CN109022454A

CN109022454A - 一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用

Info

Publication number: CN109022454A
Application number: CN201811058134.3A
Authority: CN
Inventors: 罗明; 牛琪; 徐梦贝; 李芳�; 锁晓栋; 肖月华; 裴炎
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-09-11
Also published as: WO2020052199A1; CN109022454B

Abstract

本发明提供了一种GhLFHE2基因及其编码的蛋白质和应用，属于植物基因工程技术领域。所述GhLFHE2的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化宿主，进一步转化棉花，获得转基因棉花。实验证明：本发明提供的棉花长纤维高表达基因GhLFHE2具有促进棉花纤维伸长的作用，能用于提高纤维品质和棉花产量。

Description

一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

棉花是世界上主要的纤维作物之一。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期：纤维细胞起始期、纤维细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。每个时期都有各自的特点，但相邻发育时期又有所重叠。纤维发育的每个时期对纤维的产量和/或品质都有影响，纤维的分化起始决定了单粒胚珠中纤维的数量，纤维细胞伸长速率和持续时间主要决定了纤维的长度，同时也影响纤维产量。次生壁沉积的方式和持续时间主要决定了成熟纤维的强度和次生壁厚度。纤维伸长期是(初生壁合成期)从开花当天开始，可以持续到开花后25天(25DPA)，主要进行细胞极性伸长和初生细胞壁的合成，这时期的纤维伸长速率和持续时间决定纤维的最终长度，陆地棉纤维长径比可达1000～3000。但迄今为止，我们对调控纤维伸长的有效基因仍知之甚少。

棉花ligon lintless-1(li-1)突变体是棉花栽培种TM-1的一个自然突变体，该突变体具有极短的纤维，而纤维细胞的分化和起始与野生型没有明显差异，因此li-1突变体是研究纤维细胞伸长的良好材料。利用2-DE和本地化EST数据库支持的MS/MS技术，zhao等人在li-1和TM-1的12DPA纤维细胞中发现81个差异表达的蛋白质，而在6DPA纤维中没有发现明显的差异表达蛋白(Zhao PM,Wang LL,Han LB,Wang J,Yao Y,Wang HY,Du XM,LuoYM,Xia GX(2010)Proteomic identification of differentially expressed proteinsin the Ligon lintless mutant of upland cotton(Gossypium hirsutum L.).J.Proteome Res 9:1076-1087)。但是2-DE技术难以检测低丰度蛋白质，因此可能漏检对纤维伸长有重要调控作用的蛋白。Liu等人通过转录组分析证实，有577个转录本在6DPA的li-1和TM-1纤维中差异表达，而在0DPA胚珠和3DPA纤维中仅有少许基因的差异表达(LiuK,Sun J,Yao LY,Yuan YL(2012)Transcriptome analysis reveals critical genes andkey pathways for early cotton fiber elongation in Ligon lintless-1mutant.Genomics 100:42-50)。这些结果说明突变体的纤维变短的确与纤维伸长期相关基因的表达变化有密切关系。

鞘脂(sphingolipids)是含有长链鞘样碱基骨架的一类结构复杂的脂类分子，它广泛存在于真核生物中。动物、植物和真菌细胞中约有300～400个不同种类的鞘脂分子(Hannun and Luberto,2000)。鞘脂不仅是生物膜结构的重要成分，也是重要的生物活性分子。鞘脂是生物膜上脂筏的主要组成成分，而脂筏是生物膜的重要部位和性质调控中心。不同种类的鞘脂存在于不同组织中，甚至是同一组织的不同细胞类型中。哺乳动物中主要是鞘磷脂以及中性和酸性的糖脂(Lester andDickson,1993)，真菌和植物组织中主要是葡萄糖神经酰胺(Sakaki etal.,2001；Lynch and Dunn,2004)。

鞘脂在动物和真菌中的功能较为清楚，但鞘脂在植物生长发育中的功能还远未清楚，仅认为植物鞘脂在细胞信号、膜稳定性、生物和非生物胁迫响应和细胞程序性凋亡中具有重要作用。研究报道：鞘氨醇-1-磷酸参与拟南芥保卫细胞中干旱诱导的信号转导，且与脱落酸引起的细胞膨胀的还原有关；鞘氨醇-1-磷酸可以调节拟南芥保卫细胞膨压，促使Ca²⁺介导的保卫细胞关闭，同时抑制质膜内部K⁺通道和慢性阴离子通道的活动(Tonnet tiet al.,1999；Ng and Hetherington,2001a；Sylvie et al.,2005)。低浓度的鞘氨醇刺激细胞生长，高浓度的鞘氨醇则对细胞有毒害作用(Lynch and Dunn,2004)。鞘脂分子通过增强植物质膜和液泡膜的稳定性来促进植物对各种逆境(干旱、重金属、低温)的忍耐或适应(Dunn et al.,2004)。在干旱胁迫时，鸭跖草(Commelina communis)表皮细胞内鞘氨醇-1-磷酸浓度增加，从而增强Ca²⁺的流动性，改变保卫细胞膨压，进而促使保卫细胞关闭，以缓解干旱逆境对植物的伤害(Ng et al.,2001b)。这些研究初步揭示了鞘脂在植物生长发育中具有重要作用，但是鞘脂是否能促进植物细胞伸长还没有任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能促进棉花纤维伸长的棉花长纤维高表达基因GhLFHE2(Long Fiber High Expression 2)及其编码的蛋白和应用。

本发明提供了一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2，所述GhLFHE2的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述GhLFHE2的gDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2和启动子，所述启动子包括增强型、组成型、组织特异性和诱导型中的任意一种或多种。

优选的，所述表达载体的T-DNA区段内有三套表达元件，第一套由启动子控制GhLFHE2基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制筛选基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制报告基因正向序列，终止子为NOS终止子。

更优选的，所述表达载体的T-DNA区段内有3套表达元件，第一套由组成型启动子35S控制GhLFHE2基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制NPTII基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制GUS基因正向序列，终止子为NOS终止子。

本发明提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。

本发明提供了上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2、蛋白质、表达载体或转化体在提高棉花纤维质品质和/或增加棉花纤维产量中的应用。

本发明提供了一种含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE2的转基因棉花的制备方法，包含如下步骤：

1)将棉花长纤维高表达基因GhLFHE2与启动子连接，导入植物表达载体，构建得到重组载体；

2)用所述重组载体转化宿主，获得转化体；

3)用所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

有益效果：本发明提供了一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2，所述GhLFHE2的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化宿主，进一步转化棉花，获得转基因棉花。实验证明：本发明提供的棉花长纤维高表达基因GhLFHE2具有促进棉花纤维伸长的作用，能用于提高纤维品质和棉花产量。

附图说明

图1为GhLFHE2基因在TM-1和超短纤维突变体li-1纤维和胚珠中的表达情况；其中，TM-1代表陆地棉野生型；li-1代表超短纤维突变体；FO-0DPA代表开花当天的胚珠纤维；FO-4DPA代表开花后4天的胚珠纤维；F-10DPA代表开花后10天的纤维细胞；O-10DPA代表开花后10天的胚珠；

图2为GhLFHE2蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较结果；其中，AF364401代表线虫(Caenorhabditis elegans)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AF364402代表稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AF364403代表毕赤酵母(Pichiapastoris)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AF367245代表中棉(Gossypium arboreum)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AtGCS代表拟南芥(Arabidopsis thaliana)神经酰胺葡萄糖基转移酶(At2G19880)；

图3为GhLFHE2的系统进化分析图谱；其中，AF364401(CeGCS)代表线虫(Caenorhabditis elegans)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AF364402(MgGCS)代表稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AF364403(PpGCS)代表毕赤酵母(Pichiapastoris)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AF367245(GaGCS)代表中棉(Gossypiumarboreum)神经酰胺葡萄糖基转移酶；AtGCS(At2G19880)代表拟南芥(Arabidopsisthaliana)神经酰胺葡萄糖基转移酶；

图4为GhLFHE2基因的表达分析结果；其中，图4-A为GhLFHE2基因在棉花不同组织和器官中的表达水平；图4-B为GhLFHE2基因在纤维细胞和胚珠不同发育时期的表达水平；Root代表根；Stem代表茎；Leaf代表叶；Flower代表花；FO-0DPA和FO-2DPA分别指开花当天和开花后2天的胚珠纤维；F-6DPA～F-16DPA:分别指开花后6天至16天的纤维细胞；O-6DPA～O-18DPA分别指开花后6天至18天的胚珠；

图5为含GhLFHE2基因的植物表达载体的结构图；其中35S代表CaMV35S启动子；GhLFHE2代表GhLFHE2基因cDNA；term代表终止子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；

图6为植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE2-NOS结构图；其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；term代表Nos终止子；CaMV 35S代表来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；植物表达载体为实施例3所述改造的pCambia载体；

图7为反义抑制GhLFHE2基因植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhLFHE2-NOS结构图；其中GRP-GusPlus-His6代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；term代表Nos终止子；CaMV 35S代表来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；植物表达载体为实施例3所述改造的pCambia载体；

图8为转基因棉花的鉴定结果；其中，图8-A为转基因棉花的组织化学鉴定结果，WT代表非转基因棉花(野生型)，作对照；OE-7和OE-22分别代表超量表达GhLFHE2转基因棉花7#和22#；SE-1和SE-2分别代表抑制GhLFHE2表达的转基因棉花1#和2#；图8-B为超量表达GhLFHE2转基因棉花的扩增验证结果，M组为DNA marker 2000；P组以pC-GhLFHE2质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；N组为非转基因棉花(野生型)，作阴性对照；W组以水为PCR扩增模板，作空白对照；1～4分别代表超量表达GhLFHE2的转基因棉花；图8-C为反义抑制GhLFHE2转基因棉花的扩增验证结果，M组为DNA marker 2000；P组以pC-反义GhLFHE2质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；N组为非转基因棉花(野生型)，作阴性对照；W组以水为PCR扩增模板，作空白对照；5～8分别代表反义抑制GhLFHE2表达的转基因棉花；

图9为转基因棉花中GhLFHE2基因的表达分析结果；其中，Control代表非转基因棉花(野生型)；OE7和OE22分别代表超量表达GhLFHE2转基因棉花7#和22#。SE1和SE2分别代表反义抑制GhLFHE2转基因棉花1#和2#；

图10为超量表达GhLFHE2基因促进棉花纤维伸长的结果；其中，OE-7和OE-22分别代表超量表达GhLFHE2转基因棉花7#和22#；

图11为超量表达GhLFHE2转基因棉花的纤维长度统计结果；其中，Control代表非转基因棉花(野生型)；OE-7和OE-22分别代表超量表达GhLFHE2转基因棉花7#和22#；“**”表示与WT组差异极显著(P＜0.01)，用t测验计算显著性差异；

图12为反义抑制GhLFHE2基因抑制棉花纤维伸长结果；其中，SE1和SE2分别代表反义抑制GhLFHE2转基因棉花1#和2#；

图13为反义抑制GhLFHE2转基因棉花的纤维长度统计结果；其中，SE1和SE2分别代表反义抑制GhLFHE2转基因棉花1#和2#；“**”表示与WT组差异极显著(P＜0.01)，用t测验计算显著性差异。

具体实施方式

本发明提供了一种能促进棉花纤维伸长的棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用。

在本发明中，所述GhLFHE2基因与拟南芥葡萄糖神经酰胺合成酶具有较高的同源性，不仅在纤维细胞快速伸长期优势表达，而且在超短纤维突变体li-1的短纤维细胞中表达降低。在本发明中，所述GhLFHE2基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，长度1688bp。所述GhLFHE2的gDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，长度5251bp。在本发明中，所述GhLFHE2基因具有促进棉花纤维伸长的作用，能用于提高纤维品质和棉花产量。

本发明提供了上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。所述GhLFHE2编码的蛋白质在棉花长纤维细胞的快速伸长期表达增多，具有促进棉花纤维细胞伸长的作用。

本发明还提供了上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。以SEQID No.1所示核苷酸序列的cDNA链为模板，利用本发明提供的引物对能实现对模板的PCR扩增表达。在本发明中，所述PCR扩增优选采用20μL的反应体系，所述反应体系优选包括10μL的MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)，10DPA纤维细胞的cDNA 1μL和双蒸水7μL。所述PCR的扩增程序优选为：94℃预变性3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，预设循环数为30。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2和启动子。在本发明中，所述启动子优选包括增强型、组成型、组织特异性和诱导型中的一种或多种。在本发明中，所述表达载体优选具有如图5所示的结构：T-DNA区段内有三套表达元件，第一套由启动子控制GhLFHE2基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制筛选基因正向序列，终止子为NOS终止子，为转基因植物细胞提供可供筛选的抗性；第三套由组成型启动子35S控制报告基因正向序列，终止子为NOS终止子，为转基因植物材料提供相对更方便的检测方法。进一步优选的，所述表达载体具有如图6所示的结构：T-DNA区段内有3套表达元件，第一套由组成型启动子35S控制GhLFHE2基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制NPTII基因正向序列，终止子为NOS终止子，为转基因植物细胞提供卡拉霉素抗性；第三套由组成型启动子35S控制GUS基因正向序列，终止子为NOS终止子。

在本发明的实施例中，所述表达载体通过如下步骤构建得到：

①从10DPA纤维细胞cDNA中扩增获得GhLFHE2基因的cDNA序列；

②对所述cDNA序列进行测序，确定该序列长度为1688bp，包含一个长1563bp的开放阅读框，明确该序列在克隆载体pEASY-GhLFHE2上的方向；

③用DNA限制性内切酶酶切pEASY-GhLFHE2载体，回收外源片段，同时酶切改造的pCambia植物表达载体，回收载体片段，将回收的外源片段和载体片段连接，分别构建成超量表达GhLFHE2基因和反义抑制GhLFHE2基因的植物表达载体pC-GhLFHE2和pC-AGhLFHE2。

本发明提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。在本发明中，所述宿主优选为大肠杆菌或农杆菌。本发明对所述转化体的制备方法不作特别限定，本领域常规操作即可。

本发明还提供了上述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2、蛋白质、表达载体或转化体在提高棉花纤维质品质和/或增加棉花纤维产量中的应用。在本发明中，所述应用优选包括将所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2导入植物体进行表达。

2)用所述重组载体转化宿主，获得转化体；

3)用所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

本发明对所述步骤(1)中连接、构建的方法不作特别限定，按照本发明所公开的启动子类型和基因连接顺序，依据本领域常规技术手段将各结构连接到一起即可。本发明对所述步骤(2)或步骤(3)中转化的具体操作不做特别限定，本领域常规用于转化宿主或植物体的操作步骤均可。

下面结合实施例对本发明提供的一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用进行详细的说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的构思，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为冀棉14(Gossypium hirsutumcv.Jimian14)，TM-1(Gossypium hirsutum cv.TM-1)及其超短纤维突变体(ligonlintless-1,li-1)。li-1突变体种子播种后，将其野生型(TM-1)分离出(由于li-1突变体的突变基因纯合致死，因此每次能收获的突变体种子都是杂合型，部分种子所含胚是野生型，li-1突变体种子播种后，一部分长成野生型棉花(TM-1)，一部分为li-1突变体)。

实施例1

GhLFHE2基因差异表达分析和基因序列的克隆

(1)棉花RNA的提取

棉花各种样品总RNA提取使用“EASYspin植物RNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司)，取新鲜样品材料100mg，在液氮中研磨后转入1.5mL离心管中，加入1mLRLT和100μL PLANTaid，剧烈摇晃振荡15s，13000rmp离心10min；取上清，加入1/2体积的无水乙醇，混匀后转入到吸附柱RA中，13000rpm离心2min，弃流出液；在吸附柱RA中加入700μL去蛋白液RW1，室温放置1min，13000rpm离心30s，弃流出液；加入500μL漂洗液RW(用前按要求加入无水乙醇)，13000rpm离心30s，弃流出液，然后重复1遍；将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，除尽漂洗液；取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶离心管中，加入50μL无RNA酶水，室温放置1min，12000rpm离心1min。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

(2)cDNA合成

提取棉花各种样品总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成cDNA一链。具体方法为：取约10μg总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL 2.5μmol/L Oligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL 5×reaction buffer，2μL 10mmol/L dNTPs，1μL RNase inhibitor(20U)，37℃处理5min。加入1μL AMV Rtase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，一链产物于-20℃冻存。

(3)筛选陆地棉中同源性较高的基因序列

以拟南芥鞘脂合成酶的蛋白质序列搜索陆地棉基因组数据库(https://cottonfgd.org/)。检测到4个与拟南芥葡萄糖神经酰胺合成酶具有一定同源性的基因，其中一个基因编号为Gh_A06G0583。根据该基因序列设计表达引物，检测TM-1及其超短纤维突变体纤维发育相同时期的表达差异。

(4)利用实时定量RT-PCR进行差异表达分析

以合成的cDNA一链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR。表达引物依据GhLFHE2的cDNA序列设计，5’端引物为GhLFHE2-e1(SEQ ID NO.6)，3’端引物为GhLFHE2-e2(SEQ ID NO.7)。在20μL的反应体系中包括10μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)，cDNA 1μL，双蒸水7μL。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因(GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1(SEQ ID NO.9)，3'-引物为GhHIS-2(SEQ ID NO.10)。利用实时定量RT-PCR检测了TM-1和li-1突变体开花当天的胚珠纤维(FO-0DPA)、开花后4天的胚珠纤维(FO-4DPA)、开花后10天的纤维细胞(F-10DPA)和开花后10天的胚珠(O-10DPA)中GhLFHE2基因的表达差异。

结果表明该基因的表达水平在4DPA胚珠纤维和10DPA纤维中出现显著差异，而在0DPA胚珠纤维和10DPA胚珠中表达水平相似(图1)。由此推测GhLFHE2基因在4DPA胚珠纤维中的表达差异主要也来源于4DPA纤维细胞中的差异表达。这结果说明GhLFHE2基因在长纤维细胞中的表达水平远远高于相同发育时期超短纤维细胞中的表达水平，因此将该基因命名为长纤维高表达基因(Long Fiber High Expression 2，GhLFHE2)。该基因在纤维细胞伸长中具有重要作用。

(5)扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

a.电泳：将扩增产物在1.0％(W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

b.回收：使用回收试剂盒：回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

c.克隆和测序：回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pEASY-Blunt(北京全式金)载体上。序列测定由英骏公司完成。

回收的片段与pEASY-Blunt(北京全式金)载体建立如下连接体系:

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

(6)棉花基因组DNA的提取

棉花基因组DNA提取使用“新型植物基因组DNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司)。具体方法是取棉花嫩叶材料100mg，在液氮中研磨后转入1.5mL离心管中，加入400μL缓冲液和4μL RNase A(10mg/mL)；涡旋混匀，65℃水浴10min，其中颠倒混匀2～3次；加入130μL缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5min，14000rpm离心10min，取上清；加入1.5倍体积的AP3/E(按试剂盒说明书：在使用前加入50mL无水乙醇)，立即混匀；混匀后加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心1min，弃流出液；加入600μL漂洗液WB(按试剂盒说明书：在使用前加入100mL无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃流出液；将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min除尽漂洗液；取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，加入100μL洗脱缓冲液EB(65～70℃预热)，室温放置3～5min，12000rpm离心1min，-20℃保存备用。

(7)GhLFHE2基因序列分析

以陆地棉基因组数据库(https://cottonfgd.org/)中Gh_A06G0583的cDNA序列作为参考序列，在其推测ORF两侧设计扩增引物，其中5'引物为GhLFHE2-1(SEQ ID NO.4)，3'引物为GhLFHE2-2(SEQ ID NO.5)。运用这对引物，以陆地棉冀14的12DPA纤维cDNA为模板，扩增出一条大约1700bp的特异带。测序后发现该扩增特异片段长1688bp(SEQ ID NO.1)，包含一个完整的ORF(图2)，长1563bp。编码一个520个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO.3)，该蛋白质预测的分子量为58.6kD，等电点为8.0。

在NCBI上搜索GhLFHE2的同源蛋白，该蛋白与中棉中已经鉴定葡萄糖神经酰胺合成酶(AF367245)具有较高的同源性，氨基酸序列的相似性达97.7％。与拟南芥中葡萄糖神经酰胺合成酶(At2G19880)也具有较高的同源性，氨基酸序列的相似性达80.2％。与真菌和线虫中的葡萄糖神经酰胺合成酶(AF364403、AF364402和AF364401)的同源性较低，氨基酸序列的相似性分别是14.3％、13.4％和18.4％。这些结果说明GhLFHE2基因是棉花中葡萄糖神经酰胺合成酶基因的同源基因。

系统进化分析结果表明GhLFHE2与拟南芥和中棉等植物的葡萄糖神经酰胺合成酶具有较近的亲缘关系，而与酵母、稻瘟病菌和线虫等真菌和低等动物的葡萄糖神经酰胺合成酶亲缘关系较远(图3)。

同时从陆地棉中克隆了GhLFHE2的基因组DNA序列，该序列长5251bp(SEQ IDNO.2)，通过与GhLFHE2基因的cDNA序列进行比对和根据GT-AG内含子识别规律分析，结果发现，GhLFHE2基因组序列含有14个外显子和13个内含子。

实施例2

GhLFHE2基因在棉花植株和纤维发育中的表达分析

提取陆地棉(Gossypium hirsutum L.)各组织和器官的总RNA，并合成cDNA一链。用实时定量RT-PCR检测GhLFHE2基因在不同组织和器官中的表达情况。表达引物依据GhLFHE2的cDNA序列设计，5’端引物为GhLFHE2-e1(SEQ ID NO.6)，3’端引物为GhLFHE2-e2(SEQ ID NO.7)。在20μL的反应体系中包括10μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，5'-端和3'-端表达引物各1μL(5μmol/L)，cDNA 1μL，双蒸水7μL。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，预设循环数为40。用棉花GhHISTONE3基因(GenBank登录号：AF024716)作内标，GhHISTONE3基因的5'-引物是GhHIS-1(SEQ IDNO.9)，3'-引物为GhHIS-2(SEQ ID NO.10)。

检测结果表明，GhLFHE2在棉花10DPA纤维中具有很高的表达水平，10DPA胚珠、根、茎、叶和花中的表达水平远远低于纤维中的表达水平(图4-A)。说明该基因是一个纤维细胞优势表达基因，与纤维细胞发育具有密切关系。

进一步检测GhLFHE2在棉花胚珠纤维不同发育时期的表达情况。结果表明：该基因在纤维细胞起始期(0DPA～2DPA)表达水平很低，随着纤维细胞的发育，基因的表达水平快速上升，在纤维发育的快速伸长期(6DPA～12DPA)GhLFHE2的表达水平很高，表达峰值出现在12DPA纤维中；其后，随着纤维伸长速度降低和次生壁的逐渐形成，该基因的表达水平明显降低。该基因在胚珠中的表达一直处于较低的水平(图4-B)。说明该基因是一个纤维优势表达基因，在纤维快速伸长期高量表达，进一步证明该基因与纤维细胞伸长有密切关系，对纤维伸长具有重要作用。

实施例3

超量表达和反义抑制GhLFHE2基因植物表达载体的构建

pGEm-GhLFHE2载体是在克隆GhLFHE2基因时构建，其上的GhLFHE2片段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体，该载体的HPT II基因用XhoI单酶切后替换为NPT II基因(设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计两端带XhoI位点)，限制性酶切和测序结果验证了NPT II基因的方向。在pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位点，形成CaMV35S：：MCS：：NOS单元。该植物表达载体含有1套2×CaMV35S启动子控制NPTII基因的植物表达元件、1套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点(Multiple cloning site，MCS)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

为了在转基因植物中超量表达GhLFHE2基因，需要将GhLFHE2基因正向插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此根据pEASY-GhLFHE2载体上的酶切位点和GhLFHE2的插入方向以及改造的pCambia植物表达载体上的多克隆位点和CaMV35S启动子的方向，构建了超量表达GhLFHE2基因植物表达载体pCambia-35S-GhLFHE2-NOS(简称pC-GhLFHE2)(图6)和反义抑制GhLFHE2基因的植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhLFHE2-NOS(简称pC-AGhLFHE2)(图7)。具体操作为：用DNA限制性内切酶HindIII和Xho I酶切pEASY-GhLFHE2载体，回收外源片段，同时用Hind III和SalI酶切改造的pCambia植物表达载体，回收载体片段，将回收的外源片段和载体片段连接，构建成超量表达GhLFHE2基因植物表达载体pC-GhLFHE2。用DNA限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切pEASY-GhLFHE2载体，回收外源片段，同时用KpnI和SalI酶切改造的pCambia植物表达载体，回收载体片段，将回收的外源片段和载体片段连接，构建成反义抑制GhLFHE2基因植物表达载体pC-AGhLFHE2。

实施例4

棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：

冀棉14种子剥去外壳，用0.1％的升汞(HgCl₂)灭菌10min，用大量无菌水冲洗8次。在125mL三角瓶中加入约35mL无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2-3d，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。

转化用的含pCambia-35S-GhLFHE2-NOS和pCambia-35S-antisenseGhLFHE2-NOS植物表达载体的农杆菌菌株在含50mg/LKm和125mg/L Sm的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1：20的比例转接到25mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6～0.8，10,000rpm、1min离心收集菌体，菌体用等体积的共培养基(组成见表1)重悬备用。

转化时，将棉花下胚轴切成1.5～2.0cm的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120rpm侵染30min。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2～3天。

共培养后，下胚段转入到下胚段筛选培养基(组成见表1)，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120rpm摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0mL枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20～30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1～2cm时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3～5cm高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。

表1：根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962

B5:Gamborg,1986

实施例5

转基因棉花的验证

(1)组织化学鉴定

由于构建的植物表达载体中具有一套CaMV35S启动子控制报告基因GRP-GusPlus-His6的植物表达元件，因此可以利用组织化学法鉴定是否是转化植株。待转化植株在生根培养基上生根并长到5～8cm时，将幼苗从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2～3d。同时，取一小块叶片和一小段根进行GUS染色。结果如图8-A所示，野生型叶片GUS染色为阴性，抗性植株叶片GUS染色为阳性，阳性植株直接移栽到营养钵中。

(2)扩增验证

待棉花植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取棉花基因组DNA，以CaMV35S启动子的上游引物35S(SEQ ID NO.8)和GhLFHE2基因的3'端引物GhLFHE2-2(SEQID NO.5)扩增超量表达载体的转基因棉花；以CaMV35S启动子的上游引物35S(SEQ IDNO.8)和GhLFHE2基因的5'端引物GhLFHE2-1(SEQ ID NO.4)扩增反义抑制的转基因棉花。25μL的扩增体系含2.5μL 10倍PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl₂，各1μL引物GUS-1和GUS-2(5μmol/L)，1μLTaq DNA聚合酶，1μL基因组DNA(50ng)和15μL双蒸水。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，2.5min，35个循环；72℃延伸10min。用正反植物表达载体质粒作阳性对照，以水作空白，以野生型棉花基因组DNA作阴性对照。结果显示GUS染色阳性的转基因棉花植株都能扩增出一条与阳性对照一致的带，说明植物表达载体的T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中(图8-B和8C)。

实施例6

检测GhLFHE2基因在转基因棉花中的表达变化

按照实施例1中提取棉花RNA的方法，提取转基因棉花和野生型棉花叶片的总RNA，并合成cDNA一链。用Real-Time PCR方法分析转基因棉花中目的基因的表达，PCR在实时定量PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂，实时定量RT-PCR试剂盒提供，Bio-Rad)。GhLFHE2基因用引物GhLFHE2-e1(SEQ ID NO.6)和GhLFHE2-e2(SEQ ID NO.7)扩增，内标采用棉花GhHISTONE3(GenBank登录号：AF024716)，引物为GhHIS-1和GhHIS-2。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；预设循环数为35。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。

实时定量RT-PCR分析的结果表明GhLFHE2基因在pC-GhLFHE2转基因棉花中的表达水平比对照高，相反在pC-AGhLFHE2转基因棉花中的表达水平比对照低(图9)。这结果说明已获得超量表达和反义抑制GhLFHE2的转基因棉花植株。

实施例7

超量表达GhLFHE2基因促进棉花纤维伸长

将T1代转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观察棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。当棉花纤维成熟后，用梳子梳理同时期同部位的棉花纤维，然后再用直尺测量纤维的长度(图10)。结果显示，Pc-GhLFHE2纤维的平均长度达到了34.85±0.75mm，而对照的纤维的平均长度为29.15±0.41mm，纤维长度增加了19.55％(图11)。

这些结果说明：增加GhLFHE2基因的表达水平促进了棉花纤维的伸长，该基因在棉花纤维细胞发育中具有重要作用，特别是对纤维细胞的伸长，是利用基因工程改良纤维品质的有效基因。

实施例8

抑制GhLFHE2基因表达阻碍棉花纤维伸长

为了进一步确定GhLFHE2基因在棉花纤维发育中的作用，将反义抑制GhLFHE2的T1代转基因棉花和对照同时栽种到试验田，进行正常的生产管理，观测棉花纤维的生长发育和比较成熟纤维的长度。结果显示，Pc-AGhLFHE2纤维的平均长度为25.55±0.44mm，而对照的纤维的平均长度为29.80±0.42mm，纤维长度降低了14.26％(图12和图13)。这结果进一步说明GhLFHE2基因在纤维细胞伸长过程中具有重要作用，其表达水平与纤维长度有密切关系。

以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1688

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agataggttg gattgagagg gagggaagag cagaagaaaa taaatagaat agaaatgtca 60

gcggcattgg accctgtcga ttggcttctc ttctctctca gtagagcttt ccgtagtcct 120

cttgctgttt ttgttcagat ccagggatgt gtaatatgct tgactcttgc tattgggtgg 180

gcttttgctg cttatgtcag gaacagagag atcaatagca tgaaggatgc catgaaatgt 240

ggcaatagct ttgctttttt gtgccatgat attaatgaac ttgagcacac taatcaggtc 300

aatctaccaa gagttacagt tgtgatgcct ttaaaaggtt ttggagaaca taatctgcac 360

aactggacga gtcagatcac atctctctat ggtggtcctc tagaatttct ttttgtggtg 420

gaaagtactg aagatcctgc ttaccatgct gtatctcggt taataaggga ttttaatgat 480

gatgttgatg ctaaaatcat tgtggctggt ttgtcaacag cctgtagtca gaaaatacat 540

aaccagctga ttggggtgga aagaatgcat aaagatacca agtatgtatt atttttggat 600

gatgatgtta ggcttcaccc tggatcaatt ggagccctca ctgctgagat ggaaaagaat 660

cctgagatat ttattcaaac tggataccct cttgatttac cgtctggaag tttagggagt 720

tactgcatct atgaatacca tatgccttgc tctatgggat ttgccactgg tgggaaaaca 780

ttttttcttt ggggagggtg tatgatgatg caagctgatg attttagacg tgacaattac 840

ggtgtggtct caggacttcg agatggtgga tactctgatg atatgacact agctgctata 900

ccgggagccc acaagaggct tattacgtcc cctcctgtag ctgtttttcc tcatcctctt 960

gcaagtgatc tcagtttctc taggtactgg aattacttga ggaagcaaac atttgttttg 1020

gaatcataca taagcagggt taattggcta atgaatagag gactgttgtc attccattgt 1080

tatctttcat ggggatttgt agcaccatac ttcatggctg cagttcatat tgcagcagca 1140

ttacatatct atatcaaggg ttattcatat gaggaaacaa cctgtactac atgtggattg 1200

ttactagcaa gttgcttagc tatatgtacc cttacggagc tactttccat gtggaactta 1260

acaaggcttg aagttcaact atgcaacatg ttatcccctg aggcacctaa gctctcactt 1320

gattattaca actggagctt gatatttgtc gcattgctgg ttgataactt tctataccct 1380

atctctgcgt tccgatctcg tttctctcaa tcaatcaatt ggtcgggtat tcgatatcac 1440

ttgaagaatg gaaaaataaa caagattgaa aggaacaaag gtaggggacc aaagttcaca 1500

gacttgggag gtaagcattt atatgggaaa aaaggagctc ctccaaaagc ctcattccta 1560

agctcattgg cgagaagttt gtgtcaatgg catcaaccca agaaatacga ggtttagcag 1620

agagaaggaa tgtttatttt ttttgaccat tgtggctctt catttttgga tccgagtgga 1680

agcagcaa 1688

<210> 2

<211> 5251

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400> 2

agataggttg gattgagagg gagggaagag cagaagaaaa taaatagaat agaaatgtca 60

gcggcattgg accctgtcga ttggcttctc ttctctctca gtagagcttt ccgtagtcct 120

cttgctgttt ttgttcagat ccaggtttgt tcttcttttc tctttcgaaa ccattttctt 180

cctttgattc cgcgttatac gaagtgtgat ttttgtatat ttttcccctt ttcggtgttc 240

ggatagctct agcgattagc atgttgattt ttttcccttt ctttaatctg agcttcaaaa 300

aaaattaaac cttattttcc gtctttcctc ggacattaat tggatgtttg gttagtttct 360

cagctttgta tcttttctac aattagctta tttattttaa tctaattttt aagatttaga 420

gtctgcacct taaaatgatt atgatttcct tttacaatga aggcgctggc ttttcattac 480

tattggatct cggtagttat gtctagaact gaaagctaaa tctctttgat ttttactctc 540

tcttatttat ttatttattt atttaccaga aaagaaaaga gagaaaagaa tactgtttgt 600

gagataattg aaatgaaatg tttggaattt ggtcagagtg gtggctgtta tgaaaatagt 660

tggcaatgtt tcttgtaatg attgcaaatt ttgtaattta aataccttga ttcttcaccg 720

attatgtaat ttgtagtatt gagacagtaa agagttttat taagctctga attgagcttt 780

gtttattata ggcttatagc attagaatca aatggagtag gaagcttctt ttcctaaata 840

tgttttctct atatcacggg acttttgttt tagtttactg atttgtttgt gttgtttgag 900

ggaaggatga catgtcagtt aatgtaacaa gggtcgtctc attggatggc aaaggaaatg 960

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ttaccaatta caacttttga aggaactaca atgtttgacg aattcatgtt atctattctg 1080

ctagctgatg ttcttgtact tctaagtagt gcctttcttt taacttcaca atcattccaa 1140

ttatctactt tatgaataca gtacttttaa ctttgattgt tatatatcag ttgcccttct 1200

ttatctgcct gtttaaactt caaaaaggtt accaatctga atgctttgta tatgatgtag 1260

ggatgtgtaa tatgcttgac tcttgctatt gggtgggctt ttgctgctta tgtcaggtac 1320

gtggtttcaa gagaatttaa aaaagcaggc tgcttgctgc cataaccatt ctatgttgtc 1380

ttatgaccta gaaacttgcc tatttcattt atatatacct gcattctttg ccctttacag 1440

gaacagagag atcaatagaa tgaaggatgc catgaaatgt ggcaatagct ttgctttttt 1500

gtgccatgat attaatgaac ttgagcacac taatcaggtc aatctaccaa gagttacagt 1560

tgtgatgcct ttaaaaggtt ttggagaaca taatctgcac aactggaaga gtcaggtgag 1620

tattttatgg tctagctaac actaagcttt aggtgtcctt ttagtgcatt ctaaagaagc 1680

gtgcatttac ctattccttg tccacatttt gttcatcaga aaatggaaaa ctgaactaaa 1740

tttgtctcct ttatattttt tttcatattg ctctaagaat tttcatgttt gcaataggca 1800

attttctgaa gtatttgttt aatgtcaatg gaggcagatc acatctctct atggtggtcc 1860

tctagaattt ctttttgtgg tggaaagtac tgaagatcct gcttaccatg ctgtatctcg 1920

gttaataagg gattttaagg tatactaaaa tttgctttct gattatattg acaaaaaagt 1980

caaatagttt ttttattaat ctatatcctt gattcccctt tcactgaaaa ccctgggtac 2040

tcaatgcttg ccccttgttt cacgcaagtg ttagagggca ccatttggag tgtcttctct 2100

gtggctttac ttcttgcctt cctgatttca ttgcatgttt ttctgcgcag gatgatgttg 2160

atgctaaaat cattgtggct ggtttgtcaa caacctgtag tcagaaaata cataaccagc 2220

tggtacgtaa taactttacc aaattgttaa acagattttg caaatgatct ctccttttat 2280

tcctgtatta gtattatgtt taaaccataa aattgtcagt ctcacttgta ctcagtgaag 2340

aattatgtta atccacaatt atttaaagtc ggtccttgta tgttgttaac atctctttgc 2400

tggaagcgta ttcaacatat tatgtcattt ggtatttctt ttgaagattg gggtggaaag 2460

aatgcataaa gataccaagt atgtattatt tttggatgat gatgttaggc ttcaccctgg 2520

atcaattgga gccctcactg ctgagatgga aaagaatcct gaggtatgtt gcacacggca 2580

atatacatta agtcaaaata attaactttt tttctgaact gttgatttct tttgtggtat 2640

tcatgttatt ggcaatggcg tgcagatatt tattcaaact ggataccctc ttgatttacc 2700

gtctggaagt ttagggagtt actgcatcta tgaataccat atggtatgat gccatctacg 2760

acttattttc tcttcccaag attttgtata tacctgacca tatattattt tcggataact 2820

tgaattgtat ttatacaaga gagcagtgaa aaaccagcta tcaaaacaac agtacaacaa 2880

gaaataaaac agttagtgac taacacctaa gtcaaccatc caattatttc ataaaatatg 2940

gatttaaatg gggagtcagg ctctagtaac ttttttgtat atggtgtact gttttgttgt 3000

tgtcctaatg tcaaaatcta tcagcaacac ctgtagataa gttgcacctt tgattgctag 3060

ctgagcaatc ctgctttcct ccctaaagat taaacacaca cattaattca tgtactccta 3120

ctcatcaaat atttcttttc tacagccttg ctctatggga tttgccactg gtgggaaaac 3180

attttttctt tggggagggt gtatgatggt aagtagcccc ccccttattg ttctcagtgc 3240

atcctgtgca aatttgaagg attatttctg attcttctag attgtttttc agatgcaagc 3300

tgatgatttt agacgtgaca attacggtgt ggtctcagga cttcgagatg gtggatactc 3360

tgatgatatg acactagctg ctatagcggg taatttagtc tctgttagct gttttagtat 3420

actaatatat ctgttgatat tagaattaaa gctttttatt ctcgtagact tgcagccttt 3480

aactgctcat gattgtctct tctcaggagc ccacaagagg cttattacgt cccctcctgt 3540

agctgttttt cctcatcctc ttgcaagtga tctcagtttc tctaggtttg tgaattttac 3600

ctgttaagct gatctattat atgcaaatcc ttcttgactt ggacttgttg tccaggtact 3660

ggaattactt gaggaagcaa acatttgttt tggaatcata cataagcagg gttaattggc 3720

taatgaatag aggactgttt tcattccatt gttatctttc atggggattt gtagcaccat 3780

actttatggc tgcagttcat attgcagcag cattacaaat ctatatcaag ggttattcat 3840

atgaggaaac aacctgtact acaagtggtg agcacactac ttttcctttt tagctaggtt 3900

tggtcgtagt attaactagt taagaagaag ccaatgtctg ggattgtaat ctggtagtat 3960

accagtctat ttatgacatt ttgagtaaca agattttgtt tctttgtctt tggctgagat 4020

ggaactaagt tatactggta atttacaatt tcctctgggc cctcaacata ttgggtttgg 4080

taatttagac ttgtttatca gggatgcatg cctgtttgcc ttccactact agagatgcta 4140

gcagtagccc ttttcacata atagaaattt ctttttcggt agtaaatatt ggctgcagag 4200

aagcatgcta tggtaaagtt tgaaataggt cctgcaacta agcaaactct ttttccacag 4260

gattgttact agcaagttgc ttagctatat gtacccttac ggagctactt tccatgtgga 4320

acttaacaag gattgaagtt caactatgca acatgttatc ccctgaggca cctaagctct 4380

cacttgatta ttacaactgg agcttggtaa gcacctctat ctcttttgta tcgaggatgg 4440

caacgaattt tattgaactt gtatcattat gttgttcaca tgaaactcga gtgtgaatct 4500

ttagtatata cctcttcctt cttcccaact gtatattatt cataagttgc acacacctat 4560

gtgtttagag tgatgacaaa aatttctggc ctttttatcc gtttccattc ctggtctaaa 4620

atcctggaat gatctccttc acactgtagt gaaatagtgt actcaaggtt tcacttaaaa 4680

ggaacataaa agttttatag ttaaatcaac tgtgtttttt gtttgattaa ggtctgaatt 4740

ttgactcgaa gcttggttat atcgcttttc gagtatgtag atgaaattgt tttgtgattg 4800

agcagatatt tgtcgcattg ctggttgata actttctata ccctatctct gccttccgat 4860

ctcatttctc tcaatcaatc aattggtcgg gtattcgata tcacttgaag aatggaaaaa 4920

taaacaaggt aagtcagtgg agcatggcac ttaaattaaa ccattcataa tgacctcgag 4980

gtttattaat ttgttggaag cttagcagta tttgtgtaat ggtgcagatt gaaaggaaca 5040

aaggtagggg accaaagttc acagacttgg gaggtaagca tttatatggg aaaaaaggag 5100

ctcctccaaa agcctcattc ctaagctcat tggcgagaag tttgtgtcaa tggcatcaac 5160

ccaagaaata cgaggtttag cagagagaag gaatgtttat tttttttgac cattgtggct 5220

cttcattttt ggatccgagt ggaagcagca a 5251

<210> 3

<211> 520

<212> PRT

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400> 3

Met Ser Ala Ala Leu Asp Pro Val Asp Trp Leu Leu Phe Ser Leu Ser

1 5 10 15

Arg Ala Phe Arg Ser Pro Leu Ala Val Phe Val Gln Ile Gln Gly Cys

20 25 30

Val Ile Cys Leu Thr Leu Ala Ile Gly Trp Ala Phe Ala Ala Tyr Val

35 40 45

Arg Asn Arg Glu Ile Asn Ser Met Lys Asp Ala Met Lys Cys Gly Asn

50 55 60

Ser Phe Ala Phe Leu Cys His Asp Ile Asn Glu Leu Glu His Thr Asn

65 70 75 80

Gln Val Asn Leu Pro Arg Val Thr Val Val Met Pro Leu Lys Gly Phe

85 90 95

Gly Glu His Asn Leu His Asn Trp Thr Ser Gln Ile Thr Ser Leu Tyr

100 105 110

Gly Gly Pro Leu Glu Phe Leu Phe Val Val Glu Ser Thr Glu Asp Pro

115 120 125

Ala Tyr His Ala Val Ser Arg Leu Ile Arg Asp Phe Asn Asp Asp Val

130 135 140

Asp Ala Lys Ile Ile Val Ala Gly Leu Ser Thr Ala Cys Ser Gln Lys

145 150 155 160

Ile His Asn Gln Leu Ile Gly Val Glu Arg Met His Lys Asp Thr Lys

165 170 175

Tyr Val Leu Phe Leu Asp Asp Asp Val Arg Leu His Pro Gly Ser Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Thr Ala Glu Met Glu Lys Asn Pro Glu Ile Phe Ile Gln

195 200 205

Thr Gly Tyr Pro Leu Asp Leu Pro Ser Gly Ser Leu Gly Ser Tyr Cys

210 215 220

Ile Tyr Glu Tyr His Met Pro Cys Ser Met Gly Phe Ala Thr Gly Gly

225 230 235 240

Lys Thr Phe Phe Leu Trp Gly Gly Cys Met Met Met Gln Ala Asp Asp

245 250 255

Phe Arg Arg Asp Asn Tyr Gly Val Val Ser Gly Leu Arg Asp Gly Gly

260 265 270

Tyr Ser Asp Asp Met Thr Leu Ala Ala Ile Pro Gly Ala His Lys Arg

275 280 285

Leu Ile Thr Ser Pro Pro Val Ala Val Phe Pro His Pro Leu Ala Ser

290 295 300

Asp Leu Ser Phe Ser Arg Tyr Trp Asn Tyr Leu Arg Lys Gln Thr Phe

305 310 315 320

Val Leu Glu Ser Tyr Ile Ser Arg Val Asn Trp Leu Met Asn Arg Gly

325 330 335

Leu Leu Ser Phe His Cys Tyr Leu Ser Trp Gly Phe Val Ala Pro Tyr

340 345 350

Phe Met Ala Ala Val His Ile Ala Ala Ala Leu His Ile Tyr Ile Lys

355 360 365

Gly Tyr Ser Tyr Glu Glu Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Leu Leu Leu

370 375 380

Ala Ser Cys Leu Ala Ile Cys Thr Leu Thr Glu Leu Leu Ser Met Trp

385 390 395 400

Asn Leu Thr Arg Leu Glu Val Gln Leu Cys Asn Met Leu Ser Pro Glu

405 410 415

Ala Pro Lys Leu Ser Leu Asp Tyr Tyr Asn Trp Ser Leu Ile Phe Val

420 425 430

Ala Leu Leu Val Asp Asn Phe Leu Tyr Pro Ile Ser Ala Phe Arg Ser

435 440 445

Arg Phe Ser Gln Ser Ile Asn Trp Ser Gly Ile Arg Tyr His Leu Lys

450 455 460

Asn Gly Lys Ile Asn Lys Ile Glu Arg Asn Lys Gly Arg Gly Pro Lys

465 470 475 480

Phe Thr Asp Leu Gly Gly Lys His Leu Tyr Gly Lys Lys Gly Ala Pro

485 490 495

Pro Lys Ala Ser Phe Leu Ser Ser Leu Ala Arg Ser Leu Cys Gln Trp

500 505 510

His Gln Pro Lys Lys Tyr Glu Val

515 520

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agataggttg gattgagagg g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgctgcttc cactcggatc c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttgagcaca ctaatcaggt c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agggtgaagc ctaacatcat c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgacaggac acaccctctt g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaagcctcat cgataccgtc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctaccactac catcatggc 19

Claims

1.一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2，其特征在于，所述GhLFHE2的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的棉花长纤维高表达基因GhLFHE2，其特征在于，所述GhLFHE2的gDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1或2所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.权利要求1所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2的扩增引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1或2所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2和启动子，所述启动子包括增强型、组成型、组织特异性和诱导型中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的T-DNA区段内有三套表达元件，第一套由启动子控制GhLFHE2基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制筛选基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制报告基因正向序列，终止子为NOS终止子。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的T-DNA区段内有3套表达元件，第一套由组成型启动子35S控制GhLFHE2基因正向序列，终止子为NOS终止子；第二套由组成型启动子35S控制NPTII基因正向序列，终止子为NOS终止子；第三套由组成型启动子35S控制GUS基因正向序列，终止子为NOS终止子。

8.一种转化体，其特征在于，所述转化体由权利要求5～7任一项所述表达载体转化宿主获得。

9.权利要求1或2所述棉花长纤维高表达基因GhLFHE2、权利要求3所述蛋白质、权利要求5～7任一项所述表达载体、权利要求8所述转化体在提高棉花纤维质品质和/或增加棉花纤维产量中的应用。

10.一种含有棉花长纤维高表达基因GhLFHE2的转基因棉花的制备方法，包含如下步骤：

2)用所述重组载体转化宿主，获得转化体；

3)用所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。