CN110129338B - 玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用 - Google Patents

玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用，ZmEREB160基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。玉米转录因子ZmEREB160蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的玉米转录因子ZmEREB160基因能提高植物耐干旱能力或渗透胁迫耐性。

Description

玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用
技术领域
本发明属于基因领域，具体涉及玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用。
背景技术
干旱、盐渍、高温等非生物胁迫严重影响玉米的生长和产量，由于逆境在玉米的整个生长周期有可能发生，玉米在长期的进化中，逐渐建立起相应的抗性机制。为了提高玉米的耐旱、耐盐等能力成为了育种中迫切的需要，挖掘玉米中具有应用价值的抵抗环境胁迫的功能基因，培育耐旱的玉米种质资源具有重要研究意义。转录因子AP2/EREBP家族参与了植物细胞发育、激素应答和非生物逆境反应，该类基因表达对提高玉米在干旱胁迫下的耐性起着重要的作用。
大豆中GmERF3、GmERF057在烟草转基因中，提高了烟草对盐和干旱的耐性GmERF7能提高大豆的耐旱性。小麦EREBP转录因子W17基因可以显著增强转基因拟南芥耐寒性。这些研究表明，AP2家族蛋白参与了非生物胁迫的应答，可以增强植物对干旱的耐性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供新的玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用。
本发明的技术方案为：
玉米转录因子ZmEREB160基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
玉米转录因子ZmEREB160蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
玉米转录因子ZmEREB160基因在提高玉米耐干旱能力上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
ZmEREB160基因是通过全基因组关联分析，与在干旱胁迫处理下的相对电导率表型性状进行关联分析，发现的候选耐旱基因。ZmEREB160基因在玉米受到干旱胁迫的诱导，并且表达上调。说明该基因对干旱胁迫具有应答，参与了玉米耐旱的作用。通过在拟南芥转基因ZmEREB160的过表达株系中发现，增强了转基因植株在幼苗时期对渗透胁迫的耐性。
附图说明
图1 ZmEREB160基因在PEG胁迫处理下表达分析；
图2 ZmEREB160转基因拟南芥渗透胁迫处理，WT：拟南芥野生型，L3、L4和L5是ZmEREB160转基因拟南芥株系。
具体实施方式
实施例1 ZmEREB160基因的筛选和克隆
选择68份玉米自交系材料，种子播种于含有草炭土的营养钵中，每份自交系种植30钵，每钵2粒种子。在温室中培养，待玉米苗长至三叶一心期时，进行胁迫处理。对照每4天浇一次水，干旱胁迫停止浇水。10天后测定相对电导率，3次重复。相对电导率测定方法按照张宪政主编的《作物生理研究法》。相对电导率的抗旱系数计算如下：
耐寒系数＝干旱测定值/对照测定值。
68份玉米自交系用IluminaMaizeSNP 55K芯片测定基因信息，通过软件plink对芯片数据进行质控，获得了40580个SNPs，挑选在玉米10条染色体上均匀分布的2642个SNPs，用STRUCTURE软件进行群体遗传结构划分，并用SPAGeDi软件进行亲缘关系计算。最后通过TASSEL软件进行全基因组关联分析，采用MLM混合模型。
利用全基因组关联分析玉米苗期干旱胁迫处理，找到与相对电导率关联位点，在这个位点找了候选基因ZmEREB160。根据网站上B73的基因组设计引物扩增ZmEREB160:
上游引物：5’-CGaagcttATGTGCGGCGGCGCCATCCTGTC-3’(SEQ ID No.3)；
下游引物：5’-GCgtcgacGGTAGAAACCAGCAGACATGGGCATG-3’(SEQ ID No.4)。
基因序列全长1098bp。利用KOD-plus neo，吉853cDNA为模板扩增基因。扩增体系：50μL，引物各1.5μL(引物浓度10μmol/L)，cDNA：200ng；25mM MgSO4：3μL；2mM dNTPs：5μL，10X PCR Buffer：5μL；KOD-plus neo：1μL。
反应程序：
Figure BDA0002094710350000021
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。PCR产物进行胶回收后，与pMD18T载体连接。连接产物转化E.coli TOP10感受态，感受态涂布在LB(Kan+)平板上。从平板上挑选菌落送公司测序验证。经测序，ZmEREB160基因序列如SEQ ID No.1所示。其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2 ZmEREB160基因在干旱胁迫下转录表达分析
玉米自交系吉853播种于含有蛭石的营养钵中，待长至三叶一心期时，把玉米苗放置含有20％(w/v)PEG6000的营养液中，进行胁迫处理，取0和3小时的样品，用HiPure植物RNA小量提取试剂盒(Magen，中国)提取总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，用玉米Actin基因作为内参，进行荧光定量分析ZmEREB160基因在胁迫下的表达。采用2--ΔΔCt进行数据分析。结果表明，ZmEREB160基因表达量上调，ZmEREB160基因受干旱诱导表达(见图1)。
实施例3转基因ZmEREB160植物的构建及渗透胁迫处理
ZmEREB160通过HindIII和SalI限制性内切酶重pMD18T载体切下，并同时用这两个酶酶切super pCAMBIA1300-GFP载体，用胶回收试剂盒回收酶切产物。然后，用T4DNAase连接ZmEREB160和super pCAMBIA1300-GFP载体；连接产物转化E.coli TOP10感受态，感受态涂布在LB(Kan+)平板上。从平板上挑选菌落送公司测序验证。提取测序正确的克隆，并通过冻融法转化农杆菌GV3101。
农杆菌法转化拟南芥
1)农杆菌菌种吸取20μl加于3ml YEB(kan+、Rif+)中；
2)28℃，200rpm，摇24h；
3)取摇好的菌，12,000rpm，1min离心收集菌株，去上清
4)将沉淀用1ml 5％蔗糖1/2MS溶液重悬，再次收集菌株
5)最后仍用1ml 5％蔗糖1/2MS溶液重悬，同时加入0.2μl Silwet77，充分混匀后，即可侵染拟南芥。
6)待拟南芥种子成熟后，收获种子。
7)种子播种在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，挑取抗性苗。
8)PCR鉴定抗性苗(引物用上述扩增基因的引物)，反复筛选抗性苗和PCR鉴定，直至获得纯合子T3代种子。
转基因ZmEREB160拟南芥渗透胁迫处理
拟南芥野生型和转基因ZmEREB160拟南芥种子经过表面消毒后，播种在1/2MS培养基上，4℃处理3天。然后放置于21℃光照培养箱培养5天，把野生型和转基因拟南芥移到含有400mM甘露醇的1/2MS培养上垂直培养6天。从图2可以看到，野生型拟南芥的根生长受到了一致，转基因拟南芥明显比野生型根长。实验表明，ZmEREB160基因增强了拟南芥对渗透胁迫的耐性。ZmEREB160基因的表达，能增强植物的耐旱性。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
atgtgcggcg gcgccatcct gtcggacatc atcccgccgc cgccgccgcg gcgggtcacg 60
gcgggccacc tctggcccga gagcaagaag ccgaggaggg ctgcagccgg caggaggaga 120
gcccccgtgg agcaggagca ggaggaggat ttcgaggccg acttcgagga gttcgaggtg 180
gagtccggcg agtcggagct cgagtccgag gacgagccca agcccaagcc cttcgccgcc 240
cccagcagcg cgctcgccag aggtggacta aacactggtg cagctggtgt cgatggccct 300
gctgcaaatt cagttaaaag gaagaggaag aaccagttca ggggtatccg ccggcgcccg 360
tggggcaaat gggctgctga gatcagagat cctcgcaagg gcgtgcgcgt ctggctcggt 420
acattcaact ctcccgaaga agctgccaga gcttacgacg ccgaggcacg caggatccgc 480
ggcaagaagg ctaaagtcaa cttcccggat gaggttccta cggcggtttc tcagaagcgc 540
cgtgctgctg ggcctgcctc tctgaaagcg cctaagatgg acgttgagga ggagaagccg 600
atcatcaagc tcgcagtgaa caatatgacc aactcaaacg catatcacta ccctgccgtc 660
gtcggccacc acaacatcat acccgagcca ttcatgcaga ctcagaacat gccattcgct 720
cctctggtga attatgctgc cctcgtgaac ctgtcttcag accaaggcag caactcgttc 780
ggttgctcgg acttcagcct cgagaacgac tccaggaccc ctgacataac ttcggtgcct 840
gcgcccgttg ccaccttggc cgccgttggc gagtctgcgt ttgtccagaa caccgccgac 900
catggtgtgg cgcctcctgc gacggggaac gctggtgttg atctcgccga gttggagccg 960
tatatgaatt tcctgatgga cggtggttca gacgactcga tcagcactct cttgagctgt 1020
gatggatccc aggacgtggt cagcaacatg gacctttgga gcttcgacga catgcccatg 1080
tctgctggtt tctactag 1098
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 2
Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ser Asp Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10 15
Arg Arg Val Thr Ala Gly His Leu Trp Pro Glu Ser Lys Lys Pro Arg
20 25 30
Arg Ala Ala Ala Gly Arg Arg Arg Ala Pro Val Glu Gln Glu Gln Glu
35 40 45
Glu Asp Phe Glu Ala Asp Phe Glu Glu Phe Glu Val Glu Ser Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Leu Glu Ser Glu Asp Glu Pro Lys Pro Lys Pro Phe Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ser Ser Ala Leu Ala Arg Gly Gly Leu Asn Thr Gly Ala Ala Gly
85 90 95
Val Asp Gly Pro Ala Ala Asn Ser Val Lys Arg Lys Arg Lys Asn Gln
100 105 110
Phe Arg Gly Ile Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile
115 120 125
Arg Asp Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Ser
130 135 140
Pro Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Arg Ile Arg
145 150 155 160
Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Glu Val Pro Thr Ala Val
165 170 175
Ser Gln Lys Arg Arg Ala Ala Gly Pro Ala Ser Leu Lys Ala Pro Lys
180 185 190
Met Asp Val Glu Glu Glu Lys Pro Ile Ile Lys Leu Ala Val Asn Asn
195 200 205
Met Thr Asn Ser Asn Ala Tyr His Tyr Pro Ala Val Val Gly His His
210 215 220
Asn Ile Ile Pro Glu Pro Phe Met Gln Thr Gln Asn Met Pro Phe Ala
225 230 235 240
Pro Leu Val Asn Tyr Ala Ala Leu Val Asn Leu Ser Ser Asp Gln Gly
245 250 255
Ser Asn Ser Phe Gly Cys Ser Asp Phe Ser Leu Glu Asn Asp Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Asp Ile Thr Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Thr Leu Ala Ala
275 280 285
Val Gly Glu Ser Ala Phe Val Gln Asn Thr Ala Asp His Gly Val Ala
290 295 300
Pro Pro Ala Thr Gly Asn Ala Gly Val Asp Leu Ala Glu Leu Glu Pro
305 310 315 320
Tyr Met Asn Phe Leu Met Asp Gly Gly Ser Asp Asp Ser Ile Ser Thr
325 330 335
Leu Leu Ser Cys Asp Gly Ser Gln Asp Val Val Ser Asn Met Asp Leu
340 345 350
Trp Ser Phe Asp Asp Met Pro Met Ser Ala Gly Phe Tyr
355 360 365
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaagcttat gtgcggcggc gccatcctgt c 31
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtcgacgg tagaaaccag cagacatggg catg 34

Claims (1)

1. 玉米转录因子ZmEREB160基因在提高拟南芥渗透胁迫耐性上的应用，所述玉米转录因子ZmEREB160基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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