CN113337522A - 棉花GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了棉花GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用，属于植物基因工程技术领域。GhNFYC4基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列并可编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。利用本发明，可为植物尤其是棉花的分子改良进行技术支持。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及棉花GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用。
背景技术
棉花是我国最重要的天然纺织原料来源，在我国纺织工业中起着举足轻重的作用。然而，目前我国棉花的种植结构单一、机械化程度低和早熟棉优异品种缺乏，造成生产收益较低，以致近10年来我国棉花种植面积大幅下降。在黄河、长江流域棉区，利用早熟棉品种，实现麦(油)棉一年两熟生产，以期解决目前该流域棉花种植的困局。在西北内陆棉区，春季气温回升慢、终霜结束晚，秋季气温下降快、初霜开始早，早熟性也是该区域棉花育种的主要目标及机械化生产的前提条件。在目前我国推进种植业结构调整、植棉全程机械化进程的大形势下，早熟性显得尤为重要。因此，鉴定调节棉花花发育相关基因，阐明其调控机制，并创制早熟棉优异种质资源，对于早熟棉品种的培育及产业化具有重要的意义。
植物开花是营养生长向生殖生长的转变，该过程经历开花诱导、花的发端和花器官形成3个阶段的复杂过程，每个过程完成均受多个基因及环境因子的调控。陆地棉从花芽开始分化到植株停止生长，一直处于营养生长与生殖生长并进阶段。相对于一般双子叶植物，棉花的花器官发育很有特点，花器官除萼片、花瓣、花药和心皮外，在萼片外层还存在一轮苞叶。由于陆地棉的花发育特点及结构上差异，其调控花发育的分子机制与拟南芥等模式植物有所不同。但目前对棉花花器官发育相关的分子生物学研究较少，其调控机制仍不清楚。
发明内容
发明人通过从陆地棉中克隆出GhNFYC4基因，该基因通过构建过表达载体，得到的过表达转基因株系相比于野生型开花提前，说明GhNFYC4基因在控制棉花开花期方面起到了重要的调控作用，可用于棉花分子改良。从而完成本发明。
本发明提供了GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用，所述GhNFYC4基因具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
GhNFYC4基因的开放阅读框为795bp。
在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列能够编码SEQ IDNO:2所示氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，在植物中提高GhNFYC4基因的表达量，以促进植物开花。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的在植物中提高GhNFYC4基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源GhNFYC4基因的表达，或在植物中过表达外源GhNFYC4基因。
在本发明的一个具体要求实施方案中所述过表达外源GhNFYC4基因是指将所述GhNFYC4基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。
进一步地，所述GhNFYC4基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。
更进一步地，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述GhNFYC4基因的表达。
再进一步地，所述组成型启动子是35S启动子。
在本发明中，所述促进开花是指促使植物开花期提前。
在本发明中，所述植物是棉花、玉米、水稻、小麦或拟南芥。
本发明的有益效果
本发明通过沉默棉花中GhNFYC4基因，结果表明GhNFYC4基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用。利用本发明，可为植物尤其是棉花的抗逆分子改良进行技术支持。
附图说明
图1示出了GhNFYC4在早晚熟材料顶芽中的表达量。
图2示出了GhNFYC4促进过表达转基因拟南芥提早开花。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
本发明实施例选取的棉花材料为陆地棉标准系TM-1、早熟品种中棉所50和晚熟品种国欣棉11，其中中棉所50和国欣棉11在开花时间和生育期存在着极显著差异(表1)，种植于中国农业科学院棉花研究所试验田(河南省安阳市白璧镇)，管理措施为正常大田管理。取样方式为三个棉花品种一叶期到五叶期的幼芽，至于液氮中，在提取样品RNA之前放置-80℃留存。
表1中棉所50和国欣棉11性状显著性检验
本发明实施例使用的试剂与耗材如下：
限制性内切酶，修饰酶、PCR反应体系相关酶、同源重组酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。
其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素等索莱宝生物有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌感受态购自擎科生物公司
培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55度时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS 22g/L，琼脂粉8g/L，蔗糖30g/L。
主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。
实施例1棉花GhNFYC4基因的生物信息学分析
从CottonFGD(http://www.cottonfgd.org/)上获得GhNFYC4(Gh_D12G1881)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，其开放阅读框为795bp，编码264个氨基酸，我们将该基因命名为GhNFYC4，并对其功能进行研究。
GhNFYC4开放阅读框序列为(SEQ ID NO:1)：
ATGGACGGCAACAAGCAAGCCCAGTCCTCCTCTTACCCTCCTCAGCCTCCCACTACTTCTATTACGCCTTCTCCTCCTTCCTCCTCCGCCGCCATCGCCGCCACTCCGCCTGCTCCTTTCCACCACCTCCTCCAGCAGCAGCAGCAACAGCTCCAAATGTTCTGGTCTTACCAGCGCCAAGAAATCGAGCTAGTCAACGACTTCAAGAACCATCAGCTTCCTCTTGCTCGCATCAAGAAGATCATGAAAGCCGACGAAGATGTCCGTATGATCTCCGCTGAAGCCCCTATTCTCTTCGCCAAAGCCTGCGAGCTTTTCATTCTGGAGCTTACCATCCGTTCCTGGCTTCACGCCGAGGAGAACAAGCGACGGACGCTTCAGAAAAACGACATCGCGGCGGCTATTACTAGGACCGACATTTTCGATTTCTTGGTGGATATTGTGCCCAGGGACGAGATCAAGGATGAGGCCGGTCTGGGTGGGATGGTGGGTCCCACCGCCAGTGGGGTGCCATATTTTTATCCTCCCATGAGTCAGCCTGCTGGCGCTCCTGCTGGACCTGGCGGGATGATGATTGGAAGGCCCGCCGTCGATACAACCGGTGGTATTTATGCTCAGCCTCCTTCTCAGGCTTGGCAGAGTGTTTGGCAGACGGCGGGGGCTGACGATGGGTCGTATGCCAGTGGAGGTAGCGGCGGTCAGGGGAATCTTGACGGACAAGGGTATGTAGACAACTATTGTTTTTATTCCATTCAAAGTTTAGGTTTTTTTCTTGAACTCTTTATCAGTTTGTAG
GhNFYC4编码的氨基酸序列为(SEQ ID NO:2)：
MDGNKQAQSSSYPPQPPTTSITPSPPSSSAAIAATPPAPFHHLLQQQQQQLQMFWSYQRQEIELVNDFKNHQLPLARIKKIMKADEDVRMISAEAPILFAKACELFILELTIRSWLHAEENKRRTLQKNDIAAAITRTDIFDFLVDIVPRDEIKDEAGLGGMVGPTASGVPYFYPPMSQPAGAPAGPGGMMIGRPAVDTTGGIYAQPPSQAWQSVWQTAGADDGSYASGGSGGQGNLDGQGYVDNYCFYSIQSLGFFLELFISL
实施例2 GhNFYC4的表达模式分析
因为花芽分化和顶芽的发育密切相关，许多开花相关基因在顶芽中都具有较高的表达量。因此，我们选取了一个早熟棉花品种中棉所50，一个晚熟棉花品种国欣棉11，提取一叶期至五叶期顶芽的RNA，并用qRT-PCR对表达量进行检测。结果表明，该基因在早熟棉花品种中一叶期至五叶期的每个时期均高于晚熟棉花品种，并呈现及显著差异。由此我们猜测该基因和棉花花芽分化有关。GhNFYC4在中棉所50和国欣棉11两个材料花芽分化时期表达量的差异分析具体步骤：
1磨样
把TM-1、中棉所50和国欣棉11三个材料一叶期到五叶期的顶芽置于液氮中，用研钵和研磨棒将其研磨至粉末状，大约取100mg样品放于1.5ML离心管中。
2 RNA的提取
以下所有离心步骤均在室温下进行
(1)匀浆处理：将研磨好的样品中加入700μL SL(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。
注意1：对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SL用量增加至700μL。
注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。
(2)12,000rpm离心2min。
(3)将上清液转移至过滤柱CS上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片。
(4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(5)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(6)DNaseI工作液：取10μL DNaseI储存液和70μL RDD溶液轻柔混匀。
(7)向CR3中加入80μL的DNaseI工作液，室温静止15min。
(8)静置完后，向CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(9)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(10)重复步骤9。
(11)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。如果预期RNA得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的RNA溶液再加入吸附柱CR3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。
为预防RNase污染，注意事项：
(1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染；
(2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染；
(3)RNA在裂解液SL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
(4)配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。
3反转录cDNA的合成
样品cDNA的合成是利用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒进行(宝生物，大连)。该试验过程主要包括两步：
(1)RNA样品中可能残留的基因组DNA(gDNA)的去除；
(2)将步骤(1)中得到的RNA反转录成单链cDNA，所有的体系配置过程都需在冰上进行。
具体操作如下：
(1)RNA样品中的gDNA的去除：
1)反应体系的配置
2)将配好的体系室温放置5-10min后，再将体系转置冰上，备用。
(2)cDNA单链合成
反应体系的配置：
将上述配好且混匀的体系共20μL放置在37℃下，30min；85℃下，5sec；4℃保存。将反转录后的cDNA放置到-20℃，可长期保存。
4荧光定量PCR
(1)利用Primer5.0软件设计GhNFYC4基因的特异性引物，用棉花GhActin7基因为内参基因。
(2)荧光定量PCR
利用Cwbio(China)的UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒和AppliedBiosystems 7500仪器完成。具体过程如下：
1)将上述的cDNA原液稀释5倍；
2)反应体系的配置(冰上操作)：
将配置好的体系混匀，离心至无气泡，然后利用Applied Biosystems 7500进行荧光定量PCR：按照两步法设置PCR程序：预变性：95℃2min；95℃，5sec；60℃，34sec(这一步收集荧光信号)，这两步设置40个循环；最后溶解曲线分析：95℃，15sec；60℃，20sec；95℃，15sec。完成上述反应后，将数据导出，计算基因的表达量。
结果分析：
GhNFYC4在中棉所50和国欣棉11两个材料花芽分化时期的相对表达量是利用2-△△Ct方法计算的。由图1可以看出，GhNFYC4基因在早熟棉花品种中一叶期至五叶期的每个时期均高于晚熟棉花品种，并呈现及显著差异，说明该基因跟可能和棉花早熟性有关。
实施例3 GhNFYC4基因的克隆和过表达载体的构建
1基因引物的设计
采用Prime 5软件设计引物，用PCR(Polymerase Chain Reaction)的方法从陆地棉TM-1中扩增，所用cDNA为上述步骤中TM-1二叶期的样品。为了扩增基因编码区全长，并加上特定酶切位点，根据GhNFYC4的CDS序列，分别在起始密码子ATG和终止密码子处设计含有适合酶切位点引物。所用酶切位点为XbaI和SacI。
GhNFYC4酶切位点引物序列如下：
GhNFYC4-F(SEQ ID NO:7)
5’-CACGGGGGACTCTAGAATGGACGGCAACAAGCAA-3’
GhNFYC4-R(SEQ ID NO:8)
5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTACAAACTGATAAAGAGTTCA-3’
2基因克隆的PCR反应体系、程序和产物检测
(1)PCR反应体系
(2)PCR反应程序
(3)PCR产物的检测
取2μL PCR产物，加入3μL 6×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测条带大小是否1416bp左右。
(4)PCR产物的胶回收
采用Vazyme产物纯化试剂盒，步骤如下：
1)DNA电泳结束后，在紫外灯快速切下含有目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。秤取凝胶中粮(去除空管的重量)，100mg凝胶等同于100μL体积，作为一个凝胶体积；
2)加入等体积的Buffer GDP。50～55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶；
3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2mL收集管中，把≤700μL溶胶液转移至吸附柱中，12,000Xg离心30-60sec。若溶胶体积大于700μL，把吸附柱置于收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。
4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60sec。
5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μL Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60sec。
6)重复步骤5。
7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min。
8)将吸附柱置于1.5mL灭菌的离心管中，加入20-30μL的灭菌水至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。
实施例4 PBI121-GhNFYC4植物表达载体的构建
(1)PBI121质粒的双酶切及胶回收
将PBI121质粒用XbaI和SacI双酶切，电泳回收PBI121载体的大片段产物。酶切反应体系如下：
(2)PCR胶回收产物和酶切PBI121质粒的连接
把带有接头的PCR产物和双酶切的PBI121质粒用诺唯赞同源重组酶试剂盒
One Step Cloning Kit进行连接，连接反应如下：
体系配置于冰上进行。
体系完成后，吹打混匀各组分，37℃反应30min，立即冰水浴5min，转化或者-20℃保存。
(3)连接产物转化大肠杆菌
1)向连接反应体系中加入100μL大肠杆菌DH5a感受态，冰浴30min；
2)42℃水浴热激45～90sec；
3)冰浴2min；加入900μL无抗性的LB液体培养基，37℃，190rpm，孵育1h；
4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100μL混匀后涂布含卡那抗性的LB平板；
5)37℃，恒温培养过夜。
(4)阳性克隆的检测及测序
1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8h；
2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。
(5)阳性菌液的保存
菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存。返还测序正确的质粒用于转农杆菌。
(6)转化农杆菌
利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：
1)-80℃农杆菌融化，冰水混合状态插入冰中。
2)100μL感受态中加入0.01～1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃5min，冰浴5min。
3)加入700μL无抗性的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。
4)取100-150μL菌液于含有卡那、利福平、链霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2-3天。
5)挑选阳性克隆，在加有抗性的LB液体培养基上28度培养48h，菌液PCR验证条带正确的菌液甘油保存终浓度在20％左右，-80℃保存备用。
实施例5农杆菌介导的拟南芥的转化
(1)拟南芥培养
从1/2MS平板中移栽的哥伦比亚野生型拟南芥，种植在人工气候室，长至盛花期，将已经结的果荚剪去，并保证拟南芥根部营养土的湿度。
(2)拟南芥花序侵染转化
对于35S::GhNFYC4的过表达载体的拟南芥转化采用的是花序侵染法，具体操作如下：
1)菌液活化：取-80℃保存的对应重组载体的农杆菌菌液20μL，接种到1mL LB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h；
2)扩摇：取活化后的对应菌液200μL加入到50mL LB液体培养基(加入对应的抗生素)；28℃，180rpm，培养至菌液OD600值约在1.2-1.6之间(约18-20h)，5000g，离心8min，弃上清，收集菌体；
3)侵染转化的介质配制：1/2MS减半、6％蔗糖、0.02％的SilwetL-77，用NaOH将pH调至5.6-5.7；
4)用转化介质悬浮上述菌体，将OD600调至0.6-0.8；
5)浸染：将拟南芥花序(主要是未开放的花苞)置于转化介质中30-50sec，浸染后，将拟南芥在弱光或者避光条件下平放24h；
6)将处理后的拟南芥放置正常条件下培养，并在侵染后的一周内每天给拟南芥叶片喷水；为了提高转化效率，可在约一周后进行重复侵染；
7)待成熟后，收获拟南芥种子，即为转基因的T0代种子。
实施例6转基因拟南芥植株的表型鉴定
(1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化2天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。
(2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测，检测时所用引物为：
35S-F GACGCACAATCCCACTATCC SEQ ID NO:9
GhNFYC4-R CTACAAACTGATAAAGAGTTCA SEQ ID NO:10
(3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测，荧光定量验证的过程如下：
提取RNA，反转录成cDNA，GhNFYC4荧光定量的引物：
GhNFYC4-RT-F GACGAGATCAAGGATGAGGCCG SEQ ID NO:11
GhNFYC4-RT-R CTGGCATACGACCCATCGTCAG SEQ ID NO:12
冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。荧光定量验证结果证实GhNFYC4基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，如图2。
(4)将转基因T3代植株与非转基因植株进行消毒培养于1/2MS培养基上，4℃春化两天后，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到小花盆里生长，同等条件下种植栽培，表型观察发现非转基因拟南芥开花明显晚于过表达转基因拟南芥(图2)；说明过表达GhNFYC4明显促进拟南芥开花和生殖生长发育。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 棉花GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacggca acaagcaagc ccagtcctcc tcttaccctc ctcagcctcc cactacttct 60
attacgcctt ctcctccttc ctcctccgcc gccatcgccg ccactccgcc tgctcctttc 120
caccacctcc tccagcagca gcagcaacag ctccaaatgt tctggtctta ccagcgccaa 180
gaaatcgagc tagtcaacga cttcaagaac catcagcttc ctcttgctcg catcaagaag 240
atcatgaaag ccgacgaaga tgtccgtatg atctccgctg aagcccctat tctcttcgcc 300
aaagcctgcg agcttttcat tctggagctt accatccgtt cctggcttca cgccgaggag 360
aacaagcgac ggacgcttca gaaaaacgac atcgcggcgg ctattactag gaccgacatt 420
ttcgatttct tggtggatat tgtgcccagg gacgagatca aggatgaggc cggtctgggt 480
gggatggtgg gtcccaccgc cagtggggtg ccatattttt atcctcccat gagtcagcct 540
gctggcgctc ctgctggacc tggcgggatg atgattggaa ggcccgccgt cgatacaacc 600
ggtggtattt atgctcagcc tccttctcag gcttggcaga gtgtttggca gacggcgggg 660
gctgacgatg ggtcgtatgc cagtggaggt agcggcggtc aggggaatct tgacggacaa 720
gggtatgtag acaactattg tttttattcc attcaaagtt taggtttttt tcttgaactc 780
tttatcagtt tgtag 795
<210> 2
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Gly Asn Lys Gln Ala Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Pro Gln Pro
1 5 10 15
Pro Thr Thr Ser Ile Thr Pro Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ala Ala Ile
20 25 30
Ala Ala Thr Pro Pro Ala Pro Phe His His Leu Leu Gln Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Gln Leu Gln Met Phe Trp Ser Tyr Gln Arg Gln Glu Ile Glu Leu
50 55 60
Val Asn Asp Phe Lys Asn His Gln Leu Pro Leu Ala Arg Ile Lys Lys
65 70 75 80
Ile Met Lys Ala Asp Glu Asp Val Arg Met Ile Ser Ala Glu Ala Pro
85 90 95
Ile Leu Phe Ala Lys Ala Cys Glu Leu Phe Ile Leu Glu Leu Thr Ile
100 105 110
Arg Ser Trp Leu His Ala Glu Glu Asn Lys Arg Arg Thr Leu Gln Lys
115 120 125
Asn Asp Ile Ala Ala Ala Ile Thr Arg Thr Asp Ile Phe Asp Phe Leu
130 135 140
Val Asp Ile Val Pro Arg Asp Glu Ile Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gly
145 150 155 160
Gly Met Val Gly Pro Thr Ala Ser Gly Val Pro Tyr Phe Tyr Pro Pro
165 170 175
Met Ser Gln Pro Ala Gly Ala Pro Ala Gly Pro Gly Gly Met Met Ile
180 185 190
Gly Arg Pro Ala Val Asp Thr Thr Gly Gly Ile Tyr Ala Gln Pro Pro
195 200 205
Ser Gln Ala Trp Gln Ser Val Trp Gln Thr Ala Gly Ala Asp Asp Gly
210 215 220
Ser Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Gly Asn Leu Asp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Tyr Val Asp Asn Tyr Cys Phe Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Gly Phe
245 250 255
Phe Leu Glu Leu Phe Ile Ser Leu
260
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcctccgtc ttgaccttg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtccgtcag gcaactcat 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacgagatca aggatgaggc cg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggcatacg acccatcgtc ag 22
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacgggggac tctagaatgg acggcaacaa gcaa 34
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatcggggaa attcgagctc ctacaaactg ataaagagtt ca 42
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacgcacaat cccactatcc 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctacaaactg ataaagagtt ca 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gacgagatca aggatgaggc cg 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggcatacg acccatcgtc ag 22
Claims (9)
1.GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用，其特征在于，所述GhNFYC4基因具有SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述基因编码的多肽在促进植物开花中的应用，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在植物中提高GhNFYC4基因的表达量，以促进植物开花。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的在植物中提高GhNFYC4基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源GhNFYC4基因的表达，或在植物中过表达外源GhNFYC4基因。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述过表达外源GhNFYC4基因是指将所述GhNFYC4基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行过表达。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述GhNFYC4基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述GhNFYC4基因的表达。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组成型启动子是35S启动子。
9.根据权利要求5-8任一所述的应用，其特征在于，所述植物是棉花、玉米、水稻、小麦或拟南芥。
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