CN112725360A

CN112725360A - 棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用

Info

Publication number: CN112725360A
Application number: CN202110248473.3A
Authority: CN
Inventors: 喻树迅; 张晶晶; 王寒涛; 魏恒玲; 付小康; 马亮
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN112725360B

Abstract

本发明提供了棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用，涉及生物技术领域。经发明人研究发现，从陆地棉中克隆出GhHDA6基因，构建该基因的过表达载体，并转染拟南芥，得到的过表达转基因拟南芥相比于野生型开花提前；构建该基因的病毒诱导沉默载体，并注射陆地棉中棉所36，得到的沉默棉花植株开花延迟，说明GhHDA6基因在调控棉花开花期方面起到了重要的调控作用。

Description

棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用。

背景技术

棉花是我国最重要的经济作物之一，棉花种植在我国国民经济中占有举足轻重的地位。早熟是棉花育种的重要目标性状，利用早熟棉不仅能够提高土地复种指数,扩大棉花种植区域，还可以避免自然灾害，减少农药污染，实现经济效益和生态效益的协调发展和共同提高(喻树迅et al.,2017)。生育期是棉花早熟育种最为关注的性状，开花期是重要的生育期性状之一。开花是棉花由营养生长向生殖生长过渡的标志，适时开花不仅可以避开不利的外界环境，也是决定棉花能否获得丰收的重要农艺性状。

前人研究表明，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)参与了大量与植物生长发育相关的生物过程(Hollender and Liu,2008,Hao et al.,2016)。在HDACs的超家族中，研究最多的是RPD3基因家族，它在植物发育和生理过程中起着至关重要的作用，包括开花时间、非生物胁迫反应、雌性配子体和胚胎发育、衰老、种子萌发和植物激素信号反应等(Cigliano etal.,2013,Luo et al.,2015,Zhao et al.,2016)。

开花期是棉花早熟的重要指标，受到花芽分化时间的影响，花芽分化是棉花由营养生长向生殖生长转变的生理和形态标志。早熟棉花品种花芽分化期早于晚熟棉花品种，且早熟棉花一般在三片真叶完全平展时开始花芽分化(Cheng et al.,2020)。在拟南芥中，至少有4个RPD3基因与开花时间相关：AtHDA6与四种开花途径的自主途径相关，并通过与FLD(Flowering Locus D)的相互作用调节开花时间(Wu et al.,2008,Yu et al.,2011)。HDA5通过抑制FLC(Flowering Locus C)和MAF1的表达来调控开花时间。此外，在拟南芥中，HDA5和HDA6可能与FLD和FVE形成HDAC复合物来控制开花时间(Luo et al.,2015)。在短日照条件下，AtHDA9抑制了光周期调控基因AGL19(Agamouslike 19)(Kim et al.,2013)，并且AtHDA19的下调导致开花延迟、花异常、胚胎缺陷和种子减少(Tian et al.,2003)。在最近的研究中，棉花中与AtHDA5相似的GhHDA5在纤维发育-1和0DPA时表达较高，且RNAi抑制的GhHDA5株系开花延迟，表明其可能与棉纤维起始和开花时间有关(Kumar et al.,2018)。

对于RPD3基因，在拟南芥等作物上取得了一些进展。然而，目前对棉花RPD3基因家族缺乏系统的研究。因此，有必要探索RPD3基因在棉花开花中的潜在功能。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种含GhHDA6基因的重组质粒。

本发明的第三目的在于提供一种含GhHDA6基因的重组质粒的制备方法。

本发明的第四目的在于提供一种重组质粒在促进拟南芥开花中的应用。

本发明的第五目的在于提供一种抑制基因表达重组质粒。

本发明的第六目的在于提供一种抑制基因表达重组质粒的制备方法。

本发明的第七目的在于提供一种抑制基因表达重组质粒在延迟棉花开花中的应用。

第一方面，本发明提供了棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用，所述GhHDA6基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列。

作为进一步技术方案，所述GhHDA6基因编码的氨基酸具有如SEQ ID NO.2所示序列。

作为进一步技术方案，所述植物包括棉花和拟南芥。

第二方面，本发明提供了一种含GhHDA6基因的重组质粒，所述重组质粒含有GhHDA6基因片段，所述GhHDA6基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列。

第三方面，本发明提供了一种重组质粒的制备方法，在基础质粒上引入GhHDA6基因片段，构建得到所述重组质粒。

作为进一步技术方案，所述基础质粒为PBI121。

第四方面，本发明提供了一种重组质粒在促进拟南芥开花中的应用。

第五方面，本发明提供了一种抑制基因表达重组质粒，所述抑制基因表达重组质粒含有如SEQ ID NO.3所示序列。

第六方面，本发明提供了一种重组质粒的制备方法，在基础质粒上引入SEQ IDNO.3所示序列，构建得到所述重组质粒；

优选地，所述基础质粒为pCLCrVA。

第七方面，本发明提供了一种抑制基因表达重组质粒在延迟棉花开花中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

经发明人研究发现，从陆地棉中克隆出GhHDA6基因，构建该基因的过表达载体，并转染拟南芥，得到的过表达转基因拟南芥相比于野生型开花提前；构建该基因的病毒诱导沉默载体，并注射陆地棉中棉所36，得到的沉默棉花植株开花延迟，说明GhHDA6基因在调控棉花开花期方面起到了重要的调控作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为GhHDA6的结构分析，(A)GhHDA6的内含子-外显子结构；(B)GhHDA6与拟南芥去乙酰化酶的进化树；(C)GhHDA6的保守结构域预测；

图2为GhHDA6基因表达模式分析，(A)GhHDA6在不同组织中的时空表达模式；(B)GhHDA6在中棉所36和G2005花芽分化时期的相对表达量；误差线表示三个生物学重复；

图3为转基因植株和非转基因植株中GhHDA6基因的相对表达，WT为野生型；Line1、Line 2、Line3为三个转基因株系；

图4为转基因植株和非转基因植株在25天和30天的生长状况，WT为野生型拟南芥；Line1、Line2、Line3为三个转基因株系；

图5为GhHDA6沉默株系和空载植株的表型观察，(A)pCLCrVA-1、pCLCrVA-2、pCLCrVA-3表示三个空载植株；Line 1、Line 2、Line 3表示三个沉默株系；(B)阳性对照(PDS)植株；(C)GhHDA6在沉默株系和空载植株的相对表达量；(D)沉默株系和空载植株的开花时间的统计；误差线表示三个生物学重复。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本实验室，通过对RPD3基因家族系统性的分析，在陆地棉品种中，共鉴定到18个家族成员。在棉花的花芽分化时期，其中有4个基因在早熟棉74号的相对表达量都高于晚熟棉国欣11号，而且GhHDA6是其中一种。

本发明提供了棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用，所述GhHDA6基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列。

在一些优选的实施方式中，所述GhHDA6基因编码的氨基酸具有如SEQ ID NO.2所示序列。

在一些优选的实施方式中，所述植物包括棉花和拟南芥。

试验材料

1.棉花材料

本实验选取的棉花材料为陆地棉早熟品种中棉所36和晚熟品系G2005，两个品种在开花时间和生育期存在着极显著差异(表1)，种植于中国农业科学院棉花研究所试验田(安阳白璧)，管理措施为正常大田管理。取样方式为两个棉花品种一叶期到五叶期的幼芽，置于液氮中，在提取样品RNA之前放置-80℃留存。

表1中棉所36和晚熟品系G2005性状显著性检验

2.试剂和耗材

限制性内切酶、修饰酶、PCR反应体系相关酶、同源重组酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。

其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素购自索莱宝生物有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌感受态购自擎科生物公司。

培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55度时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS 22g/L，琼脂粉(agar powder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。

主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。

实施例1棉花GhHDA6的生物信息学分析

从CottonFGD(http://www.cottonfgd.org/)上获得GhHDA6(Ghir_D03G01151)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，其开放阅读框为1416bp，编码472个氨基酸，具有6个外显子和5个内含子。蛋白的相对分子质量为53.06kDa，等电点为5.1。用结构域预测网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测该基因包含有一个保守结构域Hist_deacetyl，并且该基因与拟南芥组蛋白去乙酰化酶AtHDA6高度同源(图1)，我们将该基因命名为GhHDA6，对其功能进行研究。

GhHDA6开放阅读框序列如下：

ATGGAAGACTCTGCTGGAGGCGCATCATTACGGTCGGGTCCCGACGGGAAGAAGCGGCGTGTGACATACTTCTACGAGCCAACGATCGGCGACTACTATTACGGTCAGGGTCACCCGATGAAACCCCACCGGATTCGTATGGCACACAATCTCATCGTCCATTATTCTCTCCACCGTCGGATGGAGATTAACCGTCCTTTCCCCGCCGGTCCCGACGACATCCGTCGCTTTCACACCGAAGAGTATGTGGACTTCCTCAACGCCGTCACCCCCGATTCCATCTCCGACCCCGCTTATTCTCGCCATTTGAAGCGTTTCAATGTCGGAGAGGATTGCCCCGTGTTCGATGGGCTTTTTGGTTTCTGCCAGGCCTCCGCTGGTGGCTCCATTGGTGCCGCCGTTAAGTTGAATAGAGGGGATGCCGACATCGCCATCAATTGGGCTGGTGGATTGCATCATGCTAAGAAAAGCGAGGCTTCTGGGTTTTGCTATGTTAATGATATCGTGCTTGGGATTCTTGAGCTCCTGAAATATCACAGGCGTGTGCTGTATGTAGATATTGATGTTCATCACGGTGATGGTGTAGAAGAGGCATTTTACACCACTGACAGAGTTATGACTGTGTCTTTCCATAAATTTGGGGATTTCTTCCCAGGGACTGGACACATCAGGGATGTTGGGGTGGGTAATGGCAAATACTATGCCTTGAATATTCCCTTGAATGATGGGATGGATGATGAGAGTTTTCGGGGTCTATTTCGTCCTATCATCCAAAAGGTCATGGAAGTGTATCAACCAGATGCAGTTGTTCTTCAATGTGGAGCAGATTCATTGTCTGGTGACAGATTGGGTTGCTTCAACTTGTCTGTGAAGGGCCATGCTGATTGTCTTCGCTTTCTTAGATCTTTCAATGTTCCCCTAATGGTCTTGGGTGGAGGAGGGTATACTATCCGCAATGTTGCCAGATGTTGGTGCTATGAGACAGCTGTTGCAGTTGGGGTTGAGCCTGATAATAAGCTGCCTTATAATGAATATTATGAGTATTTCGGTCCAGATTATACACTTCATGTTGAAGTGGGCAGCATGGAGAACCTGAATGCACCTAGAGATATGGAGAAGATAAGGAACATGCTATTAGAGCAGCTTTCTAGATTATCTCATGCACCCAGTGTACCTTTTCAAACAACACCATCCACCATCCAACCGCCCGAGGAGGCCGAGGAGGACATGGATGAAAGACCAAAACCTCGCATATGGAATGGGGATGATTATGAGTCTGATCCTGAAGAGGATGAGAAACCTTTACGCAGATTCTCCAATTCTGATGTAATACAACTTACAACAGATGCTGATATGAGGCAGGTATCACAAGATTTGAAAGAAGTGAAAGCAGAAGAACAACCACCGGCACCTTGA(SEQ ID NO.1)。

GhHDA6编码的氨基酸序列如下：

MEDSAGGASLRSGPDGKKRRVTYFYEPTIGDYYYGQGHPMKPHRIRMAHNLIVHYSLHRRMEINRPFPAGPDDIRRFHTEEYVDFLNAVTPDSISDPAYSRHLKRFNVGEDCPVFDGLFGFCQASAGGSIGAAVKLNRGDADIAINWAGGLHHAKKSEASGFCYVNDIVLGILELLKYHRRVLYVDIDVHHGDGVEEAFYTTDRVMTVSFHKFGDFFPGTGHIRDVGVGNGKYYALNIPLNDGMDDESFRGLFRPIIQKVMEVYQPDAVVLQCGADSLSGDRLGCFNLSVKGHADCLRFLRSFNVPLMVLGGGGYTIRNVARCWCYETAVAVGVEPDNKLPYNEYYEYFGPDYTLHVEVGSMENLNAPRDMEKIRNMLLEQLSRLSHAPSVPFQTTPSTIQPPEEAEEDMDERPKPRIWNGDDYESDPEEDEKPLRRFSNSDVIQLTTDADMRQVSQDLKEVKAEEQPPAP(SEQ ID NO.2)。

实施例2GhHDA6的表达模式分析

为了研究GhHDA6基因可能具有的潜在功能，从NCBI数据库中获取TM-1的叶，根，茎，花萼，花瓣，雌蕊，雄蕊和纤维的RNA-seq数据，利用陆地棉基因组研究中的转录组数据，计算FPKM值表示基因的表达量，分析GhHDA6基因在不同组织中的时空表达模式。发现GhHDA6基因在生殖器官里表现出较高的表达量，尤其是花瓣和雌蕊中，说明该基因跟棉花花发育相关(图2中的A)。

实施例3GhHDA6在中棉所36和G2005两个材料花芽分化时期表达量的差异分析

1磨样

把中棉所36和G2005两个材料一叶期到五叶期的顶芽置于液氮中，用研钵和研磨棒将其研磨至粉末状，大约取100mg样品放于1.5mL离心管中。

2RNA的提取

以下所有离心步骤均在室温下进行。

(1)匀浆处理：将研磨好的样品中加入700μl裂解液SL(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。注意1：对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SL用量增加至700μl。注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。

(2)12,000rpm离心2min。

(3)将上清液转移至过滤柱CS上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片。

(4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(6)DNaseI工作液：取10μl DNaseI储存液和70μl RDD溶液轻柔混匀。

(7)向CR3中加入80μl的DNaseI工作液，室温静止15min。

(8)静置完后，向CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。如果预期RNA得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的RNA溶液再加入吸附柱CR3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

3反转录cDNA的合成

样品cDNA的合成是利用TaKaRa的PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒进行(宝生物，大连)。该试验过程主要包括两步：(1)RNA样品中可能残留的基因组DNA(gDNA)的去除；(2)将步骤(1)中得到的RNA反转录成单链cDNA，所有的体系配置过程都需在冰上进行。

具体操作如下：

(1)RNA样品中的gDNA的去除：

1)反应体系的配置

2)将配好的体系室温放置5-10min后，再将体系转置冰上，备用。

(2)cDNA单链合成

反应体系的配置：

将上述配好且混匀的体系共20μl放置在37℃下，30min；85℃下，5s；4℃保存。将反转录后的cDNA放置到-20℃，可长期保存。

4荧光定量PCR

(1)利用Primer5.0软件设计GhHDA6基因的特异性引物,用棉花GhActin基因为内参基因。

(2)荧光定量PCR

利用Cwbio(China)的UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒和AppliedBiosystems 7500仪器完成。具体过程如下：

1)将上述的cDNA原液稀释5倍；

2)反应体系的配置(冰上操作)：

将配置好的体系混匀，离心至无气泡，然后利用Applied Biosystems7500进行荧光定量PCR：按照两步法设置PCR程序：预变性：95℃2min；95℃，5s；60℃，34s(这一步收集荧光信号)，这两步设置40个循环；最后溶解曲线分析：95℃，15s；60℃，20s；95℃，15s。完成上述反应后，将数据导出，计算基因的表达量。

5结果分析

GhHDA6在中棉所36和G2005两个材料花芽分化时期的相对表达量是利用2^-△△Ct方法计算的。开花期是早熟的重要指标，能够受到花芽分化时期的影响。花芽分化是植物由营养生长转变为生殖生长的重要生理和形态指标。由图2中的B可以看出，从一叶期到五叶期，GhHDA6在中棉所36的花芽分化时期的相对表达量明显高于G2005，尤其是在二叶期。结合到组织表达特异性，说明该基因跟棉花早熟性有关。

实施例4GhHDA6基因的克隆和PBI121-GhHDA6植物表达载体的构建1基因引物的设计

采用Prime 5软件设计引物，用PCR(Polymerase Chain Reaction)的方法从陆地棉中棉所36号中扩增，所用cDNA为实施例3中棉所36二叶期的样品。为了扩增基因编码区全长，并加上特定酶切位点，根据GhHDA6的CDS序列，分别在起始密码子ATG和终止密码子处设计含有适合酶切位点引物。所用酶切位点为XbaI和SacI。

GhHDA6酶切位点引物序列如下：

上游引物F：

5’-CACGGGGGACTCTAGAATGGAAGACTCTGCTGGAGGC-3’(SEQ ID NO.8)；

下游引物R：

5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAAGGTGCCGGTGGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.9)。

2基因克隆的PCR反应体系、程序和产物检测

(1)PCR反应体系

根据PrimeSTAR GXL DNA聚合酶说明书，PCR反应体系如下：

(2)PCR反应程序

预变性：98℃，2min；

扩增：变性：98℃，10s，退火：55-60℃，15s，延伸：68℃，90s，35个循环；

延伸：16℃。

(3)PCR产物的检测

取2μl PCR产物，加入3μl 6×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测条带大小在1416bp左右。

(4)PCR产物的胶回收

采用Vazyme产物纯化试剂盒，步骤如下：

1)DNA电泳结束后，在紫外灯快速切下含有目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶量(去除空管的重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

2)加入等体积的Buffer GDP。50～55℃水浴7-10分钟，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。

3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。若溶胶体积大于700μl，把吸附柱置于收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。

4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60sec。

5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60sec。

6)重复步骤5。

7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min。

8)将吸附柱置于1.5ml灭菌的离心管中，加入20-30μl的灭菌水至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

3PBI121-GhHDA6植物表达载体的构建

(1)PBI121质粒的双酶切及胶回收

将PBI121质粒用XbaI和SacI双酶切，电泳回收PBI121载体的大片段产物。酶切反应体系如下：

(2)PCR胶回收产物和酶切PBI121质粒的连接

把带有接头的PCR产物和双酶切的PBI121质粒用诺唯赞同源重组酶试剂盒

II One Step Cloning Kit进行连接，连接反应如下：

体系配置于冰上进行。

体系完成后，吹打混匀各组分，37℃反应30min，立即冰水浴5min,转化或者-20℃保存。

(3)连接产物转化大肠杆菌

1)向连接反应体系中加入100ul大肠杆菌DH5a感受态，冰浴30min；

2)42℃水浴热激45～90s；

3)冰浴2min；加入900ul无抗性的LB液体培养基，37℃，190rpm，孵育1h；

4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100ul混匀后涂布含卡那抗性的LB平板；

5)37℃，恒温培养过夜；

(4)阳性克隆的检测及测序

1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8小时；

2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。

(5)阳性菌液的保存

菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存。返还测序正确的质粒用于转农杆菌。

(6)转化农杆菌

利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：

1)-80℃农杆菌融化，冰水混合状态插入冰中。

2)100μl感受态中加入0.01～1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟，液氮5分钟，37℃五分钟，冰浴5分钟。

3)加入700ul无抗性的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3小时。

4)取100-150ul菌液于含有卡那、利福平、链霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2-3天。

5)挑选阳性克隆，在加有抗性的LB液体培养基上28度培养48h，菌液PCR验证条带正确的菌液甘油保存终浓度在20％左右，-80℃保存备用。

实施例5农杆菌介导的拟南芥的转化

(1)拟南芥培养

从1/2MS平板中移栽的哥伦比亚野生型拟南芥，种植在人工气候室，长至盛花期，将已经结的果荚剪去，并保证拟南芥根部营养土的湿度。

(2)拟南芥花序侵染转化

对于35S::GhHDA6的过表达载体的拟南芥转化采用的是花序侵染法(Clough andBent,1998)，具体操作如下：

1)菌液活化：取-80℃保存的对应重组载体的农杆菌菌液20μl，接种到1ml LB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h；

2)扩摇：取活化后的对应菌液200μl加入到50ml LB液体培养基(加入对应的抗生素)；28℃，180rpm，培养至菌液OD600值约在1.2-1.6之间(约18-20h)，在5000g条件下离心8min，弃上清，收集菌体；

3)侵染转化的介质配制：1/2MS减半、6％蔗糖、0.02％的SilwetL-77，用NaOH将pH调至5.6-5.7；

4)用转化介质悬浮上述菌体，将OD600调至0.6-0.8；

5)浸染：将拟南芥花序(主要是未开放的花苞)置于转化介质中30-50s，浸染后，将拟南芥在弱光或者避光条件下平放24h；

6)将处理后的拟南芥放置正常条件下培养，并在侵染后的一周内每天给拟南芥叶片喷水；为了提高转化效率，可在约一周后进行重复侵染；

7)待成熟后，收获拟南芥种子，即为转基因的T0代种子。

实施例6转基因拟南芥植株的表型鉴定

(1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化2天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。

(2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测，检测时所用引物为：

上游引物F：5’-ATGGAAGACTCTGCTGGAGGC-3’(SEQ ID NO.10)；

下游引物R：5’-TCAAGGTGCCGGTGGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.11)。

(3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测,荧光定量验证的过程如下：

提取RNA，反转录成cDNA，分别设计GhHDA6和拟南芥内参基因UBQ10荧光定量的引物：

GhHDA6上游引物：5’-CCATCTCCGACCCCGCTTATTC-3’(SEQ ID NO.6)；

下游引物：5’-CAAAAAGCCCATCGAACACGGG-3’(SEQ ID NO.7)。

UBQ10上游引物：5’-AGATCCAGGACAAGGAAGGTATTC-3’(SEQ ID NO.12)；

下游引物：5’-CGCAGGACCAAGTGAAGAGTAG-3’(SEQ ID NO.13)。

冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。荧光定量验证结果证实GhHDA6基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，如图3。

(4)将转基因T3代植株与非转基因植株进行消毒培养于1/2MS培养基上，4℃春化两天后，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到小花盆里生长，同等条件下种植栽培，生长到25天左右，转基因株系开始抽薹开花，非转基因拟南芥(WT)开花晚于转基因拟南芥(图4中的A)；生长到30天左右，非转基因拟南芥开始开花，而转基因拟南芥三个株系(Line 1、Line2、Line 3)开始结出果荚，株高也明显高于野生型(图4中的B)。通过统计野生型和转基因三个株系的抽薹期、开花期和莲座叶的数量，发现三个转基因株系跟野生型都存在着显著性差异，说明过表达GhHDA6明显促进拟南芥开花和生殖生长发育。

表2三个转基因株系和野生型拟南芥开花时间和莲座叶的数目

株系	抽薹(天)	开花(天)	莲座叶
				WT	28.4±1.76	30.9±1.35	11.3±0.82
Line 1	22.7±1.44**	26.8±1.28**	8.6±0.74**
				Line 2	23.3±1.41**	27.2±1.26**	9.1±0.69**
Line 3	24.2±1.21**	27.8±0.93**	9.3±0.90**

实施例7病毒诱导GhHDA6基因沉默的棉花侵染

1棉花材料种植

对收获的中棉所36种子进行硫酸脱绒后，挑选饱满的种子种植在人工气候室中，光周期和温度条件为：光照16h，28℃；黑暗8h，22℃。待幼苗子叶展平，第一片真叶露出(约10天)后，进行VIGS菌液注射试验。

2pCLCrVA沉默载体的构建

构建VIGS的沉默载体pCLCrVA选用的是Spe I和Asc I两个酶切位点，首先对质粒进行双酶切，并胶回收酶切产物。GhHDA6沉默片段从中棉所36二叶期cDNA里通过PCR进行扩增，用到的引物为：

上游引物F：

5’-CAAAATGGCATGCCTGCAGACTAGTGTCTGGTGACAGATTGGGTTGC-3’(SEQ ID NO.14)；

下游引物R：

5’-GAATTCACTAGACCTAGGGGCGCGCCCTCCATATCTCTAGGTGCATTCAGG-3’(SEQ IDNO.15)。

扩增得到的GhHDA6沉默片段的序列如下：

GGTGACAGATTGGGTTGCTTCAACTTGTCTGTGAAGGGCCATGCTGATTGTCTTCGCTTTCTTAGATCTTTCAATGTTCCCCTAATGGTCTTGGGTGGAGGAGGGTATACTATCCGCAATGTTGCCAGATGTTGGTGCTATGAGACAGCTGTTGCAGTTGGGGTTGAGCCTGATAATAAGCTGCCTTATAATGAATATTATGAGTATTTTGGTCCAGATTATACACTTCATGTTGAAGTGGGCAGCATGGAGAACCTGAATGCACCTAGAGATATGGAGAAGA(SEQ ID NO.3)。

VIGS沉默片段胶回收以后，按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，南京)操作说明进行基因片段和载体的重组连接。将反应体系转入大肠杆菌感受态Trans 5α中，具体步骤同实施例4中的步骤3。将菌液涂布到加有卡那霉素(Kan，50μg/ml)的LB平板，放置在37℃温度下，倒置过夜培养12-16h，挑选阳性的单克隆进行测序。将测序正确的质粒转入农杆菌，并进行菌落PCR，条带正确的菌液甘油保存至-80℃。

3菌液注射

棉花VIGS的具体操作过程参考Gu等人的方法(Gu et al.,2014)，具体过程如下：

(1)活化菌液：将20μl的-80℃冻存的上述重组质粒的农杆菌菌液(连接目的基因(GhHDA6)的pCLCrVA载体)以及其他三种农杆菌菌液(阳性对照(GhPDS)的pCLCrVA、空载对照pCLCrVA和载体pCLCrVB)分别加入含三抗(卡那霉素、利福平和链霉素)的液体LB培养基中，在28℃，180rpm条件下培养14-16h；

(2)扩摇：将50-100μl的活化菌液加入50ml含上述三种抗生素的液体LB培养基，在28℃，180rpm条件下培养16-20h，使菌液的OD600值在1.5-2.0之间(这时的菌液一般变为橙黄色)。在5000g条件下离心10min，回收菌体；

(3)转化介质的调配：

转化介质的配方：MgCl₂，10mM；MES(2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid)，10mM，用NaOH调pH为5.6；AS(acetosyringone)，200μM。

用转化介质对上述收集的菌体进行悬浮，调OD600值在1.5左右，室温静置3h以上(避光)。

(4)将pCLCrVB与pCLCrVA(空载)、阳性对照的pCLCrVA、目的基因的pCLCrVA的介质分别按照1:1混匀；

(5)用1ml的无菌注射器针头划破棉花子叶背面的表皮，去除针头，将混匀后的菌液注入子叶，直至子叶完全侵润；

(6)将注射后的棉花幼苗避光过夜培养，后置于光温条件为：23℃；16h(光照)/8h(黑暗)条件下的人工气候室正常管理。

4沉默株系的鉴定

待注射阳性对照(PDS)的pCLCrVA棉花幼苗的叶片出现白化表型后，对注射的pCLCrVA::GhHDA6和pCLCrVA(空载)取叶片，提取DNA和RNA，进行PCR和荧光定量PCR检测，将检测出含有目的片段的幼苗种植到大花盆中正常管理，直至棉花开花。通过荧光定量PCR，检测到沉默植株中GhHDA6的表达量相较于空载对照降低50％左右(图5中的C)。

5表型鉴定

阳性棉花植株移至大盆以后，在同等条件下种植培养，统计其开花时间。表型观察发现，沉默植株和空载对照相比，开花期推迟6天左右，株型和株高基本上没有差异(图5)，进一步证明GhHDA6在控制棉花开花期方面具有重要的作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献

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喻树迅,王寒涛,魏恒玲,et al.2017.棉花早熟性研究进展及其应用.棉花学报[J].

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 棉花

<400> 1

atggaagact ctgctggagg cgcatcatta cggtcgggtc ccgacgggaa gaagcggcgt 60

gtgacatact tctacgagcc aacgatcggc gactactatt acggtcaggg tcacccgatg 120

aaaccccacc ggattcgtat ggcacacaat ctcatcgtcc attattctct ccaccgtcgg 180

atggagatta accgtccttt ccccgccggt cccgacgaca tccgtcgctt tcacaccgaa 240

gagtatgtgg acttcctcaa cgccgtcacc cccgattcca tctccgaccc cgcttattct 300

cgccatttga agcgtttcaa tgtcggagag gattgccccg tgttcgatgg gctttttggt 360

ttctgccagg cctccgctgg tggctccatt ggtgccgccg ttaagttgaa tagaggggat 420

gccgacatcg ccatcaattg ggctggtgga ttgcatcatg ctaagaaaag cgaggcttct 480

gggttttgct atgttaatga tatcgtgctt gggattcttg agctcctgaa atatcacagg 540

cgtgtgctgt atgtagatat tgatgttcat cacggtgatg gtgtagaaga ggcattttac 600

accactgaca gagttatgac tgtgtctttc cataaatttg gggatttctt cccagggact 660

ggacacatca gggatgttgg ggtgggtaat ggcaaatact atgccttgaa tattcccttg 720

aatgatggga tggatgatga gagttttcgg ggtctatttc gtcctatcat ccaaaaggtc 780

atggaagtgt atcaaccaga tgcagttgtt cttcaatgtg gagcagattc attgtctggt 840

gacagattgg gttgcttcaa cttgtctgtg aagggccatg ctgattgtct tcgctttctt 900

agatctttca atgttcccct aatggtcttg ggtggaggag ggtatactat ccgcaatgtt 960

gccagatgtt ggtgctatga gacagctgtt gcagttgggg ttgagcctga taataagctg 1020

ccttataatg aatattatga gtatttcggt ccagattata cacttcatgt tgaagtgggc 1080

agcatggaga acctgaatgc acctagagat atggagaaga taaggaacat gctattagag 1140

cagctttcta gattatctca tgcacccagt gtaccttttc aaacaacacc atccaccatc 1200

caaccgcccg aggaggccga ggaggacatg gatgaaagac caaaacctcg catatggaat 1260

ggggatgatt atgagtctga tcctgaagag gatgagaaac ctttacgcag attctccaat 1320

tctgatgtaa tacaacttac aacagatgct gatatgaggc aggtatcaca agatttgaaa 1380

gaagtgaaag cagaagaaca accaccggca ccttga 1416

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 棉花

<400> 2

Met Glu Asp Ser Ala Gly Gly Ala Ser Leu Arg Ser Gly Pro Asp Gly

1 5 10 15

Lys Lys Arg Arg Val Thr Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Ile Arg Met Ala

35 40 45

His Asn Leu Ile Val His Tyr Ser Leu His Arg Arg Met Glu Ile Asn

50 55 60

Arg Pro Phe Pro Ala Gly Pro Asp Asp Ile Arg Arg Phe His Thr Glu

65 70 75 80

Glu Tyr Val Asp Phe Leu Asn Ala Val Thr Pro Asp Ser Ile Ser Asp

85 90 95

Pro Ala Tyr Ser Arg His Leu Lys Arg Phe Asn Val Gly Glu Asp Cys

100 105 110

Pro Val Phe Asp Gly Leu Phe Gly Phe Cys Gln Ala Ser Ala Gly Gly

115 120 125

Ser Ile Gly Ala Ala Val Lys Leu Asn Arg Gly Asp Ala Asp Ile Ala

130 135 140

Ile Asn Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys Ser Glu Ala Ser

145 150 155 160

Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Gly Ile Leu Glu Leu Leu

165 170 175

Lys Tyr His Arg Arg Val Leu Tyr Val Asp Ile Asp Val His His Gly

180 185 190

Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg Val Met Thr Val

195 200 205

Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Phe Phe Pro Gly Thr Gly His Ile Arg

210 215 220

Asp Val Gly Val Gly Asn Gly Lys Tyr Tyr Ala Leu Asn Ile Pro Leu

225 230 235 240

Asn Asp Gly Met Asp Asp Glu Ser Phe Arg Gly Leu Phe Arg Pro Ile

245 250 255

Ile Gln Lys Val Met Glu Val Tyr Gln Pro Asp Ala Val Val Leu Gln

260 265 270

Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu Gly Cys Phe Asn Leu

275 280 285

Ser Val Lys Gly His Ala Asp Cys Leu Arg Phe Leu Arg Ser Phe Asn

290 295 300

Val Pro Leu Met Val Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Ile Arg Asn Val

305 310 315 320

Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr Ala Val Ala Val Gly Val Glu Pro

325 330 335

Asp Asn Lys Leu Pro Tyr Asn Glu Tyr Tyr Glu Tyr Phe Gly Pro Asp

340 345 350

Tyr Thr Leu His Val Glu Val Gly Ser Met Glu Asn Leu Asn Ala Pro

355 360 365

Arg Asp Met Glu Lys Ile Arg Asn Met Leu Leu Glu Gln Leu Ser Arg

370 375 380

Leu Ser His Ala Pro Ser Val Pro Phe Gln Thr Thr Pro Ser Thr Ile

385 390 395 400

Gln Pro Pro Glu Glu Ala Glu Glu Asp Met Asp Glu Arg Pro Lys Pro

405 410 415

Arg Ile Trp Asn Gly Asp Asp Tyr Glu Ser Asp Pro Glu Glu Asp Glu

420 425 430

Lys Pro Leu Arg Arg Phe Ser Asn Ser Asp Val Ile Gln Leu Thr Thr

435 440 445

Asp Ala Asp Met Arg Gln Val Ser Gln Asp Leu Lys Glu Val Lys Ala

450 455 460

Glu Glu Gln Pro Pro Ala Pro

465 470

<210> 3

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtgacagat tgggttgctt caacttgtct gtgaagggcc atgctgattg tcttcgcttt 60

cttagatctt tcaatgttcc cctaatggtc ttgggtggag gagggtatac tatccgcaat 120

gttgccagat gttggtgcta tgagacagct gttgcagttg gggttgagcc tgataataag 180

ctgccttata atgaatatta tgagtatttt ggtccagatt atacacttca tgttgaagtg 240

ggcagcatgg agaacctgaa tgcacctaga gatatggaga aga 283

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcctccgtc ttgaccttg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtccgtcag gcaactcat 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccatctccga ccccgcttat tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaaaagccc atcgaacacg gg 22

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cacgggggac tctagaatgg aagactctgc tggaggc 37

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatcggggaa attcgagctc tcaaggtgcc ggtggttgtt c 41

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggaagact ctgctggagg c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcaaggtgcc ggtggttgtt c 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agatccagga caaggaaggt attc 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcaggacca agtgaagagt ag 22

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caaaatggca tgcctgcaga ctagtgtctg gtgacagatt gggttgc 47

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaattcacta gacctagggg cgcgccctcc atatctctag gtgcattcag g 51

Claims

1.棉花GhHDA6基因在调控植物开花期中的应用，所述GhHDA6基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GhHDA6基因编码的氨基酸具有如SEQID NO.2所示序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括棉花和拟南芥。

4.一种含GhHDA6基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有GhHDA6基因片段，所述GhHDA6基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列。

5.权利要求4所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，在基础质粒上引入GhHDA6基因片段，构建得到所述重组质粒。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述基础质粒为PBI121。

7.权利要求4所述的重组质粒或者采用权利要求5或6所述的制备方法制备得到的重组质粒在促进拟南芥开花中的应用。

8.一种抑制基因表达重组质粒，其特征在于，所述抑制基因表达重组质粒含有如SEQID NO.3所示序列。

9.权利要求8所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，在基础质粒上引入SEQ IDNO.3所示序列，构建得到所述重组质粒；

优选地，所述基础质粒为pCLCrVA。

10.权利要求8所述的抑制基因表达重组质粒或者采用权利要求9所述的制备方法制备得到的抑制基因表达重组质粒在延迟棉花开花中的应用。