosteroidRegulatesFiberDevelopmentonCulturedCottonOvules,PlantCellPhysiology46:1384-1391；M.Luo,Y.H.Xiao,X.B.Li,X.F.Lu,W.Deng,D.M.Li,L.Hou,M.Y.Hu,Y.Li,Y.Pei.(2007)GhDET2,asteroid5α-reductase,playsanimportantroleincottonfibercellinitiationandelongation,PlantJ.51:419-430），再次证明BRs在棉花纤维起始和伸长中具有重要作用。

由于BRs在植物体内具有复杂的合成途径和较多的具有生物活性的中间产物，相关的合成酶基因和相应的产物在棉花纤维发育过程中是否有作用和作用如何还不清楚。为了探索li-1突变体纤维细胞伸长受阻的机理，我们根据拟南芥中BRs生物合成酶的蛋白质序列搜索到高同源性的棉花EST序列，进而以此序列设计用于基因表达分析的引物，利用实时定量RT-PCR技术检测了棉花中相关基因在野生型TM-1和突变体li-1的0DPA胚珠（含纤维）、6DPA胚珠（含纤维）、10DPA纤维和10DPA胚珠中的表达差异。超短纤维突变体li-1和其野生型TM-1是一对近等基因系，在两者纤维细胞的相同发育时期出现的差异表达基因很可能与纤维细胞的伸长有密切关系。而且10DPA时期是棉花纤维细胞的快速伸长期，这个时期差异表达的基因极有可能参与了纤维细胞的伸长发育。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种在长纤维（相对于突变体的超短纤维）生长的快速伸长期高表达的基因（LongFiberHighExpression1）GhLFHE1，其具有以下核苷酸序列之一：

（1）如SEQIDNO.1所示的cDNA序列；或

（2）如SEQIDNO.2所示的gDNA序列。

本发明还提供了由上述基因编码的蛋白质，其具有以下氨基酸序列之一：

（1）如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；或

（2）SEQIDNO.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO.3的氨基酸序列相同生物活性的由SEQIDNO.3衍生的氨基酸序列。

进一步地，本发明还提供了含有上述基因的表达载体；所述表达载体为植物表达载体，且至少含有增强型、组成型和或诱导型启动子。

更进一步地，本发明所述表达载体具有选自如图5、图6或图7所示的结构。

本发明还提供了含有本发明所述表达载体的宿主细胞或转化体。

本发明的又一个目的是提供一种超量或抑制GhLFHE1表达的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：

1）将GhLFHE1基因与启动子可操作地连接；

2）构建含有GhLFHE1基因与启动子的植物表达载体；

3）用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4）用所述转化体转化植物，获得转基因植物。

本发明的再一个目的是提供所述GhLFHE1基因在棉花品种改良中的应用，利用基因工程手段，应用所述GhLFHE1基因来促进棉花纤维伸长，提高棉花纤维长度，增加纤维品质和产量。

本发明的再一个目的是提供所述GhLFHE1基因在制备转基因棉花中的应用。

SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为编码棉花GhLFHE1基因的cDNA序列，SEQIDNO.2所示的核苷酸序列gGhLFHE1为gDNA（基因组DNA）序列。其中所述cDNA序列包含5'-非翻译区序列、开放阅读框（ORF）序列和3'-非翻译区序列，其中开放阅读框序列为编码序列，gDNA序列含有外显子和内含子序列。

由上述GhLFHE1基因编码的蛋白质，其具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，本领域技术人员可以理解的是，将SEQIDNO.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO.3的氨基酸残基序列相同生物活性的由SEQIDNO.3衍生的蛋白质序列也同样属于上述范围。

根据本发明的另一方面，提供的植物表达载体，其至少含编码GhLFHE1基因的核苷酸和启动子序列，所述植物表达载体通过将编码GhLFHE1基因、启动子序列与植物表达载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优选地，本发明的植物表达具有如图5所示的结构。例如，可以在所述表达载体中加入在植物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如抗庆大霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。

用于构建本发明植物表达载体的启动子可以是任意一种启动子，包括增强型、组成型、组织特异型以及诱导型启动子。构建表达载体时，所述启动子可以单独使用，还可以和其它植物启动子结合使用。用于构建本发明植物表达载体的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将GhLFHE1基因构建在CaMV35S的下游。

用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载体或者可用于基因枪转化的植物表达载体。

在本发明的一种具体实施方案中，将GhLFHE1基因正向插入植物表达载体pCambia-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhLFHE1基因的植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE1-NOS，其具有如图6所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因和各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。

在本发明的一种具体实施方案中，将GhLFHE1基因反向插入植物表达载体pCambia-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhLFHE1基因的植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhLFHE1-NOS，其具有如图7所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因和各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。

根据本发明的另一方面，提供一种转化体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明GhLFHE1基因的表达载体转染棉花而获得转化体。

附图说明

图1：GhLFHE1基因在TM-1和超短纤维突变体li-1纤维和胚珠中的表达。TM-1：陆地棉野生型；li-1：超短纤维突变体；FO-0DPA:开花当天的胚珠纤维；FO-6DPA:开花后6天的胚珠纤维；F-10DPA：开花后10天的纤维细胞；O-10DPA：开花后10天的胚珠。

图2：GhLFHE1蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较。

EOX90957：可可（Theobromacacao）细胞色素P450超家族蛋白；EEE90728：杨树(Populustrichocarpa)Rotundifolia3(ROT3)蛋白；XP00252150：蓖麻（Ricinuscommunis）细胞色素P450蛋白;ESR38835:柑橘（Citrusclementina）假拟蛋白。

图3：GhLFHE1的进化树分析。EOX90957：可可（Theobromacacao）细胞色素P450超家族蛋白；EEE90728：杨树(Populustrichocarpa)Rotundifolia3(ROT3)蛋白；XP002521504：蓖麻（Ricinuscommunis）细胞色素P450蛋白;ESR38835:柑橘（Citrusclementina）假拟蛋白；EMJ03167:桃（Prunuspersica）假拟蛋白；XP002457181：高粱（Sorghumbicolor）假拟蛋白；BAF56241：豌豆（Pisumsativum）细胞色素P450蛋白;XP003538868:大豆（Glycinemax）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶;XP002267958：葡萄（Vitisvinifera）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶；NP_568002：拟南芥（Arabidopsisthaliana）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶；XP_004232446：番茄（Solanumlycopersicum）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶。

图4：GhLFHE1基因的表达分析。其中A：GhLFHE1基因在不同组织和器官中的表达模式；B：GhLFHE1基因在纤维细胞和胚珠不同发育时期的表达水平；C：GhLFHE1基因的表达水平受BL反馈调节。6DPA-20DPA:开花后6天的纤维或胚珠至开花后20天的纤维或胚珠。Mock：模拟处理；BRZ220：BRs合成抑制剂BRZ220；BL：油菜素内酯。

图5：含GhLFHE1基因的植物表达载体的结构图，其中35S代表CaMV35S启动子；GhLFHE1代表GhLFHE1基因cDNA；term代表终止子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界。

图6：本发明优选的植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE1-NOS结构图。其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Nosterm：Nos终止子；35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体（详见实施例二）。

图7：本发明优选的反义抑制GhLFHE1基因植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhLFHE1-NOS结构图。其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Nosterm：Nos终止子；35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体（详见实施例二）。

图8：转基因棉花的鉴定。其中A：转基因棉花的组织化学鉴定，CK：非转基因棉花（野生型），作对照；OE1和OE2：超量表达GhLFHE1转基因棉花1#和2#；SE1和SE2：反义抑制GhLFHE1转基因棉花1#和2#。B:超量表达GhLFHE1转基因棉花的扩增验证，M：DNAmarker2000；CK:非转基因棉花（野生型），作阴性对照；-：以水为PCR扩增模板，作空白对照；+：以pC-GhLFHE1质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；OE1～OE5：超量表达GhLFHE1转基因棉花1#～5#。C：反义抑制GhLFHE1转基因棉花的扩增验证，M：DNAmarker2000；-：以水为PCR扩增模板，作空白对照；+：以pC-AGhLFHE1质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；SE1～SE5：反义抑制GhLFHE1转基因棉花1#～5#。

图9：转基因棉花中GhLFHE1基因的表达分析。其中A：超量表达GhLFHE1转基因棉花的表达分析，CK:非转基因棉花（野生型）;OE1～OE9:超量表达GhLFHE1转基因棉花1#～9#。B：反义抑制GhLFHE1转基因棉花的表达分析，CK:非转基因棉花（野生型）;SE1～SE4:反义抑制GhLFHE1转基因棉花1#～4#。

图10：超量表达GhLFHE1基因对棉花植株生长发育的影响。其中A：非转基因棉花（野生型）和超量表达GhLFHE1转基因棉花植株的生长状况；B：花器官发育比较；C：棉花幼苗，示侧根的发育；D：果实大小和果柄长度比较；E：种子大小比较。CK:非转基因棉花（野生型）；OE:超量表达GhLFHE1转基因棉花；标尺=1cm。

图11：超量表达GhLFHE1基因对棉花生长影响的统计数据。其中A：果柄长度；B：侧根总长；C：种子百粒重；CK：非转基因棉花（野生型）；OE:超量表达GhLFHE1转基因棉花。“*”表示与CK差异显著（P＜0.05），“**”表示与CK差异极显著（P＜0.01），用t测验计算显著性差异。

图12：反义抑制GhLFHE1对棉花生长发育的影响。其中A：非转基因棉花（野生型）和反义抑制GhLFHE1转基因棉花植株的生长状况；B：花器官发育比较，示雄蕊发育和药室不开裂；C：果实大小和种子比较；D：果节长度比较；E：花粉比较，示反义抑制GhLFHE1转基因棉花的花粉败育。CK:非转基因棉花（野生型）；SE:反义抑制GhLFHE1转基因棉花；标尺=1cm。

图13：超量表达GhLFHE1基因对棉花纤维细胞生长的影响。其中A：棉花胚珠离体培养体系中，非转基因棉花（野生型）和超量表达GhLFHE1转基因棉花纤维的生长情况；B：棉花胚珠离体培养体系中，不同发育时期纤维细胞的长度；C：棉花成熟纤维的长度比较。WT：非转基因棉花（野生型）；OE:超量表达GhLFHE1转基因棉花;5DPA、10DPA和15DPA:分别代表开花后5天、10天和15天。“**”表示与WT差异极显著（P＜0.01），用t测验计算显著性差异。

图14：反义抑制GhLFHE1基因对棉花纤维细胞生长的影响。其中A：棉花胚珠离体培养体系中，非转基因棉花（野生型）和反义抑制GhLFHE1转基因棉花纤维的生长情况；B：棉花胚珠离体培养体系中，不同发育时期纤维细胞的长度；C：棉花成熟纤维的长度比较。WT：非转基因棉花（野生型）；SE:反义抑制GhLFHE1转基因棉花;5DPA、10DPA和15DPA:分别代表开花后5天、10天和15天。“*”表示与WT差异显著（P＜0.05），“**”表示与WT差异极显著（P＜0.01），用t测验计算显著性差异。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明,但以下说明并不对本发明进行限定,任何对本发明的变形和改变,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售,材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为冀棉14（Gossypiumhirsutumcv.Jimian14），TM-1（Gossypiumhirsutumcv.TM-1）及其超短纤维突变体（ligonlintless-1,li-1）。

【实施例1】GhLFHE1基因差异表达分析和基因序列的克隆

1、棉花RNA的提取

选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15ml65℃预热的RNA提取液(2%CTAB（W/V），2%PVP（W/V），100mmol/LTris-HCl（pH8.0），0.5g/LSpermidine，2.0mol/LNaCl，2%巯基乙醇（V/V），使用前加入）)，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿:异戊醇（24:1）抽提2次（10,000r/min，室温，5min）。取上清，加入1/4体积10mol/LLiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿:异戊醇（25:24:1）各抽提1次（10,000r/min，室温，5min）。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）、氯仿:异戊醇（24:1）各抽提1次（10,000r/min，室温，5min）。加1/10体积3mol/LNaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

2、cDNA合成

提取棉花各种样品总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA一链。具体方法为：取约10μg总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL2.5μmol/LOligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL5×reactionbuffer，2μL10mmol/LdNTPs，1μLRNaseinhibitor(20U)，37℃处理5min。加入1μLAMVRtase（5U）后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，一链产物于-20℃冻存。

3、筛选高同源棉花EST序列

以拟南芥BRs合成酶的蛋白质序列搜索NCBI数据库中的棉花EST序列，根据对应的EST序列设计表达引物，检测TM-1及其超短纤维突变体纤维发育相同时期的表达差异。结果表明：筛选到的EST序列中，与拟南芥BRs合成酶基因CYP90C1/ROTUNDIFOLIA3(ROT3)高度同源的EST序列在GenBank中的编号为DT573461。

4、利用实时定量RT-PCR进行差异表达分析

以合成的cDNA一链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒（Bio-Rad）进行PCR。表达引物依据EST序列（DT573461）设计，5’端引物为GhLFHE1-1（SEQIDNO.4），3’端引物为GhLFHE1-2（SEQIDNO.5）。在20μL的反应体系中包括10μLMIX缓冲液（包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂），5'-端和3'-端表达引物各1μL（5μmol/L）。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，30sec，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因（GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1（SEQIDNO.8），3'-引物为GhHIS-2（SEQIDNO.9）。利用实时定量RT-PCR检测了TM-1和li-1突变体开花当天的胚珠纤维（FO-0DPA）、开花后6天的胚珠纤维（FO-6DPA）、开花后10天的纤维细胞（F-10DPA）和开花后10天的胚珠（O-10DPA）中GhLFHE1基因的表达差异。结果表明该基因的表达水平在6DPA胚珠纤维和10DPA纤维中出现显著差异，而在0DPA胚珠纤维和10DPA胚珠中表达水平相似（图1）。由此推测GhLFHE1基因在6DPA胚珠纤维中的表达差异主要也来源于6DPA纤维细胞中的差异表达。这结果说明GhLFHE1基因在长纤维中的表达水平远远高于相同发育时期超短纤维中的表达水平，因此将该基因命名为长纤维高表达基因（LongFiberHighExpression1，GhLFHE1）。该基因在纤维细胞伸长中具有重要作用。

5、GhLFHE1基因cDNA序列和基因组序列的扩增

根据筛选到的高同源性EST序列（DT573461）进行染色体步行获得GhLFHE1的cDNA5'和3'端序列，设计5'端引物GhLFHE1-3（SEQIDNO.6）和3'端引物GhLFHE1-4（SEQIDNO.7），以12DPA纤维cDNA为模板进行PCR。25μL的cDNA扩增体系含2.5μL10×ExPCRbuffer（Mg²⁺free），2μL2.5mmol/LdNTPs，2μL25mmol/LMgCl₂，1μL特异引物GhLFHE1-3（SEQIDNO.6）（5μmol/L），1μLGhLFHE1-4（SEQIDNO.7）（5μmol/L），0.2μLExTaqDNA聚合酶，1μLcDNA一链产物。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，30个循环；72℃延伸10min。

同时以棉花基因组DNA为模板和相同的引物进行扩增，20μL的基因组DNA扩增体系含10μL2×PrimerStarmix，1μL特异引物GhLFHE1-3（SEQIDNO.6）（5μmol/L），1μLGhLFHE1-4（SEQIDNO.7）（5μmol/L），1μLgDNA和7μL水。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，20sec，30个循环；72℃延伸10min。

6、扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

（1）电泳

将扩增产物在1.0%（W/V）琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

（2）回收

使用回收试剂盒：回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

（3）克隆和测序

回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pGEm-T（上海Sangon）载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pGEm-T(上海生工)载体建立如下连接体系:

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

7、棉花基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法提取棉花基因组DNA。取0.5g棉花幼叶，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL65℃预热的CTAB提取液，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL5mol/LKAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（12,000r/min，4℃离心5min），取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min，挑出絮状沉淀，75%的乙醇反复漂洗3次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重溶于500μLTE中。加入1μLRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。再用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（12,000r/min，4℃离心5min），取上清，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。-20℃放置约30min，离心（12,000r/min，4℃离心5min），弃上清，沉淀用75%的乙醇漂洗，风干，溶于200μLTE中，-20℃保存备用。

8、GhLFHE1基因序列分析

以陆地棉冀棉1412DPA纤维cDNA为模板，扩增出一条大约1700bp的特异带。测序后发现该扩增特异片段长1725bp（SEQIDNO.1），包含一个完整的开放阅读框（ORF）（图2），长1545bp。编码一个514个氨基酸残基的蛋白质（SEQIDNO.3），该蛋白质预测的分子量为58.4kD，等电点为7.9。

在NCBI上搜索GhLFHE1的同源蛋白，发现GhLFHE1属于细胞色素P450家族的CYP90C亚家族。该蛋白与可可（Theobromacacao）细胞色素P450超家族蛋白（EOX90957）、杨树(Populustrichocarpa)Rotundifolia3(ROT3)蛋白（EEE90728）、葡萄（Vitisvinifera）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶（XP_002267958）、拟南芥（Arabidopsis）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶（NP_568002）和番茄（Solanumlycopersicum）3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶（XP_0042322446）等蛋白具有较高的同源性。GhLFHE1与这些蛋白的相同氨基酸残基分别达到81%、62%、69%、70%和65%，相似氨基酸残基分别达到88%、80%、80%、83%和79%。而且GhLFHE1具有其它同源蛋白所具有的保守结构域如锚定区域、与血红素结合的结构域和与甾醇结合的结构域(图2)。这些结果说明GhLFHE1基因是棉花中BRs合成酶3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶基因的同源基因。

系统进化分析结果表明GhLFHE1与可可、柑橘、杨树和蓖麻的3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶具有较近的亲缘关系，而与豌豆和高粱等物种的CYP90C亚家族蛋白的亲缘关系较远（图3）。

同时从陆地棉中克隆了GhLFHE1的基因组DNA序列，该序列长6929bp（SEQIDNO.3），通过与GhLFHE1基因的cDNA序列进行比对和根据GT-AG内含子识别规律分析，结果发现，GhLFHE1基因组序列含有9个外显子和8个内含子。

【实施例2】GhLFHE1基因在棉花植株和纤维发育中的表达分析

提取陆地棉(GossypiumhirsutumL.)各组织和器官的总RNA，并合成cDNA一链。用实时定量RT-PCR检测了GhLFHE1基因在不同组织和器官中的表达情况。检测结果表明，GhLFHE1在棉花的子叶和幼嫩叶片中表达水平相对较高，在其它组织器官的表达水平相对较低（图4A）。

进一步检测GhLFHE1在棉花胚珠纤维不同发育时期的表达情况。结果表明，在纤维发育的快速伸长期GhLFHE1的表达水平不高，纤维在进入次生壁合成期后GhLFHE1的表达水平快速增加。从6DPA到18DPA纤维中GhLFHE1的表达水平逐渐升高，在18DPA纤维中GhLFHE1的表达水平达到峰值，20DPA纤维中表达水平有所降低，但仍维持着较高的表达水平（图4B）。这一表达模式说明GhLFHE1在纤维细胞发育中具有重要作用。

在胚珠中，GhLFHE1从6DPA开始表达水平逐渐升高，在10DPA时表达水平提高明显，12DPA时达到表达高峰，此后GhLFHE1的表达水平降低，到18DPA时GhLFHE1的表达水平又突然升高近3倍(图4B)。这一结果显示GhLFHE1参与了调控棉花胚珠发育的过程。

同时，GhLFHE1基因的表达受油菜素内酯（BL）调控。对棉花幼苗外施油菜素内酯合成抑制剂BRz220使GhLFHE1的表达水平提高，相反，对棉花幼苗外施BL使GhLFHE1的表达水平降低（图4C）。这结果表明GhLFHE1的表达受到BL的反馈抑制。

【实施例3】超量表达和反义抑制GhLFHE1基因植物表达载体的构建以及棉花的遗传转化

1、超量和反义表达载体的构建

pGEm-GhLFHE1载体是在克隆GhLFHE1基因时构建，其上的GhLFHE1片段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体，该载体的HPTII基因用XhoI单酶切后替换为NPTII基因（设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计两端带XhoI位点），限制性酶切和测序结果验证了NPTII基因的方向。在pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位点，形成CaMV35S：：MCS：：NOS单元。该植物表达载体含有1套2×CaMV35S启动子控制NPTII基因的植物表达元件、1套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点（Multiplecloningsite，MCS）插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

为了在转基因植物中超量表达GhLFHE1基因，需要将GhLFHE1基因正向插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此根据pGEm-GhLFHE1载体上的酶切位点和GhLFHE1的插入方向以及改造的pCambia植物表达载体上的多克隆位点和CaMV35S启动子的方向，构建了超量表达GhLFHE1基因植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE1-NOS（简称pC-GhLFHE1）（图6）和反义抑制GhLFHE1基因的植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhLFHE1-NOS（简称pC-AGhLFHE1）（图7）。

2.棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。

参考Bio-RADMicroPulser用户说明书,将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：

冀棉14种子剥去外壳，用0.1%的升汞（HgCl₂）灭菌10min，用大量无菌水冲洗8次。在125ml三角瓶中加入约35ml无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2-3d，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。

转化用的含pCambia-35S-GhLFHE1-NOS和pCambia-35S-antisenseGhLFHE1-NOS植物表达载体的农杆菌菌株在含50mg/LKm和125mg/LSm的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1：20的比例转接到25ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6-0.8，10,000r/min、1min离心收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。

转化时，将棉花下胚轴切成1.5-2.0cm的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120r/min侵染30min。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2-3天。

共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120r/min摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0mL枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20-30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1-2cm时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3-5cm高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。

表1:根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962

B5:Gamborg,1986

【实施例4】转基因棉花的验证

1、组织化学鉴定

由于构建的植物表达载体中具有一套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件，因此可以利用组织化学法鉴定是否是转化植株。待转化植株在生根培养基上生根并长到5-8cm时，将幼苗从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2～3d。同时，取一小块叶片和一小段根进行GUS染色。结果如图8A所示，野生型叶片GUS染色为阴性，抗性植株叶片GUS染色为阳性，阳性植株直接移栽到营养钵中。

2、扩增验证

待棉花植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取棉花基因组DNA，以GUS基因的上下游引物GUS-up（5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCG-3'）和GUS-down（5'-GGGGACTCTAGAGGATCCC-3'）进行扩增。25μL的扩增体系含2.5μL10×PCRbuffer，2μL2.5mmol/LdNTPs，1.5μL25mmol/LMgCl2，各1μL引物GUS-1和GUS-2（5μmol/L），1UTaqDNA聚合酶，1μL基因组DNA（50ng）。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，35个循环；72℃延伸10min。用正反植物表达载体质粒作阳性对照，以水和野生型棉花基因组DNA作阴性对照。结果显示GUS染色阳性的转基因棉花植株都能扩增出一条与阳性对照一致的带，说明植物表达载体的T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中(图8B和8C)。

【实施例5】检测GhLFHE1基因在转基因棉花中的表达变化

按照实施例一中提取棉花RNA的方法，提取转基因棉花和野生型棉花叶片的总RNA，并合成cDNA一链。用Real-TimePCR方法分析转基因棉花中目的基因的表达，PCR在实时定量PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μLMIXbuffer（包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2，实时定量RT-PCR试剂盒提供，Bio-Rad）。GhLFHE1基因用引物GhLFHE1-1（SEQIDNO.4）和GhLFHE1-2（SEQIDNO.5）扩增，内标采用棉花GhHISTONE3（GenBank登录号：AF024716)，引物为GhHIS-1（SEQIDNO.8）和GhHIS-2（SEQIDNO.9）。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；预设循环数为35。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。实时定量RT-PCR分析的结果表明GhLFHE1基因在大部分pC-GhLFHE1转基因棉花中的表达水平比对照高，相反在所有pC-AGhLFHE1转基因棉花中的表达水平比对照低（图9）。这结果说明已获得超量表达和反义抑制GhLFHE1的转基因棉花植株。

【实施例6】转基因棉花与野生型棉花的表型比较

1、超量表达GhLFHE1促进棉花植株的生长

在试验田中同时栽种pC-GhLFHE1转基因和野生型棉花，进行正常的生产管理。对T0和T1代GhLFHE1表达水平增加的棉花进行观察，发现pC-GhLFHE1转基因棉花生长速度比对照快，株型松散（图10A），花较大（图10B），果柄增长和棉铃变大（图10D），种子变大（图10E），同时促进了棉花幼苗侧根的发育(图10C)。统计数据表明，超量表达GhLFHE1的植株果柄长度增加了149.2%（图11A），侧根总长增加了51.1%（图11B），种子重量增加了19.5%（图11C）。表型变化的数据分析表明超量表达GhLFHE1基因能够促进棉花植株的生长。

2、下调GhLFHE1的表达抑制棉花植株的生长和育性

当GhLFHE1的表达受到抑制后，pC-AGhLFHE1转基因棉花表现出植株变矮、叶片变小、节间变短、侧枝变短和棉铃变小等表型（图12A）。同时，在GhLFHE1受到抑制的转基因棉花中，开花当天的花粉粒没有散出（图12B），散出的花粉粒经碘-碘化钾染色表现为畸形，且成黄褐色（图12E），表明花粉粒发育不良,花粉育性下降。此外，用野生型花粉粒对pC-AGhLFHE1转基因棉花进行授粉，花蕾同样在开花后4到5天掉落，仅有的几个没有掉落的棉铃也表现出棉铃不饱满、种子败育的表型（图E）。这些结果表明pC-AGhLFHE1转基因棉花不育的表型可能是由雄性不育和雌性不育共同引起的。pC-AGhLFHE1转基因棉花的表型分析表明抑制GhLFHE1的表达抑制棉花植株的生长和育性。

【实施例7】超量表达GhLFHE1基因促进棉花纤维伸长

将T1代转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观察棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。当棉花纤维成熟后，用梳子梳理同时期同部位的棉花纤维，然后再用直尺测量纤维的长度（图13）。结果显示，Pc-GhLFHE1纤维的平均长度达到了34.45±1.31mm，而对照的纤维的平均长度为29.90±1.55mm，纤维长度增加了15.03%。在农业部棉花品质监督检验测试中心纤维检测的结果显示（表2），超量表达GhLFHE1转基因棉花成熟纤维上半部的平均长度比对照增加11.2%，达到33.03mm。纤维强度比对照增加9.1%，达到32.5cN/tex。

为了进一步了解GhLFHE1基因表达水平变化对棉花纤维细胞伸长的影响，

这些结果说明：增加GhLFHE1基因的表达水平促进了棉花纤维的伸长和纤维强度的提高，该基因在棉花纤维细胞发育中具有重要作用，特别是对纤维细胞的伸长和纤维细胞的后期发育有重要影响，是利用基因工程改良纤维品质的有效基因。

表2.转基因棉花T1代纤维检测结果

【实施例8】抑制GhLFHE1基因表达阻碍棉花纤维伸长

为了进一步确定GhLFHE1基因在棉花纤维发育中的作用，将反义抑制GhLFHE1的T1代转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观测棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。结果显示，Pc-AGhLFHE1纤维的平均长度为27.41±0.9mm，而对照的纤维的平均长度为29.90±1.55mm，纤维长度降低了8.32%（图14C）。同时，通过胚珠离体培养动态检测转基因棉花纤维和对照纤维的长度。检测结果表明（图14A），抑制GhLFHE1表达的转基因棉花胚珠经离体培养后长出的纤维在不同时段都比野生型短，在10天和15天的时候分别表现为显著性和极显著性差异(图14B)。这结果进一步说明GhLFHE1基因在纤维细胞伸长过程中具有重要作用，其表达水平与纤维长度有密切关系。

Claims (9)

1.分离的棉花长纤维高表达基因GhLFHE1，其核苷酸序列为以下之一：

(1)如SEQIDNO.1所示的cDNA序列；或

(2)如SEQIDNO.2所示的gDNA序列。

2.由权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

3.含有权利要求1所述基因的表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体，且含有增强型、组成型和/或诱导型启动子。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的结构选自如下图所示结构之一：

6.含有如权利要求3所述表达载体的转化体。

7.一种超量或抑制GhLFHE1表达的转基因植物的制备方法，所述GhLFHE1为权利要求1所述的棉花长纤维高表达基因，包括以下步骤：

1)将GhLFHE1基因与启动子可操作地连接；

2)构建含有GhLFHE1基因与启动子的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得超量或抑制GhLFHE1表达的转基因植物。

8.如权利要求1所述基因在棉花品种改良中的应用。

9.如权利要求1所述基因在制备转基因棉花中的应用。