CN115976072B - 一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因及其应用、重组表达载体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因及其应用、重组表达载体和方法，属于分子育种技术领域。所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明中，所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因可以正向调控棉花中衣分的含量，过表达组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01可显著促进棉纤维的伸长，提高棉纤维中的衣分含量。该基因可作为目的基因导入植物，促进棉花纤维的伸长，提高衣分含量，增加棉纤维的产量，进而改良棉花纤维的品质。

Description

一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因及其应用、重组表达 载体和方法

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，特别是涉及一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因及其应用、重组表达载体和方法。

背景技术

棉花是中国种植面积最大的经济作物，其产量居我国经济作物之首，棉花纤维是发展棉花生产、提高棉花产量的重要生产资料，在国民经济生活的很多方面发挥重要作用，还是研究植物细胞发育的重要模式材料。检验棉花培育工作是否成功的关键标准就是棉花产量的多少，这取决于棉籽的产量以及皮棉的产量，会受到许多因素的调控与影响。

棉花纤维的发育历经纤维起始、纤维伸长、次生壁增厚及脱水成熟四个阶段形成成熟纤维。研究证明：在纤维发育起始阶段，棉纤维突起的增多会导致棉花衣分含量的增加。棉花衣分是构成皮棉产量的一个重要因素，也是除铃数和铃重之外的棉花产量的一个重要构成因素。衣分含量是指籽棉上纤维的重量与籽棉重量的比值，通常用百分率来表示。衣分含量的高低是评定棉花品种优劣的一条重要标准。大量的研究证明：提高棉花的衣分含量能够显著提高棉花的产量。通过分子育种方法提高棉花衣分含量，使之更加适应生产的需要是当前棉花纤维遗传改良的重要方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因及其应用、重组表达载体和方法，所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因可正向调控棉花衣分含量，可获得稳定遗传的高衣分含量的转基因植株。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因，所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在促进棉花纤维伸长中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在提高棉花衣分中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在提高棉花纤维产量中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在改良棉花纤维品质中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，将所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因插入到载体中，得到。

优选的，所述载体包括pCAMBIA2300。

优选的，构建重组表达载体使用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种获取转基因棉花的方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述的重组表达载体采用农杆菌浸染法转入棉花植株中，得到转基因棉花。

本发明的有益效果为：

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是组蛋白乙酰化修饰的关键酶类，组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)相互作用，动态调节细胞核内的组蛋白乙酰化水平和基因转录活性。发明人早期研究显示，组蛋白去乙酰化酶在拟南芥的表皮毛、根器官形成，纤维伸长等植物生长发育过程中起重要作用。发明人在进一步研究中发现组蛋白去乙酰化酶可以正向调控棉花的衣分含量，过表达组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因可显著提高棉花纤维长度和衣分含量，该基因可作为目的基因导入植物，促进棉花衣分含量的增加，促进纤维伸长，进而改良棉花纤维品质等特性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2中利用扫描电镜观察开花当天野生型和转基因(OE1和OE2)胚珠表皮凸起的纤维细胞(上)，并利用Image J进行了统计分析(n≧25)，其中，OE 1和OE 2表示两个GhHDT3_A01棉花转基因株系，ZM24是野生型棉花株系，图1展示了代表性的扫描电镜结果；

图2为实施例2中棉花纤维长度对比；收获野生型(ZM24)和转基因棉花的成熟纤维进行长度表型观察和分析，其中，OE 1和OE 2表示两个GhHDT3_A01棉花转基因株系，ZM24是野生型棉花株系；每个株系观察不少于20个单独的籽棉，代表性的结果被展示出来；

图3为实施例2中棉花纤维长度统计图；对野生型(ZM24)和转基因(OE1和OE2)棉花的成熟纤维进行测量后进行统计分析(n≧20)，其中，OE 1和OE 2表示两个GhHDT3_A01棉花转基因株系，ZM24是野生型棉花株系；

图4为实施例2中总纤维含量统计图；用甲苯胺蓝染色法分析野生型和转基因5个种子表皮纤维的纤维素含量，共进行了三次重复取其平均值进行作图，其中，OE 1和OE 2表示两个GhHDT3_A01棉花转基因株系，ZM24是野生型棉花株系；

图5为实施例2中不同株系纤维含量即衣分统计图；采收相同条件下野生型和转基因(OE1和OE2)相同状态20个棉铃的籽棉，进行轧花后对其纤维和种子重量进行测定和分析，计算其衣分，进行三个生物学重复取其平均值进行作图，其中，OE 1和OE 2表示两个GhHDT3_A01棉花转基因株系，ZM24是野生型棉花株系。

具体实施方式

本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因，所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

ATGGAGTTTTGGGGTGCTGAAGTTAAAAGTGGACAGAACTTTGAGGTTGAACTGGAGGATGATGGCAGTAGGATCTTGCATCTTTCACAGGTTGCCCTTGGTGAGGGGACTGGTGATAACAAGAAAGAAAAAGGAAAGGAAACCATTTGTCTCTATCTCAAATTCAAAAATCAGAAGTTTGTGGTTGGAACACTTTCCCAAGAGAAATGCCCCCAGATAGCATTGGATTTGGTATTGCATGACAAATTTGAGCTGTTCCATACGTGGAAGAATGGCAGCGTATATGTCACTGGCTATTATGTTGATACATCTCAAGGTAGTGATACTGAGTCTGAAGGGGAGCTTCCTGAACCTACAATGAATCTTGTAAAGTCAGAGCCTGCAGCATCTGATCCTACTACGACAAAGCAGGTTAAGATTGTTGAACCTAAAAAAGATGATGATAGTAGTGATGAGGATGAAGAGGATAGTTCTGCTGAGGATGAAGAGTCCAGTGAGGAGCAGGAACCTTGCATGCTGGTTAATGGTGAGAATGATACTGATGATGCTGACAGTGATGAGGATGATAGTGATGAAGAAAGCTTAGATGAGGATCAAAAGACTCCTGAGAAGGCTGGACCAAGCAAGAAGAGACCTGCTGAGTCATCTAAAAAGACCCCTACTCCCGAAAAGAAGGCAAAGCTGGTCACTCCCCAAAAGACAGGCAGATTTTCCCTTCCATCTTTGCCC。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在促进棉花纤维伸长中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在提高棉花衣分中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在提高棉花纤维产量中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在改良棉花纤维品质中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：MEFWGVEVKSGQNFEVELEDDGSRILHLSQVALGEGTGDNKKEKGKETICLYLKFKNQKFVVGTLSQEKCPQIALDLVLHDKFELFHTWKNGSVYVTGYYVDTSQGSDTESEGELPEPTMNLVKSEPAASDPTTTKQVKIVEPKKDDDNSDEDEEDSSAEDEESSEEQEPRMLVNGENDTDDADSDEDDSDEESLDEDQKTPEKAGPSKKRPAESSKKTPTPEKKAKLVTPQKTGRFSLPSLPF。

本发明还提供了一种重组表达载体，将上述技术方案所述的组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因插入到载体中得到。在本发明中，所述载体优选包括pCAMBIA2300。本发明对所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因插入到载体中的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规即可。在本发明中，构建重组表达载体使用的引物优选包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示，具体如下：

SEQ ID No.3：CTGTACAAGGGTACCATGGAGTTTTGGGGT；

SEQ ID No.4：CTGCTCAGGCGCGCCGAAGGGCAAAGATGG。

本发明还提供了一种获取转基因棉花的方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述的重组表达载体采用农杆菌浸染法转入棉花植株中，得到转基因棉花。本发明对所述重组表达载体采用农杆菌浸染法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规农杆菌浸染法即可。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将GhHDT3_A01基因转导至受体棉花中，步骤如下：

1.1从棉花ZM24中克隆去终止密码子的GhHDT3_A01的cDNA序列(SEQ ID NO.1)，利用pCAMBIA 2300和Infusion连接反应，将GhHDT3_A01 cDNA片段克隆进入目的载体pCAMBIA2300(CaMV 35S启动子)中，得到pCAMBIA 2300-GhHDT3_A01表达载体；

pCAMBIA2300-GhHDT3_A01引物序列分别为：

上游引物(SEQ ID NO.3)：

5′-CTGTACAAGGGTACCATGGAGTTTTGGGGT-3′；

下游引物(SEQ ID NO.4)：

5′-CTGCTCAGGCGCGCCGAAGGGCAAAGATGG-3′

1.2将pCAMBIA 2300-GhHDT3_A01 Ti质粒转入根癌农杆菌菌株LBA4404，以7天的ZM24无菌棉花幼苗(暗处理5天光照2天)下胚轴为外植体进行浸染培育，从而获取转基因超表达棉花，并收获其种子；

具体步骤如下：

首先使用市售浓硫酸将ZM24棉花种子快速脱绒处理，获得光滑且无毛的种子。将脱过绒的棉花种子洗净晒干，取适量种子泡在3％的H2O2溶液中过夜清洗。然后，在无菌条件下，将清洗好的棉花种子种在含有MS培养基的试管中，黑暗处理48h，光照处理4-7天。选择生长状态良好的棉花嫩茎，将其切成小段，并将其完全浸泡于扩大好的GhHDT3_A01-2300-YFP农杆菌菌液中(20ml，OD＝1.0)，2min后立马取出，均匀的平铺在覆有一层滤纸的培养基中。黑暗处理48h。接下来，准备多个灭过菌的100mL的锥形瓶，每个里面加入50mL左右的培养基(100mg/mL头孢霉素，100mg/mL利福平)，将在无抗性培养基上的茎段转移到含有抗性的一号培养基上，每个锥形瓶中最多转移6段。

最后，在培养基上培养三个月左右后(每一个月更换一次生根培养基)，将长出愈伤组织的茎段转入生根培养基(100mg/mL头孢霉素，100mg/mL利福平)，在生根培养基上培养三个月后(每一个月更换一次诱苗培养基)，转移至抗性筛选培养基中(100mg/mL头孢霉素，100mg/mL利福平)，在筛选培养基上培养三个月后(每一个月更换一次筛选培养基)，将长出的小芽转移到无抗性的生长培养基进行棉花培养。需要注意的是，在营养培养基上培养时，需要随时注意培养基的消耗以及污染情况，每个培养基培养一个月左右时根据情况需要更换一次培养基，使得培养的愈伤组织可以获得更好的生长环境，有更好的生长状态。

1.3将步骤1.2中收获的种子提取总RNA，使用半定量或定量PCR法检测比较转基因株系与野生型植株中GhHDT3_A01的表达量，鉴定出GhHDT3_A01过表达，并进一步获得阳性株系的种子；

定量PCR法检测比较转基因株系与野生型植株中GhHDT3_A01基因的表达量，以GhUBQ7(DQ116441)为内参基因，GhUBQ7扩增引物如下：

上游引物(SEQ ID NO.5)：5′-CCCGAAACCTGCATAAAATG-3′

下游引物(SEQ ID NO.6)：5′-GCGATCAAATTGGTTTTCGT-3′

1.4将步骤1.3中阳性株系的种子消毒，按常规栽培和管理方法，繁殖遗传稳定性好的GhHDT3_A01过表达或异源表达转基因植物株系的成熟棉纤维及种子。

实施例2

本实施例用于验证GhHDT3_A01基因对棉花衣分含量的正向调控。

一、纤维起始时期GhHDT3_A01过表达株系胚珠起始观察

获得过表达转基因GhHDT3_A01的阳性棉花种子后，按常规栽培和管理方法，繁殖遗传稳定性良好的GhHDT3_A01过表达或异源表达转基因植物株系，并同时种植野生型棉花品种ZM24作为对照。分别选取转基因与野生型株系开花0天的胚珠，使用扫描电镜对其胚珠表面突起进行观察。

结果如图1所示，可以看出GhHDT3_A01过表达株系在纤维起始发育时期胚珠表面突起增多，每平方毫米胚珠表皮的纤维细胞增加了不少于30％。可见，GhHDT3_A01基因在促进棉纤维起始发育过程中发挥作用。

二、对GhHDT3_A01过表达转基因株系(GhHDT3_A01 OE)以及野生型ZM24进行棉纤维长度测量

根据实施例1的操作，获得阳性的GhHDT3_A01转基因株系。按常规栽培和管理方法，繁殖遗传稳定性良好的GhHDT3_A01过表达株系。摘取相同时期、相同数量的GhHDT3_A01过表达转基因株系与野生型株系的成熟棉桃。将棉桃中的棉花取出，使用梳子对单个棉花纤维进行整理，将棉纤维梳理平整，使用游标卡尺测量纤维长度，设置三个生物学重复。

结果如图2、3所示，相对于ZM24来说，GhHDT3_A01的纤维长度显著增加，由野生型的28毫米左右增加到了不低于32毫米。可见，GhHDT3_A01基因对棉花纤维伸长具有重要促进作用。

三、GhHDT3_A01超表达棉花纤维总含量测定

按照实施例1获得GhHDT3_A01过表达棉花的稳定遗传株系，分别检测过表达转基因株系和ZM24品种中的纤维总含量。检测方法为：分别选取同时期的GhHDT3_A01转基因棉花与野生型棉花的成熟纤维，用0.02％(w/v)甲苯胺对转基因植株与野生型纤维进行30秒染色，用流动的水流冲洗1分钟，在吸水纸上充分干燥(每个株系每次测量10个样品)。用醋酸/乙醇/水(10:95:5,v/v)洗脱2h后测定吸光度，在624nm处用分光光度计进一步分析。每一个实验重复三次。

测定结果如图4所示，显示GhHDT3_A01的纤维总含量相对于ZM24显著增加。表明GhHDT3_A01具有增加棉纤维含量的作用。

四、GhHDT3_A01超表达棉花衣分含量测定

检测按照实施例1获得过表达转基因GhHDT3_A01的阳性棉花后，按常规栽培和管理方法对其进行继代培养，繁殖遗传稳定性良好的GhHDT3_A01过表达或异源表达转基因植物株系，并同时种植野生型棉花品种ZM24作为对照。同时摘取转基因和野生型棉花的棉桃(每个株系摘取60棵，每20棵为一个重复，每个株系三个重复)。将棉桃中的棉花全部摘取下来，轧花后获得分离的棉花纤维与种子，对每份纤维以及种子重量进行测量。

测定结果如图5所示，显示与野生型ZM24棉花相比，GhHDT3_A01转基因株系中的衣分含量显著增加，增加了10％左右。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (1)

1.过表达组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因在提高棉花衣分中的应用；

所述组蛋白去乙酰化酶GhHDT3_A01基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。